›
›

Bài giảng Nuôi cấy mô thực vật

pdf 38 trang hapham 2170
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Bài giảng Nuôi cấy mô thực vật", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfbai_giang_nuoi_cay_mo_thuc_vat.pdf

Nội dung text: Bài giảng Nuôi cấy mô thực vật

  1. Bài giảng Nuơi cấy mơ thực vật THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 1 Trang
  2. BÀI I PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MƠI TRƯỜNG NUƠI CẤY MƠ THỰC VẬT 1 - NGUYÊN TẮC 1.1 - Nguyên tắc pha chế mơi trường Mơi trường nuơi cấy mơ thực vật khác với các loại mơi trường nuơi cấy vi sinh là cĩ thành phần rất phức tạp, sự hiện diện của rất nhiều loại hố chất với hàm lượng rất nhỏ. Do vậy, để thuận tiện cho việc pha các mơi trường nuơi cấy (mơi trường làm việc), người ta khơng cân hố chất mỗi lần pha mơi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng nhiều loại dung dịch với độ đậm đặc từ X10 – X100, chỉ cần pha với nước cất hai lần hay nước vơ khống khi sử dụng. Các dung dịch này gọi là dung dịch mẹ (stock). Dung dịch mẹ được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu. Thơng thường pha các dung dịch mẹ: stock đa lượng, stock vi lượng, Fe – EDTA, stock vitamin, stock chất sinh trưởng, và các stock cần thiết khác. 1.2 - Phân loại mơi trường nuơi cấy mơ thực vật Tùy theo thành phần các chất cĩ trong mơi trường, cĩ thể phân thành 3 loại mơi trường: - Mơi trường nghèo chất dinh dưỡng: như mơi trường White, Knop. Mơi trường này thích hợp vào các giai đoạn cuối của quy trình nuơi cấy mơ thực vật khi chuẩn bị chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm. Mơi trường nghèo chất dinh dưỡng cũng cĩ thể sử dụng trong các sinh trắc nghiệm để kiểm tra đặc tính biến dưỡng của mơ thực vật. - Mơi trường cĩ hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: mơi trường B5, Gamborg. Loại mơi trường này được sử dụng đối với một số loại cây cĩ nhu cầu các chất dinh dưỡng trong mơi trường vừa phải hoặc cũng cĩ thể sử dụng khi nuơi cấy mơ thực vật dài ngày. - Mơi trường giàu chất dinh dường: mơi trường MS (Murashige – Skoog). Đây là mơi trường khởi đầu cho mọi quá trình nuơi cấy mơ đối với mọi đối tượng nuơi cấy. Mơi trường MS là một mơi trường thích hợp với nhiều loại cây, do giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng. 2 - NGUYÊN LIỆU - HỐ CHẤT - DỤNG CỤ 2.1 - Hố chất - Saccharose (sucrose) - Agar - NH4NO3 - KNO3 - MgSO4.7H2O - KH2PO4 THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 2 Trang
  3. - CaCl2.5H2O - KI - Na2MoO4.2H2O - CoCl2.6H2O - H3PO3 - MnSO4.4H2O - ZnSO4.7H2O - CuSO4.5H2O - Thiamine HCl - Myo-inositol - Glycine - NAA - BA (6-Benzyl aminopurin) - Na2-Ethylen diamin tetraacetat (Na2 EDTA -Fe2(SO4)3 2.2 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhĩm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng 1 - Bình định mức: 100 ml cái 10 2 - Bình định mức: 500 ml cái 3 3 - Ống đong: 100 ml cái 12 4 - Ống đong 500 ml cái 3 5 - Đũa khuấy cái 15 6 - Bình màu 200 ml cái 5 7 - Quả bĩp cao su cái 15 8 - Bể ổn nhiệt cái 1 Dùng để pha Fe-EDTA 9 - Cốc 100 ml cái 30 10 - Cốc 200 ml cái 15 11 - Pipett: 1 ml cái 15 12 - Pipett: 5 ml cái 15 13 - Pipett: 10 ml cái 15 14 - Bình định mức 250 ml cái 15 15 - Ống nghiệm Þ 25 ống 100 16 - Bơng mỡ g 200 THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 3 Trang
  4. 17 - Bình màu: 1000 ml cái 2 Bảo quản các stock 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH Học sinh chia nhĩm thực hành pha chế các dung dịch mẹ (stock) của mơi trường MS (Murashige – Skoog) như sau: dung dịch mẹ khống đa lượng (Skoog I), dung dịch mẹ Fe – EDTA (Skoog II), dung dịch mẹ khống vi lượng (Skoog III), dung dịch mẹ chất điều hồ sinh trưởng 4 - THỰC HÀNH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH MẸ (Stock) MƠI TRƯỜNG MS (Murashige – Skoog) 4.1. Pha stock khống đa lượng mơi trường MS nồng độ đậm đặc 20 lần (x20) Cân chính xác bằng cân phân tích các muối khống đa lượng. Dùng ống đong, đong khoảng 400 ml nước cất hai lần vào becher 1000 ml. Cho lần lượt các muối đa lượng vào theo trình tự nhất định sau: Nồng độ mơi trường Nồng độ dung dịch Tên hố chất nuơi cấy (mg/lít) stock (x20) (mg/lít) - MgSO4.7H2O 370 7.400 - KH2PO4 170 3.400 - KNO3 1.900 38.000 - NH4NO3 1.650 33.000 - CaCl2.2H2O 440 8.800 Mỗi lần cho một loại khống vào phải khuấy tan hồn tồn và bổ sung thêm 100 ml nước cất hai lần trước khi bổ sung các khống khác vào (phương pháp pha thể tích tăng dần). Do CaCl2.2H2O cĩ thể phản ứng tạo kết tủa với MgSO4.7H2O nên hai chất này phải pha tách rời nhau theo đúng trình tự ở trên, cho CaCl2.2H2O vào sau cùng. Cho tất cả vào bình định, dùng nước cất hai lần chuẩn lại cho đúng 1000 ml. Như vậy ta cĩ 1000 ml dung dịch mẹ khống đa lượng đậm đặc 20 lần. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10oC, dùng 50 ml cho một 1000 ml mơi trường nuơi cấy. 4.2. Pha stock khống vi lượng nồng độ đậm đặc 1000 lần (x1000) Do hàm lượng một số loại khống vi lượng trong stock khống vi lượng rất nhỏ, khĩ cĩ thể cân đong chính xác như một số các khống vi lượng khác. Vì vậy ở đây, ta phải tiến hành pha riêng dung dịch các khống này (CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O) cĩ nồng độ đậm đặc hơn 100 lần so với dung dịch mẹ và gọi là dung dịch “bà ngoại”. Sau khi pha song các dung dịch “bà ngoại”, tiến hành pha 100 ml stock khống vi lượng X1000 tương tự như ở phần trên. Thành phần các khống như sau: Nồng độ mơi Nồng độ dung dịch Nồng độ dung dịch Tên hố chất trường nuơi cấy stock (x1000) “bà ngoại “(x100) (mg/lít) (mg/lít) (mg/lít) H3PO3 6,2 6200 MnSO4.4H2O 22,3 22300 ZnSO4.4H2O 8,6 8600 THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 4 Trang
  5. Na2MoO4.2H2O 0,25 250 KI 0,83 830 CuSO4.5H2O 0,025 25 2500 CoCl2.6H2O 0,025 25 2500 4.3. Pha dung dịch mẹ Fe-EDTA nồng độ đậm đặc 200 lần (x200) Sắt là yếu tố rất cần thiết cho thực vật. Tuy nhiên, nhu cầu của thực vật đối với sắt rất nhỏ và lượng liên tục. Vì vậy, để cung cấp đủ lượng sắt cho thực vật ta thường dùng sắt dưới dạng hợp chất Fe-DETA. Hợp chất Fe-EDTA được hình thành do sự ngậm Fe của EDTA dưới tác dụng của nhiệt độ. Ở dưới dạng hợp chất này, sắt sẽ được phĩng thích ra mơi trường tuỳ theo nhu cầu của thực vật. Phương pháp pha như sau: Nồng độ mơi trường Nồng độ dung dịch stock Tên hố chất nuơi cấy (mg/lít) (x200) (mg/lít) FeSO4.7H2O 27,8 5560 Na2 EDTA 37,3 7460 Chuẩn bị hai becher 500 và 1000 ml. Cho vào mỗi becher 400 ml nước cất hai lần. Đun nĩng hai becher trong bể ổn nhiệt khoảng 80oC. Cân chính xác 5,56 g FeSO4.7H2O cho vào becher 500 ml cĩ 400 ml nước trên, khuấy tan hồn tồn. Cân chính xác 7,46 g Na2 EDTA cho vào becher 1000 ml trên, khuấy tan hồn tồn. Cho từ từ dung dịch FeSO4.7H2O vào dung dịch Na2 EDTA, vừa đổ vừa khuấy đều. Cuối cùng bổ sung nước cho đủ 1000 ml. Như vậy, ta cĩ 1000 ml dung dịch stock Fe-EDTA đậm đặc 200 lần cĩ màu vàng nhạt, trong suốt. