Bài giảng Phương pháp tạo biến dị di truyền trong chọn giống cây trồng

Nội dung text: Bài giảng Phương pháp tạo biến dị di truyền trong chọn giống cây trồng

1. 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 5.1. PHƢƠNG PHÁP LAI HỮU TÍNH 5.1.1. Khái niệm “Lai giống là sự giao phối (thụ phấn, thụ tinh) giữa hai hay nhiều dạng bố mẹ có nền di truyền khác nhau để tạo ra biến dị tái tổ hợp theo mục tiêu chọn giống ”. Chƣơng 5 Sự giao phối có thể xảy ra trong tự nhiên (lai tự nhiên) hoặc do PHƢƠNG PHÁP TẠO BIẾN DỊ DI TRUYỀN con ngƣời tiến hành (lai nhân tạo) đều tạo ra biến dị tái tổ hợp. TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG Lai hai bố mẹ có các cặp gen alen khác nhau, không liên kết, một trong số chúng là trội, phân chia nhiễm sắc thể và giao phối ngẫu nhiên giữa giao tử đực và giao tử cái, ở thế hệ F1 sẽ có các kiểu gen mới do tái tổ hợp gen của hai bố mẹ. Tổng quát để tính số kiểu gen khi lai hai bố mẹ khác nhau n gen, n n sẽ có 2 giao tử và số kiểu gen là 3 . Quần thể nhỏ nhất ở F2 cần thiết để biểu hiện các biến dị là 4n cá thể.  Phƣơng pháp lai hữu tính tạo giống thƣờng đƣợc ứng dụng đối với cây trồng có cấu tạo hoa hoàn chỉnh. Lai hữu tính tạo giống đƣợc phân chia thành lai gần và lai xa:  Trong phép lai, ngƣời ta sẽ có ký hiệu cây bố (male parent - cây cho phấn) và cây mẹ (female parent - cây nhận phấn). Lai gần là lai giữa hai bố mẹ trong cùng loài. Ví dụ, lai giữa các giống trong mỗi loài lúa trồng Oryza sativa L. (châu Á), O.  Đối với thực vật có cấu tạo hoa hoàn chỉnh gồm đủ cả nhị và glaberrima (châu Phi) nhuỵ thì cần tiến hành khử đực (emasculation) ở cây mẹ trƣớc khi tiến hành lai. Lai xa là sự giao phối giữa hai bố mẹ khác loài hay khác loài phụ. Ví dụ: lai hai bố mẹ thuộc hai loài phụ lúa Indica x Japonica; lai giữa  Các loài cây trồng có sinh sản đặc thù nhƣ: bất dục đực (male loài khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) với loài khoai tây dại sterility), đơn tính cái (Gynoecious), tự bất hợp (self - (Solanum demissum) hay lai giữa chi (genus) lúa mỳ (Triticum) với incompatibility) do yếu tố di truyền gene nhân, tế bào chất hay mạch đen (Secale) tạo ra cây Triticale. do yếu tố môi trƣờng có thể lợi dụng hiện tƣợng này để giảm bớt công khử đực, hạt thu đƣợc trên cây mẹ là hạt lai. 5.1.2. Các phƣơng pháp lai hữu tính d) Lai đỉnh (topcross) a) Lai đơn (single cross) Dòng 1 A x B Ký hiệu: A/B (theo IRRI và USDA) hoặc A - B ( theo CIMMYT). Dòng 2 b) Lai ba (three-way cross) Tester Dòng 3 (A x B) x C * Ký hiệu A/B//C (theo IRRI và USDA) hoặc A - B x C (theo CIMMYT). * c) Lai kép (double cross) * (A x B) (C x D) Ký hiệu A/B//C/D (theo USDA); A/B//C///D (theo IRRI) hoặc A – B x C- D Dòng n ( theo CIMMYT). 1
2. Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 7/18/15 e) Lai dialen (dialen cross) g) Lai trở lại (backcross) A B C D A A x A A x B A x C A x D B B x A B x B B x C B x D C C x A C x B C x C C x D D D x A D x B D x C D x D Griffing (1956) đƣa ra 4 phƣơng pháp lai nhƣ sau: Phƣơng pháp 1: Lai thuận, lai nghịch và tự phối (bố mẹ) và số tổ hợp lai = p2 Phƣơng pháp 2: Lai một chiều và tự phối (bố mẹ) và số tổ hợp lai = p(p + 1)/2 Phƣơng pháp 3: Lai thuận, lai nghịch, không tự phối và số tổ hợp lai = p(p - 1) Phƣơng pháp 4: Lai một chiều không tự phối và số tổ hợp lai = p(p - 1)/2 f) Lai thuận nghịch (reciprocal cross) A♀ x B♂ B♀ x A♂ Lai thuận Lai nghịch h) Lai trở lại nhờ marker (Marker-assisted backcrossing- MAB) MAB có nhiều mức: Mức thứ nhất: chọn lọc các gen hay QTL điều khiển tính trạng có lợi, nhƣng tính trạng đó khó đánh giá dựa trên kiểu hình hoặc do gen lặn điều khiển. Giảm bớt các gen không mong muốn liên kết kéo theo trong quá trình lai trở lại. Mức thứ hai: sử dụng hai marker liên kết hai đầu của locus mục tiêu để chọn lọc phối hợp, tối thiểu gen kéo theo và yêu cầu quần thể lớn tùy thuộc vào khoảng cách của hai marker với locus mục tiêu. Yêu cầu này rất quan trọng khi thể cho (donor) là giống địa phƣơng. Mức thứ ba: chọn lọc nền di truyền, sử dụng marker không liên kết để chọn donor tƣơng phản, lấy lại nhanh genome của bố mẹ nhận gen. Sử dụng kỹ thuật này có thể tiết kiệm 2, 3 thậm chí 4 thế hệ lai trở lại. i) Lai hồi quy (Conservatative cross) j) Lai nhiều bậc (convergent cross) Beloturca x Potapca Alpha x Xaroza Albidum-24 x Liutexen55/11 Xaratopca-29 Hình 5.7. Sơ đồ lai tạo giống lúa mì Xaratopca-29 (A.P. Sekhudin) 2
3. 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam k) Lai nhiều bố mẹ (multi-parent hybridization) l) Lai quy tụ gen dựa trên marker phân tử (Marker-Assisted Gene Pyramiding) Thời gian sinh trưởng ngắn Năng suất cao Kháng rầy nâu và bạc lá TGST ngắn Năng suất cao Kháng rầy nâu và bạc lá 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Dòng/ giống mới quy tụ các gen quy định tính trạng mong muốn ở lúa TGST ngắn – Habataki; Năng suất cao – Habataki; Kháng rầy nâu – ADR52; Kháng bạc lá – O. longistaminata Lƣu ý: Để tiến hành đƣợc phƣơng pháp này, các nghiên cứu cần tạo ra các dòng đẳng gen (NIL – nearly isogenic line). Sau đó, các dòng NIL này đƣợc tiến hành lai với nhau. Chọn lọc sẽ sử dụng các marker liên kết với các gen mong muốn để chọn. 5.1.3. Kỹ thuật lai hữu tính m) Lai tế bào soma (Somatic hybridization) a) Nguyên lý chọn cặp bố mẹ Các bƣớc lai tế bào soma: Nguyên lý 1: Chọn cặp bố mẹ dựa trên loại hình sinh thái và xa cách di truyền Bƣớc 1: Phân lập tế bào soma từ mô lá của cây con, tinh sạch Nguyên lý 2: Chọn cặp bố mẹ dựa trên khả năng kết hợp Bƣớc 2: Lai tế bào soma và kiểm tra tế bào lai Nguyên lý 3: Chọn cặp bố mẹ dựa trên khả năng chống chịu bệnh Bƣớc 3: Tái sinh cây Nguyên lý 4: Chọn cặp bố mẹ dựa trên năng suất và yếu tố tạo Bƣớc 4: Đánh giá và chọn lọc các thế hệ sau lai tế bào soma thành năng suất Nguyên lý 5: Dựa trên chỉ thị phân tử chọn bố mẹ có các tính trạng mục tiêu. c) Chuẩn bị cây lai và dụng cụ lai Trƣớc khi thực hiện thao tác lai, cây lai cần đƣợc chọn kỹ và chuẩn bị b) Gieo trồng, chăm sóc vƣờn cây bố mẹ và chọn cây bố mẹ chu đáo: cắt bỏ các cây không dùng cho lai, dọn sạch lá chết, lá vàng úa, cắt bỏ các hoa không khử đực là những hoa đã nở đầu, hoa cuối trên bông và cành hoa. Các dòng, giống bố mẹ đƣợc trồng ở ruộng riêng, có sơ đồ bố trí để thuận tiện cho công tác chăm sóc cũng nhƣ chọn cây để lai. Ví dụ, cây lúa đƣợc chọn làm vật liệu lai sẽ đƣợc đánh trồng trong chậu, cắt bỏ các bông thừa chỉ để lại từ 3 - 4 bông, dọn sạch lá chết. Tiến hành cắt bỏ các hoa đã nở và hoa non chỉ để lại khoảng 15 - 20 hoa thành thục Các kỹ thuật nhƣ thời vụ, phân bón, tƣới nƣớc và phòng trừ sâu để khử đực. bệnh cỏ dại tối ƣu đối với loài cây trồng để cây lai sinh trƣởng phát triển tốt, cơ quan sinh sản (hoa) phát triển hoàn chỉnh thuận Dụng cụ lai cần thiết gồm panh, kéo, thẻ đánh dấu, bao cách li bằng giấy bóng kính, lọ mầu đen đựng hạt phấn, ghim, bút chì hoặc bút dầu viết tiện cho thao tác khử đực và thụ phấn. trên bao cách li không bị phai Bố trí thời điểm gieo bố và mẹ để bố mẹ nở hoa trùng nhau, trong trƣờng hợp bố mẹ lệch nhau có thể sử dụng kỹ thuật điều chỉnh nhƣ ánh sáng, nhiệt độ, hóa chất 3
