Bài giàng Vi sinh vật đại cương - Nguyễn Xuân Hòa (Phần 2)

130 trang hapham 2260

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Bài giàng Vi sinh vật đại cương - Nguyễn Xuân Hòa (Phần 2)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

bai_giang_vi_sinh_vat_dai_cuong_nguyen_xuan_hoa_phan_2.pdf

Nội dung text: Bài giàng Vi sinh vật đại cương - Nguyễn Xuân Hòa (Phần 2)

CHƯƠNG III- SINH LÝ HỌC VI KHUẨN -Giảng viên: BSTY. Nguyễn Xuân Hòa – PGS.TS. Phạm Hồng Sơn -Tóm tắt: Chương này thời lượng 10 tiết giảng với 32 trang lý thuyết xen kẽ hình ảnh minh họa. Nội dung chính của chương là nghiên cứu thành phần hóa học của tế bào vi khuẩn, các chất dinh dưỡng cần thiết cho tế bào vi khuẩn sinh trưởng và phát triển. Hiểu biết về chất dinh dưỡng chúng ta mới có thể thúc đẩy sự phát triển của những vi khuẩn có lợi đồng thời tìm cách ức chế sự phát triển của các vi sinh vật có hại. Tìm hiểu quá trình vận chuyển các chất vào ra tế bào vi khuẩn và giới thiệu các phương pháp xác định số lượng vi khuẩn. - Mục tiêu: Sinh viên cần nắm được thành phần hóa học của tế bào vi khuẩn, một số quá trình lên men, các phản ứng sinh hóa xẩy ra trong tế bào, phương thức vận chuyển chất dinh dưỡng và các phương pháp định lượng chính. I. DINH DƯỠNG Ở VI KHUẨN [1] 1.1. Thành phần hóa học tế bào vi khuẩn Chất dinh dưỡng đối với vi sinh vật, là bất kỳ chất nào được vi sinh vật hấp thụ từ môi trường xung quanh và được chúng sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp và tạo ra các thành phần của tế bào hoặc để cung cấp cho các quá trình trao đổi năng lượng. Quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng để thỏa mãn mọi nhu cầu sinh trưởng và phát triển được gọi là quá trình dinh dưỡng. Hiểu biết về quá trình dinh dưỡng là cơ sở tất yếu để có thể nghiên cứu, ứng dụng hoặc ức chế vi sinh vật. Không phải mọi thành phần của môi trường nuôi cấy vi sinh vật đều được xem là chất dinh dưỡng. Một số chất rất cần thiết cho vi sinh vật nhưng chỉ làm nhiệm vụ bảo đảm các điều kiện về thế oxi hóa khử, pH, áp suất thẩm thấu, cân bằng ion, Chất dinh dưỡng phải là các chất có tham gia vào các quá trình trao đổi chất nội bào. Thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật quyết định nhu cầu dinh dưỡng của chúng. Thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật gồm có nước (nước tự do và nước liên kết) và vật chất khô (muối khoáng và hợp chất hữu cơ). Lượng chứa của các nguyên tố trong vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Các điều kiện nuôi cấy vi sinh vật khác nhau, các giai đoạn khác nhau, lượng chứa các nguyên tố trong cùng một loài vi sinh vật cũng không giống nhau. 1.1.1. Nước Nước là thành phần không thể thiếu được đối với cơ thể sống. Nước chiếm khoảng 70-90% khối lượng cơ thể vi sinh vật. Tất cả các phản ứng xẩy ra trong tế bào vi sinh vật
đều đòi hỏi có sự tồn tại của nước. Trong vi khuẩn lượng chứa nước thường là 70-85%, nấm sợi 85-90%. Từ thời cổ xưa người ta đã biết sấy khô các loại thực phẩm để đình chỉ sự phát triển của vi sinh vật. Việc dùng muối hoặc đường để bảo quản thực phẩm chẳng qua cũng tạo ra sự khô cạn về sinh lý không thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật. Nước trong tế bào thường tồn tại ở hai trạng thái khác nhau: nước tự do và nước liên kết. Nước tự do là nước không tham gia vào cấu trúc các hợp chất hóa học của tế bào nên nó dễ bay hơi khi sấy khô. Nước liên kết là nước tham gia vào cấu tạo các hợp chất hữu cơ trong tế bào, nước liên kết khó tách ra khi sấy. Yêu cầu của vi sinh vật đối với nước được biểu thị một cách định lượng bằng độ hoạt động của nước trong môi trường ký hiệu aw. Độ hoạt động của nước hay độ hoạt động của thủy phần môi trường được xác định: aw= Ở đây P là áp lực hơi nước của dung dịch, còn Po là áp lực hơi của nước nguyên chất, dung dịch có nồng độ càng cao thì P càng nhỏ. Nước nguyên chất có aw=1, nước biển có aw=0,98, máu người aw=0,995, cá muối có aw= 0,75. Mỗi vi sinh vật thường có một aw tối thích và một aw tối thiểu, một số vi sinh vật có thể phát triển được trong môi trường có áp suất thẩm thấu cao người ta gọi chúng là các vi sinh vật chịu áp lực cao. Chẳng hạn aw có thể chấp nhận được của Saccharoces rouxii là 0,85, Halococcus là 0,75. Khả năng chịu khô hạn của nấm cao hơn so với các vi sinh vật khác. Phần nước có thể tham gia vào các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật được gọi là nước tự do. Phần lớn nước trong vi sinh vật tồn tại dưới dạng nước tự do. Nước kết hợp là nước liên kết với các hợp chất hữu cơ cao phân tử trong tế bào (L, P, hydrate carbon, ), nước liên kết mất khả năng hòa tan và lưu động. 1.1.2. Vật chất khô - Muối khoáng Muối khoáng là phần còn lại khi đốt cháy hoàn toàn chất hữu cơ chúng chiếm khoảng 2-5 % khối lượng khô của tế bào. Chúng thường tồn tại dưới dạng các muối sulphate, phosphate, carbonate, clorua, trong tế bào chúng thường ở dạng các ion. Dạng 2+ 2+ + + - 2- - cation như : Mg , Ca , K , Na , Dạng anion như HPO4 , SO4 , Cl , Các ion trong tế bào vi sinh vật luôn tồn tại ở những tỷ lệ nhất định nhằm duy trì pH và áp suất thẩm thấu cho từng loài vi sinh vật. Thành phần hoá học của một tế bào vi khuẩn Phân tử % khối lượng khô Protein 55 Polysaccharide 5 Lipid 9,1 ADN 3,1
ARN 20,5 Tổng các đơn phân tử 3,5 Acid amine và tiền thể 0,5 Đường và tiền thể 2 Nucleotit và tiền thể 0,5 Các ion vô cơ 1 -Chất hữu cơ Chất hữu cơ trong tế bào vi sinh vật chủ yếu cấu tạo từ các nguyên tố C, H, O, N, P, S, Riêng 4 nguyên tố C, H, O, N chiếm tới 90-97% toàn bộ chất khô của tế bào. Đó là các nguyên tố chủ chốt cấu tạo nên protein, nucleic acid, lipid, hydrate carbon. Trong tế bào vi khuẩn các hợp chất đại phân tử thường chiếm tới 96% khối lượng khô, các chất đơn phân tử chiếm 3,5%, còn các ion vô cơ chỉ có 1%. +Protein: Cấu tạo chủ yếu từ các nguyên tố: C, O, N, H, S ngoài ra còn có thể có một lượng rất nhỏ các nguyên tố khác nhau như P, Fe, Zn, Mn, Ca, Đơn phân cấu tạo nên các protein là các acid amine. Các acid amine trong phân tử protein đuợc liên kết với nhau bằng liên kết peptide (liên kết cộng hoá trị -CO-NH-). Liên kết này được tạo thành do phản ứng kết hợp giữa nhóm carboxil (COO- )của acid amine + này và nhóm amine (NH 3) của một acid amine khác và loại đi một phân tử nước. +H N - CH(R ) - COO- + +H N - CH(R ) - COO-→+H N - 3 1 3 2 3 CH(R ) - C(O) - NH - CH(R ) - COO- + H O 1 2 2 Tùy theo số lượng các acid amine liên kết với nhau mà ta có dipeptide , tripeptide, tetrapeptide, phân tử có 15 liên kết peptide trở lên được gọi là polypeptide, protein được hình thành từ một vài chuỗi polypeptide. Có 20 loại acid amine tham gia vào cấu trúc của protein, số acid amine rất lớn nên có thể tạo ra được nhiều loại protein khác nhau. Các protein có thể được xếp loại theo hình dạng, theo cấu trúc hoặc theo chức năng: +Xếp loại theo hình dạng: Protein hình sợi, Protein hình cầu. + Xếp loại theo cấu trúc: Protein đơn giản, protein phức tạp (protein kết hợp) Nucleoprotein (Protein + acid nucleic) Glycoprotein (Protein +hidrate carbon) Lipoprotein (Protein +lipid) Mucoprotein (Protein + mucopolysaccharide) Phosphorprotein (Protein + acidphosphoric)
+Xếp loại theo chức năng: Protein phi hoạt tính (kiến tạo, dự trữ, ) Protein hoạt tính (xúc tác, vận tải, chuyển động, truyền xung thần kinh, bảo vệ, ) Trong tế bào vi sinh vật ngoài những acid amine tham gia cấu trúc protein còn có những acid amine ở trạng thái tự do. +Acid nucleic: Cấu tạo chủ yếu bởi các nguyên tố, C, H, O, N, P, căn cứ vào phân tử đường pentose trong phân tử mà acid nucleic chia làm hai loại: ADN (acid deoxiribonucleic, chứa deoxiribose) và ARN (acid ribonucleic, chứa ribose). Các sản phẩm thủy phân của 2 loại acid nucleic này như sau: +ARN → Polynucleotit→ Nucleotit (acid phosphoric, nucleozit (D-Ribose, bazơ nitơ)) Bazơ nitơ ( Adenin-A, Guanin-G, Uraxin-U, Cytozin-C) +ADN → Polynucleotit→ Nucleotit (Ax. phosphorric, nucleozit) Nucleozit: (D-2-Deoxibose, bazơ nitơ) Bazơ nitơ ( Adenin-A, Guanin-G, Thymin-T, Cytozin-C) Tỷ lệ G + C ở các vi sinh vật khác nhau là có thể không giống nhau. Đây là một chỉ tiêu quan trọng trong phân loại hiện nay. Ví dụ: Chi G+C mol % Clostridium 26-34 Proteus 38-42 Staphylococcus 30-40 +Lipid: gồm có hai loại, lipid phân cực và lipid trung tính Lipid phân cực: nó ở trạng thái hoạt động, tham gia vào cấu trúc màng (lypoprotein, phosphorlipid, glycolipid) Lipid trung tính nó ở dạng dự trữ (các hạt lipid dự trữ trong tế bào chất) Mesosom là nơi chuyển hóa phosphor lipid từ dạng trung tính dự trữ sang dạng hoạt động, nó như mạng lưới nội chất ở vi sinh vật. Tế bào phát triển thì màng tế bào rộng ra khi đó lipid từ dạng dự trữ nó chuyển sang dạng hoạt động để tham gia cấu trúc. +Glucide: (gluxit) Tế bào vi khuẩn thường chứa một lượng glucide, khoảng 12-18 % trọng lượng chất khô. Các glucide thường gặp gồm các dạng đường đơn (ose), đường kép (osie) đường đa. Các loại đường đa thường gặp ở vi sinh vật là: glucan (glucarl), dextran (dextrane), amylose, chitin, cellulose , Glucide tham gia cấu tạo acid nucleic, vào cấu trúc của thành tế bào, vỏ nhầy, của vi sinh vật. Vỏ nhầy và việc hình thành vỏ nhầy liên quan đến độc lực và quá trình
bảo vệ vi khuẩn. Một số polysaccharide có thể phối hợp với protein để hình thành gluco- protein. Gluco-protein là kháng nguyên của cơ thể vi sinh vật, polysaccharide đóng vai trò bán kháng nguyên. Một số polysaccharide vi sinh vật cũng có khả năng kích thích cơ thể sản sinh kháng thể. Glucide còn là nguồn dự trữ năng lượng và là sản phẩm trung gian của các quá trình trao đổi năng lượng trong tế bào vi sinh vật. +Vitamine: đây là nhóm chất hữu cơ vi sinh vật cần nhưng không tự tổng hợp được và chỉ cần với lượng rất ít. Nhu cầu về vitamine của các loại vi khuẩn khác nhau không giống nhau. Có những loại vi sinh vật tự dưỡng chất sinh trưởng, chúng có thể tự tổng hợp được các vitamine cần thiết. Nhưng cũng có những loại vi sinh vật dị dưỡng chất sinh trưởng, chúng đòi hỏi phải được cung cấp ít hay nhiều các loại vitamine khác nhau. vitamine có vai trò rất quan trọng trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Với lượng rất nhỏ vitamine sẽ giúp cho vi sinh vật phát triển bình thường. vitamine có thể xem là những chất xúc tác sinh học và phần lớn các vitamine là nguyên liệu để cấu tạo men. Nhiều vitamine có vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hóa vật chất (như trong chu trình Crebs, trong các quá trình quang hợp, ). Trong tự nhiên có một số vi sinh vật muốn phát triển bình thường phải cần cung cấp một hoặc nhiều loại vitamine khác nhau. Có một số nòi có mức độ phát triển tỷ lệ thuận với nồng độ của những vitamine nhất định trong môi trường. Người ta sử dụng chúng để kiểm tra và định lượng các vitamine này. Vitamine Dạng coenzyme Chức năng Oxi hoá và khử B1 (Tiamine) Tiamine pirophosphate (TPP) carboxil các ketoacid, chuyển nhóm aldehyd Flavinmononucleotit (FMN), Chuyển hydro B (Riboflavin) 2 flavin adenin dinucleotit (FAD) Oxi hoá ketoacid và B3 (Acid pantotenic) CoenzymeA tham gia vào trao đổi chất của acid béo Nicotin adenin dinucleotit Khử và chuyển hydro B (Niaxin) 5 (NAD) và NADP Chuyển amine, khử B (Pyridoxin) Pyridoxin phosphate 6 amine Chuyển CO và B (Biotin) Biotin 2 7 nhóm cacboxilic Trao đổi canxi và D Vitamine 1,25-dihydroxicole - canxiferol 2 phốt pho
