Giáo trình Di truyền học (Phần 2)

Nội dung text: Giáo trình Di truyền học (Phần 2)

1. Chương 6 Học thuyết di truyền nhiễm sắc thể Mục tiêu của chương Giới thiệu sự di truyền liên kết với giới tính, một số ví dụ về các gen liên kết với nhiễm sắc thể giới tính và ứng dụng của chúng. Các gen trên cùng một nhiễm sắc thể di truyền cùng nhau theo quy luật liên kết. Số tiết: 5 Nội dung I. Sự xác định giới tính và sự di truyền liên kết với giới tính 1. Tỉ lệ phân li giới tính Quan sát nhiều loài sinh vật chúng ta thấy có hiện tượng đực cái. Nhiều số liệu cho thấy tỉ lệ giới tính là 1♂ : 1♀. Tỉ lệ này trùng với tỉ lệ phân li đơn tính khi lai phân tích Aa × aa hoặc Aa × AA. Như vậy giới tính có sự phân ly như một dấu hiệu Mendel. Sự phân li này cho thấy một giới tính đồng hợp tử, còn giới tính kia di hợp tử. Việc phát hiện ra các nhiễm sắc thể giới tính X và Y cho thấy bộ nhiễm sắc thể của cá thể đực và cái chỉ khác nhau ở một cặp nhiễm sắc thể giới tính, còn các nhiễm sắc thể thường đều giống nhau. Ví dụ bộ nhiễm sắc thể nhiễm sắc thể của ruồi giấm có 8 nhiễm sắc thể : ruồi cái: 6A + XX và ruồi đực: 6A + XY Sự kết hợp giữa đực và cái dẫn đến tỉ lệ phân chia 1 cái : 1 đực. Tuy nhiên tỉ lệ này còn phụ thuộc vào lứa tuổi. Thực tế ở người, trong mỗi gia đình tỉ lệ có dao động, tỉ lệ trên đúng khi thống kê với số lượng lớn. 2. Các gen liên kết với giới tính Các gen nằm trên nhiễm sắc thể giới tính sẽ có sự di truyền khác hơn so với các gen nằm trên nhiễm sắc thể thường. Thực tế cho thấy nhiễm sắc thể Y hầu như không chứa gen. 96
2. 2.1. Lai thuận nghịch: - Lấy ruồi cái mắt đỏ lai với ruồi đực mắt trắng: P: cái mắt đỏ × đực mắt trắng XWXW XwY G: XW Xw , Y W w W F1: X X X Y G: XW , Xw XW , Y W W W w W w F2: X X : X X : X Y : X Y Kiểu hình: 3 đỏ : 1 trắng (đực) Tỷ lệ phân li trong trường hợp này không khác lắm so với quy luật Mendel - Lấy ruồi cái mắt trắng lai với ruồi đực mắt đỏ: P: cái mắt trắng × đực mắt đỏ XwXw XWY G: Xw XW , Y W w w F1: X X X Y G: XW , Xw Xw , Y W w w w W w F2: X X : X X : X Y : X Y 1♀ mđỏ : 1♀ mtrắng : 1♂ mđỏ : 1♂ mtrắng Ở thế hệ thứ nhất có sự di truyền chéo, tỉ lệ phân li ở F2 là 1: 1: 1: 1 Như vậy đối với các gen nằm trên nhiễm sắc thể giới tính chọn đực hay cái mang dấu hiệu nào để lai là có ý nghĩa 97
3. Hình 6.1 Lai thuận nghịch ruồi dấm mắt đỏ với ruồi mắt trắng 3. Các tính trạng liên kết với giới tính trong di truyền học người - Các gen liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X Một số bệnh di truyền ở người như bệnh máu không đông hay mù màu đỏ đều là các tính trạng do các gen liên kết với nhiễm sắc thể giới tính. Sự di truyền chéo thể hiện rõ: ông ngoại bị bệnh truyền gen mầm bệnh cho mẹ, mẹ truyền bệnh cho con trai. Cho đến nay có ít nhất 50 bệnh và 200 dấu hiệu di truyền gắn với nhiễm sắc thể X của người đã được biết. 98
4. - Các nhiễm sắc thể X và Y có những phần tương đồng chung. Trong những phần này chứa các gen xác định những tính trạng di truyền theo cách như nhau ở cả nam và nữ, như: + Bệnh da khô sắc tố: Bệnh nhân siêu nhạy cảm với tia cực tím, dưới ảnh hưởng của các tia này trên phần hở của cơ thể xuất hiện những vết sắc tố thoạt đầu ở dạng tàn nhang, về sau ở các dạng u nhú lớn hơn (nốt ruồi) và cuối cùng là các u. Đối với 2/3 số người mắc bệnh thì bệnh da khô sắc tố kết thúc nguy hiểm vào lúc bước vào thời kỳ chín sinh dục. + Hội chứng Oguti: một bệnh hay gặp ở Nhật, biểu hiện ở viêm màng lưới sắc tố mắt và phát triển dị hình ở võng mạc. * Phần không tương đồng của nhiễm sắc thể Y có gen xác định nam tính và một số hội chứng: + Màng giữa ngón Hình 6.2 Tật màng giữa ngón + Tai rậm lông Hình 6.3 Tính trạng mọc lông ở vành tai đàn ông 99