4. 7/18/15 d) Khử đực và bao cách li e) Thụ phấn và đánh dấu Có 4 phƣơng pháp sau: Thu hoa của cây bố tách bao phấn lấy phấn và thụ hoa mẹ đã đƣợc khử đực. Khử đực bằng tay: áp dụng với cây trồng có hoa đủ lớn, bộ phận Thu hoa bố trên các cây khỏa mạnh, không sâu bệnh và thời gian thu đực và cái trong thời điểm khử đực phân biệt rõ ràng nhƣ lúa, cà khi hoa nở rộ thƣờng vào buổi sáng. chua, thuốc lá, đậu, vừng Một số loài cây phấn hoa dính để tách lấy phấn phải hong khô nhƣ cà Khử đực bằng máy: máy hút chân không đƣợc sử dụng để khử chua, khoai tây. đực ở lúa. Những loài cây giao phấn, hoa đơn tính thì có thể thu nhận hạt phấn Khử đực bằng hoá chất: các loài cây có hoa rất nhỏ (kê, rau dền, vào lọ tối sau đó thụ phấn cho từng hoa. hành ). Các hoá chất thƣờng dùng để khử đực có hiệu quả cao là Dùng panh gắp bao phấn đƣa lên đầu nhụy của hoa mẹ đã khử đực các hydrazid của axit malic và ester thơm, sodium methyl arsenate, bóp nhẹ để bao phấn vỡ tung phấn lên đầu nhụy, dùng bút lông chấm Maleic hydrazide, NAA, IAA, FW450, Ethrel, RH531, MSMA, ZMA. vào cốc phấn rồi chấm lên đầu nhụy, đƣa phấn lên ngón tay hoặc vật phẳng rồi vít đầu nhụy chấm vào phấn bố Khử đực bằng nƣớc nóng: Nhiệt độ và thời gian khử đực tuỳ thuộc vào loài cây trồng (lúa sử dụng nhiệt độ 430C trong 5 phút; Quá trình thụ phấn cần lặp lại vài lần để đảm bảo thụ phấn thành lúa miến sử dụng nhiệt độ 47 - 480C trong 10 phút). công. f) Chăm sóc và thu hoạch hạt lai Sau khi lai, cây lai phải đƣợc theo dõi thƣờng xuyên để ngăn chặn kịp thời côn trùng và động vật phá hoại quả và hạt lai. Cây yếu cần đƣợc bón thêm phân kali hydrophotphat (KH2PO4) Hình 5.13. Bao cách để hạt lai đƣợc chắc, sức sống cao. ly và ghi thông tin sau khi thụ phấn Hạt lai đã chín cần thu hoạch kịp thời, phơi khô vào bảo quản trong lai tạo giống lúa tránh mất sứ nảy mầm. Hạt lai bảo quản trong các túi ghi đầy đủ thông tin, cất trữ trong nhiệt độ thấp và khô để sử dụng trong giai đoạn tiếp theo của quá trình chọn tạo giống. 5.1.4. Lai xa a) Một số ứng dụng của lai xa Trƣờng hợp 2: Con lai không kết hạt (thu đƣợc hạt lai F1 nhƣng con lai F bất thụ) Tạo ra loài mới: kết quả lai xa giữa lúa mì và lúa mạch đen, lƣỡng 1 bội hoá nhiễm sắc thể của con lai F đã tạo ra loài mới triticale. 1 Nguyên nhân: Chọn tạo giống cây trồng mới Do bố mẹ sai khác quá lớn về di truyền và sinh lý; Tạo biến dị mới, những tính trạng, đặc điểm mới mà dạng bố mẹ chƣa có. Hệ thống sinh sản của con lai bị phá vỡ. Tạo giống kháng bệnh và kháng sâu vào cây trồng Biện pháp khắc phục: Tạo giống cây trồng chống chịu với điều kiện bất thuận phi sinh Kéo dài thời gian sinh trƣởng của con lai; học Tạo giống lai có ƣu thế lai cao Kỹ thuật canh tác và chăm sóc phù hợp; Tạo dòng đơn bội, tạo con lai tế bào và đa dạng các loại bất dục tế Xử lý đa bội thể. bào chất 4
5. 7/18/15 5.2. ĐỘT BIẾN TẠO BIẾN DỊ DI TRUYỀN b) Những khó khăn khi lai xa và biện pháp khắc phục 5.2.1. Khái niệm và ý nghĩa Trƣờng hợp 1: Cây lai không kết hạt Đột biến là thuật ngữ chỉ sự thay đổi về vật chất di truyền của tế bào Nguyên nhân do: (gene và nhiễm sắc thể). Môi trƣờng trên đầu nhụy hoa của cây mẹ không phù hợp cho hạt phấn Theo định nghĩa trong từ điển thuật ngữ khoa học cây trồng là sự nảy mầm. thay đổi di truyền trong vật chất di truyền của tế bào, ở mức lớn hơn Ống phấn ngắn không thực hiện đƣợc quá trình thụ tinh hoặc khả năng là phá vỡ hoặc sắp xếp lại bộ nhiễm sắc thể, đột biến có thể di truyền lại cho con cái ở các thế hệ sau. xuyên của ống phấn phát triển chậm dẫn đến khi thụ tinh trứng đã mất sức sống. Hugo de Vries (1980) đƣa ra “Học thuyết đột biến” bao gồm những nội dung chính có ý nghĩa sau: Sai khác quá lớn về di truyền không hình thành đƣợc hợp tử, phôi hoặc hình thành phôi nhƣng không phát triển hoặc tiêu biến. (i)Đột biến xảy ra đột ngột, không qua bƣớc trung gian nào; Biện pháp khắc phục: (ii)Các dạng đột biến mới xuất hiện có thể hoàn toàn ổn định, bền vững; Thụ phấn bổ sung (iii)Đột biến tạo nên những biến đổi rời rạc, không tập trung; Lai trung gian (iv)Đột biến xảy ra ngẫu nhiên, có thể có lợi hoặc có hại; Cứu phôi (v)Sự xuất hiện đột biến phụ thuộc vào số lƣợng cá thể; (vi)Một đột biến có thể lặp lại nhiều lần. Bảng 5.1. Đột biến tạo giống thành công trên một số cây trồng ở Brazil Ý nghĩa của đột biến: Cây trồng Đặc điểm và tính trạng cải tiến Tạo ra nguồn biến dị di truyền phong phú cho chọn giống. Đặc Thuốc lá Kháng virus; khắc phục khó khăn khi lai xa khác loài biệt là những tính trạng mong muốn mà nguồn biến dị tự nhiên Cam quýt Kiểu cây gọn, chín tuần tự, không hạt không có. Đậu co ve Hàm lƣợng protein cao hơn; màu vở hạt mới, tập tính Có khả năng tạo ra giống mới, nhanh, ổn định, không phân ly, có sinh trƣởng, kháng virus khảm vàng đậu nhiều đặc tính, tính trạng quý nhƣ chín sớm, không cảm quang Chuối Giảm chiều cao cây, chịu mặn (tám thơm đột biến), năng suất cao, chống chịu sâu bệnh, tăng hàm lƣợng protein, lipid, glucid trong sản phẩm; các dòng bất dục Hoa cúc Màu sắc hoa mới, thấp cây, nhiều canh hoa hơn đực dùng trong tạo giống ƣu thế lai Lúa mỳ Kháng rỉ sắt thân; rỉ sắt lá; thân mềm; chín sớm; thấp cây; chống chịu chua phèn Có thể tạo ra các biến dị mới cho một số loài cây trồng sinh sản bằng con đƣờng vô tính hay nhóm cây sinh sản vô tính nhƣ đột Lúa Thời gian chín ngắn; chín sớm; thấp cây; cải tiến chất biến khảm đƣợc ứng dụng trong tạo giống hoa cây