Dưới đây là lượng chứa vitamine trong một vài loại vi sinh vật (γ/g trọng lượng khô) Enterobacter Pseudomonas Clostridium Torulopin Vitamine acrogenes fluorescens butyricum utilis Acid 249 210 250 500 nicotinic Riboflavin 44 67 55 49 Thiamine 11 26 9 6.2 Piridoxin 7 6 6 - Acid 140 91 93 130 pantotenic Acid folic 14 9 3 2.8 Biotin 4 7 - 1.8 +Enzyme: Như những sinh vật khác ở vi sinh vật luôn luôn xẩy ra quá trình trao đổi vật chất. Nói cách khác, quá trình sống, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật bao gồm rất nhiều phản ứng của các quá trình phân giải và tổng hợp. Các phản ứng này tiến hành được trong điều kiện bình thường là do trong cơ thể của vi sinh vật có nhiều loại men. Men có nguồn gốc protein hay nói cách khác nó có bản chất protein. Dựa vào bản chất hóa học có thể chia men ra làm hai loại -Men đơn giản: tương ứng với lớp protein đơn giản, gồm những loại có thành phần thuần túy là acid amine và tính xúc tác sinh học của chúng được quy định bởi cấu trúc phân tử của protein. - Men phức tạp: ngoài thành phần được gọi là protein (apoenzyme hay apofecment) còn có phần không phải protein (gọi là nhóm thêm hay coenzyme hay cofecment) như vitamine hay khoáng. Men phải có phân tử lượng lớn mới có quá trình chuyển hóa cấu hình không gian từ đó mới có thể xúc tác phản ứng hóa học. Mỗi men đều có trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt động là nơi cơ chất tham gia phản ứng gắn kết vào dưới tác động của men. Dựa vào vị trí tác dụng của men đối với cơ thể vi sinh vật người ta chia men làm hai loại Men nội bào và men ngoại bào. Men nội bào (endoenzyme) ở trong tế bào vi khuẩn và phát huy tác dụng xúc tác chuyển hóa trong tế bào. Men ngoại bào exoenzyme) phát huy tác dụng ở cả trong và ngoài cơ thể vi sinh vật. Trong cơ thể vi khuẩn chúng có hàng trăm loại men và chúng hoạt động rất nhịp nhàng. Kết quả hoạt động của chúng giúp cho hoạt động sống của sinh vật diễn ra bình
thường. Ngược lại vì một lý do nào đó men không hoạt động xúc tác bình thường thì cơ thể sẽ bị ảnh hưởng, quá trình sống của vi sinh vật sẽ bị trì trệ hoặc đảo lộn, vi khuẩn có thể bị tê liệt hay bị chết. + Sắc tố: Khuẩn lạc của nhiều vi sinh vật có màu sắc rõ rệt. Màu sắc có khi chỉ xuất hiện trong khuẩn lạc, có khi hòa tan vào trong nước và khuếch tán ra môi trường xung quanh. Việc tạo thành các màu sắc này là một trong những đặc điểm thường được sử dụng khi phân loại vi sinh vật (nhất là nấm mốc và xạ khuẩn). Ngoài sắc tố quang hợp (được sinh ra từ các vi sinh vật dinh dưỡng quang năng) còn có nhiều sắc tố khác. Sắc tố của vi sinh vật thuộc nhiều nhóm các hợp chất rất khác nhau: carotenoit, phenazim, piaron, araquinon, antoxiamine, Khi có mặt của sắc tố carotenoit khuẩn lạc có màu đỏ da cam (Sarcina, Micrococcus, Mycobacterium, Corynebacterium, ). Các sắc tố carotenoit phân bố trong màng nguyên sinh chất của tế bào. Loại sắc tố này giúp cho vi khuẩn tránh khỏi ảnh hưởng có hại của ánh sáng mặt trời và ánh sáng tử ngoại. Các sắc tố này cùng với bacteriochlorophill có hoạt tính quang hợp. Sắc tố puncherimin được tạo thành trong nấm men Candida puncherima. Sắc tố này nếu trên môi trường có chứa Fe nó sẽ tạo nên màu đỏ tối. Sắc tố prodigiozin làm cho khuẩn lạc Serratia marcescens (Bacterium prodigiosum) có màu đỏ sáng. Sắc tố indigoidin ở Pseudomonas indigofera và nhiều vi khuẩn khác làm cho vi khuẩn có màu lam. Vi khuẩn mủ xanh Pseudomonas acruginosa tạo thành sắc tố piocianin và một số sắc tố khác. Một số sắc tố có tính chất kháng sinh. Chính vì vậy nhiều vi sinh vật có màu sắc có khả năng sinh ra chất kháng sinh. II. CÁC KIỂU DINH DƯỠNG Ở VI KHUẨN [2] Khi nuôi cấy vi sinh vật người ta phải pha chế môi trường có thể ở dạng lỏng hoặc đặc. Trong môi trường có thể có loại chất hữu cơ có loại là chất vô cơ vô cơ. Không phải mọi thành phần của môi trường đều có thể gọi là chất dinh dưỡng. Một số thành phần của môi trường chỉ có nhiệm vụ đảm bảo các điều kiện thích hợp về thế oxi hóa, về pH, áp suất thẩm thấu, cân bằng ion, Chất dinh dưỡng phải là những chất có tham gia vào trao đổi chất của tế bào. Quá trình hấp thu các chất dinh dưỡng từ môi trường xung quanh vào cơ thể sinh vật được gọi là quá trình dinh dưỡng. 2.1. Nhu cầu về thức ăn của vi sinh vật Các chất dinh dưỡng sau khi vào tế bào sẽ được chế biến lại để tạo thành các chất riêng của cơ thể. quá trình này được gọi là quá trình đồng hóa, quá trình này cần năng lượng. Ngược lại với quá trình đồng hóa là quá trình dị hóa. Các sản phẩm của quá trình dị hóa sẽ được thải ra môi trường xung quanh hoặc một phần được sử dụng lại cho quá trình đồng hóa. Căn cứ vào nhu cầu của vi sinh vật người ta chia thức ăn làm ba loại:
-Thức ăn năng lượng: thức ăn sau khi hấp thu sẽ cung cấp cho vi sinh vật một số năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của tế bào. Các loại protein, glucid, lipid, là những thức ăn năng lượng thường gặp. -Thức ăn kiến tạo: thức ăn loại này sau khi hấp thụ sẽ tham gia xây dựng các cấu trúc của vi sinh vật. Trong thực tế thì một loại thức ăn nó vừa là nguồn năng lượng vừa là nguyên liệu để xây dựng các cấu trúc. -Chất sinh trường: là những chất cần thiết cho hoạt động sống của một loại vi sinh vật nào đó mà nó không tự tổng hợp được. Căn cứ vào, nguồn các bon, nguồn năng lượng, chất nhận điện tử cuối cùng, người ta phân chia vi sinh vật thành các kiểu dinh dưỡng sau. Căn cứ vào nguồn carbon: người ta chia vi sinh vật ra làm hai nhóm, dị dưỡng carbon và tự dưỡng carbon. + Dị dưỡng carbon: vi sinh vật dị dưỡng carbon là loại vi sinh vật sử dụng nguồn carbon trong tự nhiên từ các hợp chất hữu cơ. Từ hợp chất hữu cơ này ngoài nguồn carbon vi sinh vật còn thu được nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của mình. Số năng lượng trong quá trình chuyển hóa và hấp thu sẽ khác nhau tùy loại vi sinh vật. +Tự dưỡng carbon: là nhóm vi sinh vật sử dụng nguồn các bon từ các chất vô cơ như CO2 hoặc các muối carbonate. Quá trình này cần năng lượng, vi sinh vật có thể sử dụng hai nguồn năng lượng như: sử dụng trực tiếp năng lượng của ánh sáng mặt trời, sử dụng năng lượng hóa học nhờ sự oxi hóa hợp chất vô cơ. Căn cứ vào nguồn năng lượng: chia vi sinh vật thành dinh dưỡng quang năng và dinh dưỡng hóa năng. +Dinh dưỡng quang năng: là những vi sinh vật nhờ có sắc tố quang hợp mà có khả năng hấp thu năng lượng từ ánh sáng mặt trời và chuyển hóa thành năng lượng hóa học (tích lũy dưới dạng ATP) +Dinh dưỡng hóa năng: là những vi sinh vật sử dụng năng lượng chứa trong các hợp chất hóa học. Căn cứ vào nguồn carbon và nguồn năng lượng: người ta chia vi khuẩn thành các kiểu dinh dưỡng sau: a- Tự dưỡng: -Tự dưỡng quang năng: Nguồn C là CO2, nguồn năng lượng là ánh sáng. -Tự dưỡng hoá năng: Nguồn C là CO2, nguồn năng lượng là một số hợp chất vô cơ đơn giản. b- Dị dưỡng: Vi khuẩn đòi hỏi một phần hoặc toàn bộ nguồn dinh dưỡng phải là chất hữu cơ có sẵn: hydrate carbon (đường, tinh bột, cellulose , ). Còn nguồn N là các acid amine, yếu tố phát triển hoặc sinh trưởng là các vitamine, hoặc các chất chuyển hóa. -Dị dưỡng quang năng: Nguồn C là chất hữu cơ, nguồn năng lượng là ánh sáng. Ví dụ: ở vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía.
-Dị dưỡng hoá năng: Nguồn C là chất hữu cơ, nguồn năng lượng là từ sự chuyển hoá trao đổi chất của chất nguyên sinh của một cơ thể khác. -Dị dưỡng hoại sinh: Nguồn C là chất hữu cơ, nguồn năng lượng là từ sự trao đổi chất của chất nguyên sinh các xác hữu cơ. -Dị dưỡng kí sinh: Nguồn C là chất hữu cơ, nguồn năng lượng là lấy từ các tổ chức hoặc dịch thể của một cơ thể sống. Ví dụ vi sinh vật gây bệnh cho con người, thực vật, động vật. Loại này chỉ phát triển được trên cơ thể sống. Như vậy là tùy từng nhóm vi sinh vật mà nguồn carbon được cung cấp có thể là chất hữu cơ hoặc chất vô cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thu các nguồn thức ăn carbon khác nhau phụ thuộc vào hai yếu tố: một là thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn này, hai là đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật. Trên trái đất này không có một hợp chất hữu cơ nào mà không bị vi sinh vật này hay vi sinh vật khác phân giải, hay nói cách khác không có hợp chất hữu cơ nào bền vững tuyệt đối với vi sinh vật. Có những loại vi sinh vật có thể đồng hoá được các hợp chất rất bền như cao su, chất dẻo, dầu mỏ, parafin, khí thiên nhiên. Ngay focmon là chất diệt khuẩn cực mạnh nhưng có nhóm nấm sợi sử dụng chúng làm thức ăn. Nhiều chất hữu cơ vì không tan được trong nước hoặc vì có khối lượng phân tử quá lớn cho nên trước khi hấp thụ vi sinh vật phải tiết ra enzyme thủy phân (amylase, cellulose, proteinase, ) để chuyển chúng thành các hợp chất dễ hấp thụ (đường, acid amine, acid béo, ). Người ta thường sử dụng đường để làm thức ăn carbon cho vi sinh vật dị dưỡng. Chú ý rằng đường đơn khi ở nhiệt độ cao có thể chuyển hoá thành những hợp chất có màu tối gọi là đường cháy, khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm, sau khi khử trùng đường còn dễ bị acid hoá làm thay đổi pH môi trường. Để tránh hiện tượng này khi hấp khử trùng môi trường đường người ta thường hấp ở áp lực 0,5atm (112,50C) và duy trì trong 30 phút. Với các loại đường đơn, tốt nhất là nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn, hoặc dùng các nến lọc hay màng lọc vi khuẩn. Khi chế tạo môi trường chứa tinh bột, trước hết phải hồ hoá tinh bột ở 60-700C, sau đó đun sôi rồi mới đưa đi hấp cao áp. cellulose được đưa vào các môi trường nuôi cấy vi sinh vật phân giải cellulose dưới dạng giấy lọc, bông hoặc các bột cellulo. Khi sử dụng lipid, parafin, dầu mỏ, để làm nguồn carbon nuôi cấy một số loại vi sinh vật, phải thông khí mạnh để cho từng giọt nhỏ có thể tiếp xúc được với thành tế bào vi sinh vật. Nồng độ đường để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác nhau là không giống nhau, với vi khuẩn, xạ khuẩn thì dùng 0,05-0,2 % đường còn với nấm men thì dùng 3-10% đường. Hầu hết vi sinh vật chỉ đồng hoá được đường ở dạng đồng phân D, và phần lớn đồng phân của đường đơn trong tự nhiên là dạng D chứ không phải dạng L.
Các hợp chất hữu cơ chứa cả C và N cũng có thể sử dụng làm vừa làm nguồn C vừa làm nguồn N cho vi sinh vật (pepton, nước thịt, nước chiết nấm men, nước chiết giá đậu, nước chiết ngô, ). Phạm vi đồng hoá các nguồn thức ăn carbon của từng loài vi sinh vật cụ thể rất khác nhau. Có thực nghiệm cho thấy vi khuẩn Pseudomonas cepacia có thể đồng hoá trên 90% loại nguồn thức ăn carbon, trong khi đó các loại vi khuẩn sinh mêtan chỉ có thể đồng hoá được CO2 và vài hợp chất chứa 1 hoặc hai carbon mà thôi. Với các vi sinh vật dị dưỡng nguồn thức ăn carbon làm cả hai chức năng: nguồn dinh dưỡng và nguồn năng lượng. Một số vi khuẩn dị dưỡng, nhất là các vi khuẩn gây bệnh, sống trong máu, trong các tổ chức hoặc trong ruột người và động vật muốn sinh trưởng được, ngoài cabon hữu cơ cần phải được cung cấp một lượng nhỏ CO2 thì mới phát triển đựơc. Trong công nghiệp lên men, nguồn rỉ đường là nguồn carbon rẻ tiền và rất thích hợp sử dụng đối với nhiều loại vi sinh vật khác nhau. 2.2. Nguồn thức ăn nitơ của vi khuẩn Nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của vi sinh vật, nguồn Nitơ dễ + hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH 4, chúng xâm nhập vào tế bào dễ dàng và ở đó tạo nên các nhóm amine. Trước đây có một số quan điểm cho rằng, một số vi khuẩn không sử dụng muối amon để đồng hoá được. Quan điểm này không đúng, ngày nay người ta cho rằng tất cả các loại vi sinh vật đều có khả năng sử dụng muối amon. Urea là nguồn thức ăn nitơ trung tính về mặt sinh lý, khi bị phân giải bởi enzyme urease nó sẽ giải phóng thành NH3 và CO2. NH3 được vi sinh vật sử dụng mà không làm chua môi trường như các muối amon. NH2-CO-NH2+ H2O (urease)→ NH3+ CO2 Nhiều khi để nuôi cấy vi sinh vật bằng nguồn nitơ từ urê, người ta phải bổ sung thêm muối amon là vì phải có thức ăn nitơ dễ hấp thụ cho vi sinh vật phát triển đã khi đó mới có men urease để thủy phân urea. Nguồn nitơ có trữ lượng nhiều nhất trong tự nhiên đó là nguồn khí nitơ tự do (N2) trong khí quyển. Chúng chiếm tỷ lệ cao trong không khí (75,5% về khối lượng hoặc 78,16% theo thể tích). Số lượng nitơ trong khí quyển trên mỗi ha đất là 85000 tấn, trên trái đất có khoảng 4x1015 tấn. Trong phân tử khí nitơ hai nguyên tử N liên kết với nhau bằng ba liên kết rất bền vững vì vậy nó khó tách ra để liên kết với các chất khác và nitơ tuy có nhiều chung quanh ta mà cả người, động vật lẫn cây trồng đều thiếu thức ăn nitơ. Đa số vi sinh vật không có khả năng đồng hoá N2 trong không khí, tuy nhiên có những vi sinh vật có thể chuyển hoá N2 thành NH3 nhờ hoạt động xúc tác của một hệ thống enzyme có tên gọi là nitrogenase. Người ta gọi các vi sinh vật này là vi sinh vật cố định nitơ còn quá trình này đuợc gọi là quá trình cố định nitơ (vi khuẩn cố định ở nốt sần cây họ đậu). Nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là pepton loại chế phẩm thủy phân không triệt để của một loại protein nào đó.