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10oC, dùng 5ml cho một 1000 ml mơi trường nuơi cấy. 4.4. Pha stock hormon Các hormon khác nhau sẽ tan trong các dung mơi khác nhau. IAA, NAA, BA pha trong NaOH 1N (thêm 2-3 ml NaOH 1N và lắc cho đến khi tan hết, sau đĩ thêm o nước đến thể tích cần). GA3, 2,4-D pha trong cồn 50 cho đủ thể tích. Để pha các chất sinh trưởng, cĩ hai cách khác nhau: + Cách 1: pha theo hệ mol Ví dụ: Pha 100 ml dung dịch stock IAA (M=176,19) cĩ nồng độ 1 mmol (milimol) từ IAA tinh khiết. 176,19 g IAA pha trong 1000 ml nước 1000 ml dung dịch cĩ nồng độ 1 mol/lít. Để pha dung dịch cĩ nồng độ 1 mmol/lít cần 0,17619 g IAA. Như vậy, muốn cĩ 100 ml dung dịch IAA nồng độ 1 mmol/lít cần 0,017619 g IAA. (MNAA: 186,2; M2,4-D: 221,04; MBA: 225,2) + Cách 2: pha theo hệ mg/lít: làm tương tự như cách pha khống. Các dung dịch stock hormon sau khi pha song được bảo quản trong các chai màu ở nhiệt độ lạnh 4-10oC. 4.5. Pha stock vitamin mơi trường MS nồng độ đậm đặc 500 lần (x500) Dùng ống đong, đong 50 ml nước cất hai lần vào một becher 100 ml. Bổ sung các vitamin vào theo trình tự sau: Tên hố chất Nồng độ mơi trường Nồng độ dung dịch stock THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 5 Trang
  6. nuơi cấy (mg/lít) (x500) (mg/lít) Acid nicotinic 0,5 250 Thiamin HCl 0,1 50 Pyridoxin HCl 0,5 250 Myo-inositol 100 50.000 Glycine 2 1.000 Cho tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất bổ sung cho đủ 100 ml. Như vậy, ta cĩ 100 ml stock vitamin MS x500. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ dưới 0oC, dùng 2ml cho một 1000 ml mơi trường nuơi cấy. 4.6. Pha mơi trường làm việc (mơi trường nuơi cấy) Pha 1 lít mơi trường MS cơ bản: - Dùng ống đong, đong 500 ml nước cất hai lần vào becher. - Bổ sung 30 g đường sucrose vào, khuấy tan hồn tồn - Bổ sung 50 ml dung dịch stock đa lượng x20, khuấy đều. - Bổ sung 1 ml dung dịch stock vi lượng x1000, khuấy đều. - Bổ sung 5 ml dung dịch stock Fe-EDTA x200, khuấy đều. - Bổ sung 2 ml dung dịch stock vitamin x500. - Bổ sung stock hormon với lượng tùy mục đích nuơi cấy. - Chuyển tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất chuẩn lại cho đủ 1000 ml - Chỉnh pH của dung dịch bằng NaOH 1N hay HCl 1N về pH=5,8. - Bổ sung 6-8 g agar. - Đun sơi cho tan agar, quấy đều. Chia hỗn hợp mơi trường vào các bình nuơi cấy, cần chia xong trước khi dung dịch mơi trường MS nguội xuống 50oC. Hấp khử trùng (đối với các thành phần bị biến tính ở nhiệt độ cao sẽ được lọc vơ trùng và bổ sung vào mơi trường sau khi hấp). Mơi trường sau khi hấp được bảo quản ở 25oC. 5 - BÁO CÁO THỰC HÀNH 1. Trình bày cách pha Skoog I, Skoog II và Skoog III. 2. Quan sát hiện tượng phản ứng khi pha stock Fe-EDTA. Giải thích. 3. Từ BA tinh khiết, trình bày cách pha 100 ml stock BA cĩ nồng độ 100 mol/lít. Biết MBA =225,2. 4. Cần bao nhiêu ml dung dịch stock IAA cĩ nồng độ 150 mol/lít để pha mơi trường làm việc cĩ nồng độ IAA là 0,1 mol/lít. THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 6 Trang
  7. BÀI 2 PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MƠ THỰC VẬT 1 - NGUYÊN TẮC Một thí nghiệm nuơi cấy mơ thực vật khác với một thí nghiệm nuơi cấy vi sinh thường tiến hành trong một thời gian rất lâu dài. Với một thí nghiệm trường diễn như thế, chỉ cần một tế bào vi khuẩn, một bào tử nấm mốc rơi vào mơi trường nuơi cấy, sau một thời gian ngắn sẽ sinh sơi làm hỏng mơi trường, làm hỏng thí nghiệm và phải tiến hành làm lại từ đầu. Do đĩ việc vơ trùng tức loại bỏ hết nấm khuẩn trong nuơi cấy mơ thực vật vơ cùng quan trọng. Mơ cấy cĩ thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phơi, nỗn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ tùy theo sự tiếp xúc với mơi trường bên ngồi, các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Để chuyển mơ thực vật từ mơi trường tự nhiên vào mơi trường nuơi cấy in vitro, mơ thực vật phải trải qua giai đoạn khử trùng để loại bỏ hết các mầm vi sinh vật. Tuy nhiên quá trình này phải đảm bảo là mơ thực vật cịn sống, cĩ khả năng tăng trưởng, phát triển tốt. Phương pháp vơ trùng mơ cấy thơng dụng nhất hiện nay là dùng các chất hĩa học cĩ hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mơ cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mơ cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thơng thường người ta lắc mơ cấy với cồn 70%, sau đĩ mới xử lý dung dịch diệt khuẩn. Bảng 1. Một số tác nhân khử trùng dùng cho thực vật Tác nhân vơ trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả Canxi hypoclorid 9 – 10 5 – 30 Rất tốt Natri hypoclorid 2 5 – 30 Rất tốt Hydro peroxid 10 – 12 5 – 15 Tốt Nước Brom 1 – 2 2 – 10 Rất tốt HgCl2 0,1 – 1 2 – 10 Trung bình Chất kháng sinh 4 – 50 30 – 60 Khá tốt Trong thời gian xử lý, mơ cấy phải ngập hồn tồn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận cĩ nhiều bụi cát, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà phịng bột và rửa sạch lại bằng nước máy. Khi xử lý song, mơ cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vơ trùng (tối thiểu là 3 lần). Những phần trên mơ cấy bị tác nhân vơ trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trứơc khi đặt mơ cấy lên mơ trường. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của các tác nhân vơ trùng lên mơ cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngồi khi ngâm mơ vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bĩc đi trước khi đặt mơ cấy lên mơi trường. THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 7 Trang
  8. Như vậy, để cĩ thể đạt được mục đích khử trùng (loại bỏ hết mầm vi sinh vật, mơ thực vật cĩ thể tăng trưởng, phát triển), thì việc khử trùng là phải tìm ra được ba yếu tố liên quan chặt chẽ với nhau và liên quan tới mơ thực vật đem khử trùng đĩ là: - Chất khử trùng - Nồng độ chất khử trùng - Thời gian khử trùng. Vơ trùng mẫu là một thao tác khĩ, ít khi thành cơng ngay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm nồng độ và thời gian vơ trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả. 2 - VẬT LIỆU - HỐ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 - Vật liệu - Cây Trầu bà - Hạt thuốc lá 2.2 - Hố chất - Xà phịng bột - Cồn 70o, 90o - Javel - Ca(OCl)2 (Caxi hypoclorid) 2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhĩm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng 1 - Dao mổ cái 15 2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn 3 - Ống đong: 100 ml cái 12 4 - Ống đong 500 ml cái 3 5 - Đũa khuấy cái 15 6 - Cốc 500 ml cái 15 7 - Quả bĩp cao su cái 15 8 - Cốc 1000 ml cái 5 9 - Cốc 100 ml cái 30 10 - Cốc 200 ml cái 15 11 - Pipett: 1 ml cái 5 12 - Pipett: 5 ml cái 5 13 - Pipett: 10 ml cái 5 14 - Erlen 250ml cái 60 THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 8 Trang