cảnh. lƣợng hạt Đậu tƣơng Lá hẹp, lá rộng, nhiều màu sắc, hạt to, chín sớm Làm mất đi mối liên kết cũ, xây dựng mối liên kết mới dẫn đến Cà chua Quả ôvan; màu quả xanh đậm, chín chậm, giảm kích làm tăng khả năng tổ hợp của gen. thƣớc cây, tăng độ Brix và giảm độ Brix 5.2.2. Phân loại đột biến a) Đột biến ở mức phân tử ADN Hạn chế của đột biến: Đột biến làm thay đổi cấu trúc phân tử ADN đƣợc gọi là “đột biển điểm” hay “đột biến gen” ở nhiều mức khác nhau: Tạo biến dị không định hƣớng; Đột biến điểm (Point Mutation) là đột biến làm thay đổi một cặp Không xác định đƣợc vị trí, số lƣợng gene đột biến; cơ bản trên phân tử ADN, thay một nucleotide này bằng một nucleotide khác. Phần lớn các đột biến là những biến dị có hại, tỉ lệ biến dị Đột biến mất đoạn (Deletion mutation) là đột biến làm mất một có lợi thấp (10-6). hay nhiều hơn các nucleotide trên gen hoạch nhiễm sắc thể. Ngày nay, công nghệ gene có thể khắc phục đƣợc những Đột biến chèn đoạn (Insertion mutation) là đột biến lồng thêm ít nhất một nucleotide và chuỗi ADN. khó khăn này. Ngoài ra còn có các đột biến tạo ra gen chức năng hoặc không có chức năng, đột biến gây ra sắp xếp ADN trở dạng hoang dại của chúng, đột biến phá vỡ gen quyết định dẫn đến gây chết cơ quan sông đang phát triển 5
6. 7/18/15 c. Đột biến thể khảm (Chimaras): Theo R. Daniel Lineberger: “Một cây đƣợc gọi là đột biến thể b) Đột biến ở mức độ nhiễm sắc thể: khảm khi các tế bào có trên một kiểu gen đƣợc tìm thấy ở các mô sinh trƣởng liền kề nhau của cây”. Bao gồm thay đổi cấu trúc NST và số lƣợng NST Các cây có đốm màu khác nhau có thể là dạng chung nhất để nhận biết đột biến thể khảm. Đột biến thiếu đoạn, đảo đoạn, đổi đoạn, lặp đoạn. Thể khảm có ý nghĩa quan trọng trong chọn tạo giống cây sinh Dạng đột biến này đƣợc gọi là “đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể”. sản vô tính, cây hoa, cây cảnh. Mức độ thay đổi số lƣợng nhiễm sắc thể nhƣ tăng hay giảm số Phân loại đột biến thể khảm: Đột biến thể khảm ra ở đỉnh sinh lƣợng nhiễm sắc thể tạo ra các thể đa bội, đơn bội hay lệch bội. trƣởng phát triển ở các lớp khác nhau và phân thành 3 loại khảm chính là: Dạng đột biến này đƣợc gọi là “đột biến số lƣợng nhiễm sắc thể”. Khảm từng phần Khảm quạt Khảm vòng. 5.2.3. Các tác nhân gây đột biến a) Tác nhân vật lý Tác nhân Đặc điểm Bƣớc sóng ngắn λ = 0,05 - 10Å, sức đâm xuyên mạnh từ Tia X vài mm đến vài cm Bƣớc sóng rất ngắn λ < 0,05Å, sức xuyên mạnh hơn tia X nhƣng không mang điện nên chỉ có tác dụng điện ly gián Tia Gamma (γ) tiếp nhờ hiệu ứng quang điện. Trong sinh học thƣờng sử dụng tia γ là đồng vị phóng xạ Co60 và Ce137 Neutron Tạo ra từ lò phản ứng nhiệt hạch, rất nguy hiểm, mức đâm (nhanh, chậm, xuyên mạnh. nhiệt) Đƣợc hình thành từ hạt nhân của nguyên tử helium (He), Tia alpha (α) gồm 2 proton và 2 nơtron. tia α có khả năng xuyên sâu 0,07mm trong mô sinh vật. Bƣớc sóng 200 – 400nm (nanomet). Photon của tia UV có năng lƣợng thấp, không xuyên sâu nên không tác động đến tế bào nằm sâu trong cơ thể sinh vật nhƣng có tác Tia tử ngoại UV dụng khi xử lý hạt phấn và noãn. Tần số gây đột biến của tia này khá cao vì bƣớc sóng của nó trùng với bƣớc sóng Hình 5.15. Hình thành và phát triển của khảm DNA hấp phụ (từ 260 – 265nm). Các tác nhân gây đột biến gồm: Các chất oxy hoá khử và các gốc tự do: H2O2, HNO2, các aldehyd, b) Tác nhân hoá học các muối kim loại nặng. Trình tự tác động của các tác nhân hoá học: Các chất alkyl hoá: ethylmethan sunfonat (EMS), nitrozoethyl-urea (NEU), nitrozomethylurea (NMU), ethylenimin (EI), diethylsulphat Trước hết, chúng đi vào các bộ phận tế bào, gây chấn thương (DES), dimethylsunphat (DMS), ở mức phân tử; Các chất đồng đẳng của base nitơ: cafein, 5-bromuaraxin (5-BU), Sau đó, tác nhân hoá học tương tác với các sản phẩm trung aminopurin, các hợp chất chứa halogen gian trong tế bào và cùng với sản phẩm của tương tác tác động vào ADN. Đây là giai đoạn tiền đột biến. Các chất cảm ứng với base: ethylurethan, 5-aminouracin, teobromin Cuối cùng, các liên kết hoá học làm sai lệch thông tin đã gây ra đột biến. Các chất nhóm acridin (C13H9N): proflavin đƣợc dùng nhiều trong nghiên cứu đột biến gene. Ngoài ra còn một số chất hóa học: H2S2O7, Na2CO3, Na3PO4, 6
7. 7/18/15 5.2.4. Vật liệu và phƣơng pháp xử lý đột biến a) Vật liệu xử lý là những bộ phận có khả năng hoạt động sống Các bộ phận xử lý: cây, hạt khô, hạt ƣớt, mầm, bộ phận sinh dƣỡng, hạt phấn, tế bào, phôi, calus trong nuôi cấy mô. c) Tác nhân sinh học: b) Phƣơng pháp xử lý Phƣơng pháp xử lý tuỳ thuộc vào tính chất của các tia, liều lƣợng, loại Virus là nhóm sinh học có thể mang gen lạ, xâm nhập hoá chất, nồng độ. vào cơ thể cây trồng để gây đột biến. Khi xử lý đột biến cần chú ý đến đặc tính sinh lý của cây, thời gian và bộ phận cây trồng đƣợc xử lý. Liều lƣợng và nồng độ hoá chất căn cứ vào liều lƣợng gây chết (lethal Đây là một trong những công cụ của phƣơng pháp dose) - giá trị LD50. LD50 đƣợc xác định bằng nghiên cứu cụ thể với loại tác nhân và vật liệu chuyển gen. xử lý. Liều lƣợng xử lý bằng TNVL đƣợc đo bằng các đơn vị Rad, Kr hay Gray. Đơn vị tiêu chuẩn thống nhất là Gray viết tắt là Gy (Gray (Gy) = 1 Joule = 100rad, rad = 100erg/g vật chất), Nồng độ xử lý bằng tác nhân hóa học có đơn vị là mM hoặc ppm. Bảng 5.3. Liều lƣợng và thời gian xử lý đột biến đối với hạt lúa khô c) An toàn trong xử lý đột biến Tác nhân đột biến Liều lƣợng và thời gian xử lý Phải tuân thủ các quy tắc, quy định an toàn và đảm bảo hiệu quả xử lý. Neutrons nhanh 3 - 8 Gy Việt Nam đã ban hành luật “Luật năng lƣợng nguyên tử” năm X-rays X-rays 95 - 250 Gy 2008. Một số nguyên tắc cơ bản là: Phải có phòng thí nghiệm chuyên dụng đủ tiêu chuẩn an toàn, Tia gamma gamma rays 100 – 350 Gy hoặc khu vực xử lý an toàn. MNH (MNU) MNH (MNU) (0,7–1,5 mM) x (3 – 5 h) Cán bộ thực hiện phải đƣợc đào tạo ENH (ENU) ENH (ENU) (1,7–2,5 mM) x (3 - 5 h) Phải đầy đủ trang thiết bị bảo hiểm an toàn cho ngƣời thực hiện Sau khi sử lý phải có phƣơng pháp đảm bảo phân rã hết phóng xạ EMS EMS (0,2 – 0,5%) x (8–20 h) hay độc tố mới đƣợc sử dụng NaN3 NaN3 (0,5 – 2 mM) x (3-5 h) 5.2.5. Chọn lọc sau đột biến Vật liệu xử lý đột biến là thế hệ M0 đƣợc gieo trồng và thu hoạch gieo trồng M1 và thu hoặc trồng quần thể M2. Bắt đầu từ quần thể M2 phân thành hai khu chọn lọc, một khu vực tiếp tục chọn lọc các thế hệ phân ly, một khu vực khác đánh giá các dòng đã thuần để phát triển giống mới hoặc làm vật liệu khởi đầu cho phƣơng pháp tạo giống khác nhƣ lai, chuyển gen Chọn lọc sau đột biến đối với cây sinh sản sinh dƣỡng phân thành 2 nhóm, (i)Nhóm cây cần tách đột biến riêng rẽ ra khỏi thể khảm sử dụng nhân và ghép vô tính tạo thành các dòng vô tính ở thế hệ sau. Qua một số thế hệ chọn lọc đánh giá độ thuần và các đặc điểm nông sinh học khác để phát triển thành giống mới. (ii)Nhóm cây không cần tách đột biến ra khỏi thể khảm nhƣ hoa và cây cảnh đánh giá đột biến ổn định nhân vô tính phát triển thành giống mới. Hình 5.16. Cánh đồng xử lý đột biến ở Viện Đột biến tạo giống (IRB) quốc gia Nhật Bản 7