Về acid amine Người ta nhận thấy có thể có 3 mối quan hệ khác nhau đối với từng loại vi sinh vật. Có những loại vi sinh vật không cần đòi hỏi cung cấp bất kỳ một loại acid amine nào. Chúng có khả năng tổng hợp ra toàn bộ những acid amine mà chúng cần từ những nguồn nitơ vô cơ hay hữu cơ chuyển thành dạng NH3 để xây dựng cơ thể. Người ta gọi nhóm vi sinh vật này là tự dưỡng amine. Có những vi sinh vật bắt buộc phải cung cấp thêm một số acid amine trong quá trình sống mà chúng không có khả năng tổng hợp được gọi chúng là vi sinh vật dị dưỡng acid amine, loại này chúng tổng hợp protein và nguyên sinh chất của mình từ những acid amine có sẵn, acid amine được sử dụng làm nguyên liệu trực tiếp không bị phân giải thành NH3. Protein là hợp chất cao phân tử chúng không thể xâm nhập vào tế bào vi sinh vật. Vì vậy chỉ có những vi sinh vật tiết vào môi trường men protease thủy phân protein thành peptid và acid amine thì nó mới có khả năng đồng hóa được protein . Rất nhiều vi sinh vật có được khả năng này, đặc biệt là các vi sinh vật gây thối yếm khí. Loại thứ ba là vi sinh vật không có các acid amine trong môi trường vẫn phát triển được, nhưng nếu có mặt của một số acid amine thì chúng phát triển tốt hơn. Nhu cầu về các loại acid amine ở các loài vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Để tìm hiểu mối quan hệ giữa acid amine của một chủng vi khuẩn nào đó, trước hết người ta cấy chúng lên môi trường dinh dưỡng có nguồn nitơ duy nhất là muối amon. Nếu chúng phát triển được, chứng tỏ chúng thuộc nhóm tự dưỡng amine. Nếu chúng không phát triển được và sau khi bổ sung dịch acid amine (thủy phân casein có trộn thêm tryptophan) lại phát triển tốt thì chúng thuộc nhóm dị dưỡng acid amine, nếu sau khi bổ sung acid amine mà vẫn không phát triển được thì phải xem xét đến các yếu tố, nguồn carbon, vitamine, pH, Muốn biết quan hệ của một chủng vi khuẩn nào đó với từng loại acid amine riêng bịêt, người ta sử dụng môi trường có chứa đầy đủ nguồn thức ăn carbon, khoáng, vitamine (dạng hoá chất tinh khiết nhưng không chứa acid amine), lần lượt bổ sung từng loại acid amine vào môi trường và theo dõi sự phát triển của chúng đối với chúng vi sinh vật này. Cũng có thể đưa vào môi trường một hỗn dịch chứa đầy đủ các acid amine và các hỗn dịch đã loại bỏ một cách phân biệt từng acid amine một. Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật, sẽ xác định được nhu cầu của chúng đối với từng loại acid amine. Nhiều vi sinh vật có khả năng dùng một loại acid amine nào đó làm nguồn thức ăn nitơ duy nhất. Chúng sẽ phân giải amine này thành NH3 rồi sau đó tự tổng hợp nên các acid amine khác. Có những chủng vi sinh vật biểu hiện mối quan hệ mật thiết giữa nồng độ một acid amine nào đó trong môi trường và sự phát triển của chúng. Người ta gọi chúng là những vi sinh vật chỉ thị, dùng trong việc định lượng acid amine. Có thể dùng phương pháp gây đột biến để tạo ra các chủng vi sinh vật ''khuyết dưỡng'', tức là những chủng mất đi khả năng tự tổng hợp một chất nào đó, chúng trở nên mẫn cảm với sự có mặt với nồng độ của chất mà chúng cần (một acid amine, một
viatmin, ). Phương pháp phân tích acid amine nhờ vi sinh vật ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Nó cho phép phát hiện những nồng độ acid amine rất thấp. 2.3. Nguồn thức ăn khoáng đối với vi sinh vật Khi sử dụng các môi trường tự nhiên để nuôi cấy vi sinh vật, người ta không cần bổ sung thêm khoáng vì trong thức ăn đã có sẵn khoáng cần thiết (khoai tây, nước thịt, sữa, huyết thanh, sữa, pepton, nước chiết giá đậu, ). Ngược lại khi làm môi trường tổng hợp (nguyên liệu là hoá chất), phải bổ sung dầy đủ các nguyên tố khoáng cần thiết. Những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật cần nhiều cho quá trình sống gọi là nguyên tố khoáng đa lượng (P, K, Na, S, Mg, ) còn những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật chỉ cần ít trong quá trình sống gọi là nguyên tố khoáng vi lượng (Mn, Cu, Co, ). Nhu cầu về khoáng của các loài vi sinh vật khác nhau là không giống nhau, từng thời điểm khác nhau cũng khác nhau. Các nguyên tố khoáng thường được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật: P, S, Mg, Ca, Zn, Mn, Na, K. Nguyên tố P chiếm tỷ lệ cao nhất trong tất cả các nguyên tố khoáng của tế bào (thường chiếm 50% tổng số khoáng). P tham gia cấu tạo nhiều thành phần quan trọng của tế bào (acid nucleic, phosphorprotein, phosphorlipid, ). Sự có mặt của các muối phosphate (nhất là K2 HPO4, KH2PO4) tạo ra tính đệm cho môi trường, đảm bảo pH từ 4,5-8,0. Nguyên tố S cũng là một chất khoáng quan trọng trong tế bào vi sinh vật. Nó tham gia vào thành phần một số acid amine (cystin, cystein, methionin), một số vitamine (B1, B7) và một số coenzyme có vai trò quan trọng trong quá trình oxi hóa khử. Nguyên tố K chất khoáng chiếm tỷ lệ khá lớn trong thành phần khoáng tế bào vi sinh vật. Nhưng cho đến nay người ta chưa tìm thấy K tham gia vào thành phần nào trong nguyên sinh chất, cũng như không có enzyme nào chứa K. người ta nhận thấy K+ thường tồn tại ở trạng thái tự do ở mặt ngoài tế bào. Nhiều nghiên cứu K40 cho biết một phần đáng kể K tồn tại ở trạng thái liên kết lý hóa với protein và các thành phần khác của nguyên sinh chất. K có thể tác dụng như các oin kim loại khác thông qua việc ảnh hưởng đến tính chất hóa keo và hoạt động xúc tác của enzyme. Nhưng nhiều thí nghiệm cho biết việc thay thế K bằng các ion kim loại hóa trị I (Na, Li, Rb, Cs, ) đều không có kết quả. Có những tài liệu cho biết K tham gia vào việc hoạt hóa một số enyme amylase, invertase, phosphortrans acetylase, acetyl CoA-cyntherase, pyruvate phosphatekinase, ATP-ase. K làm tăng độ ngậm nước của hệ thống keo do đó ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất, nhất là các quá trình tổng hợp, K có những ảnh hưởng đáng kể đến quá trình hô hấp của các tế bào vi sinh vật. Na và Cl là những nguyên tố mà tế bào đòi hỏi với lượng không nhỏ nhưng cho đến nay người ta vẫn còn hiểu biết rất ít về vai trò sinh lý của chúng. Mg có vai trò quan trọng trong việc hoạt hóa nhiều loại men khác nhau và có vai trò trong việc liên kết cũng như tách rời các tiểu phần ribosome. Fe là thành phần có trong các loại men như cytochrome, cytochrome oxidase, peroxidase, catalase,
Bình thường khi nuôi cấy vi sinh vật người ta không cần bổ sung các nguyên tố vi lượng. Những nguyên tố này có sẵn trong nước máy, trong hóa chất, dung môi làm môi trường. Trong một số trường hợp cụ thể người ta phải bổ sung một số nguyên tố vi lượng như: bổ sung Zn khi nuôi cấy nấm mốc, bổ sung Co vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp vitamine B12. 2.4. Nhu cầu về chất sinh trưởng của vi sinh vật Vấn đề về chất sinh trưởng của vi sinh vật đã được L. Pasteur phát hiện từ khoảng 1859-1864, khi ông nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường chứa carbon, muối amon và một số thức ăn khác, Ông nhận thấy vi sinh vật phát triển yếu. Nhưng nếu bổ sung thêm một ít nước chiết các nguyên liệu thiên nhiên vào môi trường nói trên thì sự phát triển của vi sinh vật tăng lên rất nhiều. Năm 1912 K. Funk, nhà sinh hoá học người Ba Lan nhận thấy trong cám gạo có một chất hữu cơ có thể điều trị được bệnh tê phù ở gà. Ông cho rằng chất này thuộc acid amine không thay thế và đặt tên cho chúng là vitamine (có nghĩa là acid amine cần thiết cho sự sống). Thuật ngữ này được sử dụng rộng rãi tới ngày nay, mặc dù người ta biết rằng vitamine không phải là acid amine, nhiều loại vitamine không có chứa gốc amine nào trong cấu trúc của chúng. Người ta định nghĩa vitamine là những chất hữu cơ ngoại sinh hoàn toàn, cần thiết đối với hoạt động sinh sống bình thường của cơ thể người và động vật mặc dù chỉ cần với lượng rất là nhỏ. Thiếu bất kỳ một vitamine nào ở cơ thể người và động vật đều có thể bị những rối loạn nhất định trong trao đổi chất. Về bản chất thì ngày nay người ta đã xác định được phần lớn các vitamine là những thành phần của coenzyme. Những hợp chất hữu cơ có bản chất phi protein tham gia vào những biến đổi do enzyme xúc tác với tính chất là những yếu tố phù hợp không thể thiếu được. Tuy nhiên khái niệm chất sinh trưởng của vi sinh vật không hoàn toàn giống với khái niệm '' vitamine'' đối với cơ thể người và động vật. Đối với vi sinh vật thì khái niệm chất sinh trưởng là một khái niệm rất linh động. Nó chỉ có ý nghĩa là những chất hữu cơ cần thiết đối với hoạt động sống mà một loại vi sinh vật nào đó không tự tổng hợp được ra chúng từ những chất khác. Như vậy cùng một chất nhưng nó có thể là chất cần thiết (nếu vi khuẩn không tự tổng hợp được) nhưng nó lại không cần thiết (nếu vi khuẩn tự tổng hợp được) hoặc nó có thể là có tác dụng kích thích sinh trưởng (nếu như vi sinh vật nào đó tự tổng hợp được nhưng nhanh chóng tiêu thụ hết). Như vậy những chất có thể coi là chất kích thích sinh trưởng của loại vi sinh vật này hoàn toàn có thể không phải là chất sinh trưởng đối với một loại vi sinh vật khác. Hầu như không có chất nào là chất sinh trưởng chung cho tất cả các loại vi sinh vật. Thông thường các chất được coi là chất sinh trưởng đối với một loại nào đó có thể thuộc về một trong các loại sau đây: các gốc kiềm purin, pirimidin và các dẫn xuất của chúng, các acid béo và thành phần của màng tế bào, các vitamine thông thường.
Một số gốc kiềm không chỉ có mặt trong acid nucleic mà còn có mặt trong nhiều coenzyme, chẳng hạn như sự có mặt của adenin trong coenzyme A, FAD, FMN, ATP, NAD, NADP, III. CƠ CHẾ VẬN CHUYỂN CÁC CHẤT DINH DƯỠNG VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN [4] Để tồn tại và phát triển, tế bào vi sinh vật thường xuyên phải trao đổi chất và năng lượng với môi trường bên ngoài. Một mặt chúng nhận các chất dinh dưỡng cần thiết từ môi trường ngoài, mặt khác thải ra ngoài các sản phẩm trao đổi chất. Như vậy, giữa môi trường xung quanh và môi trường bên trong tế bào tồn tại một hàng rào thẩm thấu, hàng rào này chính là màng tế bào chất lypoprotein. Những dẫn chứng sau đây có thể chứng minh kết luận trên: Các hợp chất ưa lipid thường xâm nhập vào tế bào nhanh hơn các hợp chất kỵ lipid. Hơn nữa nếu xử lý vi sinh vật bằng các dung môi của lipid như butanol (gây nên việc tách các hợp chất phân tử thấp khỏi tế bào) thì hàng rào thẩm thấu của vi sinh vật có thể bị hủy hoại. Rõ ràng là màng tế bào chất phải có khả năng tinh vi, điều chỉnh sự ra vào các chất khác nhau, tế bào nhận và thải các chất một cách chọn lọc. Vận chuyển của các chất qua thành tế bào tương đối đơn giản. Sự xâm nhập của nước và các chất hòa tan qua màng tế bào chất là quá trình động học; tế bào vi sinh vật đang sống không bao giờ ở trạng thái cân bằng với môi trường xung quanh. Các chất được vận chuyển qua màng tế bào chất thông qua một trong hai cơ chế: khuếch tán đơn giản hay còn gọi là vận chuyển bị động và vận chuyển chủ động phân tử protein đặc biệt có trên bề mặt tế bào. 3.1. Khuếch tán thụ động Các phân tử đi qua màng nhờ sự chênh lệch nồng độ (trong trường hợp các chất không điện phân) hay chênh lệch điện thế (trường hợp các ion) ở hai phía của màng. Sự vận chuyển kiểu này không đòi hỏi bất kỳ một chi phí năng lượng nào của tế bào vi sinh vật. Hàng loạt các nghiên cứu đã khẳng định, trừ nước ra, rất ít các hợp chất có thể qua được màng tế bào theo cơ chế trên. Đa số các chất hòa tan qua màng do tác dụng của các chất vận chuyển đặc biệt:
3.2. Vận chuyển nhờ permease
Những phân tử protein vận chuyển sắp xếp trong màng liên kết với các phân tử chất hòa tan rồi chuyển chúng vào bề mặt bên trong của màng: từ đây các phân tử hòa tan được chuyển vào trong tế bào chất. Kiểu khuếch tán này được gọi là kiểu khuếch tán xúc tiến. Các phân tử protein vận chuyển nói trên được gọi là protein thấm-permease. Bản chất protein của permease được khẳng định bởi các dẫn chứng sau:[4] Việc tổng hợp permease thường được cảm ứng hoặc được kiềm chế như tổng hợp một số enzyme. Chloramphenicol ức chế việc tổng hợp protein cũng ức chế quá trình tổng hợp permease. Hàng loạt các protein màng mang tính chất của permease đã được tách ra. Tế bào vi sinh vật có khả năng tổng hợp một lượng lớn các permease, các acid amine và hydrate carbon. Tuy nhiên nếu hệ thống vận chuyển này đều được tổng hợp thường xuyên theo kiểu cấu trúc thì tế bào sẽ phí phạm về vật chất và năng lượng. Do đó, chúng ta không lấy làm lạ là, nhiều permease được tổng hợp theo kiểu cảm ứng hoặc kiềm chế. Ngoài ra protein thấm còn có enzyme vận chuyển.
Sự vận chuyển các chất dinh dưỡng nhờ permease có thể theo cơ chế thụ động (không cần năng lượng) hoặc chủ động (cần năng lượng tế bào). Theo cơ chế vận chuyển thụ động thì chất hòa tan liên kết thuận nghịch vào một vị trí trên phân tử permease nằm ở bên trong màng (có thể ở các lỗ của màng). Phức hợp chất hòa tan được vận chuyển theo cả hai phía của màng nhờ sự chênh lệch nồng độ của một chất nào đó, nghĩa là sự vận chuyển diễn ra theo kiểu ''xuôi dòng''. Sự vận chuyển thụ động đã được chứng minh ở một số vi sinh vật. Tuy nhiên vi sinh vật có khả năng tích luỹ một số chất với nồng độ cao hơn nhiều so với bên ngoài. Chẳng hạn nồng độ của K+ bên trong tế bào có thể cao gấp hàng ngàn lần so với bên ngoài. Để đảm bảo trung hòa điện tử, tế bào cũng phải thải ra ngoài các ion H+, hay Na+. Thêm vào đó người ta còn thấy ở các màng tế bào vi khuẩn có hoạt tính của ATP - ase là men có liên quan đến việc vận chuyển các chất. Như vậy trong tế bào vi sinh vật ngoài cơ chế vận chuyển thụ động còn tồn tại cơ chế vận chuyển chủ động nhờ permease. Sự vận chuyển này được tiến hành bất chấp gradien nồng độ nghĩa là theo kiểu ''ngược dòng'' năng lượng tiêu thụ có lẽ do ATP ( hình thành trong mesosom hoặc màng tế bào chất) cung cấp. Trong mô hình vận chuyển trên thì cùng một phân tử permease có thể đảm nhận cả chức vận chuyển chủ động lẫn chức vận chuyển thụ động (tùy theo sự có mặt hay vắng mặt của ATP). Ngày nay, người ta đã phân lập được hàng loạt protein vận chuyển trong các loài vi sinh vật. Giống như enzime, chúng có tính đặc hiệu cơ chất khác nhau. Một số có tính đặc hiệu hầu như tuyệt đối. Chẳng hạn như permease của galactose ở E. coli chỉ vận chuyển galactose. Các permease của đường và acid amine khác thể hiện tính đặc hiệu yếu hơn đối với các chất hòa tan. Điều đáng chú ý là, trong vi khuẩn sự vận chuyển chủ động của đường, phụ thuộc vào các quá trình phosphorryl hóa. Năm 1964 Kundig phân lập được một hệ thống phosphortransferase bao gồm hai men (E1 và E2) và một protein vận chuyển bền nhiệt (HPr) có khối lượng phân tử thấp. Các thành phần protein của hệ thống này đã được thuần khiết và phản ứng diễn ra hai bước: Trước hết E1 chuyển phosphate từ phosphorenolpiruvat (PEP) đến HPr: HPr +PEP → HPr-P + Piruvat Sau đó E2 chuyển phosphate từ HPr-P đến C6 của đường đơn. E1 là chung cho nhiều loại đường nhưng E2 lại đặc hiệu cho từng loại đường. Nghĩa là một đột biến nào đó ảnh hưởng đến việc tổng hợp E1 sẽ dẫn đến mất khả năng vận chuyển nhiều loại đường. Trái lại với đột biến như thế với E2 chỉ ảnh hưởng đến sự vận chuyển một loại đường. IV. TRAO ĐỔi CHẤT VÀ NĂNG LƯỢNG Khái niệm trao đổi chất Trao đổi chất là chỉ các chuyển hoá có liên quan đến qúa trình tổng hợp và phân huỷ trong tế bào. Trao đổi chất gồm có hai quá trình đồng hoá và dị hoá.