  9. Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng 15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15 16 - Bơng mỡ g 200 17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15 Tủ cấy cĩ quạt thổi vơ 18 - Tủ cấy vơ trùng cái 1 trùng 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH Học sinh thực hành khử trùng đốt thân cây Trầu bà, hạt thuốc lá. Sau khi vơ trùng tiến hành gieo hạt thuốc lá, cấy đốt thân cây Trầu bà lên mơi trường MS. 4 - THỰC HÀNH 4.1 - Khử trùng cây Trầu bà a. Thực hiện trong phịng thí nghiệm - Cây Trầu bà được cắt thành những đoạn nhỏ 30cm. Rửa các đoạn này dưới vịi nước máy cho sạch bụi đất. - Cắt thành những đoạn Trầu bà này thành những đốt khoảng 3cm, mỗi đốt mang một chồi ngủ. Cắt bỏ lá, rễ. - Rửa các đốt với nước cĩ pha một ít xà phịng trong các erlen. - Rửa lại bằng nước máy nhiều lần cho sạch xà phịng. b. Thực hiện trong tủ cấy - Lắc các đốt thân với cồn 70o trong 1 phút - Chiết bỏ cồn. Ngâm các mẫu trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 10 phút (hay dung dịch javel được pha lỗng với tỷ lệ 1:9 trong 5 phút). - Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vơ trùng 5-6 lần - Gạn bỏ nước. 4.2 - Khử trùng hạt thuốc lá - Thực hiện trong phịng thí nghiệm, rửa hạt thuốc lá dưới vịi nước máy. - Lắc hạt với nước cĩ pha một ít xà phịng. - Rửa lại nhiều lần bằng nước máy cho sạch xà phịng - Thực hiện trong tủ cấy, lắc hạt với cồn 70o trong 1 phút. - Chiết bỏ cồn, ngâm hạt trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 5 phút. - Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vơ trùng 5-6 lần. - Gạn bỏ nước. 4.3 - Cách cấy mẫu a. Mẫu cây Trầu bà THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 9 Trang
  10. - Trong tủ cấy vơ trùng, những đốt cây Trầu bà đã khử trùng, được đặt trên giấy cấy vơ trùng. Dùng dao mổ và kẹp tách các lá. - Ở mỗi nách lá cĩ mang một mầm ngủ. Dùng dao mổ cắt một đoạn mẫu cĩ kích thước khoảng 1x1 cm cấy vào mơi trường MS đã hấp khử trùng trong các ống nghiệm. - Khi cấy mẫu cần chú ý cấy đúng chiều của thân. Các ống nghiệm được đặt trong phịng lạnh nhiệt độ 25oC, cường độ ánh sáng 2500-3000 lux. b. Mẫu hạt thuốc lá - Hạt thuốc lá sau khi khử trùng, dùng kẹp đặt đều trên bề mặt mơi trường MS trong các erlen. Khoảng cách giữa các hạt là 1cm. - Các erlen được đặt ở nơi tối hồn tồn. 5 - BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH 1. Trình bày phương pháp khử trùng đốt thân Trầu bà, hạt thuốc lá. 2. Vai trị và tác dụng của tác nhân khử trùng cồn, canxi hypoclorid. 3. Ghi nhận kết quả nuơi cấy. THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 10 Trang
  11. BÀI 3 KHỬ TRÙNG, NUƠI CẤY CHỒI NGỦ CÚC HẠT CAM 1 - NGUYÊN TẮC Trong các phương pháp nhân giống vơ tính in vitro cây trồng, bên cạnh những phương pháp địi hỏi người làm việc phải cĩ kỹ thuật cao như tách và nuơi cấy đỉnh sinh trưởng, vi ghép , phương pháp nhân giống bằng nuơi cấy chồi ngủ (chồi nách) là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và mang lại hiệu quả cao nhất. Ở đa số các lồi thực vật, mỗi nách lá đều mang một chồi ngủ. Các chồi ngủ này cĩ đặc tính hồn tồn giống với các đỉnh sinh trưởng (là một đỉnh sinh trưởng ở trạng thái tiềm sinh), cĩ khả năng tăng trưởng phát triển thành một cơ thể thực vật tồn vẹn. Các chồi ngủ này đa số bị ức chế sự phát triển bởi các chồi đỉnh (tính ưu thế ngọn). Nếu tách riêng một đoạn thân cĩ mang chồi nách này ra khỏi cơ thể thực vật, dưới tác động bởi những yếu tố kích thích sinh trưởng ngoại sinh như cytokinin, auxin thì từ một chồi nách này cĩ thể cho ra một cụm chồi với rất nhiều chồi mới (từ hàng chục tới hàng trăm chồi). Với những chồi mới tạo thành, tiếp tục cấy chuyền sang những mơi trường tạo chồi mới thì hệ số nhân giống rất đáng kể. Với những lồi thực vật cĩ đỉnh sinh trưởng nhỏ (đỉnh sinh trưởng dấu hoa thị) thì việc tách lấy đỉnh sinh trưởng rất khĩ thực hiện. Vì vậy, với những loại thực vật này, phương pháp nhân giống vơ tính hiệu quả nhất là nuơi cấy chồi nách. Chồi nách đem nuơi cấy thường gắn liền với một đoạn thân, do đĩ sức sống của chồi nách thường tốt hơn rất nhiều lần so với đỉnh sinh trưởng tách rời, hiệu quả tạo cụm chồi cũng thường tốt hơn so với phương pháp nuơi cấy đỉnh sinh trưởng Việc tách chồi nách thường thực hiện với những đoạn nhánh cĩ mang chồi của thực vật. Những đoạn nhánh này được khử trùng trước khi cắt nhỏ thành những đoạn cĩ mang chồi nách. Bên cạnh đĩ, việc tách chồi nách cũng cĩ thể thực hiện từ những cây vơ trùng trong ống nghiệm được tạo ra do việc nuơi cấy hạt giống. Trong bài thực hành này, sẽ đề cập tới phương pháp nhân giống vơ tính thực vật qua nuơi cấy chồi nách và tạo nguồn cây cho phương pháp nuơi cấy chồi nách từ hạt giống. 2- VẬT LIỆU –HỐ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 - Vật liệu - Cây hoa cúc - Hạt cam 2.2 - Hố chất - Cồn 70o, 90o - Mơi trường MS bổ sung 2,4 – D - Xà phịng bột - Cồn 70o, 90o - Javel THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 11 Trang
  12. - NAA - BA 2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhĩm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng 1 - Dao mổ cái 15 2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn 3 - Ống đong: 100 ml cái 12 4 - Ống đong 500 ml cái 3 5 - Đũa khuấy cái 15 6 - Cốc 500 ml cái 15 7 - Quả bĩp cao su cái 15 8 - Cốc 1000 ml cái 5 9 - Cốc 100 ml cái 30 10 - Cốc 200 ml cái 15 11 - Pipett: 1 ml cái 5 12 - Pipett: 5 ml cái 5 13 - Pipett: 10 ml cái 5 14 - Erlen 250ml cái 60 15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15 16 - Bơng mỡ g 200 17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15 18 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15 19 - Đèn cồn cái 15 Tủ cấy cĩ quạt thổi khí vơ 20 - Tủ cấy vơ trùng cái 1 trùng 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH - Sinh viên tiến hành cắt đốt thân cúc, thực hiện xác định cơng thức khử trùng. Nuơi cấy thân cúc trên mơi trường MS bổ sung. - Sinh viên tiến hành khử trùng, tách vỏ và nuơi cấy hạt cam trên mơi trường MS. 4 - THỰC HÀNH 4.1 - Khử trùng và nuơi cấy thân cúc cắt đốt a. Khử trùng THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 12 Trang
  13. - Lựa cây cúc cịn tươi, non, lá ít bị dập. Dùng dao cắt bỏ hoa và gốc. Cắt lấy một đoạn cách gốc 1015 cm. - Rửa sạch đoạn thân cúc dưới vịi nước máy. - Cắt thành những đoạn nhỏ. Cắt ở giữa hai chồi ngủ. Mỗi đoạn cĩ một chồi ngủ. - Lắc các đoạn trong nước xà phịng từ 1015 phút. - Rửa sạch xà phịng dưới vịi nước máy. - Lắc với cồn 70o trong 1 phút. - Lắc với dung dịch javel/nước ở các tỷ lệ 1/9, 2/8, 3/7, 4/6, 1/1. - Rửa sạch javel bằng nước cất vơ trùng 56 lần. b. Nuơi cấy - Thân cúc sau khi khử trùng được nuơi cấy trên mơi trường MS bổ sung BA và NAA với tỷ lệ NAA/BA <1. - Cắm thân cúc vào mơi trường sao cho chồi ngủ vẫn nằm trên bề mặt mơi trường . 4.2 - Khử trùng và nuơi cấy hạt cam a. Khử trùng hạt - Rửa hạt cam dưới vịi nước máy. - Lắc hạt với nước xà phịng 1015 phút. - Rửa sạch xà phịng bằng nước máy. - Lắc với cồn 70o trong 30 giây. - Rửa sạch cồn bằng nước cất vơ trùng 56 lần. b. Tách vỏ hạt - Đặt hạt cam lên trên giấy cấy. Dùng kẹp giữ hạt. - Dùng dao mổ cắt hai đường dọc theo chiều dài hạt. Hai đường này đối diện nhau. Lưỡi dao chỉ vừa đủ cắt rách lớp vỏ, khơng chạm vào phần thịt hạt. - Dùng dao và kẹp tách bỏ lớp vỏ cứng (vỏ trấu) và vỏ lụa bên ngồi. - Hạt cam là hạt đa phơi, khi tách các phơi cĩ thể tách rời nhau. Ta vẫn cĩ thể dùng những mảnh phơi để nuơi cấy, mỗi mảnh phơi sẽ phát triển thành một cây cam. c. Nuơi cấy - Đặt ngang hạt cam trên mơi trường MS. - Dùng kẹp đè nhẹ hạt lên bề mặt mơi trường sao cho ½ hạt nhập vào mơi trường - Đặt bình nuơi cấy trong điều kiện ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 25oC. 5 - BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH 1. Phương pháp lựa chọn cơng thức khử trùng. 2. Tại sao phải tách vỏ ngồi (vỏ trấu), vỏ lụa hạt cam trước khi nuơi cấy? 3. Nếu để bình nuơi cấy hạt cam trong điều kiện khơng cĩ ánh sáng, phơi cĩ nảy mầm phát triển được khơng? Giải thích? THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 13 Trang
