Bài giảng Công nghệ sinh học - Công nghệ DNA tái tổ hợp - Nguyễn Vũ Phong

Nội dung text: Bài giảng Công nghệ sinh học - Công nghệ DNA tái tổ hợp - Nguyễn Vũ Phong

1. 3/3/2015 Lịch s ử hình thành • 1972 – 1973: DNA tái tổ hợp in vitro từ 3 ngu ồn vật li ệu di truy ền khác nhau. (Berg, Boyer và Cohen) • 1973 – 1974: DNA tái tổ hợp có ho ạt tính sinh học (Cohen, Công ngh ệ DNA tái t ổ h ợp Henlinski, Boyer). Tên gọi: •Kỹ thu ật DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology) Nguy ễn Vũ Phong •Kỹ thu ật gene (Gene engineering) hay công ngh ệ gene (Genetic technology) • Thao tác gene (Gene manipulation) •Tạo dòng phân tử (Molecular cloning) •Kỹ thu ật di truy ền (Genetic engineering): thao tác với nh ững ph ần lớn hơn của bộ gene. QUY TRÌNH TI ẾN HÀNH 1. Enzyme •Bướ c 1: Nuôi tế bào ch ủ và tế bào cho 1.1. Enzyme cắt gi ới hạn (Restriction endonuclease enzyme, RE) •Bướ c 2: Tách DNA plasmid và DNA tế - 1962: hạn ch ế sự sinh sản của phage trong tế bào vi khu ẩn bào cho -Hệ th ống hạn ch ế - bi ến đổ i (restriction – modification system) giúp bảo vệ tế bào kh ỏi sự xâm nh ập của DNA lạ. •Bướ c 3: Cắt DNA plasmid và DNA mục tiêu bằng 1 lo ại enzyme cắt gi ới hạn Restriction enzyme.swf •Bướ c 4: Tr ộn và nối 2 lo ại DNA bằng enzyme nối tạo DNA tái tổ hợp hoàn ch ỉnh •Bướ c 5: Chuy ển DNA tái tổ hợp vào tế bào nh ận (E. coli , nấm men) •Bướ c 6: Ch ọn lọc và nhân dòng tế bào mang gene tái tổ hợp •Bướ c 7: Nghiên cứu điều ki ện để gene bi ểu hi ện ra sản ph ẩm 1. Enzyme 1. Enzyme 1.2. Enzyme n ối (Ligase) 1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE) - Trình tự nh ận bi ết: gồm 4-6 cặp nu đố i xứng đả o ng ượ c (palindrom) Hình thành c ầu phosphodiester -Cắt tạo thành đầ u so le (sticky end) hay đầ u bằng (cohesive end) . gắn các nucleotid k ề c ận hay ch ụm c ầu v ới nhau - Kho ảng 3000 RE với 230 trình tự nh ận bi ết khác nhau. - Eco RI: Escherichia co li R: dòng vi khu ẩn I: th ứ tự tìm ra (I: đầ u tiên) 1
2. 3/3/2015 1. Enzyme 1. Enzyme 1.3. Enzyme phiên mã ng ượ c 1.4. Các enzyme khác (reverse transcriptase) •Tổng hợp sợi DNA bổ sung Enzyme Ch ức n ăng c-DNA (complementary DNA) từ một sợi mRNA ho ặc từ polyribonucleotide DNaseI Phân hủy DNA mạch kép bằng ph ản ứng th ủy tổng hợp phân nội liên kết phosphodiester (Endonuclease) Nuclase BAL31 Phân hủy 2 đầ u mút 3’ và 5’ của DNA (Exon • c-DNA có th ể tổng hợp nuclease) thành c-DNA kép (c-DNA duplex) nh ờ DNA S1 nuclease Cắt DNA mạch đơ n polymerase. c-DNA kép đượ c dùng trong vi ệc tạo Đoạn Klenow DNA polymerase ch ỉ còn ho ạt tính exonuclease dòng c-DNA 3’-5’ Taq polymerase DNA polymerase ch ịu nhi ệt từ vi khu ẩn Thermophilus aquaticus cDNA.swf 2. Các vector