5. * Phần không tương đồng của X có các hội chứng: + Bệnh máu khó đông (hemophilia): bệnh có thể được phát triển do kết quả không đủ chất globulin chống chảy máu. Bệnh máu khó đông đã được mô tả trong phả hệ các gia đình hoàng tộc châu Âu là một trường hợp điển hình, bắt đầu từ nữ hoàng Victoria, sau này gặp ở các hoàng tử Tây Ban Nha, Đức, Nga. + Bệnh không có gamma-globulin làm giảm sút rõ rệt sức đề kháng đối với các bệnh truyền nhiễm khác nhau. + Bệnh đái tháo nhạt: người bệnh bị giảm chức năng của tuyến yên, dẫn đến cơ thể bị mất nước rõ rệt. Trẻ em mắc bệnh này sinh trưởng chậm, rối loạn tâm thần, suy nhược cơ thể đôi khi chết. + Bệnh mù màu: rối loạn về khả năng nhìn màu sắc. Hiện tượng rối loạn thị giác này dựa trên cơ sở tác động của nhiều gen. Hiện tượng mù về màu đỏ xanh gọi là chứng mù màu đỏ. + Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne: bệnh do gen lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X. Bệnh xuất hiện từ lúc còn ít tuổi, dần dần dẫn đến tần phế và chết ở tuổi dưới 20. Do đó đàn ông bị loạn dưỡng cơ Duchenne không có con, còn phụ nữ dị hợp về gen này lại hoàn toàn bình thường * Các bệnh di truyền do gen trội liên kết với nhiễm sắc thể X có số lượng ít hơn và có ý nghĩa về mặt lâm sàng không bằng trường hợp di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể X, ngoại trừ trường hợp hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy. Một số bệnh di truyền do gen trội liên kết với nhiễm sắc thể X: + Bệnh còi xương do giảm phosphat máu là bệnh mà thận bị suy giảm khả năng tái hấp thu phosphat, dẫn đến việc cốt hóa bất thường làm xương bị cong và bị biến dạng. Đây là bệnh di truyền gen trội liên kết nhiễm sắc thể X nên người nữ có khả năng mắc bệnh cao hơn người nam. + Hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy: là hội chứng di truyền kiểu trội liên kết nhiễm sắc thể X, thể hiện sự chậm trí của người bệnh. Hội chứng được gặp với tỷ lệ 1/4.000 ở nam và 1/8.000 ở nữ. Ở người nữ, mức độ chậm trí có xu hướng nhẹ hơn và thay đổi mức độ biểu hiện nhiều hơn ở người nam. 100
6. 4. Gen nam giới và gen nữ giới ở người 4.1. Gen xác định nam giới Gen nam tính SRY (Sex determining region Y) được phát hiện vào năm 1990 trong một số trường hợp ngoại lệ không tuân theo nguyên tắc XX là nữ và XY là nam. Đã tìm thấy người nam bình thường có XX (nhưng bất thụ) có SRY trên một trong 2 nhiễm sắc thể X và người nữ bình thường mang XY nhưng mất SRY trên nhiễm sắc thể Y. Hình 6.4 Sự phân hóa di truyền các đoạn của X và Y Gen SRY còn gọi là nhân tố xác định tinh hoàn TDF (Testis determining factor) nằm trên một đoạn của vai ngắn của nhiễm sắc thể Y ở người. Có giả thuyết cho rằng gen này sản sinh ra protein gắn ADN hoạt hóa một hay nhiều gen khác trong hệ thống các nhân tố hoạt hóa các gen điều khiển sự phát triển của tinh hoàn. Khi thiếu sự hiện diện của TDF mô sinh dục sẽ phát triển thành noãn hoàng. TDF có tính bảo tồn các ở động vật có vú, chúng có nhiều điểm giống nhau giữa các loài. 4.2. Gen xác định nữ giới Gen xác định nữ giới DSS (Dosage sensitive sex reversal) được phát hiện vào năm 1994 do G. Carmerino (Ý). Ở những người nam (XY) nhưng có cơ quan sinh dục nữ có gen SRY trên nhiễm sắc thể Y, đặc trưng bởi sự lặp lại 1 đoạn vai ngắn nhiễm sắc thể X. Sự bất thường này rất hiếm 101