  14. BÀI 4 VI NHÂN GIỐNG DỨA BẰNG NUƠI CẤY CHỒI NGỦ 1 - NGUYÊN TẮC Đối với một số cây như tre, mía, dứa, phương pháp nhân giống vẫn thường được sử dụng hiện nay trong nơng nghiệp là nhân giống truyền thống bằng chồi nách, chồi ngầm, thân ngầm, giâm hom Tuy nhiên đặc điểm chung của các phương pháp này là hệ số nhân giống thấp, khơng đáp ứng được nhu cầu về cây giống để mở rộng sản xuất. Trước nhu cầu của việc mở rộng sản xuất, trong một số năm gần nay để nhân giống dứa thường tiến hành bằng nuơi cấy chồi ngủ (phương pháp nhân cụm chồi). Ưu điểm của phương pháp này là tốc độ nhân giống cao, hệ số nhân giống lớn. Đặc điểm của phương pháp này là chồi ngủ được tách từ cụm chồi ngủ ở ngọn dứa, sau đĩ được nuơi cấy tạo cụm chồi trên mơi trường in vitro. Các chồi cĩ hình dạng giống như vảy cá hoặc hạt gạo nằm ép sát vào thân (lõi), cĩ màu trắng. Mỗi chồi được tách riêng để nuơi cấy để tạo thành cụm chồi. 2 - VẬT LIỆU – HỐ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 - Vật liệu Chồi ngủ được tách từ ngọn dứa dùng làm vật liệu nuơi cấy. 2.2 - Hố chất - Cồn 70o, 90o - Mơi trường MS bổ sung NAA, BA - Javel - Xà phịng bột 2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhĩm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng 1 - Dao mổ cái 15 2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn 3 - Ống đong: 100 ml cái 12 4 - Ống đong 500 ml cái 3 5 - Đũa khuấy cái 15 6 - Cốc 500 ml cái 15 7 - Quả bĩp cao su cái 15 8 - Cốc 1000 ml cái 5 9 - Cốc 100 ml cái 30 10 - Cốc 200 ml cái 15 THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 14 Trang
  15. Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng 11 - Pipett: 1 ml cái 5 12 - Pipett: 5 ml cái 5 13 - Pipett: 10 ml cái 5 14 - Erlen 250ml cái 60 15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15 16 - Bơng mỡ g 200 17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15 18 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15 19 - Đèn cồn cái 15 Tủ cấy cĩ quạt thổi khí vơ 20 - Tủ cấy vơ trùng cái 1 trùng 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH - Học sinh tiến hành tách bỏ lá ở các ngọn dứa để thu chồi ngủ. - Các chồi ngủ được tách rời, nuơi cấy trên mơi trường MS bổ sung NAA và BA. 4 - THỰC HÀNH 4.1 - Phương pháp khử trùng chồi ngủ dứa - Tách bỏ tồn bộ các lá ở phần ngọn dứa. Tách lần lượt các lá từ dưới lên trên, từ ngồi vào trong để trách làm tổn thương các chồi ngủ. - Tách rời phần cùi (lõi) cĩ mang chồi ngủ. - Rửa nhẹ nhàng cùi dứa dưới vịi nước máy, tránh làm tổ thương các chồi ngủ. - Dùng dao cắt lấy bốn mặt của cùi dứa cĩ mang chồi ngủ. - Lắc nhẹ nhàng các mảnh cĩ mang chồi ngủ này trong nước xà phịng trong 10 phút. - Rửa sạch nước xà phịng dưới vịi nước máy. - Lắc các mảnh mơ dứa trong cồn 700 trong 2 phút. - Khử trùng với nước javel (tỷ lệ 3:7) trong 7 phút. - Rửa sạch lại bằng nước cất vơ trùng 5÷6 lần. THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 15 Trang
  16. Hình 1. Cắt các mặt cĩ mang chồi ngủ từ cùi dứa 4.2 - Phương pháp nuơi cấy - Dùng dao mổ cắt những đường dọc, ngang tách rời từng chồi ngủ muốn lấy. - Cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mơ dứa cĩ mang chồi ngủ tạo thành hình tháp. - Cắm phần đầu hình tháp ngập vào mơi trường nuơi cấy. - Đặt các bình nuơi cấy trong điều kiện ánh sáng 3000 lux, ở nhiệt độ 25oC. 4.3 - Phương pháp tạo cụm chồi Sau thời gian nuơi cấy từ 20-30 ngày các chồi được cấy chuyền sang mơi trường nuơi cấy để tạo cụm chồi. Mơi trường nuơi cấy cĩ nồng độ chất điều hồ sinh trưởng NAA 1mg/lít, BA 0,1mg/lít. Sau 30-40 ngày, các chồi nhỏ xuất hiện ở phía gốc chồi. Số lượng các chồi nhỏ tăng dần lên, sắp xếp chồng chất lên nhau thành một cụm chồi (thường là sau 3-4 tháng nuơi cấy). Các chồi nhỏ được tách và chuyển sang mơi trường tái sinh cây hồn chỉnh. Điều kiện nuơi cấy để tạo cụm chồi dứa: cường độ ánh sáng 4000 lux, thời gian chiếu sáng 10-14 giờ/ngày, nhiệt độ 25-270C. Hình 2. Cách cắt rời chồi ngủ dứa 5 - BÀI TƯỜNG TRÌNH 1. Trình bày những điểm cần lưu ý khi tách chồi ngủ dứa 2. Trình bày quy trình nhân giống dứa bằng chồi ngủ. 3. Tại sao phải cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mơ dứa cĩ mang chồi ngủ? THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 16 Trang
  17. BÀI 5 PHƯƠNG PHÁP NUƠI CẤY TẠO MƠ SẸO THỰC VẬT 1 - NGUYÊN TẮC Trong đặc tính sinh lý của cơ thể thực vật, khi bị những tổn thương về mặt vật lý (những vết cắt trên cơ thể, những tổn thương do cơn trùng tấn cơng) thực vật cĩ khả năng hình thành những tế bào mới để hàn kín những chỗ tổn thương đĩ. Những tế bào mới được hình thành đĩ là tế bào mơ sẹo. Mơ sẹo là một khối tế bào nhu mơ phát triển vơ tổ chức, hiện diện trong các giai đoạn hố lignin khác nhau của thực vật, thường do các tế bào trong vùng tượng tầng (vùng phân sinh) như tượng tầng liber –mộc, tượng tầng vỏ ở gốc của đoạn cắt tạo thành. Những tế bào mơ sẹo thường cĩ hình cầu, màu trắng hoặc nâu nhạt. Khối mơ sẹo cĩ khả năng tái sinh thành cây hồn chỉnh trong điều kiện mơi trường khơng cĩ chất kích thích sinh trưởng tạo mơ sẹo. Nuơi cấy tạo mơ sẹo được thực hiện đối với các lồi thực vật khơng cĩ khả năng nhân giống thơng qua nuơi cấy đỉnh sinh trưởng. Những mơ của thực vật cĩ thể dùng nuơi cấy tạo mơ sẹo là: tượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phơi nhũ, tế bào diệp nhục, lá, trụ bì rễ, tử diệp Cây tái sinh từ mơ sẹo cĩ đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào mơ sẹo cĩ thể tái sinh cho cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuơi cấy đỉnh sinh trưởng. A B Hình 3. Sự tái sinh chồi từ mơ sẹo. A: Mơ sẹo, B: Chồi tái sinh. Mơ sẹo thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ. Do đĩ, cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ tạo mơ sẹo. Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành khơng cĩ khả năng tạo mơ sẹo. Sự tạo mơ sẹo ở thực vật xảy ra khi mơi trường nuơi cấy được bổ sung một lượng auxin (2,4-D) thích hợp. Sự tạo mơ sẹo do tác dụng của auxin do 3 quá trình: - Sự phản phân hố của tế bào nhu mơ: xảy ra ở các tế bào nhu mơ mộc và libe, nhu mơ vỏ hay lõi. THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 17 Trang