Quá trình đồng hoá: là quá trình chế biến lại các chất dinh dưỡng được hấp thụ thành chất riêng của tế bào từng loại vi sinh vật. Quá trình này còn gọi là sự trao đổi kiến tạo hay sự sinh tổng hợp, đây là quá trình thu nhiệt. Quá trình dị hoá: quá trình phân huỷ các thành phần bên trong tế bào. Sản phẩm của sự phân huỷ được thải ra ngoài môi trường hay được tế bào sử dụng. Quá trình trao đổi năng lượng: là quá trình phân huỷ có kèm giải phóng năng lượng. Ở sinh vật bậc cao quá trình dị hoá và trao đổi năng lượng chỉ là một, đó là sự oxi hoá các chất hữu cơ trong cơ thể để giải phóng năng lượng Q. Ở vi sinh vật quá trình trao đổi năng lượng không chỉ là quá trình dị hoá (phân huỷ các thành phần trong cơ thể) mà chủ yếu còn là quá trình phân huỷ với các chất được hấp thụ từ bên ngoài. Như vậy có thể nhận thấy quá trình TĐC ở vi sinh vật chính là sự tổng hợp các phản ứng hoá học diễn ra trong tế bào, gồm hai loại: -Các phản ứng giải phóng năng lượng-trao đổi năng lượng -Các phản ứng sử dụng năng lượng-trao đổi kiến tạo, (tổng hợp) Hai quá trình này tương tác và diễn ra đồng thời. Năng lượng sinh ra được dùng trong quá trình tổng hợp các thành phần cấu trúc tế bào (vách, màng). Tổng hợp các enzyme, acid nucleic, lipid, polysaccharid và năng lượng còn lại dùng cho các hoạt động sống khác của tế bào như sinh truowngr sinh sản, vận chuyển chất dinh dưỡng, di động. 4.1. Quá trình trao đổi năng lượng Quá trình TĐNL nhằm cung cấp năng lượng cho hoạt động sống của cơ thể là một mặt hoạt động sinh lý quan trọng của sinh vật nói chung và vi sinh vật nói riêng. Hoạt động sinh lý này như đã quen gọi là sự hô hấp. 4.1.1. Bản chất của sự hô hấp vi sinh vật Cũng như các sinh vật khác bản chất của hô hấp VSV là quá trình oxi hoá khử được thực hiện bằng sự khử hydrro của cơ chất và chuyển H này cho chất nhận, hoàn thành giai đoạn oxi hoá khử giải phóng ra năng lượng. Sự hô hấp khác nhau của VSV phụ thuộc vào chất nhận H cuối cùng của quá trình oxi hoá khử: có thể là oxi phân tử (O2), là chất hữu cơ hay chất vô cơ. Năng lượng giải phóng sẽ được giữ lại trong các hợp chất giàu năng lượng trong tế bào (ATP, axetyl photphat, axetyl CoA) trong số này quan trọng nhất là ATP. Năng lượng của của ATP được dùng trong hầu hết các phản ứng cần năng lượng; AMP, ADP, ATP rất dễ chuyển hoá tương hỗ lẫn nhau, do đó sử dụng rất tốt trong quá trình trao đổi năng lượng. AMP + H3PO4+ Q ⇔ ADP ADP + H3PO4+ Q ⇔ ATP So với động vật, hô hấp ở VSV có những điểm chung giống nhau nhung cũng có những điểm khác nhau, đó là: Qúa trình cung cấp năng lượng cho hoạt động sống
Không có bộ máy hô hấp chuyên trách, sự hô hấp xảy ra trên toàn bộ tế bào. Hô hấp có thể cần oxi như động vật nhưng cũng có thể không cần oxi (hô hấp yếm khí). Cơ chất để oxi hoá có thể là chất hữu cơ và cũng có thể là chất vô cơ. Một phần năng lượng của quá trình oxi hoá được chuyển thành nhiệt năng làm nóng môi trường. 4.1.2. Các loại hô hấp Vi sinh vật có thể oxi hoá khử các chất hữu cơ và vô cơ để cho năng lượng nhưng hầu như đại đa số VSV sử dụng chất hữu cơ mà chủ yếu là đường Glucose. Bất kể loại VSV nào dù hô hấp hiếu khí hay yếm khí thì chúng đều thực hiện giai đoạn đầu phân giải glucose giống nhau, theo 3 con đường chính sau đây: -Con đường E.M.P (Empden-Meyehof-pasnas) Glucose chuyển thành Pyruvat qua 10 phản ứng tạo ra các chất trung gian đều ở dạng photphoryl hóa: Glucose → 2 pyruvat +2ATP +2NADH2 Ở đây ATP (chất cao năng dùng phổ biến ở mọi tế bào) được tạo thành do photphoryl hóa cơ chất. Con đường EMP đã cung cấp 6 tiền chất dùng để tổng hợp các đơn vị cấu trúc là Glc-6-P, Fruct-6P, 3-P glyceraldehyd, 3-P-glyxerat, P-enol pyruvat và pyruvat. -Con đường PP (Pentozo-phostphat) Nhiều vi khuẩn bị đột biến lớn hơn một enzyme của con đường EMP nhưng vẫn chuyển hóa được glucose đến pyruvat nhờ con đường PP. Con đường này cung cấp cho tế bào hai tiền chất khác nhau trong tổng hợp các đơn vị cấu trúc là ribozo-5P (dùng để tổng hợp acid nucleic, ADP, ), erytroza -4-P- (tổng hợp các acid amin thơm) cùng các NADPH2 Glucoza → 1 pyruvat → +3 CO2 + 6NADPH2+1NADH2+1ATP -Con đường Enter-Doudoroff (KDPG) Chỉ gặp ở vi khuẩn chuyển hóa gluconat: Pseudomonas, saccharofhila và Alcaligenes phân giải 100% glucose theo con đường này Giữa 3 con đường chuyển hóa chuyển hóa trên có mối quan hệ qua lại với nhau và tùy thuộc vào loại hình vi sinh vật khác nhau tỷ lệ % đường được phân giải theo từng con đường là không giống nhau. 4.1.2.1. Hô hấp hiếu khí Là qúa trình oxy hóa khử cơ chất có sự tham gia của O2. Oxi là chất nhận điện tử cuối cùng. Thực hiện loại hô hấp này thuộc về nhóm vi sinh vật hiếu khí, nhưng căn cứ vào cơ chất bị oxi hóa để cho năng lượng mà phân thành hai loại hô hấp là: hô hấp hiếu khí dị dưỡng và hô hấp hiếu khí tự dưỡng. Hô hấp hiếu khí dị dưỡng: là loại hình hô hấp của các vi sinh vật dị dưỡng hóa năng. Quá trình hô hấp được diễn ra như sau Trước hết glucose được phân giải thành pyruvat theo một trong ba con đường phân giải khác nhau đó là con đường EMP, PP, KDPG, sau đó pyruvat đi vào chu trình ací tricacboxylic (ATC) hay còn gọi là chu trình Krebs.
Trước hết phần lớn pyruvat trong điều kiện có oxi được chuyển hóa thành axetyl -CoA nhờ phức hệ pyruvat-drhydrogenaza (PDH) Pyruvat +CoA + NAD → Axetyl-CoA +NADH2 +CO2 Các H+ và electron (e) tách ra từ cơ chất tham gia vào chu trình hô hấp và e được chuyển đến O2. Năng lượng thoát ra được tổng hợp thành ATP một cách mạnh mẽ nhờ chuỗi hô hấp. 4.1.2.2 Năng lượng hóa học Trong quá trình sống, như những sinh vật khác, vi sinh vật cũng cần có năng lượng. Các quá trình oxi hoá - phân hủy kèm với quá trình giải phóng năng lượng gọi là quá trình trao đổi năng lượng (năng lượng hóa học). Ở sinh vật bậc cao thì hai khái niệm trao đổi năng lượng và dị hoá gắn liền với nhau nhưng ở vi sinh vật thì hai khái niệm này có thể phân biệt với nhau. Có thể do lượng vật chất trong cơ thể vi sinh vật quá ít, nên trong quá trình sống chúng phải sử dụng cả các hợp chất thu được từ môi trường. Chuyển hóa năng lượng: năng lượng cần thiết cho quá trình sống của vi khuẩn có được là nhờ quá trình oxi hóa các cơ chất năng lượng. Sự chuyển hóa năng lượng (trao đổi năng lượng) của động vật bậc cao trùng hợp với quá trình trao đổi chất (đồng hóa và dị hóa). Nhưng đối với vi khuẩn không nhất thiết có sự trùng hợp này. Vi khuẩn có khả năng hấp thu năng lượng cơ chất năng lượng qua màng của tế bào. Đối với nhóm vi sinh vật kỵ khí quá trình oxi hóa sinh năng lượng không kèm theo việc liên kết với oxi không khí. Ngày nay người ta hiểu rằng oxi hóa không chỉ có nghĩa là liên kết với oxi mà bao gồm cả quá trình mất hydro như quá trình tách hydro hoặc quá trình mất electron tăng thêm hóa trị dương. Phụ thuộc vào sự có mặt của oxi trong quá trình chuyển hóa của vi khuẩn, người ta chia chúng ra làm các nhóm sau: +Vi khuẩn hiếu khí: cần oxi cho quá trình phát triển +Vi khuẩn kỵ khí: hô hấp kỵ khí thuần túy và lên men Hô hấp hiếu khí: ở vi khuẩn hô hấp là quá trình chuyển hóa năng lượng diễn ra trong chuỗi dài cytochrom có sự tham gia của men vàng Obiquinon, nhưng chất nhận e cuối cùng là O2 của khí trời. Hô hấp kỵ khí: chất nhận điện tử cuối cùng không phải là oxi mà là các chất vô cơ khác. Các vi khuẩn nhóm này không có hệ thống Cytocrom và các men peroxidase, deoxidase để phân hủy O2 cho nên O2 độc với chúng. Lên men: là quá trình hô hấp kỵ khí, trong đó chất nhận điện tử cuối cùng là một phần chất hữu cơ sinh năng lượng. Ví dụ : C6H12O6 (lên men rượu) 2CH3CH2OH + 2CO2 Tóm lại quá trình đồng hóa năng lượng là quá trình tăng ATP trong tế bào còn quá trình dị hóa là giảm ATP trong tế bào. *Phân loại vi khuẩn theo chuyển hóa năng lượng: chia vi khuẩn làm ba nhóm:
Vi khuẩn hiếu khí: chỉ phát triển trong điều kiện có O2, tuy nhiên nhu cầu oxi không nhất định. Nhóm cần nhiều oxi (vi khuẩn lao), nhóm cần ít oxi (vi hiếu khí) đối với loại này lượng oxi cần rất nhỏ (vi khuẩn sẩy thai truyền nhiễm) Vi khuẩn yếm khí (còn gọi là kỵ khí) là những vi khuẩn có phương thức trao đổi kỵ khí và lên men. Những vi khuẩn gây bệnh thuộc nhóm này rất nguy hiểm như vi khuẩn uốn ván, Vi khuẩn yếm khí tùy tiện: phát triển được trong cả điều kiện yếm khí và hiếu khí. 4.2. Sự phân giải các hợp chất hữu cơ 4.2.1. Phân giải các hợp chất không chứa Nitơ +Phân giải cellulose Hằng năm có khoảng 30 tỷ tấn chất hữu cơ được cây xanh tổng hợp trên trái đất. Trong số này có tới 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose, người ta nhận thấy cenlulo chiếm 90% trong bông và 40-50% trong gỗ. Các sợi cellulose tự nhiên chứa khoảng 10000-12000 gốc gluco, các sợi này liên kết thành bó nhỏ gọi là các microfibrin. Trọng lượng phân tử của từng loại cellulose thay đổi tùy từng loại thực vật. Cellulose là loại hợp chất bền vững, không tan trong nước, nó không được tiêu hoá trong đường tiêu hoá của con người, sỡ dĩ động vật nhai lại và con người tiêu hoá được cellulose là nhờ hoạt động phân giải cellulose của rất nhiều loại vi sinh vật (sống trong dạ cỏ và trong đường tiêu hoá của người) Các loại vi sinh vật phân giải cellulose Vsv Vsv yếm yếm khí Vsv ưa Vi sinh vật (vsv) hiếu khí khí sống tự nóng do Niêm Baci llus vi khuẩn: Nấ m mốc celluloae Cytoph Vi Baci Vi Xạ Aspergil hydrogeni aga, khuẩn dạ llus khuẩn khuẩn us, cus Sporicytoph cỏ loài cellulosae Baci Strepto Penicili Baci aga, Ruminoco thermoph llus myces um, llus cenlulomon ccus icus Fusariu cellulose as m methanic us Cơ chế của quá trình phân giải cellulose : Muốn phân giải được cellulose các vi sinh vật phải tiết ra men cellulease, sau đó men mới tác động trực tiếp lên cellulose. Cellulose → disacharit → monosaccharit (glucose)
+ Sự phân giải tinh bột Tinh bột là chất dự trữ chủ yếu của thực vật, nó phản ứng với iod tạo thành chất có màu lam tím. Trong tế bào thực vật tinh bột tồn tại trong dạng các hạt tinh bột, các hạt tinh bột có hình dạng và kích thước thay đổi tùy theo loại thực vật. Tinh bột gồm hai thành phần khác nhau amylose và amylosepectin. Vi sinh vật phân giải tinh bột Nhiều loại vi sinh vật có khả năng sản sinh ra men amylase ngoại bào làm phân giải tinh bột thành các thành phần đơn giản hơn có thể phân biệt một số loại amylase sau: α-amylase: tác động đồng thời lên nhiều dây nối, kể cả bên trong đại phân tử, sản phẩm phân giải này ngoài mantose còn có oligmer chứa 3-4 gốc glucose. β-amylase: men này chỉ tác động bên ngoài đại phân tử, phân cắt liên kết 1-6 ở các vị trí phân nhánh. Glucoamylase: phân giải tinh bột thành glucose và các oligosaccarit. Một số loại vi sinh vật có hoạt tính amylase Loại amylase Vi sinh vật Aspegyllus candidus, Asp. niger, Asp. orysee. α-amylase Bacillus subtillis, B. maccarans, B. mesintericus, Clostridium acetobutylicum, β-amylase Asp. awamori, Asp. oryse Glucoamylase Asp. niger, Asp. awamori, Asp. oryse Các quá trình lên men +Quá trình lên men Etilic Dưới tác dụng của một số loài vi sinh vật, đường glucosa có thể được chuyển hoá thành rượu etylic và CO2 đồng thời làm sản sinh một số năng lượng xác định. Quá trình này được gọi là quá trình lên men etilic hay còn gọi là quá trình lên men rượu. Vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rượu: Loài nấm men có khả năng lên men rượu mạnh mẽ nhất và có nhiều ý nghĩa kinh tế nhất là Saccharomyces cerevisiae. Loại nấm men này có khả năng lên men đường glucose, galactose, maltose, lactose, tinh bột. Trong công nghiệp bia, người ta sử dụng các loại Sac. carsbergensis. Rượu rum thường lên men Schizosacchramyces, chúng phân biệt dễ dàng với Saccharomyces ở chỗ có khả năng phân chia tế bào nhờ vách ngăn ngang (không nẩy chồi). Tóm tắt quá trình: C6 H12 O6 → CH3COCOOH + 4H CH3COCOOH → CH3CHO +2CO2
CH3CHO + 4H → CH3CH2OH C6H12O6 → CH3CH2OH + 2CO2 + 22Kcalo Nếu cơ chất là các sản phẩm phức tạp khác như tinh bột, cellulo thì quá trình này sẽ qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu các hợp chất hữu cơ phức tạp này bị các chất hữu cơ khác phân giải thành các dung dịch đường, sau đó dưới tác dụng của nấm men mới biến thành rượu. Quá trình này được ứng dụng: Sản xuất rượu bia, các loại nước giải khát, sử dụng nấm men làm nở bột mỳ, ủ thức ăn cho gia súc. +Lên men lactic Đường glucose dưới tác dụng của một số vi sinh vật yếm khí đặc biệt sẽ cho chúng ta acid lactic gọi là quá trình lên men lactic. Cơ chế quá trình: Có hai quá trình lên len lactic khác nhau đó là lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình. Trong chu trình lên men lactic đồng hình glucose sẽ được chuyển hoá theo chu trình Embden-Meyerhoff để cuối cùng tạo thành acid pyruvic và NAD-H+. Acid pyruvic sẽ tiếp tục khử thành acid lactic: C6H12O6→ 2CH3COCOOH + 4H CH3COCOOH + 4H → 2CH3CHOHCOOH Quá trình lên men lactic đồng hình được thực hiện bởi nhóm vi khuẩn lactose bacterium (Thermobacterium, Streptobacterium) và Streptococcus. Trong quá trình lên men lactic dị hình, ngoài acid lactic còn tạo thành các sản phẩm khác như acid acetic, CO2, ethanol, glyceril. C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + CH3COOH + CH3CH2OH +CO2 Vi khuẩn lên men lactic dị hình, ngoài việc tạo thành các acid lactic còn có nhiều sản phẩm khác. Vi khuẩn lên men lactic dị hình không có men chủ yếu của chu trình Embden - Meyerhoff . Vi khuẩn lactic thuộc Streptococcaceae và Lactobacillaceae, vi khuẩn lactic không sinh bào tử, Gram dương (trừ Lactobacillus inulinus), thường không di động, chúng thuộc loại vi khuẩn kỵ khí hoặc háo khí. Vi khuẩn lactic thường đòi hỏi nhiều chất sinh trưởng (acid amine, thiamin, riboflavin, ) chúng thường không thể phát triển được trên môi trường tổng hợp, người ta thường nuôi cấy vi khuẩn lactic trên các môi trường chứa chất hữu cơ phức tạp như nấm men, nước cà chua, sữa, máu, Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn lactic phát triển đó là 22-450C, vi khuẩn lactic thường ít gặp trong đất, nước, chúng thường phát triển ở những nơi có chứa nhiều chất hữu cơ phức tạp như trên xác thực vật, sữa, Ứng dụng: sản xuất acid lactic, chế biến sữa chua, ủ chua thức ăn cho gia súc. Lên men butyric