7. (khoảng 1/20.000 người). Sự cố nhiễm sắc thể này không liên quan đến giảm phân. Những người mang gen này bất thụ. Trong số 8 người bệnh nghiên cứu, 3 người có Y bình thường và một có X với vai ngắn gấp đôi, còn 5 người có một X nguyên trạng và một Y có vai ngắn của X ghép thêm vào. Trong 2 trường hợp có sự hiện diện của 2 đoạn vai ngắn của X. Các nghiên cứu tiếp cho thấy đoạn vai ngắn của X gắn vào càng dài, giới tính càng lệch về tạo phái nữ. Gen DSS đã được tách ra. 5. Nhiễm sắc thể X bất hoạt ở người Trong phôi người, một nhiễm sắc thể X bắt nguồn từ mẹ hay cha trong mỗi tế bào soma sẽ bất hoạt ngẫu nhiên. Tất cả thế hệ tế bào con đều được truyền nhiễm sắc thể X bất hoạt. Thường thì nhiễm sắc thể X có cấu trúc không bình thường bất hoạt, trừ một số ngoại lệ liên quan đến các đột biến liên kết giới tính. Khi nhuộm màu nhân tế bào của người nữ, nhiễm sắc thể X bất hoạt thể hiện ở dạng tròn, được gọi là thể Barr. Trung tâm bất hoạt nằm ở vai dài q, gần tâm động. 6.Ví dụ ứng dụng sự di truyền các gen liên kết với giới tính - Ở gà: B: lông vằn, b: lông trắng, nằm trên X. P: ♀ lông vằn × ♂ lông trắng ZBY × ZbZb G: ZB, Y Zb B b b F1: Z Z : Z Y ♂ lông vằn : ♀ lông trắng Ứng dụng vào nông nghiệp, giúp phân đàn ngay khi lúc gà mới nở: muốn nuôi lấy trứng, chọn gà mái; muốn phát triển sản lượng, nuôi gà trống 102
8. Hình 6.5 Ứng dụng của di truyền liên kết với nhiễm sắc thể giới tính trong phân đan gà - Ở tằm: L: màu sẫm, l: màu sáng P: cái ZLW x đực ZlZl ♀ màu sẫm ♂ màu sáng L l l F1 Z Z : Z W ♂ màu sẫm ♀ màu sáng Hình 6.6 Ứng dụng di truyền liên kết với nhiễm sắc thể giới tính trong phân loại trứng tằm Tằm đực cho nhiều tơ hơn tằm cái: 20-30%. Dựa vào tính chất liên kết với giới tính người ta có thể phân biệt được 2 loại tằm đực và cái ngay 103
9. từ giai đoạn trứng dựa vào màu sắc trứng: trứng màu sáng phát triển thành tằm cái, trứng màu sẫm phát triển thành tằm đực. Ý nghĩa: Dựa vào các dấu hiệu có thể phân biệt giới tính động vật ngay từ khi sinh vật còn bé. Trong công tác chọn giống gia súc thì vấn đề phân biệt giới tính ngay từ đầu có thể phân vùng hợp lý cho việc chăn nuôi. Một số thực vật có hiện tượng di truyền liên kết với giới tính : chà là. 6. Hiện tượng không chia ly của nhiễm sắc thể Ở thí nghiệm: ruồi cái mắt trắng x đực mắt đỏ F1 thu được cái mắt đỏ , đực mắt trắng Calvin Bridges đã phát hiện trường hợp ngoại lệ trong kết quả lai giữa ruồi cái mắt trắng với ruồi đực mắt đỏ: trong 2000 ruồi F1 thì xuất hiện 1 con cái mắt trắng và 1 con đực mắt đỏ. Quan sát tế bào học cho thấy ruồi cái có cặp nhiễm sắc thể XX đi cùng nhau do không chia ly (non- disjunction) trong giảm phân nên ruồi cái có kiểu gen XwXwY biểu hiện mắt trắng, ruồi đực XWO có mắt đỏ. P : XwXw × XWY Mắt trắng Mắt đỏ G : XwXw, O XW, Y W w w w w W F1 : X X X : X X Y : X O : OY Siêu cái mắt đỏ : cái mắt trắng : đực đỏ : chết (thường chết) Từ kết quả này của Bridges cho thấy sự xác định giới tính ở ruồi giấm không do nhiễm sắc thể Y mà do tỉ số X/A quyết định Nếu X /A = 0,5 trở xuống : ruồi đực. X/A = 1,0 trở lên : ruồi cái X/A = 0,5 - 1,0 : giới tính trung gian 104