chuy ển gene 2. Các vector chuy ển gene Yêu cầu tối thi ểu đố i với vector chuy ển gene . Plasmid: - DNA vòng tròn - Có trình tự kh ởi đầ u sao chép (ori) - Sao chép độ c l ập trong t ế bào để tự sao chép mà tồn tại độ c lập - Có kh ả n ăng mang m ột s ố gene - Trình tự nh ận bi ết cho RE tạo vết có kh ả n ăng bi ểu hi ện thành cắt để chèn gene lạ protein - Trình tự điều hòa (promoter) tạo Vector : điều ki ện thu ận lợi phiên mã gene - Phân t ử DNA có kh ả n ăng t ự tái b ản lạ -Tồn t ại độ c l ập trong t ế bào - Đả m bảo sự di truy ền bền vững - Mang đượ c gene mong mu ốn của DNA tái tổ hợp - Có gene đánh dấu (marker) để dễ dàng nh ận bi ết các gene lạ. 2. Các vector chuy ển gene 2. Các vector chuy ển gene Các lo ại vector chuy ển gene Ứng dụng của vector chuy ển gene Vector Đặ c điểm Kh ả năng Ứng dụng -Tạo dòng và khuy ếch đạ i trình tự DNA (nhi ều bản sao) chèn Plasmid Dạngvòng 0,1 –10kb Procaryote - Nghiên cứu sự bi ểu hi ện của đoạn DNA Phage λ Tự độ ng xâm nhi ễm và sinh 15 – 23 Kb Lập ngân hàng gene - Chuy ển gene sản trong TB vi khu ẩn -Sản xu ất RNA Cosmid Plasmid + đoạn cos của 45kb Lập th ư vi ện gene -Sản xu ất protein từ gene đượ c tạo dòng. phage λ Hệ th ống vector chuy ển gen đượ c hoàn thi ện không ng ừng. Phage DNA mạch đơ n Xác đị nh trình tự nu M13 Sản xu ất mẫu dò Gây độ t bi ến điểm đị nh hướ ng BAC NST nhân tạo vi khu ẩn 50 – 300kb YAC Vòngtròn2 micrometrecải 100-2000kb ti ến MAC NST nhân tạo độ ng vật có vú >2000kb 2
3. 3/3/2015 2. Các vector chuy ển gene 3. H ệ th ống t ế bào ch ủ Plasmid Ti (Host) - 200Kb Mục đích : - Agrobacterium tumefaciens - Nhân nuôi t ạo s ố l ượ ng l ớn dùng cho thí nghi ệm t ạo dòng. - Chuy ển gen ở th ực v ật - Bi ểu hi ện gene, đặ c bi ệt ở Eukaryote - Chuy ển và g ắn ng ẫu nhiên vào b ộ gene c ủa t ế bào -Sản xu ất protein tái t ổ h ợp. 3. H ệ th ống t ế bào ch ủ 3. H ệ th ống t ế bào ch ủ (Host) (Host) 3.1. Escherichia coli (E.coli) 3.3. H ệ th ống t ế bào th ực v ật -Dễ nuôi c ấy và nhân dòng 3.4. H ệ th ống t ế bào độ ng v ật -Dễ ch ấp nh ận các lo ại vector khác nhau. -Tế bào th ận kh ỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney) - Vi khu ẩn Gram-, hình que, -Tế bào th ận chu ột đồ ng con (BHK- Baby hamster kidney) -Bộ gene kho ảng 4,6x10(6) c ặp base -Tế bào th ận phôi ng ườ i (HEK-239- Human embryonic kidney 3.2. Saccharomyces cerevisiae -Tế bào t ử cung chu ột b ạch (CHO-Chinese hamster ovary) - Eukaryote đơ n bào -Tế bào côn trùng nuôi baculovirus bi ều hi ện protein ng ườ i -Dễ dàng nuôi cấy và thu sinh kh ối -Tế bào tuy ến trùng Caenorhabditis elegans - Phân lập đượ c nhi ều promotor ho ạt độ ng mạnh - Th ực hi ện bi ến đổ i sau dịch mã tạo protein có đủ ho