  18. - Sự phân chia của các tế bào tượng tầng: các tế bào bào tượng tầng của phần lớn cây hai lá mầm dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin. - Sự xáo trộn của các mơ phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ). 2 - VẬT LIỆU – HỐ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 - Vật liệu Hạt thuốc lá (Nicotiana tabacum) được gieo trên mơi trường MS. Sử dụng các cây con làm vật liệu thí nghiệm. 2.2 - Hố chất - Cồn 70o, 90o - Mơi trường MS bổ sung 2,4 - D 2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhĩm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng 1 - Dao mổ cái 15 2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn 3 - Ống đong: 100 ml cái 12 4 - Ống đong 500 ml cái 3 5 - Đũa khuấy cái 15 6 - Cốc 500 ml cái 15 7 - Quả bĩp cao su cái 15 8 - Cốc 1000 ml cái 5 9 - Cốc 100 ml cái 30 10 - Cốc 200 ml cái 15 11 - Pipett: 1 ml cái 5 12 - Pipett: 5 ml cái 5 13 - Pipett: 10 ml cái 5 14 - Erlen 250ml cái 60 15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15 16 - Bơng mỡ g 200 17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15 18 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15 19 - Đèn cồn cái 15 Tủ cấy cĩ quạt thổi khí vơ 20 - Tủ cấy vơ trùng cái 1 trùng THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 18 Trang
  19. 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH - Học sinh tiến hành cắt đốt thân, mảnh lá, đoạn rễ cây thuốc lá để nuơi cấy tạo mơ sẹo, những đoạn cĩ mang chồi ngủ được nuơi cấy tái sinh cây. - Các thành phần này được nuơi cấy trên mơi trường MS bổ sung 2,4 – D. 4 - THỰC HÀNH 4.1 - Vật liệu nuơi cấy a. Mơ cấy từ cây thuốc lá tạo ra qua nuơi cấy hạt - Tiến hành khử trùng hạt thuốc lá. - Nuơi cấy hạt thuốc lá trong mơi trường MS. - Bình nuơi cấy được đặc trong điều kiện tối, nhiệt độ 250C cho nảy mầm. - Cây con được nuơi cấy trong điều kiện cĩ ánh sáng. - Sau 15-20 ngày nuơi cấy, khi cây cĩ từ 6-8 lá, cao khoảng 10-15cm, cĩ thể sử dụng là nguyên liệu cho nuơi cấy mơ sẹo b. Mơ cấy từ cây thuốc lá mọc ngồi tự nhiên Cây thuốc lá mọc ngồi tự nhiên cĩ sức tăng trưởng mạnh, khả năng hình thành mơ sẹo rất lớn. Những mơ đặt cấy lấy từ cây thuốc lá mọc ngồi tự nhiên phải trải qua giai đoạn vơ trùng mẫu để loại bỏ hết nấm, khuẩn tồn tại trong và trên mẫu cấy. 4.2 - Chuẩn bị mẫu cấy a. Cắt đốt thân - Dùng kẹp gắp một cây thuốc lá trong bình nuơi cấy đặt lên giấy cấy. - Dùng dao mổ cắt rời tất cả lá, rễ ra khỏi thân. - Cắt thân thuốc lá thành những đoạn nhỏ, mỗi đoạn là một đốt thân. Từ các đốt này, tiếp tục chia nhỏ thành các đoạn, mỗi đoạn cĩ kích thước khoảng 0,2 – 0,4 cm. Các đoạn nhỏ này được nuơi cấy tạo mơ sẹo. - Điều lưu ý khi cắt các đoạn thân là phải bỏ tất cả các phần mắt của đốt. Các phần này khơng cĩ khả năng tạo sẹo, chỉ cĩ thể được sử dụng để nuơi cấy tạo chồi. b. Cắt mảnh lá - Từ các lá ở phần trên, sử dụng dao mổ cắt bỏ gân chính và rìa lá. - Các phần lá này được cắt thành các mảnh nhỏ cĩ kích thước 0,2 x 1 cm. - Các mảnh lá này được nuơi cấy tạo mơ sẹo. c. Cắt đoạn rễ - Sau khi cắt các đoạn thân, lá, phần rễ cịn lại được rửa sạch agar trong nước cất vơ trùng. - Dùng dao cắt rễ thành các đoạn nhỏ cĩ kích thước 0,2 - 0,4 cm. Các đoạn này được nuơi cấy tạo mơ sẹo. THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 19 Trang
  20. A B C Hình 4. Phương pháp cắt mảnh lá (A), đốt thân (B), đoạn rễ (C) 4.3 - Nuơi cấy tạo mơ sẹo a. Nuơi cấy thân, lá - Dùng kẹp gắp các đoạn thân mảnh lá cấy trên mơi trường MS bổ sung 2,4-D. - Khoảng cách giữa các đoạn thân, mảnh lá là 1cm. Tránh cấy quá dày. - Sử dụng mơi trường MS bổ sung 2,4-D cĩ nồng độ là 1µmol/lít mơi trường. b. Nuơi cấy đoạn rễ - Các đoạn rễ được nuơi cấy trên mơi trường MS bổ sung 2,4-D cĩ nồng độ 0,1 µmol/lít mơi trường. Những khối mơ sẹo hình thành qua quá trình nuơi cấy cĩ thể được tách ra và chuyển sang nuơi cấy cĩ nồng độ 2,4-D giảm (0,05µmol/lít mơi trường) để tiếp tục phân chia tạo thành những khối mơ sẹo mới. Thời gian cấy chuyền giữa các lần nuơi cấy là 4-6 tuần. Khối mơ sẹo cũng cĩ thể được cho tái sinh thành cây nếu mơi trường nuơi cấy loại bỏ 2,4-D và bổ sung BA vào. 5. BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH 1. Khái niệm mơ sẹo? Nguyên nhân của việc hình thành mơ sẹo ở thực vật? 2. Vai trị của auxin đối với việc hình thành mơ sẹo ở thực vật. Nồng độ thích hợp nhất kích thích tạo mơ sẹo từ thân, lá, rễ cây thuốc lá. 3. Phương pháp cắt đốt thân, đoạn rễ, mảnh lá để tạo mơ sẹo ở cây thuốc lá. THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 20 Trang
  21. BÀI 6 KỸ THUẬT TẠO ÁO BAO HẠTGIỐNG NHÂN TẠO 1 - Ý NGHĨA Ở một số loại thực vật như mía, khoai tây, khoai mìm dâu tây đều khơng cĩ khả năng nhân giống bằng hạt. Bên cạnh đĩ cĩ nhiều loại thực vật tạo được hạt giống nhưng hạt giống kém chất lượng hay hạt giống rất đắt. Để giải quyết tất cả các vấn đề trên, một phương pháp nhân giống mới được nghiên cứu và ứng dụng đĩ là phương pháp tạo hạt nhân tạo. Hạt giống nhân tạo về cơ bản giống như hạt giống tự nhiên. Chỉ cĩ sự khác nhau là hạt giống nhân tạo cĩ cấu tạo là phơi được bao bọc bởi lớp áo bên ngồi thay cho nội nhũ, vỏ và phơi ở hạt nhân tạo là phơi vơ tính (phơi soma) (hình 1). Hạt giống nhân tạo gồm 3 phần (hình 2): - Phơi vơ tính - Vỏ bọc polymer như alginat - Màng ngồi: được cấu tạo từ alginat canxi Phơi soma ở hạt nhân tạo giống như phơi hợp tử ở hạt tự nhiên là cĩ hai cực (đỉnh chồi và đỉnh rễ), như thế cĩ thể phát triển thành một cây hồn chỉnh tương tự như hạt nảy mầm. Cấu trúc phơi soma giống như phơi hợp tử nhưng phơi soma của hạt giống nhân tạo khơng cĩ vỏ bao hạt cũng như mơ dự trữ. Hình 5 - So sánh cấu trúc hạt tự nhiên và hạt nhân tạo THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 21 Trang
  22. Nội Phôi nhũ soma nhân tạo Vỏ nhân tạo Hình 6 - Cấu tạo hạt nhân tạo Hạt nhân tạo thườmg cĩ vỏ làm bằng alginat Na và alginat Ca hay B-hydrogel. Alginat Na là một chất cao phân tử được chiết suất từ rong biển (rong Mơ Sargassum sp là một loại rong nâu). Trong rong Mơ alginat Na tồn tại dưới dạng alginit khơng tan là hợp chất của các axid manuronic. Để chiết tách alginat , thường tiến hành nấu rong với Na2CO3. [(C5H7O4COO)2Ca]n + nNa2CO3 2[C5H7O4COONa]n + nCaCO3 Alginat Ca Alginat Na Alginat Na là dạng tan trong nước. Khi Alginat Na tiếp xúc với dung dịch CaCl2, xảy ra phản ứng trao đổi ion giữa hai dung dịch này theo phản ứng: 2[C5H7O4COONa]n + nCaCl2 [(C5H7O4COO)2Ca]n + 2nNaCl Alginat Na Alginat Ca Ở dạng này, alginat Ca kết tủa, trở thành dạng khơng tan, tạo thành màng khơng thấm nước. Tồn bộ bề mặt của gịot hỗn hợp trên sẽ được bao bọc bằng một lớp áo alginat Ca khơng thấm nước và tạo thành một hạt. Phần alginat Na bên trong vẫn ở trạng thái tan. Vỏ hạt nhân tạo được tạo ra theo nguyên tắc này. Hạt nhân tạo cĩ thể bảo quản, tồn trữ và trồng trọt bằng những kỹ thuật canh tác truyền thống. Và đặc biệt là cĩ thể chủ động trong sản xuất, trồng trọt, canh tác khơng phụ thuộc vào các điều kiện thời tiết, mùa vụ. Trong bài thực hành này, chúng ta sẽ tìm hiểu kỹ thuật tạo áo bao cho phơi vơ tính để cấu thành một hạt giống nhân tạo hồn chỉnh. 2 - NGUYÊN LIỆU - HỐ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 - Nguyên liệu, hố chất Đơn vị Số STT Tên hố chất, phụ liệu Ghi chú tính lượng 1 Alginat Na 4% ml 100 2 Mơi trường MS ml 1000 THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 22 Trang