10. Hinh 6.7 Sư hinh thanh thê hê sau do sư không phân ly cua căp nhiêm săc thê giơi tinh Hinh 6.8 Sư không phân ly cua nhiêm săc thê (a) Sư không phân ly nhiêm săc thê ơ con cai XX (b) Sư không phân ly nhiêm săc thê ơ con cai XXY Giới tính của ruồi giấm Cấu trúc nhiễm sắc thể Tỷ lệ X/A 105
11. Siêu cái AAXXX 1,5 Ruồi cái bình thường + Tứ bội AAAAXXXX 1,0 + Tam bội AAAXXX 1,0 + Lưỡng bội AAXX 1,0 + Đơn bội AX 1,0 Giới tính trung gian AAAXX 0,67 Đực bình thường AAXY 0,5 Siêu đực AAAXY 0,33 7. Xác định giới tính do số bội thể Ở côn trùng bộ Hymenoptera (ong , kiến): đực (n), cái (2n), ong thợ (2n) Ong đực được phát triển trinh sinh từ trứng không được thụ tinh có bộ nhiễm sắc thể đơn bội (n). Trong kiểu xác định giới tính này không có nhiễm sắc thể giới tính. Còn giới tính cái thì xác định do những alen giới tính khác nhau phối hợp, ong thợ và ong chúa đều là ong cái. Sự khác nhau giữa ong thợ và ong chúa là do ngay từ những ngày đầu mới nở, thức ăn của ong thợ bị thiếu một số vitamin nên bất thụ. Ong thợ làm nhiệm vụ bảo vệ tổ. Ong đực được phát triển từ trứng không thụ tinh nên tế bào sinh dục là đơn bội, cơ thể phục hồi lại nhiễm sắc thể lưỡng bội nên có kích thước và sức sống bình thường. 8. Xác định giới tính do điều kiện môi trường Ở một số loài, sự xác định giới tính do điều kiện môi trường quyết định. Ở loài biển Bonellia viridis, các ấu trùng xuất hiện sau khi được thụ tinh sống tự do một thời gian rồi hoặc bám xuống đáy thành con cái hoặc bám vào con cái rồi chiu vào tử cung thành con đực và thụ tinh. Cả đực và cái đều có kiểu gen như nhau. 106
12. Ở cây Arisaema japonica, yếu tố quyết định giới tính là trọng lượng củ: những củ to nhất và chứa nhiều chất dinh dưỡng nhất sinh ra cây có hoa cái, trong khi đó các củ gầy chỉ cho cây có hoa đực. II. Sự di truyền liên kết Ở trong cơ thể sinh vật, số lượng gen rất nhiều nhưng số lượng nhiễm sắc thể lại ít nên nhiều gen cùng nằm trên nhiễm sắc thể. Khi 2 hay nhiều gen nằm trên một nhiễm sắc thể, chúng sẽ cùng di truyền với nhau gọi là sự di truyền liên kết. Các gen liên kết có xu hướng cùng di chuyển với nhau trong quá trình hình thành giao tử. 1. Hiện tượng liên kết Bateson và Punnet năm 1906 đã phát hiện ra hiện tượng liên kết khi thực hiện phép lai ở Đậu thơm (Lathyrus odoratus) với hai tính trạng: R : hoa đỏ thẩm r : hoa đỏ Ro: hạt phấn dài ro: hạt phấn tròn P : hoa đỏ thẩm hạt phấn dài × hoa đỏ hạt phấn tròn F1 : 100% hoa đỏ thẩm hạt phấn dài. F2 : 192 hoa đỏ thẩm hạt phấn dài; 182 đỏ, hạt phấn tròn; 23 đỏ thẩm, hạt phấn tròn; 30 đỏ, hạt phấn dài Hinh 6.9 Kiêu hinh ruôi hoang dai va ruôi đôt biên 107
13. 2. Liên kết hoàn toàn B : thân xám b : thân đen Vg : Cánh dài vg : cánh cụt Thí nghiệm : P : ruồi giấm mình xám cánh dài × ruồi giấm thân đen cánh cụt BVg × bvg BVg bvg G : BVg bvg F1 : BVg bvg (100% xám dài) Lai phân tích ruồi đực F1 : BVg × bvg bvg bvg đực xám dài cái đen cụt G : BVg bvg bvg FB : BVg bvg bvg bvg 50% xám dài : 50 % đen cụt Tỷ lệ phân li 1:1 giống với lai một tính, hai gen b và vg đi cùng nhau như 1 gen. Một hiện tượng cho đến nay chưa rõ cơ chế là ở ruồi giấm đực không xảy ra tái tổ hợp di truyền, nên có sự liên kết hoàn toàn của các gen trên một nhiễm sắc thể. 3. Hiện tượng di truyền liên kết không hoàn toàn Dùng ruồi giấm cái F1 của thí nghiệm trên lai phân tích: F1 : Thân xám, cánh dài × thân đen, cánh cụt BVg × bvg bvg bvg G : BVg bvg bVg Bvg bvg 41,5% 41,5% 8,5% 8,5% 100% 108