ạt tính sinh học. -Sản xu ất protein tái tổ hợp dễ dàng - Sinh vật an toàn Kỹ thu ật và ph ươ ng pháp c ăn b ản Kỹ thu ật và ph ươ ng pháp c ăn b ản 1. Lai nucleic acid 2. Thu nh ận gene Đặc tính bi ến tính và hồi tính có th ể lai gi ữa DNA-DNA, DNA-RNA, - Thu nh ận DNA từ bộ RNA-RNA gene * Shotgun: toàn bộ DNA của sinh vật đượ c cắt đoạn nh ỏ bằng cơ học hay RE và gắn vào vector tạo dòng * Ngân hàng/th ư vi ện DNA bộ gene (Bank/Library of genomic DNA) Southern Blot.swf 3
4. 3/3/2015 Kỹ thu ật và ph ươ ng pháp c ăn b ản Kỹ thu ật và ph ươ ng pháp c ăn b ản 2. Thu nh ận gene 2. Thu nh ận gene -Tổng hợp gene bằng ph ươ ng pháp hóa học -Lập ngân hàng c-DNA *Tạo gene từ các mRNA thông tin nh ờ enzyme phiên mã ng ượ c Ưu điểm - Ch ứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (không ch ứa đoạn intron) Kỹ thu ật và ph ươ ng pháp c ăn b ản Kỹ thu ật và ph ươ ng pháp c ăn b ản 3. T ạo plasmid tái t ổ h ợp 3. T ạo plasmid tái t ổ h ợp a) Dùng đầ u so le a) Dùng đầ u so le b) Dùng các đoạn nối (linkers) Kỹ thu ật và ph ươ ng pháp c ăn b ản Kỹ thu ật và ph ươ ng pháp c ăn b ản 3. T ạo plasmid tái t ổ h ợp 4. Bi ến n ạp DNA tái t ổ h ợp vào t ế bào a) Dùng đầ u so le a) Hóa bi ến n ạp b) Dùng các đoạn nối (linkers) c) Dùng enzyme terminal transferase 4
5. 3/3/2015 Kỹ thu ật và ph ươ ng pháp c ăn b ản Kỹ thu ật và ph ươ ng pháp c ăn b ản 4. Bi ến n ạp DNA tái t ổ h ợp vào t ế bào 4. Bi ến n ạp DNA tái t ổ h ợp vào t ế bào b) Điện bi ến n ạp c) Vi tiêm Kỹ thu ật và ph ươ ng pháp c ăn b ản 4. Bi ến n ạp DNA tái t ổ h ợp vào t ế bào Tạo cây chuy ển gene d) B ắn gene DNA coated Cell’s DNA golden particles Plant cell Gene gun A plant cell with the new gene Transgenic plant Cell division Kỹ thu ật và ph ươ ng pháp c ăn b ản Kỹ thu ật và ph ươ ng pháp c ăn b ản 5. Ch ọn l ọc, t ạo dòng và s ự bi ểu hi ện gene 5. Ch ọn l ọc, t ạo dòng và s ự bi ểu hi ện gene a) Xác đị nh dòng vi khu ẩn ch ứa plasmid tái t ổ h ợp b) S ự bi ểu hi ện c ủa gene thành protein Screening.swf 5
6. 3/3/2015 Ph ản ứng t ạo chu ỗi nucleotide Polymerase Chain Reaction, PCR (Polymerase Chain Reaction, PCR) PCR dựa trên 3 bướ c ở nhi ệt độ khác nhau. 1985, Kary Mullis 1. Nguyên t ắc 1. Bi ến tính : tạo dây đơ n DNA với nhi ệt độ 94 oC 2. Bắt cặp: lai gi ữa primers và DNA đơ n. Nhi ệt độ kho ảng 50 oC 3. Kéo dài : tạo dây DNA bổ sung với tác độ ng của polymerase và dNTPs: 72 oC. Lặp lại chu kỳ kho ảng 30-40 lần sẽ tạo ra số lượ ng DNA cần khu ếch đạ i đủ quan sát trên gel qua quá trình điện di 2. Thành ph ần ph ản ứng - Primer - Polymerase ch ịu nhi ệt - dNTP - Dung d ịch đệ m PCR.swf -Mẫu - Dung d ịch đệ m Sequencing Sequencing 1. Ph ươ ng pháp hóa h ọc c ủa Maxam và Gilbert 