  23. Đơn vị Số STT Tên hố chất, phụ liệu Ghi chú tính lượng 3 CaCl2 2,5% ml 300 4 Nước cất ml 500 5 Giấy lọc gĩi 1 6 Phơi vơ tính 2.2 - Dụng cụ, thiết bị cần cho một nhĩm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng 1 Bình chiết 500ml cái 2 Tạo giọt nhỏ 2 Pipette 10 ml cái 2 Hút và chuyển phơi 3 Kẹp gắp 25cm cái 2 Gắp hạt 4 Phễu lớn cái 2 5 Erlen 500ml cái 2 6 Erlen 250 cái 2 7 Quả bĩp cao su cái 2 8 Đồng hồ cá nhân cái 2 9 Đĩa petri cái 2 10 Cốc 1000 ml cái 2 11 Cốc 250ml cái 2 3. NỘI DUNG THỰC HÀNH - Học sinh tiến hành nhỏ giọt và chuyển phơi tạo hạt - Học sinh thực hiện ngâm hạt trong dung dịch CaCl2 và nước để tạo hạt hồn chỉnh 4 – THỰC HÀNH 4.1 – Tạo giọt nhỏ - Hồ tan 100 ml Alginat Na 4% vào 1 lít mơi trường MS cĩ chứa các muơi khống, đường, vitamin, các chất sinh trưởng. Cho hỗn hợp này vào bình chiết. - Mở khố nhỏ giọt của bình chiết, nhỏ từng giọt nhẹ nhàng hỗn hợp này vào một cốc dung dịch CaCl2 2,5%. Mỗi lần nhỏ, khi giọt dung dịch vừa lĩ ra ở đầu ống nhỏ giọt của bình chiết, vặn khố lại để dừng giọt dung dịch ở đầu ống nhỏ giọt 4.2 – Chuyển phơi và tạo hạt - Dùng pipette hút một phơi trong dung dịch MS chuyển vào trong giọt nhỏ đang dừng ở đầu bình chiết. - Mở khố bình chiết để giọt cĩ chứa phơi nhỏ vào trong erlen đựng CaCl2. THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 23 Trang
  24. - Ngâm hạt này trong dung dịch CaCl2 20 phút, cĩ thể lắc nhẹ erlen. 4.3 – Rửa và làm khơ hạt - Sau 20 phút, dùng kẹp gắp hạt nhân tạo sang một cốc đựng nước cất. Hạt được ngâm nước 5 phút để làm cứng và ngăn chận phản ứng. - Sau 5 phút, dùng kẹp chuyển hạt ra một đĩa petri cĩ lĩt giấy lọc để làm khơ hạt. - Hạt sau khi được làm khơ cĩ thể được bảo quản hay sử dụng cho gieo trồng trực tiếp. Hỗn hợp alginat Na 4 % và môi trường MS Chuyển phôi vào giọt nhiểu Tạo màng bao alginat Ca trong 20 phút Ngâm nước và thu hạt nhân tạo Hình 7. Kỹ thuật tạo áo bao hạt giống nhân tạo 5 - NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Tất cả mọi cơng việc tạo áo bao hạt nhân tạo đều phải được thực hiện trong tủ cấy vơ trùng - Việc vặn khố của bình cầu nhỏ giọt phải thực hiện cẩn thận để cĩ thể giữ được giọt dung dịch ở đầu ống. - Thao tác chuyên phơi vào giọt nhỏ thực hiện nhẹ nhàng để khơng làm rơi giọt dung dịch. - Thời gian ngâm hạt phải chính xác 20 phút. 6. TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM - Làm tường trình thí nghiệm - Giải thích nguyên tắc tạo áo bao hạt giống nhân tạo - So sánh giữa vỏ hạt giống từ nhiên và hạt giống nhân tạo - Nêu ý nghĩa và cách bảo quản hạt giống nhân tạo THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 24 Trang
  25. BÀI 7 PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ NUƠI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG 1 - NGUYÊN TẮC Mơ phân sinh đỉnh chứa những tế bào đỉnh sinh trưởng, được bao bọc bởi một lớp vỏ bề mặt cĩ cấu tạo cutin hạn chế thấp nhất quá trình mất nước và lớp cutin này bao bọc cả chồi đỉnh. Ở thực vật, sự hình thành mới các cơ quan bắt đầu trong các mơ phân sinh đỉnh, các mơ này phân hố ngay từ những giai đoạn phát triển đầu của phơi và giữ lại trong suốt đời sống của cây. Điều này xảy ra là do mơ phân sinh cĩ sự phân hố của những tế bào khởi sinh. Tất cả các tế bào cịn lại đều xuất phát từ các tế bào khởi sinh. Quá trình sinh trưởng của cơ quan diễn ra theo 3 giai đoạn: - Giai đoạn thứ nhất: thường được gọi là giai đoạn phơi sinh. Trong các điểm sinh trưởng (trong các mơ phân sinh đỉnh) xảy ra sự hình thành mầm cơ quan và sự phân chia đầu tiên của nĩ thành các mơ riêng biệt. - Giai đoạn thứ hai: giai đoạn dài ra do sự sinh trưởng nhanh chĩng, mầm cơ quan đạt đến kích thước tối đa và trở nên cĩ hình dạng nhất định. - Giai đoạn thứ ba: giai đoạn kết thúc sự phân hĩa tế bào, bắt đầu sự hố gỗ các thành tế bào, xuất hiện ở trên đĩ những chỗ dầy lên cĩ cấu tạo và kết quả là khơng cịn khả năng tiếp tục sinh trưởng. Ở mỗi nách lá đều cĩ chồi nách. Chồi nách thực chất cĩ cấu tạo khơng khác đỉnh sinh trưởng của thân. Do hiện tượng ưu thế ngọn, chồi nách khơng phát triển, nhưng khi được đánh thức và bắt đầu sinh trưởng, chúng cĩ cấu tạo lá đầy đủ như thân chính. Quá trình sinh tổng hợp DNA của virus thực vật khơng xảy ra trong tế bào đỉnh sinh trưởng do một cơ chế hiện nay khơng rõ. Vì vậy mơ đỉnh sinh trưởng là mơ duy nhất sạch virus. Do đĩ trong kỹ thuật nuơi cấy mơ tế bào, mơ đỉnh sinh trưởng được sử dụng là vật liệu nuơi cấy mơ tế bào nhằm tạo các cây khơng nhiễm virus và các loại vi khuẩn hay nấm gây bệnh. Nuơi cấy đỉnh sinh trưởng là phương pháp nhân giống quan trọng vừa tạo ra những loại cây trồng sạch vius vừa cĩ hệ số nhân giống rất cao. Phương pháp này đã áp dụng hiệu quả đối với cây thân thảo như cúc, cẩm chướng, khoai tây, khoai lang, chuối THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 25 Trang
  26. Hình 8. Đỉnh sinh trưởng 2 - VẬT LIỆU –HỐ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 - Vật liệu - Cây hoa Dạ Yên Thảo (Petunia sp) 2.2 - Hố chất - Cồn 70o, 90o - Mơi trường MS bổ sung BA - Xà phịng bột - Cồn 70o, 90o - Javel - BA 2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhĩm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng 1 - Dao mổ cái 30 2 - Lưỡi dao mổ cái 30 Dùng lưỡi dao mổ nhọn 3 - Ống đong: 100 ml cái 12 4 - Ống đong 500 ml cái 3 5 - Đũa khuấy cái 15 6 - Cốc 500 ml cái 15 7 - Quả bĩp cao su cái 15 THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 26 Trang