Trong tự nhiên, đường glucose dưới tác dụng của một số vi sinh vật yếm khí đặc biệt, được chuyển hoá để cho ra acid butyric gọi là quá trình lên men butyric. Cơ chế: C6H12O6 → 2CH3COOH + 4H 2CH3COOH → 2CH3CHO + CO2 CH3CHO + CH3CHO → CH3CHOHCH2CHO CH3CHOHCH2CHO → CH3CH2CH2COOH Qua cơ chế trên chúng ta thấy có sự trùng hợp giữa hai phân tử CH3CHO. Quá trình trùng hợp này phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh, khi ngoại cảnh thay đổi thì sản phẩm cũng thay đổi, ngoài acid butyric ra, người ta còn thu được nhiều sản phẩm khác như acid acetic, acetone, rượu butanol, Vi sinh vật lên men butyric Vi sinh vật lên men chủ yếu là Clostridium, là một loại vi khuẩn Gram dương, chu mao, di động sinh nha bào, kích thước nha bào lớn hơn kích thước tế bào vi khuẩn nên khi mang nha bào vi khuẩn có dạng hình vợt, dùi trống, chúng thích hợp trong phát triển kỵ khí. Ứng dụng: vi khuẩn lên men butyric tham gia tích cực vào quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong tự nhiên. Nhưng nếu quá trình này xẩy ra mạnh thì lượng acid butyric sinh ra nhiều gây ảnh hưởng đối với sự phát triển của cây trồng. Quá trình lên men butyric gây ảnh hưởng xấu trong quá trình bảo quản hoa quả, muối dưa, ủ chua thức ăn chăn nuôi. 4.2.2. Phân giải các hợp chất hữu cơ chứa Nitơ +Quá trình amon hóa protein Dưới tác dụng của vi sinh vật, protein được phân giải để cho ra NH3 gọi là quá trình amon hóa protein. Trong tự nhiên có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng sản sinh vào môi trường men protease (proteinase và peptidase), chúng xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid và một số liên kết khác làm cho phân tử protein được phân giải. Khác với các loại protease của thực vật và động vật protein của vi sinh vật thường là men ngoại bào, có tính chuyển hóa rộng, căn cứ vào pH hoạt động của protease, người ta có thể chia làm ba loại, loại acid trung tính và kiềm. Vi sinh vật phân giải: có nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân giải protein: vi khuẩn hiếu khí, yếm khí, xạ khuẩn, nấm. Cơ chế Dưới tác dụng của protease, protein được phân giải thành các hợp chất đơn giản (polypeptid và olipeptid). Các chất này tiếp tục phân giải thành acid amine nhờ tác dụng của men peptidase ngoại bào. Các acid amine này sẽ được sử dụng một phần vào quá trình sinh tổng hợp protein của vi sinh vật, một phần tiếp tục phân giải để tạo ra NH3,
CO2 và nhiều sản phẩm trung gian khác. Qúa trình phân giải từ một protein đến các acid amine là một quá trình phức tạp có thể diễn ra như sau: R - CH(NH2) - COOH + 1/2 O2→ R -CO- COOH + NH3 R - CH(NH2) - COOH + O2 → R - COOH + CO2 + NH3 R - CH(NH2) - COOH + H2O → R - CHOH + CO2+ NH3 R - CH(NH2) - COOH + H2O → R - CO - COOH + NH3 R - CH(NH2) - COOH + 2H→ R-CH2 - COOH + NH3 Khi phân giải các acid amine chứa lưu huỳnh (cistin, cistein, methionin) vi sinh vật giải phóng ra khí H2S HOOC - CH2NH - CH2 -SH + 2H2O → H2S +NH3+CH3COOH +HCOOH Khi phân giải triptophan một số vi sinh vật có thể sinh ra indol và scaton có mùi thối. +Quá trình amon hóa urea Vi khuẩn amon hóa urea thường thuộc loại hiếu khí hay kị khí không bắt buộc (Micrococcus ureae, Planosarcina ureae, Bacillus, Pasteurela, ). Chúng phát triển tốt trong môi trường trung tính hay hơi kiềm, chúng có men urease xúc tác phân giải urea thành NH3, CO2, và H2O CO(NH2)2 + 2H2O urease→ (NH4)2CO3 (NH4)2CO3 → 2NH3 + CO2+H2O +Quá trình amon hóa uric Uric là một chất hữu cơ chứa trong nước tiểu. Chúng phân giải thành urea và acid. Sau đó ure được tiếp tục phân giải như trên. 4.3. Tổng hợp các hợp chất hữu cơ 4.3.1. Tổng hợp các hợp chất hữu cơ có Nitơ +Sinh tổng hợp acid amine Nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp được nhiều loại acid amine, hiện nay hai acid amine chính dược tổng hợp bằng vi sinh vật là acid glutamic và Lysin, các vi sinh vật thường dùng là Brevibacterium, Micrococcus, Microbacterium, +Quá trình cố định N2 Quá trình cố định N2 có ý nghĩa rất quan trọng đối với sản xuất nông nghiệp, trong không khí mỗi ha đất có khoảng 80000 tấn N2, nhưng người, gia súc và cây trồng đều không có khả năng sử dụng nguồn N2 này do liên kết trong phân tử quá chặt chẽ bởi ba liên kết, để chế tạo ra các phân bón hữu cơ cần có điều kiện kỹ thuật phức tạp (t0 cao, áp suất lớn, chất xúc tác đắt tiền) trong khi đó một số vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất dễ dàng và thường xuyên người ta gọi chúng là những vi sinh vật cố định N2. Các vi khuẩn có khả năng cố định N2 như: Azotobacter (tốn 1g đường thì vi khuẩn có khả năng cố định 518 g N). Clostridium sống trong đất ẩm có khả năng cố định N2
không khí, vi khuẩn lam sống cộng sinh cố định N2, vi khuẩn nốt sần cây họ đậu (Rhizobium) 4.3.2.Tổng hợp các hợp chất hữu cơ không chứa Nitơ Ngoài quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất đơn giản, trong tự nhiên còn có nhiều loại vi sinh vật có thể nhờ năng lượng mặt trời tiến hành tổng hợp các hợp chất hữu cơ không có Nitơ từ H2S và CO2 trong không khí. Chúng thuộc loại vi sinh vật tự dưỡng quang năng. Một số vi sinh vật có chứa sắc tố quang hợp. Chúng có khả năng chuyển hoá năng lượng của ánh sáng mặt trời thành năng lượng hoá học tích lũy trong dãy nối cao năng của ATP. Quá trình quang hợp của cây xanh có thể tóm tắt như sau: CO2 + → [CH2O] +O2 (Hν, năng lượng mặt trời) Tảo lam quang hợp gần giống cây xanh, vi khuẩn lưu huỳnh màu lục hoặc vi khuẩn lưu huỳnh màu tía quá trình quang hợp khác với cây xanh. Nếu ở cây xanh nguồn H là từ H2O thì ở vi khuẩn nguồn H là từ H2S có thể tóm tắt quá trình quang hợp của vi khuẩn như sau: CO2 + H2S hν [CH2O] +2S Bacterio chlorophile IV. SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN 4.1. Sinh trưởng, sinh sản và phát triển của vi khuẩn Sinh trưởng và phát triển là thuộc tính cơ bản của mọi sinh vật, cũng như động vật và thực vật, vi sinh vật cũng sinh trưởng và phát triển. Sinh trưởng là sự tăng kích thước và khối lượng của tế bào, còn sự phát triển (hoặc sinh sản) là sự tăng sinh số lượng tế bào. Tuy nhiên sự tăng số lượng tế bào không phải bao giờ cũng diễn ra song song với sự tăng sinh khối. Chẳng hạn khi chất dinh dưỡng trong môi trường đã cạn, vi khuẩn tuy còn phân chia 1-2 lần nhưng cho 2-4 tế bào nhỏ hơn tế bào bình thường, trong pha mở đầu sinh khối tế bào vi khuẩn tăng lên nhưng số lượng tế bào không thay đổi, ngược lại pha logarit kích thước tế bào giảm đi nhưng số tế bào lại tăng lên. Ở vi sinh vật khi nói đến sinh trưởng là nói đến sự sinh trưởng của cả quần thể. 4.2. Phương pháp nghiên cứu sự phát triển của vi khuẩn 4.2.1. Nuôi cấy vi khuẩn a, Phân loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn Căn cứ vào nguồn gốc, tính chất mà có nhiều cách phân loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn khác nhau. 1. Căn cứ vào nguồn gốc của môi trường: người ta chia môi trường nuôi cấy vi khuẩn ra làm 2 loại: 1.1. Môi trường nuôi cấy có nguồn gốc tự nhiên
Môi trường thuộc nhóm này được phân lập dựa trên kinh nghiệm hơn là dựa vào sự hiểu biết về thành phần dinh dưỡng đối với vi khuẩn nuôi cấy. Các môi trường tự nhiên được dùng phổ biến là: nước báng, nước trích thịt bò, nước trích các loại rau, củ, Các loại môi trường này thường chứa nhiều chất hữu cơ và vô cơ tan trong nước, có thể đáp ứng nhu cầu về sự phát triển của vi khuẩn. Môi trường tự nhiên dễ chuẩn bị, vừa rẻ tiền lại có thể sử dụng cho nhiều mục đích nghiên cứu vi khuẩn. Khuyết điểm của loại môi trường này là, không biết chính xác thành phần dinh dưỡng, cũng như thành phần dinh dưỡng của những lần chuẩn bị khác nhau sẽ không hoàn toàn giống nhau. Do đó khi nuôi cấy vi khuẩn của những lần chuẩn bị môi trường khác nhau có thể không giống nhau. 1.2. Môi trường nuôi cấy có nguồn gốc tổng hợp Để bổ sung khuyết điểm của môi trường nuôi cấy tự nhiên, người ta đã thiết lập các môi trường nuôi cấy tổng hợp, trong đó các thành phần dinh dưỡng của môi trường được kiểm soát chặt chẽ về số lượng và chất lượng. Tùy theo nhu cầu dinh dưỡng của mỗi loại vi khuẩn mà người ta thiết lập thành phần dinh dưỡng khác nhau trong mỗi loại môi trường. Ví dụ: môi trường, MacConkey, Vinson Blai, SS (Salmonella-Shigella), KAI (Kligler -Iron -Agar), Ưu điểm của các loại môi trường nuôi cấy tổng hợp là ta có thể biết rõ ràng thành phần dinh dưỡng của môi trường, để phù hợp với mục đích nuôi cấy từng loại vi khuẩn, khi biết rõ nhu cầu dinh dưỡng của chúng. Nhược điểm: đắt tiền, chuẩn bị phức tạp, chỉ sử dụng cho từng loài vi khuẩn thích hợp, trường hợp vi khuẩn chưa xác định, không thể nuôi cấy trên môi trường này một cách bảo đảm. 2. Căn cứ vào tính chất vật lý Chia môi trường ra làm các loại sau: môi trường rắn (thạch Agar hoặc môi trường các chất dinh dưỡng có bổ sung thêm thạch cho dễ nuôi cấy vi khuẩn, môi trường loại này dùng kiểm tra hình hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc), môi trường lỏng (nước thịt pepton, để xác định tính chất làm đục, cặn, khả năng sinh màng), môi trường bán cố thể (nửa rắn, nửa lỏng) (Manitol motility-xác định tính chất di động và khả năng lên men đường mannis). 3. Phân loại theo mục đích sử dụng: môi trường thông thường và môi trường đặc biệt. 3.1. Môi trường thông thường: là môi trường mà thành phần môi trường đơn giản và được dùng phổ biến như: nước thịt - pepton, thạch thường. 3.2. Môi trường đặc biệt: là môi trường có các chất quyết định đến quá trình phát triển của vi khuẩn, nếu có mặt hay vắng mặt các thành phần này vi khuẩn không thể phát triển được. -Môi trường tăng sinh: có các chất kích thích sự phát triển của vi khuẩn, như máu, huyết thanh, acid amine,
-Môi trường sinh hóa: là môi trường để kiểm tra một số tính chất của vi khuẩn, như khả năng lên men đường glucose, lactose, mannitol, khả năng sinh H2S, sinh urea, indol, thủy phân gelatin, dung huyết, -Môi trường ưu tiên hay tuyển lựa: là môi trường ức chế sự phát triển của một số loại vi khuẩn, nhưng lại kích thích vi khuẩn khác phát triển. Chẳng hạn môi trường SS (Salmonella-Shigella) ức chế sự phát triển của vi khuẩn E. coli. Môi trường Wilson, Blaire ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn Gram dương. Môi trường pepton có chứa acid phenic 5% và nuôi cấy ở 420C chỉ ưu tiên cho vi khuẩn E. coli phát triển. - Môi trường phân biệt: sử dụng tổng hợp cả ba loại môi trường trên để phân biệt tính chất của các loại vi khuẩn trong quá trình phân lập. Yêu cầu của môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Môi trường phải đảm bảo những yêu cầu vật lý (màu, trạng thái rắn, lỏng, bán lỏng), hoá học (thành phần dinh dưỡng), vi sinh vật học (đảm bảo vô trùng). Vô trùng môi trường bằng cách hấp ở 1210C/15-20 phút. Đối với thạch sau khi hấp vô trùng để nhiệt độ 45-500C đổ ra các đĩa Petri, môi trường lỏng sau khi hấp cho vào các ống nghiệm và bảo quản vô trùng. Đối với các loại đường dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao cho nên có thể sử dụng màng lọc vi khuẩn để lọc vô trùng. b, Nuôi cấy vi khuẩn Tùy từng loại vi khuẩn cần nuôi cấy mà yêu cầu thành phần dinh dưỡng, môi trường nuôi cấy khác nhau. Sau đây chỉ trình bày phương pháp nuôi cấy đơn giản. Cấy vào môi trường nước thịt: dùng que cấy lấy mẫu khuấy vào môi trường ủ 370C/24 giờ quan sát màu sắc độ đục, cặn váng của ống nước thịt. Phương pháp vạch trên mặt đĩa Petri: Môi trường dinh dưỡng thích hợp cho vi sinh vật muốn nuôi cấy, thêm 2-3% thạch cho cứng dễ vạch hơn. Hấp 1210C/15 phút để nguội 450C đổ ra đĩa Petri một lớp mỏng (khoảng 20ml/đĩa có φ= 8cm). Cách vạch để có khuẩn lạc mọc ra từ một tế bào, dùng que cấy lấy vi khuẩn sau đó vạch lên mặt thạch theo đường cấy zic zắc theo đường cấy 3 pha hay 4 pha để mô tả, phân lập thuần khiết khuẩn lạc. Sử dụng màng lọc vi khuẩn Dùng môi trường nuôi cấy như trên, pha loãng huyền phù vi khuẩn ra nhiều lần sao cho có khoảng 1-5 tế bào /1ml, cho qua màng lọc khoảng 5-10ml huyền phù đã pha loãng. Lấy màng lọc ra đặt lên trên mặt của đĩa thạch Petri ủ vào tủ ấm. Sau khi ủ tủ ấm 24 giờ kiểm tra hình dạng và màu sắc, số lượng của khuẩn lạc. 4.2.2. Các phương pháp định lượng vi khuẩn Có rất nhiều phương pháp đếm số lượng vi khuẩn, tùy theo mục đích, phương tiện, tùy loài vi khuẩn mà có thể sử dụng các phương pháp khác nhau. Sau đây là một số phương pháp phổ biến. 1. Đếm trực tiếp dưới kính hiển vi *Sử dụng buồng đếm hồng cầu (Neubauer, Thomas) để đếm tế bào vi khuẩn.