8. 7/18/15 Chọn lọc sau đột biến với cây sinh sản hữu tính: tƣơng tự nhƣ Bảng 5.4. Yêu cầu số cá thể của gia đình M2 đảm bảo xuất hiện đột biến chọn lọc phân ly sau lai điểm khác biệt là có thể chọn lọc một quả, một bông để hình thành dòng ở thế hệ sau mà không nhất thiết từ Số gia đình M2 một cây hay một khóm nhƣ chọn lọc sau lai. Tỉ lệ đột biến p1 = 0,90 p1 = 0,99 Yêu cầu chọn lọc quần thể phân ly lớn, ƣớc lƣợng độ lớn quần thể 10-2 233 465 M1 theo Brock (1971). log(1 p ) 10-3 2.326 5.652 N 1 log(1  ) 10-4 23.260 46.520 10-5 232.600 465.200 Trong đó: N là số cá thể M1 sống sót để tạo gia đình M2; µ là tỉ lệ đột biến; p1 là xác suất ít nhất xảy ra một đột biến. 5.3. ĐA BỘI THỂ Đặc điểm dạng đa bội 5.3.1. Khái niệm và ý nghĩa đa bội trong chọn giống Sinh trƣởng, phát triển mạnh hơn nên khả năng thích ứng tốt Khái niệm: “Đa bội thể là những sinh vật trong tế bào sinh dƣỡng có nhƣ cây chuối số lƣợng nhiễm sắc thể tăng theo bội số nguyên lần của bộ nhiễm sắc thể đơn bội (từ 3n trở lên)”. Thân lá to nên năng suất xanh cao Bất dục đặc biệt dạng tam bội 3n. Nhiều trƣờng hợp bất dục hoàn - Một số dạng đa bội toàn Bảng 5.5. Đa bội ở một số loài cây trồng Hàm lƣợng các chất cao nhƣ đƣờng, methol bạc hà Loài cây trồng Đơn bội (n) Đa bội Những điểm hạn chế ở cây đa bội Đa bội thể cao (6n, 8n ) có hiện tƣợng sinh trƣởng phát triển Họ cà 6 hoặc 12 24, 36, 48, 60, 72, 96, 108 không bình thƣờng, cây thấp đi do tế bào dầy không phát triển Lúa nƣớc 12 24, 48 chiều dài. Cải bẹ 8, 9, 10 16, 18, 20 Hiện tƣợng bất dục khó khăn đối với lấy hạt. Trong trƣờng hợp nhân giống hữu tính, quá trình sản xuất hạt Mía 40 80, 120 giống rất khó khăn 5.3.2. Phân loại đa bội thể a) Đa bội cùng nguồn (autopoly ploidy) Đa bội cùng nguồn hay còn đƣợc gọi là đồng nguyên đa bội, tự đa bội là hiện tƣợng đa bội thể đƣợc tạo nên từ bộ nhiễm sắc thể giống nhau của cùng một loài - Tam bội - Autotriploidy (3x) - Tứ bội - Autotetraploidy (4x) - Ngũ bội - Autopentaploidy (5x) - Lục bội - Autohexaploidy (6x) b) Đa bội khác nguồn (Allopolyploidy) - Tứ bội khác nguồn - Allotetraploidy (2x1+2x2) - Lục bội khác nguồn - Allohexaploidy (2x1+2x2 + 2x3) - Bát bội khác nguồn - Allooctaploidy (2x1+2x2 + 2x3 + 2x4) Hình 5.17. Những con đƣờng chủ yếu hình thành đa bội 8
9. 7/18/15 5.3.3. Phƣơng pháp tạo đa bội thể c. Đa bội lệch (aneuploid) Nguyên tắc xử lý đa bội: xử lý đa bội có thể dùng tác nhân lí, hoá Đa bội lệch là sự thay đổi bộ NST không bằng bội số mà từng NST học tác động vào sơ thể sinh vật đặc biệt lúc tế bào đang phân chia riêng biệt dẫn đến phân chia không bình thƣờng và hình thành đa bội. Công thức tổng quát: 2n ± x (x: số NST) Các phƣơng pháp xử lý Đa bội lệch đƣợc phát hiện ở nhiều loài cây trồng: lúa mì, ngô, cà chua, bông, thuốc lá Phƣơng pháp gây chấn thƣơng: có hiệu quả nhất ở cây họ cà. Các dạng đa bội lệch dẫn tới biến dị dị hình, sức sống kém do mất Phƣơng pháp thay đổi nhiệt độ đột ngột. cân bằng bộ NST, không phân bào đƣợc nên bất dục, không hoặc ít có giá trị trong chọn giống mà chỉ có thể sử dụng để xác định nhóm Phƣơng pháp hoá học: xử lý bằng chất colchicine, idol axetic axit, sunfamit gen liên kết. Phƣơng pháp tạo đa bội thể bằng colchicine (C22H25NO6) Colchicine là một chất hoá học đƣợc chiết từ cây (Colchicum autumnale) có nhiều ở vùng Địa Trung Hải, colchicine dạng tinh thể, màu trắng tan trong rƣợu và benzen, không tan trong nƣớc. Tạo đa bội thể bằng lai Nồng độ và thời gian xử lý tùy thuộc vào vật liệu và loài cây trồng, Các thể đa bội có thể tiến hành lai với nhau nhƣ lai giữa dạng tứ nồng độ dao động từ 0,01 – 1,6%, thời gian xử lý từ 30 phút đến 10 bội (4n) và nhị bội (2n) tạo ra dạng tam bội (3n). giờ. Một số loài cây trồng khi xử lý có bổ sung thêm hóa chất khác nhƣ Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng thành công ở một số loài cây trồng nhƣ dƣa hấu tam bội, dâu tằm tam bội. DMSO (Dimethyl sulfoxide - (CH3)2SO). Khi xử lý trực tiếp lên đỉnh sinh trƣởng của cây trên đồng ruộng thời Sử dụng các vật liệu đa bội theo các hƣớng sau: gian ngắn hơn và lặp lại một vài ngày. Chọn lọc sử dụng trực tiếp. Sau khi xử lý phải rửa sạch bằng nƣớc vô trùng 30 phút Tạo giống lai làm vật liệu cho các tổ hợp lai. Phƣơng pháp xử lý tuỳ thuộc vào từng trƣờng hợp cụ thể Tiêm vào đỉnh sinh trƣởng Khắc phục hiện tƣợng bất dục trong lai xa. Dùng bông thấm đặt lên đỉnh sinh trƣởng cây con khi lá mầm mở Nhúng đỉnh sinh trƣởng hoặc đỉnh rễ vào dung dịch colchicine Phun dung dịch colchicine lên đỉnh sinh trƣởng của cây con 5.4.2. Giá trị của cây đơn bội và đơn bội kép 5.4. ĐƠN BỘI THỂ VÀ ĐƠN BỘI KÉP Để tiến hành nghiên cứu di truyền các tính trạng. Tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn in vitro 5.4.1. Khái niệm Đến nay, số lƣợng các cây đơn bội của hơn 247 loài thuộc 88 chi Đơn bội (Haploid) là thực vật có bộ nhiễm sắc thể n = 1 nhƣ một và 34 họ thực vật hạt kín đã đƣợc tạo ra từ nuôi cấy bao phấn và giao tử đực là hạt phấn hoặc giao tử cái là tế bào trứng. hạt phấn. Đơn bội kép (Double Haploid - DH) có bộ nhiễm sắc thể 2n giống hệt H.H. Geiger và G.A. Gordillo (2010) cho rằng tiến bộ chủ yếu của dòng DH trong chọn tạo giống ngô lai là nhau do nhân lên từ bộ NST đơn bội và có thể hình thành từ tế bào trứng hoặc hạt phấn. (i)biến di di truyền tối đa, Chawla (2002) khái niệm đơn bội kép (DH) là một kiểu gen đƣợc (ii)đồng hợp hoàn toàn, đƣợc hình thành khi các tế bào đơn bội trải qua quá trình nhân đôi (iii)nhanh thƣơng mại, nhiễm sắc thể. (iv)đơn giản, (v)giảm chi phí (vi)(vi) tối ƣu cho ứng dụng marker. 9