14. FB : BVg bvg Bvg bVg bvg bvg bvg bvg 41,5% xám dài : 4,5% đen cụt : 8,5% xám cụt : 8,5% đen cụt. Kết luận: đã có hiện tượng hoán vị gen giữa gen quy định thân xám cánh dài với gen quy định thân đen cánh cụt trong quá trình phân bào 4. Các nhóm liên kết (Gene linkage) Các gen cùng nằm trên một nhiễm sắc thể, cùng di truyền với nhau được xếp vào một nhóm gọi là nhóm liên kết gen. Số nhóm liên kết gen tối đa bằng số cặp nhiễm sắc thể. Ví dụ: Ruồi giấm 2n = 8, số nhóm liên kết gen tối đa = 4 Bắp : 2n =20, có 10 nhóm liên kết gen III. Hiện tượng tái tổ hợp 1. Tái tổ hợp và trao đổi chéo Khi các gen liên kết không hoàn toàn, xuất hiện các dạng giao tử mới không giống cha mẹ do có sự sắp xếp lai các gen. Hiện tượng này gọi là tái tổ hợp (recombination) và các dạng mới xuất hiện gọi là dạng tái tổ hợp (recombinant). Để đánh giá mức độ liên kết, dùng khái niệm tần số tái tổ hợp. % tái tổ hợp = Số cá thể tái tổ hợp / tổng số cá thể × 100% Nhiều thí nghiệm cho thấy tần số tái tổ hợp giữa 2 gen là một số tương đối ổn định từ lần lai này qua lần lai khác, không phụ thuộc vào cách sắp xếp. Hai alen trội cùng một phía trên nhiễm sắc thể gọi là vị trí cis(AB/ab), 2 alen trội nằm trên 2 nhiễm sắc thể gọi là vị trí trans (Ab/aB). Hiện tượng tái tổ hợp có được nhờ quá trình trao đổi chéo (crossing over). Trong đó 2 nhiễm sắc thể tương đồng hoán vị nhau hay đổi chéo nhau ở những điểm nhất định. Nhiễm sắc thể tương đồng tiếp hợp nhau và trao đổi chéo xảy ra giữa các chromatid không chị em. Các giao tử từ các chromatid không có trao đổi chéo (kiểu cha mẹ) được gọi là giao tử kiểu cha mẹ. Các giao tử từ 2 chromatid khác có xảy ra trao đổi chéo gọi là giao tử tái tổ hợp. 109
15. Hình 6.10 Trao đổi chéo giữa các chromatid Hình 6.11 Sự tạo thành các dạng tái tổ hợp 110
16. 2. Cở sở tế bào học của trao đổi chéo Năm 1931, các thí nghiệm chứng minh cơ sở tế bào học của tái tổ hợp di truyền do Stern tiến hành ở Drosophila melanogaster và do Creighton và Mc Clintok tiến hành ở ngô. Cả 2 thí nghiệm đều dùng "dấu chuẩn" về hình dạng trên một trên hai nhiễm sắc thể tương đồng có thể nhìn thấy được khi quan sát tế bào học. Hai nhiễm sắc thể tương đồng được phân biệt với nhau về hình thái này, mang các alen tương ứng khác nhau về mặt di truyền của một số cặp gen. Tái tổ hợp di truyền sẽ tạo ra các kiểu hình độc đáo kèm theo các thay đổi tế bào học dễ quan sát và dự đoán được. Thí nghiệm lai ở ngô với các gen có biểu hiện rõ ràng nằm trên cặp nhiễm sắc thể số 9 có dấu đặc biệt nhiễm sắc thể có 1 đầu có gù lớn và phần sau dài ra, nhiễm sắc thể kia ngắn hơn không có gù. Các gen được sử dụng: C+ : có màu , c: không màu W+ : bắp tẻ (tinh bột), w: bắp nếp (hồ bột) Cho lai bắp có màu, tẻ với bắp không màu , nếp. Kết quả thu được 4 dạng: có màu, nếp; không màu, tẻ; có màu, tẻ; không màu, nếp. Hinh 6.12 Trao đôi cheo ơ nhiêm săc thê sô 9 cua băp đươc quan sat dưa trên "dâu chuân" 111