  27. Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng 8 - Cốc 1000 ml cái 5 9 - Cốc 100 ml cái 30 10 - Cốc 200 ml cái 15 11 - Erlen 250ml cái 60 12 - Kẹp dài 25 cm Cái 15 13 - Bơng mỡ g 200 14 - Ống nghiệm þ25 cái 15 15 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15 16 - Đèn cồn cái 15 17 - Kính lúp hai mắt cái 1 Cĩ đèn rọi từ trên xuống 18 - Đĩa petri 100mm cái 1 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH - Sinh viên tiến hành tách đỉnh sinh trưởng cây hoa Dạ yên Thảo. - Sinh viên tiến hành cấy và nuơi đỉnh sinh trưởng vừa tách trên mơi trường MS 4 - THỰC HÀNH 4.1 - Khử trùng mẫu tách đỉnh sinh trưởng Chọn cây mẹ trưởng thành cĩ phẩm chất tốt (lá khơng bị sâu, thân khơng bị dập, chồi ngọn và chồi ngủ phát triển tốt) hái búp non dài 2 ÷ 3 cm, cho vào chai hay túi nilon kín, chuyển về phịng thí nghiệm. - Dùng dao mổ cắt bỏ bớt lá. - Khử trùng mẫu lần lượt với nước xà phịng lỗng, cồn và NaOCl 0,5% trong 5 phút. Rửa mẫu với nước cất vơ trùng, làm ráo để chuẩn bị tách đỉnh sinh trưởng. 4.2 - Tách đỉnh sinh trưởng Phương pháp nuơi cấy đỉnh sinh trưởng sử dụng phần nhỏ nhất ở chồi đỉnh của thân làm mẫu nuơi cấy. Phần này gồm mơ phân sinh và vài phác thể lá. Việc tách và nuơi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm tạo các cây sạch bệnh. Mẫu cấy càng nhỏ khả năng tạo cây sạch bệnh càng cao. Ví dụ, mơ phân sinh từ 0,1 đến 0,15 mm cĩ thể cĩ 100% sạch virus. Tuy nhiên mẫu cành nhỏ khả năng sống sĩt càng thấp. Do vậy người ta thường sử dụng mẫu cấy từ 0,25 đến 1 mm. - Đỉnh sinh trưởng được tách dưới kính lúp cĩ độ phĩng đại từ 10 đến 40 lần được làm vơ trùng bằng cách lau cồn thật sạch thân kính và bàn để mẫu tách. Trong quá trình tách luơn chuẩn bị một tấm bơng tẩm cồn trên bàn mang mẫu để tiện việc vơ trùng và làm nguội dao. - Dùng hai dao mổ thật sắc để thao tác tách đỉnh sinh trưởng. THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 27 Trang
  28. - Gắp mẫu lên bàn đặt mẫu, dùng mũi dao mổ tách bỏ hết những lá ngồi, chỉ để lại hai lá nguyên thủy. Tách các lá lần lượt từ ngồi vào trong, trách để lưỡi dao làm tổn thương phần chồi đỉnh. - Sau khi tách bỏ hết các là ngồi, dùng mũi dao mổ nhọn cắt lấy phần đỉnh sinh trưởng cĩ hai phác thể lá cĩ kích thước 0,6mm. Giữ nguyên đỉnh sinh trưởng trên mũi dao để chuyển vào mơi trường nuơi cấy. 4.3 - Nuơi cấy đỉnh sinh trưởng Đối với những loại cây tiết nhiều phenol thường nên được nuơi cấy trên mơi trường cĩ bổ sung than hoạt tính. Mơi trường nuơi cấy đỉnh sinh trưởng Dạ Yên Thảo thường bổ sung BA 2mg/lít, NAA 0,1mg/lít. Mơi trường cĩ thể là đặc hoặc lỏng (cĩ cầu giấy). - Đỉnh sinh trưởng sau khi tách xong để nguyên trên lưỡi dao mổ. - Đưa lưỡi dao mổ vào mơi trường nuơi cấy, đâm xuyên lưỡi dao mổ vào bề mặt mơi trường, đỉnh sinh trưởng sẽ được giữ ngay ngắn trên bề mặt mơi trường nuơi cấy. - Đỉnh sinh trưởng được nuơi cấy ở nhiệt độ 250C , ánh sáng 3000 lux. Nếu đỉnh sinh trưởng tiết nhiều phenol thì nên cấy chuyền liên tục trong quá trình nuơi cấy. 5 - BÀI TƯỜNG TRÌNH 1. Ý nghĩa của phương pháp nuơi cấy đỉnh sinh trưởng? 2. Nếu đặt đỉnh sinh trưởng khơng ngay ngắn lên mơi trường (mặt cắt khơng tiếp xúc được với bề mặt mơi trường) đỉnh sinh trưởng cĩ tăng trưởng được khơng? Giải thích? 3. Để loại bỏ virus ở cây trồng, thường cĩ những phương pháp gì? THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 28 Trang
  29. BÀI 8 PHƯƠNG PHÁP VI GHÉP Ở THỰC VẬT 1 - NGUYÊN TẮC Nuơi cấy đỉnh sinh trưởng là một phương pháp nhân giống quan trọng nhằm thu được một số lượng lớn cây giống và cây sạch bệnh virus. Tuy nhiên đối với một số loại thực vật, đặc biệt là cây thân gỗ, đỉnh sinh trưởng rất khĩ cĩ thể sinh trưởng trên mơi trường nhân tạo. Do vậy đối với những loại cây này, vi ghép là một phương pháp quan trọng cĩ thể áp dụng. Mặt khác, việc làm sạch bệnh virus cho cây trồng, đặc biệt cây ăn quả cĩ múi thuộc họ cam chanh đang là nhu cầu lớn đối với nhiều nơi trên thế giới. Trong khi chưa tạo được những giống kháng virus thì việc tạo ra những khu vực cây mẹ sạch virus để cung cấp mắt ghép và cành chiết đầu dịng là cần thiết. Bên cạnh những biện pháp tẩy virus như cấy mơ xử lý nhiệt, tạo cây trong nuơi cấy phơi tâm phương pháp nuơi cấy đỉnh sinh trưởng đang được áp dụng rộng rãi và cĩ hiệu quả vào việc làm sạch virus đối với nhiều cây trồng khác nhau. Trong trường hợp cây ăn quả lâu năm, kỹ thuật ghép đang chiếm vị trí hàng đầu trong nhân giống vì kết hợp được khả năng chống chịu của gốc cây hoang dã với ưu điểm năng suất và phẩm chất của mắt ghép. Tuy nhiên, trong lúc ghép theo kỹ thuật truyền thống do thời gian trồng gốc ghép kéo dài và kích thích mắt ghép khá lớn, nên bệnh virus cĩ thể lây truyền. Để khắc phục những nhược điểm trên, kỹ thuật ghép đỉnh sinh trưởng gọi tắt là vi ghép được thử nghiệm và mang lại kết quả tốt. Về nguyên tắc, vi ghép là nuơi cấy đỉnh sinh trưởng, nhưng thơng qua dinh dưỡng tự nhiên của gốc ghép. Đỉnh sinh trưởng làm mắt ghép cĩ kích thước 0,2÷0,5 mm, được tách từ búp non đang sinh trưởng mạnh của cây mẹ trưởng thành, gốc ghép là mầm giá mới nảy từ hạt của giống hoang dại, tồn bộ cây ghép được nuơi dưỡng trong điều kiện ống nghiệm vơ trùng. Những cây ghép thu được bằng phương pháp này hồn tồn sạch bệnh và mang đặc điểm di truyền của cây mẹ cho mắt ghép. 2 - VẬT LIỆU –HỐ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 - Vật liệu - Cây cam nuơi cấy từ hạt trong ống nghiệm là nguyên liệu dùng làm gốc để vi ghép. - Cành cam lấy từ cây cam cĩ chất lượng quả cao được sử dụng làm nguyên liệu để tách đỉnh sinh trưởng. 2.2 - Hố chất - Cồn 70o, 90o - Mơi trường MS bổ sung BA - Xà phịng bột - Javel - BA, NAA THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 29 Trang
  30. 2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhĩm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng 1 - Dao mổ cái 30 2 - Lưỡi dao mổ cái 30 Dùng lưỡi dao mổ nhọn 9 - Cốc 100 ml cái 30 10 - Cốc 200 ml cái 15 11 - Erlen 250ml cái 15 12 - Kẹp dài 25 cm Cái 15 13 - Bơng mỡ g 200 14 - Ống nghiệm þ25 cái 15 15 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15 16 - Đèn cồn cái 15 Kính lúp cĩ đèn rọi từ trên 17 - Kính lúp 2 mắt cái 15 xuống 18 - Đĩa petri 100mm cái 1 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH - Sinh viên tiến hành tách đỉnh sinh trưởng cây cam nuơi cấy trong ống nghiệm. - Sinh viên tiến hành ghép đỉnh sinh trưởng vừa tách vào gốc ghép. 4 - THỰC HÀNH 4.1 - Chuẩn bị gốc ghép Tách hạt cam từ quả chín, rửa sạch và để khơ trong vịng 24 giờ, cất giữ trong tủ lạnh ở 4oC, dùng dần. - Hạt được khử trùng 5÷10 phút bằng dung dịch HgCl 0,1%. - Tiến hành tách bỏ vỏ trấu, vỏ lụa. - Gieo hạt trên mơi trường MS chứa 2% đường và 0,8% agar để ở 25oC nơi tối hồn tồn, sau 10 ngày cây mầm dài 5÷8 cm được chọn làm gốc ghép. 4.2 - Tách đỉnh sinh trưởng Chọn cây mẹ trưởng thành cĩ năng suất và phẩm chất tốt, hái búp non dài1,5 ÷ 3 cm, cho vào chai hay túi nilon kín, chuyển về phịng thí nghiệm. - Cắt bỏ bớt lá, khử trùng bằng NaOCl 0,5% trong 5 phút. - Dùng kim nhọn gạt bỏ những lá non, sau đĩ dùng lưỡi dao mổ nhọn cắt đỉnh sinh trưởng 0,5 mm để nguyên trên lưỡi dao để chuyển vào vi trí ghép. 4.3 -. Tiến hành ghép THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 30 Trang