1. Ph ươ ng pháp hóa h ọc c ủa Maxam và Gilbert 2. Ph ươ ng pháp didesoxy c ủa F. Sanger Ứng d ụng công ngh ệ gene Ứng d ụng công ngh ệ gene 2. Công ngh ệ protein tái t ổ h ợp 1. Khai thác DNA các b ộ gene - Sản xu ất r-protein 1.1. Genomics: STT Sản ph ẩm Các b ệnh điều tr ị Năm h ết patent - Xác đị nh trình t ự nucleotide c ủa b ộ gene và ch ức n ăng c ủa chúng - Phát hi ện, b ảo t ồn s ự đa d ạng sinh h ọc, s ử d ụng chúng. 1 Insulin Ti ểu đườ ng 2001 1.2. Proteomics 2 Interferon alpha Viêm gan siêu vi B, ung 2002 - Nghiên c ứu c ấu hình (conformation), v ị trí (localization), các bi ến th ư, đổ i (modification), s ự t ươ ng tác (interactions), ch ức n ăng 3 Interferon beta Xơ c ứng 2003 (function) 4 Hormon t ăng t ưở ng ng ườ i Thi ểu n ăng t ăng tr ưở ng 2003 -Tạo hormone, vaccin tái t ổ h ợp dùng ch ữa tr ị b ệnh. 1.3. Human Genome Projet 5 Erythropoetin Thi ếu máu 2004 1.4. Các ngành h ọc khác 6 T-PA (tissu plasminogen Nh ồi máu c ơ tim 2005 - Cellomics activator) - Metabolomics 7 G-CSF (granulocyte – Chemotherapy-induced 2006 COLONY Stimulating Factor neutropenia - Ionomics 6
7. 3/3/2015 Ứng d ụng công ngh ệ gene Ứng d ụng công ngh ệ gene 4. Vi sinh v ật chuy ển gene 3. Ch ẩn đoán phân t ử - Genomics vi sinh v ật: gi ải trình t ự h ơn 200 loài vsv. -Dựa trên ph ươ ng pháp lai DNA: đặ c hi ệu, nh ạy, chính xác, đơ n gi ản -Sản xu ất các h ợp ch ất s ơ c ấp và th ứ c ấp. - DNA marker: chu ỗi DNA dùng để phân bi ệt gi ữa 2 cá th ể, 2 dòng ho ặc 2 gi ống khác nhau. - Công ngh ệ b ề m ặt t ế bào n ấm men. - Biomarker: d ấu chu ẩn sinh h ọc - DNA fingerprinting: d ấu vân tay di truy ền - Microarray và Biochips: Ứng d ụng công ngh ệ gene Ứng d ụng công ngh ệ gene 5. Th ực v ật chuy ển gene 6. Độ ng v ật chuy ển gene -Cải thi ện gi ống cây tr ồng: kháng thu ốc di ệt c ỏ, kháng b ệnh, - Độ ng v ật mang gene ng ườ i làm mô hình thí nghi ệm (b ệnh di truy ền, ung th ư,, thoái hóa c ơ, viêm kh ớp, ) -Tạo gi ống ch ống ch ịu điều ki ện khí h ậu b ất l ợi, già hóa -Sản xu ất protein tái t ổ h ợp -Tạo s ắc t ố ở các th ực v ật chuy ển gene - Ch ăn nuôi gene (gene farming) - Bi ến đổ i ch ất l ượ ng th ực ph ẩm cây tr ồng - Th ực v ật s ản xu ất vaccine, protein tr ị li ệu -Sản xu ất d ầu nh ờn công nghi ệp -Sản xu ất plastid Ứng d ụng công ngh ệ gene 7. Công ngh ệ gene đố i v ới s ức kh ỏe con ng ườ i Xét nghi ệm SNP (Single Nucleotide Polymorphism) * Thi ết k ế thu ốc cho t ừng b ệnh nhân * Nh ận d ạng t ừng nhóm b ệnh, xác đị nh ph ươ ng th ức điều tr ị Pharmacogenomics: (D ượ c h ọc b ộ gene) Cung c ấp cách ch ữa b ệnh an toàn và hi ệu qu ả cho t ừng cá nhân Gene therapy: * Chuy ển gen lành thay th ế gene sai h ỏng * Thay th ế gene 7