Nguyên tắc chung: Đếm số lượng tế bào vi khuẩn có trong một đơn vị thể tích của phòng đếm, từ đó suy ra số lượng tế bào có trong 1ml dung dịch, nhân với độ pha loãng để biết số tế bào có trong dung dịch ban đầu. Buồng đếm Neubauer: Là một phiến kính đặc biệt, trên bề mặt chia thành các ô vuông nhỏ, cạnh ô vuông nhỏ là 1/20mm, khoảng cách giữa phiến kính và lá kính 0,1 mm. Ta nhỏ lên buồng để đếm một giọt huyền phù chứa vi khuẩn muốn đếm, đậy lá kính lại khi đó ta có thể tích mỗi ô nhỏ là: 1/10 x 1/20 x 1/20mm3=1/4000mm3= cm3. Gọi độ pha loãng của dung dịch vi khuẩn cần đếm là K, trung bình số vi khuẩn trên mỗi ô nhỏ là A (ta đếm vài ô lớn, sau đó lấy trung bình số vi khuẩn trên mỗi ô nhỏ), khi đó số vi khuẩn có trong 1ml dung dịch là N: N=A x 4 x 106 x (số tế bào/1ml) Phương pháp này cho kết quả nhanh, tuy nhiên không thể phân biệt được tế bào vi khuẩn sống và tế bào vi khuẩn chết. Hơn nữa tế bào vi khuẩn rất bé nên việc đếm dưới kính hiển vi là không dễ dàng. (Phương pháp này chủ yếu áp dụng cho những tế bào không cần nhuộm màu). Đếm vi khuẩn đã nhuộm: Nhỏ một thể tích nhất định của huyền phù muốn đếm lên một diện tích nhất định trên phiến kính, cố định và nhuộm màu, thường là với xanh mtylen hoặc với màu phù hợp với vi khuẩn ấy. Sau đó, đếm số lượng tế bào trên một đơn vị diện tích. *Đếm trực tiếp theo Breed Lấy một phiến kính sạch đặt lên tờ giấy kẻ ô vuông, thông thường ô vuông có cạnh 1cm (diện tích mỗi ô là S=1cm2). Dùng micropipet hút 0,01ml mẫu rồi quệt kín diện tích một ô (0,01ml/1cm2, nếu quệt bị lem ra ngoài ô phải làm lại). Lặp lại với 4-5 ô cách rời nhau, cố định vết bôi, nhuộm màu tiêu bản (Gram, Newman-Lampert cải tiến), sau đó đếm số lượng vi khuẩn có trên một diện tích vi trường, lặp lại khoảng vài chục lần ở các vi trường khác nhau. Tính trung bình số lượng vi khuẩn có trong một vi trường hiển vi. Cách tính: tính diện tích vi trường, dùng thước đo vật kính, thước này có chiều dài 1mm, được chia 100 phần mỗi khoảng cách tương ứng 0,01 hay 10µm. Đặt thước đo lên bàn kính, điều chỉnh khoảng cách để nhìn thấy các vạch trên thước đo. Đo đường kính của vi trường hiển vi, tính diện tích vi trường theo công thức s = π.r2. Số lượng tế bào có trong 1ml là : =x A x x K là độ pha loãng, A trung bình số vi khuẩn có trong một vi trường, S là diện tích 2 dung dịch dàn mỏng (1cm ) svt diện tích vi trường. 2. Đếm số tế bào sống (khuẩn lạc trên đĩa thạch) *Phương pháp pha loãng Dùng dung dịch cần đếm vi khuẩn pha loãng ở các độ liên tiếp nhau, theo cơ số 10, thông thường lấy vi khuẩn đã pha loãng ở ba nồng độ liên tiếp thích hợp với từng loại vi khuẩn. Đảm bảo có thể đếm được khuẩn lạc, ít nhất là có hai ống có thể nhìn thấy khuẩn lạc. Ví dụ: 10-6, 10-7, 10-8, mỗi nồng độ pha loãng lấy 0,1 ml cấy lên 2 đĩa thạch
thích hợp (có thể dùng que gạt thủy tinh hay bi thủy tinh để dàn mỏng) sau đó ủ 370C/24 giờ. Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Sau khi có số khuẩn lạc ta tính toán như sau: Số lượng tế bào/ml = a x x a: số khuẩn lạc trung bình trên mỗi đĩa thạch có cùng độ pha lãng V: Thể tích dịch cấy trên mỗi đĩa thạch (ml) K: độ pha loãng tương ứng của dịch được cấy. Phương pháp này nó cho phép đếm được số tế bào sống có trong 1ml dung dịch. *Sử dụng màng lọc vi khuẩn Trường hợp dung dịch cần đếm có mật độ vi khuẩn thấp như kiểm tra vi khuẩn có trong bia, các loại nước uống. Cho một lượng lớn dung dịch cần kiểm tra qua màng lọc sau đó đặt màng lọc lên nuôi cấy trên đĩa thạch, căn cứ vào lượng dung dịch đem lọc và số khuẩn lạc trên mỗi màng lọc ta suy ra số lượng vi khuẩn có trong một đơn vị thể tích. Phương pháp này cho chúng ta kết quả gần đúng, chứ không cho số chính xác. Phương pháp này cho phép đếm số tế bào sống, không đếm được tế bào chết sai số thường lớn, do đó phải thực hiện hai ba lần và lấy trị số trung bình, để giảm bớt sai số. 3. Phương pháp đo độ đục của huyền phù vi khuẩn *Đo bằng quang phổ kế Nguyên tắc: Dùng chùm tia sáng đơn sắc chiếu xuyên qua huyền phù chứa vi sinh vật muốn đo, vi sinh vật làm phân tán bớt chùm tia sáng nhiều hoặc ít tùy thuộc vào số lượng của chúng trong huyền phù. Số tia sáng còn lại khi xuyên qua huyền phù sẽ kích thích một tế bào quang điện. Tùy theo cường độ còn lại của chùm tia sáng mà tế bào quang điện nhận được, một cây kim di động và chỉ số phần trăm tia sáng bị phân tán trên bảng chỉ thị (phương pháp này cho ta biết số lượng vi khuẩn chết và sống). Nếu dịch đem đếm không chứa vi sinh vật nào cả thì tất cả ánh sáng xuyên qua và kích thích tế bào quang điện tối đa, ta điều chỉnh cho kim chỉ ở số 100. Đưa huyền phù cần đo vào. Vì có một số vi sinh vật trong huyền phù nên một số tia sáng bị phân tán đi. Chỉ còn lại một số ít xuyên qua được, so sánh với bảng chuẩn sẽ biết được mật số trong huyền phù. Chỉ tiến hành đo độ đục các mẫu mà ở đó vi sinh vật sinh trưởng làm đục đồng đều môi trường nuôi cấy, không tạo thành váng, khối. Chúng ta có thể áp dụng phương pháp này đối chiếu với phương pháp đếm trực tiếp để lập một bảng chuẩn cho từng loại vi sinh vật. Ngày nay trên cơ sở nguyên lý này người ta chế tạo ra các loại máy quang phổ kế khác nhau. *Dùng máy đếm điện tử: với máy đếm loại này có thể đếm hàng ngàn tế bào trong vòng vài giây. Nguyên tắc là vi sinh vật được đưa qua tia sáng của mắt điện tử, vi sinh vật cản tia sáng và ghi dấu hiệu trên bộ đếm của máy. *Sử dụng ống nghiệm có độ đục khác nhau (dãy ống Macfaland) Nguyên tắc: dãy ống nghiệm chứa BaSO4 ở các độ pha loãng khác nhau tương ứng với độ pha loãng có bảng đối chiếu nồng độ vi khuẩn tương ứng. Đối chiếu độ đục ống
nghiệm với dãy ống MacFaland sau đó đối chứng bảng ta sẽ biết đựơc nồng độ vi khuẩn tương ứng. Cách làm: dùng 10 ống nghiệm sạch, trong, có kích thước bằng nhau. Cho BaCl2 1% vào từng ống theo thứ tự từ một đến 10 (ống 1: 0,1ml ống 2: 0,2ml và cứ như thế ống 10: 1ml, mỗi ống hơn nhau 0,1 ml). Sau đó cho vào mỗi ống vừa đủ 10ml dung dịch H2SO4 1% hàn miệng ống nghiệm lại. Lấy ống nghiệm chứa vi khuẩn cần so màu cho vào máy li tâm, gạn rửa, sau đó cho nước sinh lý vào tiếp tục li tâm, gạn rửa 2-3 lần. Cuối cùng cho nước sinh lý vào một lượng ngang với lượng dung dịch nuôi cấy. Đặt ống nghiệm chứa vi khuẩn đã gạn rửa, vào giữa hai ống MacFacland áng chừng có màu tương tự. Số lượng vi khuẩn có trong một ml dung dịch sẽ nằm trong khoảng 2 mức chuẩn của ống Macfaclan. Bảng so màu đánh giá số lượng vi khuẩn theo MacFaland Số vi khuẩn/ml Số vi khuẩn/ml Số TT Số TT (triệu) (triệu) 1 300 6 1800 2 600 7 2100 3 900 8 2400 4 1200 9 2700 5 1500 10 3000 4.3. Lý thuyết về sự phát triển của vi khuẩn: Tế bào vi khuẩn khi được nuôi cấy vào môi trường dinh dưỡng thích hợp, vi khuẩn sẽ sinh trưởng, tăng khối lượng và thể tích, tổng hợp các thành phần tế bào cho đến khi kích thước lớn gấp đôi. Vi khuẩn phân chia cho hai tế bào. Hai tế bào này, lại tiếp tục sinh trưởng và phân chia thành 4, rồi 8,16 tế bào. Nếu số tế bào ban đầu không phải là 1 mà là N0 thì sau n lần phân chia ta sẽ có số tế bào tổng cộng là N: n N = N0 x 2 (1) Các giá trị N và N0 có thể xác định nhờ phòng đếm hoặc tính số khuẩn lạc mọc trên môi trường đặc. Còn giá trị n (số thế hệ) có thể tính nhờ logarit thập phân: logN = logN0 + n.log2. Từ đó rút ra: n = (2). Vi dụ: vi khuẩn phân chia n lần sau thời gian t, khoảng thời gian giữa hai lần phân chia liên tiếp (hay thời gian cần thiết để vi khuẩn tăng đôi tế bào) gọi là thời gian thế hệ và biểu thị bằng g: g = = (3)
Ở đây t2-t1 biểu thị sự sai khác giữa thời gian đầu và thời gian cuối tính bằng giờ trong đó số tế bào được xác định. Giá trị đảo nghịch của thời gian thế hệ hay là số lần phân chia sau một đơn vị thời gian (giờ) gọi là hằng số tốc độ phân chia C. C= = = (4) Rõ ràng thời gian thế hệ càng ngắn, vi khuẩn sinh trưởng và sinh sản càng nhanh vì: C=n/t nên n=C.t. Thay giá trị của n vào phương trình (1) ta có: ct N = N0 x 2 Hằng số tốc độ phân chia phụ thuộc vào loài vi khuẩn, nhiệt độ nuôi cấy và môi trường nuôi cấy. -Loài vi khuẩn: ví dụ ở 37 0C đối với E. coli C = 3 và Mycobacterium tuberculosis C=0.07. -Ảnh hưởng nhiệt độ: ví dụ nuôi cấy vi khuẩn E. coli trong môi trường nước thịt. Tuy nhiên đối với một cơ chất đã cho hằng số tốc độ phân chia không phụ thuộc vào nồng độ trong một giới hạn rộng. Chẳng hạn khi nuôi cấy Bacilus subtillis trong môi trường chứa glucose dù cho nồng độ 0.3g/lit hay 50g/l ta vẫn có C= 0.8. -Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy. Tốc độ phân chia Vi khuẩn Môi trường (C) Nước thịt 2 Khoáng -gluco 0.8 Bacilus subtillis Khoáng -citrat 0.3 Khoáng-gluco- 1,2 citrat Thời gian thế hệ Hằng số tốc độ Nhiệt độ (Oc) (phút) phân chia 18 120 0.5 22 60 1 30 30 2 37 20 3 43 - - 4.4. Biểu đồ phát triển của vi khuẩn 4.4.1. Sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn trong điều kiện nuôi cấy tĩnh[5]
Nếu theo dõi sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm, người ta nhận thấy số lượng của chúng tăng lên nhanh chống. Điều này dễ hiểu vì với điều kiện thích hợp thời gian thế hệ của nhiều loài vi khuẩn chỉ khoảng 30phút. Rõ ràng các quá trình sinh tổng hợp cũng như quá trình dị hoá, nhằm cung cấp năng lượng, nguyên liệu cho các phản ứng tổng hợp diễn ra trong tế bào với tốc độ rất nhanh, hoàn toàn không thấy ở các sinh vật khác. Phương pháp nuôi cấy mà trong suốt thời gian đó ta không thêm vào đó chất dinh dưỡng cũng không loại bỏ đi các sản phẩm trao đổi chất cuối cùng gọi là nuôi cấy tĩnh, sự phát triển của vi khuẩn khi nuôi cấy tĩnh diễn ra qua 4 pha: *Pha lag: pha này tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy cho đến khi vi khuẩn đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại. Trong pha lag vi khuẩn chưa phân chia (nghĩa là chưa có khả năng sinh sản), có thể đây là giai đoạn vi sinh vật làm quen với môi trường nuôi cấy mới và chuẩn bị cho sự tăng trưởng vượt bậc sau đó. Thể tích và khối lượng tế bào tăng lên rõ rệt do quá trình tổng hợp các chất, trước hết là các cao phân tử (protein, enzime, acid nucleic, ) diễn ra mạnh mẽ. Chẳng hạn một số enzime cần cho quá trình tổng hợp thuộc các endoenzime loại proteinase, amylase, và các enzime nằm trong quá trình chuyển hóa glucide, đều được hình thành trong pha này. Độ dài của pha này phụ thuộc vào tuổi của ống giống và thành phần của môi truờng. Chẳng hạn pha lag sẽ không có nếu chúng ta dùng ống giống gồm các tế bào ở pha sinh trưởng logarit và cấy chúng vào cùng một môi trường dưới những điều kiện nuôi cấy như nhau. Trái lại nếu ta cấy các tế bào ở pha ổn định vào một môi trường và điều kiện nuôi cấy như nhau thì vẫn có pha lag. Thường tế bào giống càng già thì pha lag càng dài. Như vậy pha lag phụ thuộc vào những yếu tố sau: tuổi giống, lượng cấy giống và thành phần của môi trường. *Pha logarit: Trong pha này vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo luỹ thừa, ct nghĩa là sinh khối và số lượng tế bào tăng theo phương trình: N = N0 x 2 , kích thước tế bào thành phần dinh dưỡng, hoạt tính sinh lý, nói chung không thay đổi theo thời gian. Tế bào ở trạng thái động học và đuợc coi như là những tế bào tiêu chuẩn. *Pha ổn định: trong pha này quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, đa số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Kết quả cả tế bào và cả sinh khối không tăng cũng không giảm. Tốc độ sinh trưởng bây giờ phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Cho nên khi giảm nồng độ cơ chất (trước khi cơ chất bị cạn hòan toàn) tôc độ sinh trưởng của vi khuẩn cũng giảm. Nguyên nhân tồn tại của pha ổn định là do sự tích luỹ các sản phẩm độc của trao đổi chất (rượu acid hữu cơ) và việc cạn chất dinh duỡng. *Pha tử vong: trong pha này số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo luỹ thừa (mặc dù số lượng tế bào tổng cộng có thể không giảm). Đôi khi các tế bào tự phân nhờ các enzyme của bản thân. ở các vi khuẩn sinh bào tử thì giai đoạn này phức tạp hơn do quá trình hình thành bào tử. Ứng dụng biểu đồ phát triển của vi khuẩn vào quá trình bảo quản vi sinh vật. +Cấy chuyển thường xuyên trên thạch nghiêng hay cấy trích sâu vào thạch, sau khi đã sinh trưởng vi khuẩn được giữ trong tủ lạnh +40C, phương pháp này thường dùng nhưng kém hiệu quả.