17. Dựa vào kết quả lai, đối chiếu với các quan sát nhiễm sắc thể về mặt hình thái: thu được dạng nhiễm sắc thể có gù nhưng ngắn, còn dạng kia không gù, dài và 2 dạng giống bố mẹ: có gù, dài và không gù, ngắn. Chứng tỏ đã có xảy ra trao đổi chéo của các đoạn nhiễm sắc thể. Stern đã dùng nhiễm sắc thể X ở một đầu mút có dính một đoạn nhiễm sắc thể Y. Các nhiễm sắc thể khác có độ dài tương tự, với tâm động. Hai cặp gen được dùng là carnation (car: lặn, mắt đỏ nhạt) - hoang dại (+, trội, mắt đỏ) và Bar (B: trội, mắt hình thỏi) và hoang dại (+, mắt bình thường). Ruồi cái mẹ dị hợp tử ở cả 2 gen, có kiểu hình mắt đỏ dạng thỏi (car+B) với ruồi đực mắt đỏ nhạt, dạng thường (car +). Thế hệ con nhận được cả 4 loại kiểu hình tương ứng với các dấu hiệu hình thái trên nhiễm sắc thể: ngoài 2 kiểu có ở cha mẹ còn có 2 kiểu hình tái tổ hợp là mắt đỏ nhạt, hình thỏi (car B) và mắt đỏ, dạng thường (car++). Hình 6.9 Sự trao đổi các đoạn nhiễm sắc thể tạo các dạng tái tổ hợp Hinh 6.13 Trao đôi cheo ơ ruôi dâm đươc quan sat dưa trên "dâu chuân" 3. Trao đổi chéo ở trong giai đoạn 4 sợi 112
18. Hình 6.14 Sơ đồ trao đổi chéo đơn và trao đổi chéo kép 113
19. Trao đổi chéo ở giai đoạn 4 cromatid, tức trao đổi chéo xảy ra sau khi nhiễm sắc thể đã tự nhân đôi (còn gọi là giai đoạn 4 sợi). Về nguyên tắc có thể cho rằng trao đổi chéo có thể xảy ra cả khi nhiễm sắc thể chưa tự nhân đôi (giai đoạn 2 sợi) Phân tích bộ bốn có thể giải quyết vấn đề này. Phân tích bộ bốn là phép phân tích di truyền học nghiên cứu bốn sản phẩm trực tiếp của giảm phân khi tế bào lưỡng bội dị hợp về một gen hay nhiều gen liên kết phân chia giảm phân. Năm 1925, C. Bridge và I. Anderson đã chứng minh trao đổi chéo các cromatid ở ruồi giấm. Tác giả sử dụng dòng ruồi có nhiễm sắc thể X mang thêm đoạn nhiễm sắc thể Y (X,XY) dị hợp về các gen của nhiễm sắc thể X: f (forked) - lông phân nhánh, g (garnet) - mắt đỏ rực. Khi cho lai con cái này với con đực bình thường thì chúng truyền trực tiếp 2 nhiễm sắc thể X cho thế hệ sau và chỉ một nửa thế hệ con của chúng sống sót. Khi ấy một phần cá thể con ở đời sau từ phép lai này là đồng hợp theo các gen của nhiễm sắc thể X. Các thể đồng hợp này chỉ có thể xuất hiện do trao đổi chéo ở giai đoạn 4 sợi trong đoạn gen - tâm động. 4. Trao đổi chéo nhiều lần Trao đổi chéo giữa 2 chromatid có thể xảy ra nhiều lần: 2, 3, 4 lần Nếu 2 trao đổi chéo xảy ra trên cùng 2 chromatid ở đoạn giữa 2 gen đánh dấu thì sản phẩm cuối cùng đều có kiểu cha mẹ, nên không phát hiện được. Kiểu trao đổi chéo này chỉ có thể phát hiện được khi sử dụng thêm một gen đánh dấu thứ ba nằm giữa 2 gen này. Nếu xác suất trao đổi chéo giữa A và C và giữa B và C tương ứng với x và y, thì xác suất xảy ra trao đổi chéo đôi là: 0,2 × 0,1 = 0,02 (2%) 5. Nhiễu (Interference) và trùng hợp (Coincidence) Thường thì sự trao đổi chéo ở một chỗ làm giảm xác suất trao đổi chéo thứ hai gần kề nó. Đó là hiện tượng nhiễu. Để đánh giá kết quả người ta dùng hệ số trùng hợp. 114
20. % trao đổi chéo đôi quan sát được Hệ số trùng hợp = % trao đổi chéo đôi theo lý thuyết Sự trùng hợp + nhiều = 100% = 1 Ví dụ: Biết khoảng cách A-B = 10 đơn vị (10%) và B-C = 20 đơn vị (20%), nếu không có nhiễu thì tần số trao đổi chéo đôi theo lý thuyết là 0,1 × 0,2 = 0,02 hay 2%. Giả sử quan sát được tần số trao đổi chéo đôi là 1,6%. Sự trùng hợp = 1,6/2,0 = 0,8. Điều này cho thấy trao đổi chéo đôi chỉ xảy ra có 80% và sự nhiễu 1,0 - 0,8 = 0,2 (hay 20%) IV. Xác định vị trí gen và bản đồ di truyền 1.Xác định vi trí gen Morgan cho rằng những gen đứng gần nhau thì liên