  31. Đối với gốc ghép, dùng dao mổ cắt bỏ đầu rễ, trụ trên lá mầm và hai lá mầm, để lại ở phần rễ chừng 2÷3 cm và phần thân chừng 2 cm. Tùy theo cách ghép sẽ tiến hành xử lý gốc ghép khác nhau. a. Ghép lên mặt cắt - Dùng dao mổ cắt ngang thân gốc ghép tạo thành một mặt phẳng vuơng gĩc với trục thân gốc ghép. - Dưới kính lúp, xác định vịng tượng tầng libe-mộc. Đặt mắt ghép trực tiếp lên bề mặt nhát ghép, trên vịng tượng tầng. b. Ghép chữ T ngược - Dùng đầu nhọn của lưỡi dao mổ, cắt tạo thành hình chữ T ngược trên gốc ghép cách mặt cắt bên trên khoảng 0,1-0,3cm. Vết cắt đi hết vùng vỏ của gốc ghép. Chân của chữ T là mặt cắt để dễ tiếp bộc lộc vùng tượng tầng libe-mộc. - Dùng mũi kim hay đầu dao mổ đặt đỉnh sinh trưởng vừa tách được ở trên vào mặt cắt của chữ T (chân của chữ T ngược) sao cho mặt cắt của đỉnh sinh trưởng tiếp xúc với vùng tượng tầng. c. Ghép hàm ếch - Khoét trên thân mềm cách mặt cắt 5 mm một vết lõm hình hàm ếch, chiều sâu vết lõm bằng chiều dày lớp vỏ. - Dùng kim nhọn hay đầu dao mổ nhọn đặt đỉnh sinh trưởng vừa tách vào đáy hàm ếch. Hình 9. Ba kiểu vi ghép 4.4 - Nuơi cây ghép Cây ghép được đặt vào ống nghiệm lớn (200 x 25 mm) chứa 6 ml mơi trường MS lỏng cĩ hàm lượng đường cao là 7,5%. Đặt ống nghiệm cĩ chứa cây ghép ở nhiệt độ 25oC, chiếu sáng 12 giờ/ ngày, cường độ chiếu sáng từ 3000-5000 lux. 5 - BÀI TƯỜNG TRÌNH 1. Giải thích cơ chế liên kết giữa gốc ghép và mắt ghép (đỉnh sinh trưởng)? 2. Trình bày những phương pháp vi ghép và những điểm cần lưu ý cho từng phương pháp? THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 31 Trang
  32. 3. Cĩ thể sử dụng phương pháp vi ghép cho những đối tượng cây trồng nào (cây thân gỗ, thân thảo ), giải thích? THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 32 Trang
  33. BÀI 9 PHƯƠNG PHÁP THUẦN HỐ CÂY RA VƯỜN ƯƠM 1 - NGUYÊN TẮC Sự thành cơng của một kỹ thuật nhân giống thực vật thể hiện qua số cây con sống được ngồi vườn ươm. Tỉ lệ cây nuơi cấy sống được ngồi vườn ươm phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật thuần hố. Do đĩ, việc thuần hố cây nhằm mục đích cho cây nuơi cấy thích nghi được với những điều kiện của mơi trường tự nhiên: + Nhiệt độ + Độ ẩm + Ánh sáng + Chế độ dinh dưỡng + Dịch bệnh Giữa điều kiện mơi trường bình nuơi cấy, phịng tăng trưởng và mơi trường tự nhiên (mơi trường vườn ươm) cĩ sự khác biệt căn bản về tất cả các yếu tố, do đĩ điểm cấu trúc và sinh lý giữa cây nuơi cấy cĩ sự khác biệt với cây tự nhiên. Như vậy, mục đích của việc thuần hố là chuẩn bị cho cây nuơi cấy cĩ được những tính chất như cây tự nhiên để cĩ thể thích nghi và sống được ngồi mơi trường tự nhiên. Những tính chất này được hình thành dựa trên nguyên tắc cĩ sự thay đổi dần dần các điều kiện mơi trường ngồi bình nuơi cấy để bằng được với các điều kiện mơi trường tự nhiên: - Nhiệt độ: thay đổi từ 26oC đến 32-34oC - Độ ẩm: thay đổi từ 80-90% đến 50-60% - Ánh sáng: thay đổi từ 3.000-5.000 lux đến 12.000 đến 15.000 lux - Chế độ dinh dưỡng: thay đổi từ phương thức dị dưỡng thành phương thức tự dưỡng. 2 - VẬT LIỆU –HỐ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 - Vật liệu - Cây lan Hồ Điệp đã tái sinh hồn chỉnh - Cây Bạch đàn đã tái sinh hồn chỉnh 2.2 - Hố chất, nguyên liệu - Dung dịch KMnO4: 0,5% - Giá thể hỗn hợp để ươm cây Bạch đàn - Giá thể dớn, rêu biển để ươm cây lan Hồ Điệp 2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhĩm (3 sinh viên) thực hành Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng 1 - Khay ươm cái 1 THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 33 Trang
  34. Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng 2 - Thau nhựa cái 1 3 - Rổ vuơng 30x50cm cái 1 4 - Cốc 200 ml cái 1 5 - Erlen 250ml cái 1 6 - Kẹp dài 25 cm Cái 1 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH - Sinh viên tiến hành gắp cây khỏi bình mơi trường nuơi cấy, xử lý và trồng vào giá thể trên khay ươm. - Sinh viên tiến hành chăm sĩc, thay đổi các điều kiện mơi trường vườn ươm để thuần hố cây. 4 - THỰC HÀNH 4.1 – Chuẩn bị giá thể ươm cây * Giá thể ươm cây Bạch đàn - Tỉ lệ giá thể: Đất (70%) + Phân chuồng ủ hoai (10%) + tro trấu (20%) - Độ ẩm giá thể: 70% - Giá thể được xử lý tiệt trùng bằng cách hấp hoặc bằng một số loại hố chất (24 giờ trước khi trồng): + Vantox M12: 0,5% + Zinep: 0,4% + Formaline: 40% (phun 2-3 ngày trước khi trồng. * Giá thể ươm cây lan Hồ điệp - Tỉ lệ giá thể: Dớn hoặc rêu đá (60%) + Hạt xốp (40%) - Độ ẩm giá thể: 70% - Giá thể được xử lý tiệt trùng bằng cách hấp hoặc bằng một số loại hố chất (24 giờ trước khi trồng): + Vantox M12: 0,5% + Zinep: 0,4% + Formaline: 40% (phun 2-3 ngày trước khi trồng. 4.2 – Chuyển cây ra khỏi bình nuơi cấy - Bình cây nuơi cấy mơ đã mở nút đậy được 1 tuần THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 34 Trang
  35. - Dùng kẹp inox, gắp cây khỏi giá thể agar. Trách làm tổn thương lá và rễ cây nuơi cấy - Đặt cây vào thau nhựa, dùng vải mềm hoặc bơng thấm nước rửa sạch agar và dưỡng chất trên bề mặt cây. Tráng lại 3 lần bằng nước sạch. - Ngâm cây vào dung dịch KMNO4 0,5% trong 20 phút để diệt vi sinh vật. - Vớt cây vào rổ nhựa, để ráo 1-2 giờ. 4.3 -. Tiến hành trồng cây vào giá thể - Giá thể sau khi đã trộn đều theo tỉ lệ và khử trùng, được phân đều vào các lỗ của khay ươm, dùng tay nén chặt vừa phải. - Đối với cây Bạch đàn cấy mơ, dùng 1 thanh tre, soi một lỗ nhỏ vào giữa khối giá thể, đặt 1 cây con Bạch đàn vào lỗ soi và dùng tay ấn nhẹ giá thể xung quanh gốc để giữ cố định. - Đối với cây lan Hồ điệp, dùng một ít giá thể cuộn xung quanh phần rễ của cây (khơng quá cổ rễ). Đặt cây vào giữa lỗ khay ươm, chèn thêm một ít giá thể để giữ cố định. Lưu ý, tránh bĩ quá chặt hoặc làm tổn thương rễ trong quá trình trồng. 4.4 – Chăm sĩc, thuần hố cây con cấy mơ Khay ươm cây con cấy mơ được chuyển vào vườn ươm, điều kiện mơi trường được điều chỉnh như sau: - Nhiệt độ 30oC - Ánh sáng: + Một tuần đầu: ½ ánh sáng tự nhiên (7.000 lux) + Tuần thứ 2: 70% ánh sáng tự nhiên (10.000 – 12.000 lux) + Từ tuần thứ 3: 100% ánh sáng tự nhiên - Độ ẩm: + Tuần đầu: phun sương ẩm 90% + Tuần 2: 70% + Từ tuần 3: 60% Sau 1 tháng, tiến hành đánh giá số lượng cây con sống được ngồi vườn ươm. Mơ tả đặc điểm sinh trưởng của cây con như: chiều cao cấy, số lá, màu sắc lá 5 – BÀI TƯỜNG TRÌNH 1. Giải thích sự khác biệt về đặc điểm giữa cây trong bình nuơi cấy và cây ngồi tự nhiên? 2. Trình bày phương pháp thuần hố cây con và chuyển cây con ra vườn ươm? 3. Báo cáo kết quả về tỉ lệ cây con sống được ngồi vườm ươm, đặc điểm sinh trưởng của cây con cấy mơ khi được chuyển ra vườn ươm? THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 35 Trang
  36. THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 36 Trang
  37. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Dương Cơng Kiên, 2000. Nuơi cấy mơ thực vật. NXB Trường ĐH Khoa Học Tự nhiên. 2. Kenneth C. Torres, 1957. Tissue culture techniques for horticultural crops. Chapman & Hall, New York - London 3. Nguyễn Đức Lượng, 2002. Cơng nghệ tế bào. NXB ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Văn Minh, 1998. Cơng nghệ tế bào. NXB ĐH Nơng lâm Tp. Hồ Chí Minh 5. Nguyễn Văn Uyển, 1993. Nuơi cấy mơ thực vật phục vụ cơng tác giống cây trồng. NXB Nơng nghiệp. 6. Bùi Trang Việt, 2000. Tài liệu học tập Nuơi cấy mơ thực vật. NXB ĐH Y dược Tp. Hồ Chí Minh THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 37 Trang
  38. THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 38 Trang