10. 7/18/15 5.4.3. Phƣơng pháp tạo đơn bội (Haploid) và đơn bội kép (DH) Phƣơng pháp 1: Tạo đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn Các bƣớc nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội: Một số kỹ thuật tạo đơn bội nhƣ: Bƣớc 1: Lựa chọn kiểu gen Chiếu xạ hạt phấn Bƣớc 2: Trồng và chăm sóc cây cho phấn Trì hoãn thụ phấn Bƣớc 3: Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy Sử dụng tế bào chất lạ hoặc tác nhân thụ phấn Bƣớc 4: Thu bao phấn, khử trùng, bảo quản Lai xa Bƣớc 5: Nuôi cấy tạo calus và tái sinh cây Tạo đa phôi Bƣớc 6: Chuyển cây ra giá thể, ngoài đất và đánh giá chọn lọc dòng. Ghép cây con Xử lý hóa chất Bƣớc 2: Trồng và chăm sóc cây Trồng và chăm sóc cây lấy bao phấn trong điều kiện phù hợp với loài, Bƣớc 1: Lựa chọn kiểu gen trong một số trƣờng hợp trồng trong nhà kính, nhà lƣới và trong chậu vại. Kiểu gen là dòng, giống thuần, giống thụ phấn tự do hoặc con lai Bƣớc 3: Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy F1 đƣợc chọn để trồng cây cho phấn. Môi trƣờng nuôi cấy bao phấn trên môi trƣờng MS cơ bản, một số loài cây Bƣớc lựa chọn kiểu gen rất quan trọng, quyết định khả năng nuôi trên môi trƣờng N6 của Chu (1978). cấy thành công. Kiểu gen của mỗi loài cây trồng phản ứng khác Môi trƣờng nuối cấy bao phấn nghiên cứu cải tiến phù hợp với mỗi loài cây nhau với nuôi cấy bao phấn. trồng và kiểu gen. Nhiều nhà nghiên cứu khẳng định nuôi cấy bao phấn ở lúa (Ozyza Ví dụ đối với lúa loài phụ Indica môi trƣờng N6 bổ sung thêm galactose sativa L.) gặp khó khăn là khả năng tạo calus của hạt phấn rất thấp (0,1M), lactose (0,1M), nƣớc dừa (5%), caseine hydrolisate (0,05% w/v), L- và sai khác lớn khi tái sinh cây glutamine (1,3mM), biotin (2mM), ascorbic acid (2,8mM) và các chất điều tiết sinh trƣởng Loài phụ Japonica khả năng tạo calus tốt hơn loài phụ Indica Loài phụ Japonica môi trƣờng SK-I hiệu quả cao hơn. Kết quả nuối cấy tạo ra cây đơn bội, cây lƣỡng bội và cây tam bội, Môi trƣờng MS bổ sung thêm 2,4D và BAP hiệu quả đối nuôi cấy bao phấn sau nuôi cấy tiến hành đánh giá và chọn lọc cây đơn bội. cây họ thập tự. Các nhà khoa học Úc cho rằng môi trƣờng B5 + 2,4-D (2mg/l) + 9% sucrose phù hợp cho cây họ đậu. Bƣớc 4: Thu nụ hoa, khử trùng và tách bao phấn nuôi cấy Bước 5: Nuôi cấy tạo calus và tái sinh cây Thu nụ hoa giai đoạn hình thành tiểu bào tử đơn nhân (lúa khi Môi trường nuôi cấy bao phấn dựa trên môi trường MS hoặc N6 cải bông vẫn trong bẹ lá đòng, khoảng cách giữa lá đòng và tai lá cuối tiến phù hợp với mỗi loài cây trồng và kiểu gen. cùng là 3cm). Môi trường cải tiến thường bổ sung thêm các chất điều tiết sinh Sau khi thu hoa, phƣơng pháp nhuộm màu để xác định thời điểm trưởng và hóa chất khác (xem bước chuẩn bị môi trường). nuôi cấy phù hợp, một số hóa chất nhuộm màu sử dụng nhƣ iron - Điều kiện buồng nuôi cấy thường ở nhiệt độ 25 ± 1oC, thời gian chiếu alum haematoxylin nhuộm màu bao phấn lúa, DAPI (4,6 diamidino sáng 16 giờ, cường độ ánh sáng 1000lux (đối với lúa). 2-phenylindol dichloride) với bao phấn cây họ cam quýt. Một số loài cây trồng yêu cầu môi trường tạo calus và môi trường tái Thu hoa khử trùng và bảo quản trong nhiệt độ thấp sinh cây khác nhau như: lúa sau khi tạo calus 3 tuần chuyển sang môi trường tái sinh cây là môi trường MS bổ sung thêm 1-2mg NAA Sau khi bảo quản, tách bao phấn ra khỏi hoa đƣa vào môi trƣờng (Naphthalene acetic acid), 4mg/l kinetin, 40mg/l adenine sulfat và 15% nuôi cấy trên đĩa petri CM. Số lƣợng nuôi cấy tùy theo loài, cơ sở vật chất. Bình quân số lƣợng Điều kiện nuôi cấy giống như nuôi cấy tạo calus nhưng cường độ ánh bao phấn nuôi cấy trên mỗi đĩa petri khoảng 30 bao phấn, nuôi cấy sáng tăng lên 2000lux. tổng số 100 bao phấn cho một kiểu gen. 10
11. 7/18/15 Phƣơng pháp 2: tạo đơn bội bằng kích tạo đơn bội tự nhiên Bƣớc 6: Chuyển cây ra ngoài giá thể hoặc ngoài đất đánh giá chọn dòng Phƣơng pháp kích tạo đơn bội tự nhiên hay còn gọi là phƣơng pháp tạo đơn bội kép (DH) in vivo. Trồng cây tái sinh ra chậu chứa đất và dinh dƣỡng phù hợp, hoặc ngoài đất trong nhà kính, nhà lƣới đánh giá các đặc điểm nông sinh Geiger (2009) đã thông báo rằng nếu thụ phấn các cây ngô có kiểu học và xác định độ bội. gen đặc thù gọi là cây kích tạo (inducer), cây nhận phấn tạo ra một tỉ lệ hạt nhất định có phôi đơn bội (haploid embryo) và nội nhũ tam Ví dụ đối với lúa: xác định độ bội bằng xử lý đỉnh rễ trong dung bội. dịch 8- hydroxyquinoline tại 18oC trong 3 giờ, cố định trong dung dịch ethanol-acetic axít (3:1 v/v) qua đêm và nhuộm màu bằng kỹ Kỹ thuật sử dụng rộng rãi phát triển dòng thuần trong tạo giống thuật Feulgen squash và quan sát trên kính hiển vi. ngô lai thƣơng mại. Những tiến bộ trong khoa học đã có các thiết bị mới có thể xác Các bƣớc tạo dòng DH ở ngô đƣợc trình bày trong hình 5.20. định độ bội nhanh và tiết kiệm chi phí hơn nhƣ máy đo độ bội hoặc sử dụng marker phân tử. Sau khi thu hạt đơn bội có thể lƣỡng bội hóa tạo dòng đơn bội kép ngay từ thế hệ đầu tiên. * Lƣỡng bội hóa cây đơn bội tạo cây đơn bội kép (DH): Phƣơng pháp lƣỡng bội hóa cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn hay kích tạo đơn bội (in vivo) phổ biến nhất là sử dụng colchicine. Chất alkaloid này hoạt động cản trở quá trình phân chia tế bào và dẫn đến không giảm số lƣợng nhiễm sắc thể khi phân chia. Colchicine có tính độc cao, ngày nay có thể sử dụng một số chất khác thay thế là thuốc trừ cỏ, pronamid, APM, trifluralin, oryzalin, Nitrous oxide gas (Kato, 2002), nhƣng những chất thay thế này không phù hợp xử lý một số lƣợng lớn. Hình 5.20. Các bƣớc tạo dòng DH ở ngô băng Phƣơng pháp in vivo 5.4.4. Ứng dụng của đơn bội và đơn bội kép trong cải tiến giống cây trồng 5.5. TẠO BIẾN DỊ BẰNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO Phƣơng pháp phát triển dòng thuần truyền thống bằng thụ phấn cƣỡng bức của chính cây đó (tự phối) qua 8 - 10 thế hệ thu đƣợc dòng thuần, tuy nhiên không thể tạo đồng hợp hoàn toàn. Nuôi cấy mô tế bào tạo ra một lƣợng lớn biến dị di truyền ở các Tỉ lệ đồng hợp tăng qua các thế hệ tự thụ phấn. Giả sử lai 2 bố mẹ đồng loài thực vật, những biến dị di truyền này có thể sử dụng trong các hợp AA x aa thu đƣợc con lai F1 (Aa), bắt đầu từ F1 cho thụ phấn hoàn toàn chƣơng trình chọn tạo giống cây trồng. tỉ lệ đồng hợp và dị hợp thu đƣợc qua các thế hệ nhƣ sau: Bằng chọn lọc in vitro các đột biến về đặc điểm nông sinh học có Bảng 5.6. Tỉ lệ đồng hợp qua các thể hệ tự thụ phấn lợi, chống chịu mặn, hạn và chống chịu sâu bệnh có thể phân lập Tỉ lệ (%) Thế hệ tự thụ phấn đƣợc trong một thời gian ngắn. Đồng hợp Dị hợp F1 100 F2 50 50 Biến dị soma tạo thành giống mới thành công ở một số cây trồng F3 75 25 nhƣ cải, lúa và cây trồng khác (S. Mohan Jain, 2001). F4 87,5 12,5 F5 93,75 6,25 F6 96,88 3,12 F7 98,44 1,56 F8 99,32 0,78 11