kết chặt, còn các gen đứng xa nhau thì liên kết yếu. Những gen đứng gần nhau liên kết chặt nên ít xảy ra trao đổi chéo, tần số tái tổ hợp nhỏ, còn các gen đứng xa nhau thì mức liên kết yếu nên tần số tái tổ hợp lớn hơn. Nếu cho rằng các phần của nhiễm sắc thể có khả năng trao đổi chéo như nhau thì tần số tái tổ hợp phản ánh khoảng cách tương đối giữa các gen và tỷ lệ nghịch với mức liên kết gen. Số phần trăm tái tổ hợp được dùng làm số đo khoảng cách giữa 2 gen trên bản đồ di truyền. Một đơn vị bản đồ được coi là đơn vị đo khoảng cách giữa 2 cặp gen khi trong 100 sản phẩm của giảm phân có một dạng tái tổ hợp 1% tái tổ hợp = 1 đơn vị bản đồ, đơn vị này được gọi là centiMorgan (cM). Mỗi cM bằng khoảng 1000 kb hay 106 bp. Như vậy biết được tần số tái tổ hợp giữa các gen có thể xác định vị trí của chúng trên nhiễm sắc thể. Muốn xác định vị trí của một gen bất kỳ phải tiến hành lai và qua 2 bước: - Căn cứ tỷ lệ phân ly để xác định nhóm liên kết gen - Dựa vào tần số tái tổ hợp so với 2 gen khác để xếp vị trí trên nhiễm sắc thể. A B 115
21. + Nếu: C nằm giữa AB: AC + CB = AB C nằm ngoài phía A: CB - CA = AB C nằm ngoài phía B: CA - CB = AB So sánh cụ thể tần sô tái tổ hợp giữa C-A, C-B, A-B xác định được vị trí của C. 2. Bản đồ di truyền của nhiễm sắc thể và bản đồ di truyền tế bào Nhờ xác định được vị trí gen, bản đồ di truyền nhiễm sắc thể của nhiều đối tượng như ruồi dấm, cà chua, bắp, đã được xây dựng. Hinh 6.15 Ban đô di truyên nhiêm săc sô 12 cua ca chua 116
22. Năm 1943, nhiễm sắc thể khổng lồ ở tuyến nước bọt ruồi dấm được phát hiện. Quan sát kính hiển vi có thể nhìn thấy các vệt nhuộm màu đặc trưng (khoảng 5.000 vệt của nhiễm sắc thể khổng lồ sau khi nhuộm. Nhiều dạng đột biến thường là đột biến nhiễm sắc thể gây nên những biến đổi hình thái quan sát rõ rệt trên nhiễm sắc thể khổng lồ. Điều này được sử dụng để lập bản đồ di truyền tế bào (cytogenetic map) mà không theo tần số tái tổ hợp do lai. Sự đối chiếu giữa bản đồ di truyền nhiễm sắc thể và bản đồ di truyền tế bào cho thấy có sự giống nhau về trình tự sắp xếp gen theo đường thẳng, tuy khoảng cách có khác nhau (do hiện tượng nhiễu). Điều này khẳng định thêm gen nằm trên nhiễm sắc thể. Hinh 6.16 Ban đô di truyên nhiêm săc sô 10 cua băp 117
23. Hinh 6.17 Thê di hơp mât đoan nhiêm săc thê cua ruôi dâm đươc sư dung đê lâp ban đô di truyên Hinh 6.18 Ban đô di truyên cua E.coli 118
24. * Đặc điểm chính của học thuyết di truyền nhiễm sắc thể - Các gen nằm trên nhiễm sắc thể sản xuất theo đường thẳng tạo thành các nhóm liên kết có số lượng bằng số cặp nhiễm sắc thể - Các gen cùng nằm trên một nhiễm sắc thể có sự di truyền liên kết và mức liên kết phụ thuộc vào khoảng cách giữa các gen - Giữa các nhiễm sắc thể tương đồng có thể xảy ra trao đổi chéo dẫn đến tái tổ hợp các gen. Tái tổ hợp là một nguồn biến dị quan trọng cung cấp nguyên liệu cho quá trình chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo. - Sự liên kết các gen và sự tái tổ hợp giữa chúng do trao đổi chéo là những hiện tượng sinh học trong đó biểu hiện sự thống nhất giữa tính biến dị và tính di truyền. V. Nhiễm sắc thể người và bản đồ nhiễm sắc thể người 1. Nhiễm sắc thể người Năm 1956, J. H. Tjio và A. Levan mới xác định được chính xác số lượng nhiễm sắc thể của người là: 2n = 46. Sau đó nhờ kĩ thuật nhuộm màu bằng giemsa và quan sát