+Bảo quản dưới dầu vô trùng: Dầu parafin vừa ngăn cản môi trường khô vừa ngăn cản trao đổi chất do cản trở sự xâm nhập của oxi. +Bảo quản trong cát hoặc đất sét vô trùng:do cấu trúc lý hoá của cát đất sét rất phù hợp cho việc mang các vi sinh vật, chủ yếu là cácbào tử, sau khi làm khô đất sét, cát cùng với vi khuẩn có thể bảo quản tế bào rất lâu. +Đông khô: là phương pháp hòan thiện và có hiệu quả nhất. Vi khuẩn đuợc trộn với môi trường thích hợp (sữa, huyết thanh, ) rồi làm lạnh và làm khô nhờ băng khô, sau mấy năm bảo quản tế bào vẫn có khả năng sống mà không bị biến đổi về mặt di truyền. +Bảo quản trong glycerin (10%) và giữ trong tủ lạnh sâu (-60, -80) đây là phương pháp thích hợp. Sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn trong điều kiện nuôi cấy liên tục Trong điều kiện nuôi cấy liên tục, kéo dài thời gian sinh trưởng, tức là kéo dài pha thứ III. Muốn làm được như vậy người ta bố trí, hệ thống nuôi cấy gồm một hệ thống bình cấy, phía trên nối với dung dịch nuôi cấy. Phía dưới nối với hệ thống thu sinh khối. Trong bình nuôi cấy có hệ thống sục khí và que khuấy. Sau một thời gian nuôi cấy người ta rút ra một lượng dung dịch vi khuẩn, sau đó cho vào bình, dịch nuôi cấy vi khuẩn, bằng lượng lấy ra. Như vậy, vi khuẩn sinh sản liên tục, phương pháp này có thể thu được sinh khối lớn.
-Câu hỏi ôn tập chương 1. Thành phần hóa học chính tham gia cấu trúc tế bào vi khuẩn. 2. Các phương thức vận chuyển chất dinh dưỡng xẩy ra trong tế bào vi khuẩn. 3. Phương pháp đếm số lượng tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đếm trực tiếp (thông qua buồng đếm hồng cầu) 4. Đếm số tế bào vi khuẩn thông qua phương pháp Breed 5. Đếm số lượng tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đếm gián tiếp(phương pháp pha loãng) 6. Vẽ và giải thích đồ thị phát triển của vi khuẩn trong điều kiện nuôi cấy tĩnh hệ thống kín. 7. Giải thích sự phát triển của vi khuẩn trong điều kiện nuôi cấy liên tục. -Tài liệu tham khảo: 1. W.D.PHILILIPS-T.J.CHILTON, người dịch Nguyễn Bá (1997). Nhà xuất bản giáo dục. 2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000). Nhà xuất bản giáo dục Hà Nội. 3. Vũ Thị Minh Đức (2001). Thực tập vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Hà Nội. 4. Phạm Thành Hổ (2002). Sinh học đại cương. Nhã xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. 5. Biền Văn Minh, Phạm Văn Ty, Kiều Hữu ảnh, Phạm Hồng Sơn, Phạm Ngọc Lan, Nguyễn Thị Thu Thủy (2006). Giáo trình vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Huế. -Giải thích thuật ngữ:
Petri: tên nhà khoa học phát minh ra hộp đĩa lồng dùng trong nuôi cấy vi khuẩn. Permease: protein làm nhiệm vụ vận chuyển chất qua màng Glycoprotein: phức protein liên kết với oligo hoặc polysacarit Glycogyl hóa: sự gắn đường vào protein Macfaclan: dãy ống nghiệm chứa BaSO4 ở các nồng độ khác nhau, người ta đã tính toán số lượng vi khuẩn tương ứng mỗi độ đục. Dùng Macfaclan để định lượng số vi khuẩn có trong dung dịch. CHƯƠNG IV-VIRUS HỌC Giảng viên: BSTY. Nguyễn Xuân Hòa-TS. Phạm Hồng Sơn Nội dung chương: Chương virus học được viết tóm tắt trong 26 trang phục vụ cho 8 tiết giảng với các nội dung cơ bản như: giới thiệu về lịch sử phát triển của virus học, các đặc trưng cơ bản của virus, các dạng hình thái và cấu trúc một số dạng điển hình của virus. Virus là vi sinh vật cấu trúc chỉ gồm acid nucleic (AND hoặc ARN) và vỏ bọc protein. Mỗi dạng cấu trúc khác nhau của virus có sự khác nhau trong quá trình tái tạo chính vì thế trong chương này trình bày khá kỹ quá trình tái tạo của các nhóm virus điển hình. Mục tiêu: Để có thể nghiên cứu sâu về virus và ảnh hưởng của chúng đối với đời sống con người và súc vật từ đó có cách phòng trị thích hợp, trước tiên người học cần nắm vững những đặc trưng cơ bản nhất, căn cứ vào hình thái phân biệt được một số dạng điển hình, hiểu về nguyên lý tái tạo của những nhóm virus có acidnucleic khác nhau. I. SƠ YẾU VỀ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA VIRUS HỌC [1] Khoảng 1500 năm trước công nguyên, vào đời vua Ai Cập thứ 18 đã có những bằng chứng về bệnh bại liệt. Nhà triết học cổ Hi Lạp Arristotle (384-322 trước công nguyên). Đã miêu tả các triệu chứng của bệnh dại. Khoảng 2-3 thế kỷ trước công nguyên người Trung Hoa và người Ấn Độ đã miêu tả về bệnh đậu mùa. Tất nhiên khi đó con người chưa biết được nguyên nhân gây ra các bệnh hiểm nghèo này. Năm 1886 A. Mayer (người Đức) lần đầu tiên phát hiện thấy bệnh khảm ở lá cây thuốc lá và chứng minh đó là một bệnh truyền nhiễm. Năm 1892 nhà sinh lý học thực vật trẻ tuổi D. I. Ivanoskii, người Nga bắt tay vào việc nghiên cứu mầm bệnh khảm ở thuốc lá. Ông chứng minh được rằng mầm bệnh này nhỏ hơn vi khuẩn, vì nó có thể chui qua các nến lọc vi khuẩn bằng sứ và không quan sát được bằng kính hiển vi quang học. Khi nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn chúng không mọc được nhưng nếu cấy vào các cây thuốc lá khỏe thì cây khỏe bị mắc bệnh. Từ kết quả trên ông kết luận có một loại vi sinh vật rất nhỏ đã gây bệnh cho cây thuốc lá và ông gọi chúng là vi khuẩn cực tiểu hay độc tố của vi khuẩn. Sáu năm sau, năm 1898 nhà vi sinh vật học Hà Lan M.W. Beijerinck (1851-1931) cũng nghiên cứu một cách độc lập mầm bệnh của bệnh khảm thuốc lá và ông cho rằng đó là một chất dịch có hoạt tính truyền nhiễm ông dùng tiếng Latin là virus (mầm độc) để gọi mầm bệnh này này. Ông kết luận:
1. Bệnh đốm thuốc lá không phải do vi khuẩn gây ra mà do ''chất dịch có hoạt tính truyền nhiễm''. Ông dùng tiếng Latin là Virus (mầm độc) để gọi mầm bệnh này. Thuật ngữ virus có từ bấy giờ. 2. Virus qua lọc chỉ sản sinh trong mô sống của thực vật. 3. Có thể diệt virus bằng cách đun sôi. Tuy nhiên nếu chỉ sấy khô thì tính độc vẫn còn. Cũng chính vào năm ấy hai nhà bác học Đức F. Loefler và F. Frosch lần đầu tiên đã phát hiện ra virus gây bệnh lở mồm long móng ở gia súc có sừng. Năm 1901, các bác sĩ quân y người Anh đã phát hiện ra virus gây bệnh sốt vàng ở người. Về sau chỉ trong một thời gian ngắn, các nhà bác học đã liên tiếp phát hiện ra hàng chục virus gây bệnh cho người và gia súc. Mãi đến năm 1939 chiếc kính hiển vi điện tử ra đời và cũng từ mốc thời gian này, loài người mới nhìn thấy hình dạng của virus. Virus đầu tiên quan sát được là virus khảm thuốc lá. Từ đó ngành virus học đã phát triển hết sức nhanh chóng, đến nay đã trở thành ngành khoa học hoàn chỉnh. Do sự phát triển trong nghiên cứu về virus, từ trước đến nay đã có khá nhiều định nghĩa khác nhau về virus, song định nghĩa đầy đủ nhất là của Giáo sư Chu Phúc Đán (Đại Học Phúc Đán Trung Quốc). Định nghĩa virus như sau: ''Virus là một loại sinh vật phi tế bào, siêu hiển vi, mỗi loại virus chỉ chứa một loại acid nucleic. Chúng chỉ có thể ký sinh bắt buộc trong các cơ thể sống, dựa vào sự hiệp trợ của hệ thống trao đổi chất của vật chủ mà sao chép acid nucleic, tổng hợp các thành phần như protein, sau đó tiến hành lắp nối để sinh sản; trong điều kiện ngoài cơ thể, chúng có thể tồn tại lâu dài ở trạng thái đại phân tử hóa học, không sống và có hoạt tính truyền nhiễm''. Người ta đã phát hiện được 1671 loài virus của côn trùng (1990), 931 loài virus của động vật có xương sống, 300 loài virus của người (1984), 100 loài virus trên nấm, và trên 2850 loài và chủng thực khuẩn thể (1987). II. NHỮNG ĐẶC TRƯNG CỦA VIRUS VÀ PHÂN LOẠI VIRUS [1] 2.1. Những đặc trưng của virus Virus là những vi sinh vật chưa có cấu tạo tế bào, kích thước cực kỳ nhỏ bé, muốn thấy được chúng phải sử dụng kính hiển vi điện tử, mặc dù virus rất nhỏ bé nhưng nó có đặc trưng của vật chất sống, có thể nhân lên trong tế bào sống và gây bệnh ở hầu hết các loài sinh vật. Virus có các đặc tính sau: 1- Virus có kích thước vô cùng nhỏ bé từ hàng chục đến hàng trăm nm (1nm = 10- 3µ = 10 A0). 2- Virus không có cấu tạo tế bào, chỉ là vật chất sống đơn giản chứa một loại acid nucleic (ADN hoặc ARN ) và được bao bọc bằng một lớp protein, protein có tác dụng
bảo vệ và giúp cho virus bám vào tế bào. Một số loại còn có áo ngoài (có nguồn gốc từ tế bào chủ). 3- Thông tin di truyền trong acid nucleic điều hành quá trình tổng hợp các thành phần cấu tạo nên virus khi virus đã xâm nhập vào trong tế bào. 4- Virus không có trao đổi chất, chỉ có thể sinh sản trong các tổ chức sống. 5- Virus ký sinh nội bào tuyệt đối, tách khỏi tế bào chủ virus không sống được, do đó còn gọi virus là vật trung gian giữa vô sinh và hữu sinh. 6- Virus có khả năng tạo thành các tinh thể. Tùy từng lúc từng giai đoạn chức năng của virus mà nó có thể có các tên gọi khác nhau. Virion: (hạt virus) nó là dạng virus có thành phần phần hóa học hoàn chỉnh là một virus thành thục. Virus tái tạo: là dạng acid nucleic của virus sau khi đã xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm, đây là dạng virus tái tạo để cho ra các virion mới. Viroid: nó không có vỏ bọc protein có dạng sợi và có khả năng gây bệnh.
Hình thái và phân loại virus (theo Phạm Hồng Sơn. 2002)[3] Kích Lọai virus Họ Nhóm, chi Hình thái thước Circoviridae Circovirus Cầu 15-17 Pavovirus Virus ADN một sợi Hạt, hình Nhỏ (không có áo Pavoviridae ngoài) Densovirus cầu nhất Mastadenovirus Hai sợi Adenoviridae 70-90 Virus dạng xoắn ADN hai sợi Aviadenovirus (không có áo ngoài) Khối, 20 Papillomavirus, Papovaviridae mặt tam 45-55 Polyomavirus giác đều Orthopoxvirus, Parapoxvirus,Avipoxvirus, Capipoxvirus, Suispoxvirus, Thoi, viên Poxviridae Leporipoxvirus, gạch. Moluscipoxvirus, Yatapoxvirus; 220 - +Entomopoxvirinae: A, B, C, 450 x Virus 140 ADN hai sợi Alphaherpesvirinae, Phức tạp, có áo ngoài Betaherpesvirinae, Herpesviridae trung tâm Gamaherpesvirinae, hơn 90 có lõi loài đã biết đến Granulovirus, 50-70 x Baculoviridae Nucleopolyhedrovirus, Chưa rõ 240- Baculovirus 420 HepaADNvirus: HepaADNviridae +OrthohepaADNvirus, Cầu 40-42 +AvihepaADNvirus Các virus Retrovirus có enzyme +Oncovirus, +Retrovirus, phiên ngược. Retroviridae +Retrovirus type D, Cầu 80-130 +Retrovirus type +Sspumavirus, +HTV/BLV, +Lentivirus, Influenza virus A,B; Các virus Orthomyxoviridae Cầu 80-120 ARN một sợi Influenza virus C
âm (có áo Respirovirus, Rubulavirus, ngoài) Henipavirus, Morbillivirus; Cầu, que, 150- Paramyxoviridae Pneumovirus và một số chưa sợi 300 phân loại Bunyavirus, Phlebovirus, Bunyaviridae Nairovirus, Hantavirus, Cầu 90-110 Tospovirus 1. LCM-Lassa group-Nhóm Cầu, vô 110- Arenaviridae LCM-Lassa, 2. Tokabe định 130 Vesiculovirus, Lyssavirus, Rhabdoviridae Que 45-430 Rhabdovirus thực vật Sợi, que Marburgvirus, Ebolavirus, Ôn Filoviridae phân Restonvirus định 80 nhánh, , chung với Filoviridae và BoARNviridae Cầu 80-100 Paramyxoviridae Coronaviridae Coronavirus, Torovirus Cầu 75-160 Gần hình Arteriviridae 50-72 Các virus cầu ARN một sợi Alphavirus có 27 loài, Togaviridae Cầu 60-70 dương có áo Rubivirus (Rubellavirus, sởi đỏ) ngoài Flavivirus có 9 loài, Pestivirus có 3 loài, Hepatitis Flaviviridae Cầu nhỏ 40-60 C virus Group (nhóm viêm gan C) Calicivirus: Vesicular exanthema virus, San Miguel Khối 20 sea lion virus, Feline Caliciviridae mặt đối 35-39 calicivirus, Canine calicivirus, xứng Rabbit haemorrhagic disaese Virus virus ARN một sợi (dương) không có áo ngoài Enterovirus, Hepatovirus, Cardiovirus, Rhinovirus, Nhỏ 20 Piconarviridae 22-30 Aphtovirus, và một số chưa mặt phân loại Asstroviridae Astrovirus: Cầu 27-30
Reoviruses: Orthoreoviruses, Orbivirus, Đối xứng Coltivirus, Rotavirus, Virus Reoviridae 20 mặt đều 60-80 Aquareoviruses, Cypovirus, ARN hai sợi hay cầu (không có áo Phytoreovius, Fijivirus, các ngoài) virus thực vật chưa phân nhóm Đối xứng BiARNviridae BiARNvirus 60 20 mặt đều III. HÌNH THÁI CẤU TẠO CỦA VIRUS [4] 3.1. Hình thái của virus Virus chưa có cấu tạo tế bào, mỗi virus không thể gọi là một tế bào mà được gọi là một hạt virus hay virion. Đó là một virus thành thục có cấu trúc hoàn chỉnh. Thành phần chủ yếu của hạt virus là acid nucleic (ADN hay ARN ) được bao quanh bởi một vỏ protein. Acid nucleic nằm ở giữa hạt virus tạo thành lõi hay hệ gen của virus. Protein bao bọc bên ngoài lõi tạo thành một vỏ capsid. Capsid mang các thành phần kháng nguyên và có tác dụng bảo vê lõi acid nucleic. Capsid cấu tạo bởi các đơn vị capsom. Lõi và vỏ hợp lại tạo thành một nucleocapsid, đó là kết cấu cơ bản của mọi virus. Một số virus khá phức tạp, bên ngoài capsid còn có một màng bao (hay áo ngoài) cấu tạo bởi lipid hay lipoprotein. Có loại trên màng bao còn có các mấu gai bám đầy chung quanh. Màng bao thực chất là màng tế bào chất của vật chủ nhưng đã bị virus cải tạo thành và mang tính kháng nguyên đặc trưng cho virus. Màng bao có thể bị các dung môi hòa tan lipid (cồn, ether, ) phá hủy. Hình thái virion Để quan sát được hình thái virion phải sử dụng kính hiển vi điện tử, ta thấy virion thường có cấu trúc đối xứng xoắn, đối xứng 20 mặt hoặc đối xứng đẳng trục. Loại thứ ba là đối xứng phức hợp, không giống các loại trên. Mỗi loại đối xứng lại phân thành loại có màng bao và loại không có màng bao.