12. 7/18/15 5.5.1. Những thay đổi di truyền xảy ra trƣớc khi nuôi cấy mô in vitro Trong quá trình phát triển cá thể, phân hoá và già hoá của mô và tế 5.5.2. Những thay đổi di truyền xảy ra trong quá trình in vitro bào, một số thay đổi di truyền xảy ra và đƣợc tích luỹ trong các tế bào soma. Auxin gây ra đa bội hoá bên trong tế bào nuôi cấy. Nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô, cây đƣợc tái sinh từ tế bào soma sẽ là Mức độ đột biến tế bào soma lớn đến mức tần số đột biến do các các đột biến. chất đột biến gây ra. Nguyên nhân gây đột biến có thể do cấu trúc bình thƣờng của hạt và tế bào bị phá vỡ - các enzym tiếp xúc với các chất và tạo ra sản Có thay đổi số lƣợng, cấu trúc nhiễm sắc thể, đột biến gen. phẩm đột biến. Thay đổi di truyền phổ biến nhất xảy ra trong tế bào nuôi cấy là đa Tuỳ theo phƣơng thức nuôi cấy tế bào soma, ngƣời ta phân biệt các bội thể. loại biến dị dƣới đây: Biến dị dòng tế bào mô sẹo (calusoclonal variation): khi cây biến dị Đột biến tế bào soma xảy ra ở các gen trong tế bào chất (ty thể và tái sinh từ mô sẹo (calus). lục lạp). Biến dị dòng tế bào trần (protoclonal variation) - khi cây biến dị tái Đột biến tế bào soma đã ứng dụng vào chọn giống hiệu quả ở nhiều sinh từ tế bào trần. cây trồng nhƣ mía, khoai tây, cà chua, thuốc lá, lúa và lúa mì. Những biến dị di truyền xảy ra và đƣợc phát hiện trong quá trình nuôi cấy in vitro gọi chung là đột biến dòng tế bào. 5.6. TẠO BIẾN DỊ DI TRUYỀN DỰA TRÊN CÔNG NGHỆ GEN 5.5.3. Ứng dụng của biến dị tế bào soma Ứng dụng công nghệ gen tạo biến dị di truyền ở mức phân tử ADN, locus tính trạng số lƣợng (QTL) hay từng gen, sau đây gọi chung là Biến dị và chọn lọc các đột biến tế bào soma xảy ra trong nuôi cấy kỹ nghệ di truyền. in vitro cung cấp một số lƣợng lớn biến dị và có thể ứng dụng rất đa dạng: Chuyển gen là một kỹ nghệ di truyền và là một công cụ mới bổ sung cho chọn tạo giống truyền thống và có thể giúp cho việc mở Tạo ra dòng tế bào nuôi cấy có khả năng sản xuất các chất hoạt rộng các nguồn gen có lợi từ các loài khác chuyển sang các loài tính sinh học với năng suất cao (xem công nghệ bioreactor) cây trồng mong muốn. Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dị quý, Kỹ nghệ di truyền chuyển gen có lợi thế là có thể chuyển một gen, một số gen hay một QTL mà phƣơng pháp truyền thống rất khó Ví dụ, các nhà khoa học ở Đài Loan đã chọn tạo đƣợc giống chuối thực hiện. thấp cây, chống chịu bệnh thối rũ do nấm Fusarium gây ra. Khái niệm cây trồng chuyển gen theo J. Machex (1997): “Cây Ở nƣớc ta, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đã tạo đƣợc trồng chuyển gen là cây đƣợc chuyển một hay nhiều gen mới từ đó giống lúa mới DR2 có khả năng chịu hạn, chịu lạnh bằng phƣơng ta thu đƣợc thêm một hay nhiều đặc điểm mới. Các gen đƣợc pháp chọn lọc các biến dị tế bào soma in vitro kết hợp xử lý các điều chuyển vào cây không phải bằng con đƣờng lai hữu tính giữa hai kiện cực đoan từ một giống lúa không có khả năng chống chịu. bố mẹ mà đƣợc chuyển bằng kỹ thuật di truyền”. 5.6.1. Chuyển gen trực tiếp b) Chuyển gen nhờ phân tử PEG (polyethylene glycon) Là phƣơng pháp chuyển trực tiếp các gen đã đƣợc thiết kế trong plasmid PEG là một phân tử lớn có phân cực, lợi dụng tính chất này ngƣời vào tế bào thực vật có sự trợ giúp của yếu tố hoá học, vật lý và tác nhân cơ ta tách gen cần chuyển, đƣa vào dung môi cùng với phân tử PEG và giới. tế bào trần. Chuyển gen trực tiếp sử dụng một số kỹ thuật sau: Các ADN bị hút vào các đầu phân tử PEG có điện cực trái dấu, sau a) Chuyển gen bằng xung điện đó PEG bị tế bào trần hút về phía nó. Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trƣờng cực mạnh. Các ADN trên đầu PEG đi vào tế bào trần theo cơ chế nuốt amip. Khi các tế bào trần (protoplast) trong điện trƣờng, sự dẫn điện và tính Thuốc lá và hoa mào gà là hai đối tƣợng đầu tiên đƣợc sử dụng cho thấm của màng nguyên sinh bị thay đổi. chuyển gen trực tiếp nhờ tác động của PEG. Sự thay đổi này kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời của màng hình thành lỗ hổng. Nhƣợc điểm lớn nhất khi sử dụng phƣơng pháp chuyển gen bằng xung điện và nhờ xử lý PEG là việc tái sinh cây hữu thụ tốn rất nhiều Một loạt các lỗ hổng đƣợc hình thành, ADN đƣợc chuyển qua lỗ hổng vào tế thời gian, công sức mà kết quả phụ thuộc vào kiểu gen của loài cây bào gắn vào bộ máy di truyền. trồng. Tế bào chuyển gen đƣợc nuối cấy tạo calus, tái sinh cây và đánh giá cây chuyển gen. Ngoài ra, vấn đề về các biến dị soma, có nhiều bản sao gắn trong hệ gen, tái sinh cây bạch tạng là những trở ngại cho việc chuyển Một tế bào thực vật có thể tiếp thụ ADN nhờ xung điện mà không cần xử lý gen khi sử dụng hai phƣơng pháp này ở cây hoà thảo (cây lúa). trƣớc nhƣ tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì. 12
13. 7/18/15 d) Chuyển gen bằng bắn gen c) Chuyển gen bằng vi tiêm Lịch sử và thành tựu chuyển gen bằng bắn gen: Ngƣời ta sử dụng vi kim và kính hiển vi để tiêm một lƣợng nhỏ ADN  vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào trần hay tế bào nguyên. Phƣơng pháp chuyển gen bằng bắn gen đƣợc Klein T.M., Wolf E.D. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là ADN đƣợc đƣa vào tế bào một cách và Sanford J.C công bố lần đầu tiên năm 1987 với tiêu đề vi đạn tốc chính xác. độ cao đƣa nucleic axít vào tế bào sống đăng trên tạp chí Nature số 327. Phƣơng pháp này cần thao tác khéo léo, yêu cầu trang thiết bị. Các nhà khoa học sử dụng hạt tungsten có kích thƣớc nhỏ, khối Vật liệu chuyển gen là tế bào trần, hoặc qua ống phấn. lƣợng phân tử lớn, bay với vận tốc nhanh khi xuyên qua thành và Khi hạt phấn rơi trên đầu nhuỵ (quá trình thụ phấn), hạt phấn sẽ màng tế bào không gây chết tế bào sống. nảy mầm và hình thành ống phấn. Lúc này tiêm ADN mong muốn đã tách đi theo ống phấn mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái, Các tác giả cho rằng phƣơng pháp này có thể khắc phục những ADN cần chuyển kết hợp hình thành hợp tử có mang gen cần chuyển. khó khăn của phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vì phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn bị hạn chế Phƣơng pháp này khá thành công trên cây lúa và cây bông, tuy phạm vi ký chủ. nhiên hạn chế của phƣơng pháp là kỹ thuật cao và tốn kém. Nguyên lý chung chuyển gen bằng bắn gen: Thiết kế vector mang ADN cần chuyển, kết tủa ADN lên bề mặt vi đạn, sử dụng áp lực khí He (helium) bắn vi đạn bay đi xuyên qua mô tế bào. Các ADN trên bề mặt vi đạn đƣợc giữ lại trong mô tế bào và gắn vào bộ máy di truyền, tái sinh cây và đánh giá tế bào và cây chuyển gen. Vi đạn là các loại vi đạn là vàng, tungsten (Wolfram). Vật liệu sử dụng chuyển gen bằng bắn gen: Vật liệu sử dụng bắn chuyển gen có thể là mô tế bào, phôi, mô hạt, calus tế bào huyền phù trong nuôi cấy mô tế bào. Các bƣớc chuyển gen bằng bắn gen gồm: chọn kiểu gen, tách mô, thiết kế vector chuyển gen, xử lý mô, thiết kế quá trình bắn gen (kết tủa ADN trên bề mặt vi đạn, nuôi cấy tạo mô chuyển gen, nạp đạn và vi đạn), tái sinh cây, đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen. Hình 5.21. Sơ đồ các bƣớc bắn gen vào mô thực vật Bƣớc 2: Chuẩn bị vector chuyển gen Bƣớc 1: Chọn kiểu gen và tách mô Cấu trúc mang gen có nhiều loại khác nhau gọi là vector chuyển gen. Kiểu gen sử dụng chuyển gen là dòng, giống ƣu tú cần cải tiến một hoặc một số tính trạng nào đó. Vector chuyển gen là plamid một phân tử ADN mạch đôi dạng vòng có kích thƣớc 1 đến hơn 400 kilobase pairs (kbp). Tách mô và khử trùng đƣa vào nuôi cấy in vitro tạo vật liệu chuyển Ví dụ: vector chuyển gen vào mô hạt ngô của Diaa Al-Abed và cs. gen. năm 2007. Plasmid pC1301 mang vùng không phiên mã intron ß- Ví dụ, chuyển gen CBF3 biểu hiện tăng cƣờng tính chịu lạnh, chịu glucuronuridase (GUS) của Australia (Black Mountain, ACT, Australia). The GUS intron sử dụng để kiểm tra nhanh và xác định mặn và chịu hạn ở cây Arabidopsis, thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) điều kiện biểu hiện trong bao mầm và mô phân sinh chồi. và lúa mỳ (Triticum aestivum L.) vào ngô bằng hạt cho nảy mầm trên môi trƣờng MS + vitamin B bổ sung thêm 9 µmol L–1 2,4-D (2,4- ADN cần chuyển đƣợc gắn vào vector trƣớc khi kết tủa lên bề mặt 5 vi đạn. dichlorophenoxyacetic acid, Sigma, St. Louis, MO) trong 3 đến 4 ngày. Mỗi loài cây trồng, vật liệu chuyển gen thiết kế vector chuyển gen phù hợp có ý nghĩa quan trọng để bắn gen thành công. 13
14. 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Bƣớc 4: Chọn lọc và tái sinh cây Bƣớc 3: Bắn gen Xác định kết quả chuyển gen đối với vector gắn GUS có thể nhận biết mô chuyển gen thành công nhờ sử dụng nhuộm màu trong Thiết kế bắn gen cần quan tâm đến các điều kiện nâng cao hiệu dung dịch X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid) sau bắn gen 48 giờ và quan sát trên kính hiển vi. quả của bắn gen nhƣ: áp lực khí He Các mô xác định chuyển gen thành công chuyển vào môi trƣờng Theo nghiên cứu của Diaa Al-Abed và cs. (2007) áp lực khí He là nuôi cấy để tái sinh cây. 10,69 MPa hiệu quả nhất Môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy tùy thuộc loài cây trồng. Theo Elina Helenius và cs. (1996) kết quả tối ƣu nhất với Ví dụ đối với nuôi cấy mô ngô chuyển gen trên môi trƣờng MSI trong 4 ngày, nhiệt độ 26oC và điều kiện ánh sáng 16/8 giờ Arabidopsis là 75psi, nhƣng tối ƣu với thuốc lá và bạch dƣơng là sáng/tối, tiếp theo chuyển sang môi trƣờng MSI chọn lọc bổ sung 200psi. Kích thƣớc vi đạn vàng tối ƣu là 0,6µm và lƣợng ADN trên vi thêm 25 mg/l hygromycin, thay môi trƣờng sạch hai tuần một lần đạn là 1 µg tối ƣu cho cả 3 cây. Khoảng cách từ súng bắn gen đến trƣớc khi chuyển sang môi trƣờng tạo rễ là môi trƣờng MS có chứa 3,2 μmol/ L NAA (1-naphthaleneacetic acid), bổ sung thêm 10 mg/ l mô từ 6 – 9cm là phù hợp. hygromycin trƣớc khi chuyển ra ngoài giá thể và ngoài đất. 5.6.2. Chuyển gen gián tiếp Bƣớc 5: Trồng đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp là gen đƣợc chuyển vào tế bào thực vật qua một sinh vật trung gian, thƣờng là vi khuẩn hoặc virus. Cây chuyển gen đƣợc chuyển ra giá thể tiếp nhận, khi cây khỏe mạnh chuyển ra ngoài đất trong nhà kính, nhà lƣới, nhân cây và * Chuyển gen nhờ virus: đánh giá. Virus cũng đƣợc coi là một vectơ trong chuyển gen thực vật. Tiêu chuẩn để virus làm vectơ chuyển gen: Trên cơ sở gen chuyển để thiết kế thí nghiệm đánh giá. Thí nghiệm Có cấu trúc ADN đánh giá cây chuyển gen kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo, Không gây hại hoặc có độ gây hại thấp chống chịu bất thuận bằng gây bất thuận nhân tạo Ngày nay nhờ Có phổ ký chủ rộng marker phân tử, có thể đánh giá và nhận biết cây chuyển gen nhanh và chính xác hơn. Có khả năng mang gen Có khả năng di chuyển qua các lỗ tế bào. Một số hạn chế của phƣơng pháp là các mô bị phá huỷ dẫn tới khả Có hai loại virus đảm nhận vai trò làm vectơ chuyển gen là: năng phục hồi và khả năng tái sinh thấp, khả năng tái sinh ra những Caulifower Mosaic Virus (CaMV): virus hại cây họ cải cây không hoàn chỉnh, nhiều bản sao đƣợc chuyển vào trong tế bào gây khó khăn cho việc phân tích, hiệu quả chuyển gen thấp. Geninivirus: nhóm virus này gây hại trên phổ ký chủ rộng (cây 1 lá mầm và cây 2 lá mầm). * Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium: Hai chủng đƣợc sử dụng phổ biến để chuyển gen là A. tumefaciens và A. rhizogenes. Những nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium vào cây Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. đầu tiên của các nhà nghiên An, G. và cs. (1986), Lloyd, A. và cs. (1986), Sheikholeslam, S. N. & Weeks, D. P. (1987). Đến nay phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn thành công ở hầu hết các loài cây trồng nhƣ lúa, ngô, đậu tƣơng Nguyên lý của phƣơng pháp: dựa trên hiện tƣợng nhóm vi khuẩn Ghi chú:(a) Ti- plamid chứa T-DNA ở vai phải (RB) và vai trái (LB), trong vùng phiên mã Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật gọi là Ti-plasmid của virulence (vir); (b) Các T-DNA khoảng 25bp lặp lại và cung cấp điểm tiếp hợp để nhƣ mô tả trong hình 5.23. cắt DNA của endonuclease VirD2–VirD1. Nó cắt giữa nucleotides thứ ba và thứ tƣ của trình tự hai vai; (c) Bản sao của T-DNA phóng thích phân tử DNA sợi đơn (T-strand) có phân tử VirD2 gắn ở đầu 5’. Chuỗi còn lại của T- DNA có chức năng sinh học không dài, thƣờng sử dụng nhƣ điểm định hƣớng và toàn vẹn của T-DNA trong tế bào thực vật; T- DNA tổ hợp vào bộ genome của ký chủ; (d) độ dài đầy đủ của sợi đơn; (e) phân tử T- DNA bị cắt; (f) nhân bản phân tử T-DNA. 14