A. Đối xứng xoắn: *Không có màng bao: 1. Hình que: virus khảm thuốc lá (TMV) 2. Hình sợi: thể thực khuẩn f1, fd, f13 của vi khuẩn E.coli *Có màng bao: 3. Dạng uốn khúc: virus cúm (họ Orthomyxoviridae) 4. Dạng đạn: virus dại họ (Rhabdoviridae) B. Đối xứng 20 mặt. *Không có màng bao: 5. Dạng nhỏ: virus viêm tủy xám (họ PicoARNviridae) 6. Dạng lớn: virus mụn cơm (họ Parvoviridae) 7. Virus sởi: (họ Togaviridae) C. Đối xứng phức hợp *Không có màng bao: thể thực khuẩn T của vi khuẩn E. coli *Có màng bao: virus đậu mùa (họ Poxviridae)
3.2. Thành phần hóa học của virus Virus chưa có cấu tạo tế bào, mỗi virus không thể gọi là một tế bào mà được gọi là một hạt virus hay virion. Một virus thành thục có cấu trúc hoàn chỉnh. Bao gồm hai thành phần chính: hạt virus là acid nucleic (ADN hay ARN ) và protein vỏ. Acid nucleic nằm ở giữa hạt virus tạo thành lõi hay hệ gen của virus. Protein bao bọc bên ngoài lõi tạo thành một vỏ capsid. Capsid mang các thành phần kháng nguyên và có tác dụng bảo vê lõi acid nucleic. Capsid cấu tạo bởi các đơn vị capsom. Lõi và vỏ hợp lại tạo thành một nucleocapsid, đó là kết cấu cơ bản của mọi virus. Một số virus khá phức tạp, bên ngoài capsid còn có một màng bao cấu tạo bởi lipid hay lipoprotein. Có loại trên màng bao còn có các mấu gai bám đầy chung quanh. Màng bao thực chất là màng tế bào chất của vật chủ nhưng đã bị virus cải tạo thành và mang tính kháng nguyên đặc trưng cho virus. Màng bao có thể bị các dung môi hòa tan lipid (cồn ethe, ) phá hủy. Acid nucleic nằm ở giữa hạt virus tạo thành một lõi hay hệ gen của virus. Acid nucleic là cơ sở lưu giữ tái tạo mọi thông tin di truyền vì vậy nó là thành phần quan trọng của mọi virus. Virus có nhiều loại hình acid nucleic và là cơ sở phân tử đáng tin cậy để phân loại virus. Các loại hình acid nucleic được phân biệt dựa trên mấy điểm chú ý sau đây. - Là ADN hay ARN? - Là chuỗi đơn hay chuỗi kép ? - Là dạng sợi hay dạng vòng? - Là vòng kín hay vòng hở? - Hệ gen là một thành phần, hai thành phần, ba thành phần hay nhiều thành phần? Ví dụ: Thông tin di truyền là ADN Chuỗi đơn Chuỗi kép Dạng sợi Dạng vòng Dạng sợi Dạng vòng
Adenoviridae Thể thực (gây bệnh đường hô Pavoviridae (gây khuẩn, φ X 174, Papovaviridae hấp), Herpesviridae bệnh ban đào trẻ em) M13, fd, f1 của E. (mụn cơm) (mụn rộp), Poxviridae coli (gây bệnh đậu, mùa) Thông tin di truyền là ARN Chuỗi đơn Chuỗi kép PicoARNviridae, ( viêm gan A), Rhinovirus (LMLM)Caliciviridae, Reoviridae, tiêu chảy trẻ, virus PCV gây Togaviridae, Bunyaviridae, bệnh cho côn virus, virus gây bệnh vàng lúa, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae , thể thực khuẩn φ6 của Pseudomonas Rhabdoviridae (dại), Retroviridae Protein bọc bên ngoài lõi tạo thành một vỏ gọi là capsid. Capsid mang các thành phần kháng nguyên và có tác dụng bảo vệ lõi acid nucleic. Capsid có cấu tạo bởi một hạt đơn vị phụ gọi là hạt capsid hay capsom. Lõi và vỏ hợp lại tạo thành một nucleocapsid, đó là kết cấu cơ bản của mọi virus. Một số virus khá phức tạp, bên ngoài capsid còn có một màng bao có cấu tạo bởi lipid hay lipoprotein. Có lúc trên màng bao còn có các mấu gai bám đầy chung quanh. Màng bao thực chất là màng tế bào chất hoặc màng nhân của tế bào vật chủ nhưng đã bị virus cải tạo thành và mang tính kháng nguyên đặc trưng cho virus. Màng bao có thể bị các dung môi hòa tan lipid (như ete, ) phá hủy. 3.3. Cấu trúc của ba dạng hình thái điển hình của virus 3.3.1. Cấu trúc đối xứng xoắn: lấy virus gây bệnh khảm thuốc lá (TMV: Tobacco mosa) làm ví dụ. Loại virus này được phát hiện sớm và nghiên cứu sâu hơn cả. TMV có hình que thẳng, dài 300 nm, rộng 15 nm, lõi rộng 4 nm. TMV chứa 95% protein và 5% chuỗi ARN đơn. Capsid chứa 2130 capsom hình chiếc giầy. Mỗi capsom cấu tạo bởi 158 gốc acid amine, khối lượng phân tử 17500. Các capsom bám vào sợi ARN xoắn trôn ốc. Có cả
thảy 130 vòng xoắn, mỗi vòng xoắn dài 2,3 nm, trên đó có trung bình 16,33 capsom. Sợi ARN có chứa 6390 nucleotit, khối lượng phân tử là 2 x 106. Cứ 3 nucleotit thì kết hợp với một phân tử protein. Vì TMV có vỏ protein bao bọc quanh sợi ADN xoắn ốc nên có kết cấu hết sức ổn định. Có tác giả cho biết, bảo quản ở nhiệt độ bình thường trong 50 năm TMV vẫn còn giữ được năng lực cảm nhiễm. Khi xử lý TMV bằng kiềm yếu ở pH =10,5 thì TMV bị phân ra thành những đoạn protein và ARN riêng ra. Mỗi đoạn protein này chỉ chứa vài capsom. Nếu hạ pH xuống 5 ngay khi không có ARN, các capsom này gắn lại với nhau tạo thành vỏ capsid giống hệt như cũ. Nếu có ARN thì chúng gắn lại với nhau như ban đầu để tạo thành một virus TMV hoàn chỉnh, có độ dài xác định. TMV gây tổn thất đáng kể ở thuốc lá, đậu đỗ và một số cây trồng khác. Gần đây người ta đã nghiên cứu tới các loại vaccin TMV để phòng bệnh cho cả cà và khoai tây, 3.3.2. Đối xứng 20 mặt Lấy virus Adenovirus làm ví dụ. Đó là một loại virus gây bệnh cho người và động vật được phân lập năm 1953. Chúng xâm nhiễm vào đường hô hấp, kết mạc mắt, các tổ chức lympho gây viêm. Từ thập kỷ 80 người ta đã biết có tới 80 loại Adenovirus, vật chủ tự nhiên là người, trâu bò, chó, khỉ, chuột, chim, ếch, nhái. Adenovirus có cấu trúc 20 mặt, thoáng trông gần giống hình cầu, không có màng bao, đường kính 70-80 nm. Chúng có tất cả 12 góc, 20 mặt, 30 cạnh. Capsid cấu tạo bởi 252 capsom, trong đó có 12 thể ngũ lân có khối lượng phân tử 70000, phân bố ở 12 góc và 240 thể lục lân có khối lượng phân tử 120.000, phân bố đều trên 20 mặt. Thể ngũ lân cấu tạo bởi 5 monomer protein mọc thẳng ra đầu có hình cầu, những sợi này được gọi là sợi ADN xoắn kép. Tất cả các loại Adenovirus đều có 36.500 cặp nucleotit. Adenovirus chỉ phát triển được trên tổ chức tế bào người, thích hợp nhất là trên tế bào tổ chức thận, không phát triển được trên phôi gà. Vì Adenovirus phát triển và lắp bên trong nhân tế bào vật chủ cho nên có thể làm cho tế bào vật chủ tạo ra các thể bao hàm.
3.3.3. Cấu trúc đối xứng phức hợp [4] Lấy thể thực khuẩn T số chẵn của vi khuẩn Escherichiae coli làm ví dụ. Loại này gồm có T2, T4, T6 phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Đây là mô hình rất tốt để nghiên cứu về virus học và về sinh học phân tử. Vì vậy chúng được nghiên cứu rất sâu sắc, nhất là đối với thể thực khuẩn T4.
Thể thực khuẩn T4 cấu tạo bởi 3 bộ phận: đầu, cổ và đuôi. Đầu cấu trúc đối xứng 20 mặt còn đuôi lại có đối xứng xoắn, chính vì vậy mà người ta gọi là đối xứng phức hợp. Đầu dài 95 nm, rộng 65 nm, dưới kính hiển vi điện tử có thể thấy rõ 20 mặt. Capsid có cấu tạo bởi 8 loại protein, lượng chứa protein chiếm tới 76-81% trong thể thực khuẩn. Mỗi capsom có đường kính là 8 nm. Có cả thảy là 212 capsom. Bên trong đầu có sợi ADN, đầu nối với đuôi qua cổ, đó là một đĩa hình lục giác tạo thành, đường kính 37,5 nm, có 6 tua cổ. Đuôi gồm có bao đuôi cấu tạo bởi 144 capsom. Ống đuôi cấu tạo bởi 24 vòng xoắn, tương ứng với 24 vòng xoắn trên bao đuôi. Đĩa gốc cũng tương tự như ở đĩa cổ, đó là một đĩa hình lục giác rỗng ở giữa. Trên đĩa gốc có mọc ra 6 sợi đuôi và 6 mấu ghim. Sợi đuôi cấu tạo bởi 4 loại protein khá lớn và 2 loại protein khá nhỏ. Nó có tác dụng hấp phụ chuyển hóa và mẫn cảm với tế bào vật chủ. Sau khi sợi đuôi hấp phụ, đĩa gốc sẽ bị kích thích dẫn đến việc co rút bao đuôi làm cho ống đuôi đâm vào tế bào vật chủ. Khi đó 144 capsom của đuôi sẽ phát sinh những phản ứng tương đối phức tạp, làm cho chiều dài đuôi co lại còn 50%, rất giống với sự co của các protein sợi cơ. IV. SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VIRUS [5] Chúng ta lấy thể thực khuẩn T của vi khuẩn E. coli để làm đối tượng nghiên cứu chính khi xem xét các phương thức sinh sản của virus. Sự sinh sản của thể thực khuẩn không phải là sự sinh sôi nẩy nở như ở vi khuẩn mà chỉ là sự tổng hợp hai thành phần cơ bản rồi lắp ráp lại với nhau. Nói chung sự sinh sản của virus được chia làm 5 giai đoạn: Hấp phụ → Xâm nhập → Sao chép→ Thành thục→ phóng thích Có tác giả lại chia làm sáu giai đoạn:
Hấp phụ → Xâm nhập → cởi áo→ Sao chép→ Thành thục→ phóng thích 4.1. Sự hấp phụ của virus lên tế bào cảm thụ Không có sự gắn kết giữa virus với tế bào thì hiện tượng nhiễm virus sẽ không xẩy ra. Nhưng không phải tất cả những tế bào gắn kết đều có thể bị nhiễm virus. Trong những trường hợp gắn kết không chắc chắn thì nó sẽ kéo theo sự tái tạo không chắc chắn sẽ xẩy ra. Trong dung dịch, khi thể thực khuẩn ngẫu nhiên gặp tế bào vật chủ tương ứng, có thể có sự tiếp xúc giữa mút của sợi đuôi với thụ thể đặc biệt trên bề mặt tế bào. Có tác giả cho rằng đó là một quá trình hóa học hình thành giữa gốc -NH3 sợi đuôi và -COOH trên thụ thể. Có thể do chạm vào các tua cổ mà búi sợi đuôi được gỡ tung ra sau khi sợi đuôi đã bám trên thụ thể, các mấu ghim và đĩa gốc sẽ áp sát bề mặt tế bào. Người ta nhận thấy trên bề mặt của vi khuẩn có khoảng 300 điểm hấp phụ. Các thể thực khuẩn khác nhau có các vị trí khác nhau về điểm hấp phụ. Thể thực khuẩn Điểm hấp phụ T3, T4, T7 của E. coli Lipopolysaccarit T2, T6 của E. coli Lipoprotein SP-50 Bacillus subtillis Acid teichoic X của Salmonella Tiên mao f2, MS2 pili Số lượng thể thực khuẩn: vì số điểm hấp phụ trên bề mặt tế bào vật chủ có hạn, do đó thể thực khuẩn có thể hấp phụ cũng có hạn. Số lượng thể thực khuẩn tương ứng có thể hấp phụ trên mỗi tế bào mẫn cảm được gọi là phức số cảm nhiễm (M.O.I). Phức số cảm nhiễm thường rất lớn, tới 250-360. Nếu một lượng lớn thể thực khuẩn đồng thời hấp phụ một tế bào mẫn cảm, vì đầu ống đuôi của từng thể thực khuẩn đều có một ít lysozyme làm cho bề mặt tế bào vật chủ như có trăm, ngàn lỗ khiến cho tế bào bị phá vỡ. Đó là do M.O.I quá cao gây nên. Trường hợp này sự phá vỡ tế bào, không làm sản sinh các thế hệ thể thực khuẩn mới, người ta gọi đó là sự phá vỡ tự ngoại. Các ion dương hóa trị hai thường xúc tiến hấp phụ: Ca2+, Mg2+, Ba2+, Các ion hóa trị ba thường làm bất hoạt hấp phụ: Al3+, Fe3+, Cr3+, Các nhân tố bổ trợ: tryptophan có thể xúc tiến sự hấp phụ của thể thực khuẩn T4. pH: môi trường trung tính có lợi cho sự hấp phụ, môi trường khi pH 10 khó hấp phụ. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển, cũng là nhiệt độ thích hợp cho sự hấp phụ. Cần nắm vững các yếu tố nói trên để có thể xúc tiến sự hấp phụ khi cần tiêu diệt vi khuẩn gây hại hoặc ức chế sự hấp phụ khi sử dụng vi khuẩn hoặc xạ khuẩn trong công nghiệp lên men.