15. 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Quá trình vi khuẩn chuyển gen vào tế bào trải qua 10 bƣớc là: .Bƣớc 1: vi khuẩn tiếp xúc với thực vật; Cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thƣơng tạo thành khối .Bƣớc 2 và 3: kích thích sự biểu hiện của vùng vir bằng tín hiệu đặc thù của u, khối u tiếp tục phát triển khi không có mặt của vi khuẩn do ký chủ; nó đã truyền một đoạn ADN của Ti-plasmid (T-ADN) vào bộ gen .Bƣớc 4: tạo phân tử ADN sợi đơn (T- strand), tổ hợp hoạt động của protein của cây. VirD1 và VirD2; Ti-plasmid là ADN mạch vòng kép có cấu trúc đƣợc chia thành .Bƣớc 5: tế bào vi khuẩn tồn tại T-DNA nhƣ một phức hợp protein ADN với một phân tử VirD2 gắn ở đầu 5’ của T-strand và có một số protein vir khác bốn vùng chính gồm hai vùng tác động trực tiếp đến sự hình chuyển vào tế bào ký chủ bằng hệ thống VirB/D4, mỗi bƣớc yêu cầu có thành khối u là vùng T-ADN và vùng vir, hai vùng còn lại có tƣơng tác của T-pilus với 1 protein đặc thù của ký chủ; chức năng của quá trình tiếp hợp và tái bản Ti-plasmid của vi .Bƣớc 6: bên trong tế bào chất của tế bào ký chủ T-DNA tồn tại một chút T- khuẩn. complex thành thục, phân tử T-strand có độ dài hoàn chỉnh với vỏ là một số phân tử VirE2. Những phân tử này là T-DNA cấu trúc và protein cần thiết cho Trong đoạn T-ADN gắn vào bộ gen có chứa ít nhất 3 gen tổng vận chuyển nhân đến nhân tế bào ký chủ, đây là bƣớc chính trong quá trình hợp các phytohormon auxin và cytokinin nên liên quan đến việc biến nạp di truyền; sản sinh hay duy trì sự phân chia tế bào liên tục tạo thành các .Bƣớc 7: thâm nhập vào nhân; khối u ở cây trồng. .Bƣớc 8: vận chuyển trong nhân; .Bƣớc 9: T- DNA không vỏ bọc; .Bƣớc 10: hòa hợp với di truyền ký chủ. Chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens phụ thuộc vào một số yếu tố liên quan đến vi khuẩn và thực vật. Các bƣớc chuyển gen nhờ vi khuẩn Các yếu tố liên quan đến vi khuẩn bao gồm: Bƣớc 1: Tách và nhân vi khuẩn Chủng vi khuẩn, Vi khuẩn A. tumefaciens là vi khuẩn gram âm trong đất (hình 5.24), phân lập và nuôi cây nhân vi khuẩn là bƣớc đầu tiên phục vụ Mật độ vi khuẩn, công việc chuyển gen. Thời gian lây nhiễm, Nuôi cấy, nhân vi khuẩn thông thƣờng trên môi trƣờng L-broth Hoạt tính của gen vir, (LB), trong điều kiện 28oC, máy lắc 200 vòng phút, bổ sung kháng sinh phù hợp từ 8-12 giờ. Khả năng xâm nhập vào các cây chủ và loại vectơ. Kháng sinh bổ sung trong nuôi nhân vi khuẩn, thƣờng là Các yếu tố liên quan đến thực vật gồm: kanamycin nồng độ 50 mg/ml, carbenicillin nồng độ 50 hoặc 100 Loại cây, kiểu gen, mg/ml, và tetracycline nồng độ 2 mg/ml. Dạng mẫu mô, Sau khi nhân tách dịch khuẩn bằng ly tâm và nhân vi khuẩn để sử dụng chuyển gen. Khả năng phân bào của các tế bào đích và TP môi trƣờng Bƣớc 2: Gắn ADN cần chuyển vào Ti - plamid của vi khuẩn Các kỹ thuật chủ yếu của bƣớc này là tách ADN cần chuyển bằng ezime, tách Ti - plamid của vi khuẩn và cắt đoạn ADN tƣơng ứng tại vị trí nhân gen của plamid (Multiple cloning site - MCS). Đƣa DNA và Ti - plamid đã cắt đoạn tƣơng ứng và enzyme T4 - Ligase vào môi trƣờng đệm T4 để nối ghép DNA với Ti - plamid trong điều kiện nhiệt độ thấp qua đêm, kết quả thu đƣợc Ti - plamid đã gắn gen DNA cần chuyển dạng vòng. Bƣớc tiếp theo kiểm tra Ti - plamid trên E.coli xác định các Ti - plamid chuẩn đƣợc tách chuyển vào vi khuẩn A. tumefaciens, bƣớc tiếp theo lây nhiễm vào mô, tế bào thực vật chuyển gen. Hình 5.24. Vi khuẩn A.tumefaciens 15
16. 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Bước 3: Tách mô chuyển gen Vật liệu chuyển gen nhờ vị khuẩn có thể bằng đĩa lá, mô, calus, mô hạt được tách từ kiểu gen mong muốn cần chuyển gen, khử trùng, đưa lên môi trường nuôi cấy in vitro. Chuyển gen vào mô hạt khá phổ biến ở nhiều loài cây trồng như lúa, ngô, cây họ thập tự. Bước 4: Lây nhiễm vi khuẩn đã gắn plamid vào mô tế bào Lây nhiễm để chuyển gen bằng trộn vi khuẩn với vật liệu nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, môi trường chọn lọc là môi trường có kháng sinh. Những tế bào nhận gen chuyển đồng thời nhận được cả promoter và gen kháng kháng sinh sẽ sống sót các tế bào khác bị chết trên môi trường chọn lọc. Những tế bào nhận gen sống sót phát triển thành calus và đưa sang Hình 5.25. Vị trí nhân gen của Ti-plamid vi khuẩn A. tumefaciens môi trường tái sinh cây. Bảng 5.7. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen nhờ A. tumafaciens (Theo Sambrook và cs., 1989; Frame và cs., 2002) Thành phần LBa IM CCM ReM SeM RM N6/MS - N6 N6 N6 N6 MS Bƣớc 5: Tái sinh cây chuyển gen Sucrose (g/l) - 30 20 20 20 20 Glucose (g/l) - 60 10 10 10 Môi trƣờng tái sinh cây là môi trƣờng cơ bản MS, có cải tiến đặc L-proline (g/l) - 0,7 0,7 0,7 MES (g/l) - 0,5 0,5 thù với mỗi loài cây trồng bổ sung thêm các chất điều tiết sinh 2,4-D (mg/l) - 2 2 1 trƣởng, vitamin và các hợp chất hữu cơ khác. pH 7,0 5,2 5,8 5,8 5,8 5,8 Phytagel (g/l) - 3 3 3 3 AgNO (1mg/l) - 0,85 0,85 0,85 Sau khi tái sinh cây in vitro chuyển cây ra giá thể tiếp nhận hoặc 3 AS (mM) - 200 200 ngoài đất, nhân cây và đánh giá cây chuyển gen. Cefotaxime - 250 250 250 (mg/l) Myo-inositol - 1 (g/l) Paromycin - 100 100 (mg/l) Hóa chất khác Cao nấm men: 5g; Trypton: 10g; NaCl: 10g; Agar 15g Bước 6: Đánh giá cây chuyển gen Đánh giá cây chuyển gen thực hiện bằng các thí nghiệm đồng ruộng, thí nghiệm đánh giá trong nhà kính, nhà lưới. Thí nghiệm đánh giá kiểu hình kết hợp với marker phân tử để đánh giá nhanh và chính xác hơn. Cây trồng biến đổi gen trước khi đưa ra sản xuất đại trà cần được đánh giá rủi ro về an toàn sinh học, an toàn với sức khoẻ con người và an toàn với môi trường. 16