hiển vi huỳnh quang mới phát hiện các vệt đặc trưng để xây dựng nên nhiễm sắc đồ. Sử dụng máu làm tiêu bản quan sát nhiễm sắc thể: Nuôi cấy tế bào bạch cầu máu ngoại vi của người bình thường và người mắc bệnh đã được áp dụng trong khoảng năm gần đây. Nhưng phương pháp này được ứng dụng rộng rãi nhất sau khi phát hiện được hợp chất polysacchyrid-protid lấy từ hạt cô ve dùng làm chất gây ngưng kết không đặc hiệu hồng cầu. Người ta dùng chất phytohemaglutinin này cùng với dung dịch nhược trương đã cho phép thu được kết quả của sự phân chia tế bào máu ngoại vi rất tốt. Phương pháp này đã được nhóm nghiên cứu của Moorhead sửa đổi và áp dụng. Cơ sở của phương pháp này là người ta trộn lẫn huyết thanh có lẫn bạch cầu vào môi trường dinh dưỡng với một tỷ lệ nhất định rồi cho thêm vào hỗn hợp đó chất phytohemaglutinin, sau đó cho vào lọ trung tính rồi nuôi cấy. Ngoài chất phytohemaglutinin chiết từ đậu cô ve còn nhiều chất khác cũng có tác dụng ngưng kết hồng cầu. Trong quá trình nuôi cấy bạch cầu cũng có thể tiến hành quan sát sự chuyển hóa các loại tế bào bạch cầu. Sự phân chia tế bào bạch cầu làm cơ sở cho nghiên cứu đặc điểm tế bào bạch cầu trong máu. Trên cơ sở nghiên cứu 119
25. tế bào máu bình thường và bệnh lý, có thể phát hiện ra trạng thái bệnh lý của tế bào bạch cầu ở người và động vật. 2. Kỹ thuật lai tế bào soma Đến giữa những năm 1960 chỉ mới xác định được một cách đáng tin cậy 3 nhóm liên kết (mỗi nhóm có 2 gen) trên nhiễm sắc thể thường và 4 gen trên nhiễm sắc thể X ở người, theo thống kê từ các phả hệ, nhưng chưa biết ở nhiễm sắc thể nào. Vào năm 1967, Mc Weiss và H. Green sử dụng kỹ thuật lai tế bào soma (somatic cell hybridisation) đã lần đầu tiên xác định được gen TK mã hóa cho enzyme thymidin kinase nằm trên nhiễm sắc thể 17. Các dòng tế bào soma của người và các động vật có vú, khi nuôi chung với sự hiện diện của virus Sendai có thể dung hợp hay lai với nhau. Các tế bào dung hợp này trong quá trình phân bào tiếp theo sẽ mất dần một số nhiễm sắc thể của tế bào cha mẹ. Ví dụ, tế bào người dung hợp với tế bào chuột, khi các tế bào phân chia, các nhiễm sắc thể của người bị mất nhanh. Sau khoảng 30 thế hệ tế bào, ở dòng tế bào lai giữa chuột nhắt và người còn lại toàn bộ nhiễm sắc thể của chuột và còn khoảng 7 nhiễm sắc thể của người ở một số tế bào chỉ còn 1-2 nhiễm sắc thể người. Sự xác định vị trí của một gen trên một nhiễm sắc thể nhất định được căn cứ vào sự tồn tại hay mất đi của gen đó khi đối chiếu với sự hiện diện hay văng mặt nhiễm sắc thể đó trong dòng tế bào. Kỹ thuật này đã giúp vượt qua khó khăn khi thống kê theo phả hệ và nhờ nó mà gần trăm gen được xác định vị trí trên 23 nhóm liên kết gen. Trong trường hợp gen TK, dòng tế bào chuột TK- được lai với tế bào người TK+. Sự dung hợp tạo tế bào lai chuột-người. Mặc dù phần lớn nhiễm sắc thể người bị loại mất nhanh trong các dòng tế bào lai, nhưng một số dòng còn một ít nhiễm sắc thể người. Khi các dòng tế bào này được nuôi trên các môi trường có chất aminopterin, các tế bào TK- sai hỏng hoạt tính thymidin kinase, không mọc được do mất khả năng chuyển hóa thymidine thành thymidylic acid cần cho tổng hợp ADN. Do vậy chỉ có tế bào lai có nhiễm sắc thể 17 này của người mới tạo được dòng ổn định. Chứng tỏ gen TK+ phải nằm trên nhiễm sắc thể này. Chứng cứ xác nhận thêm được thực 120
26. hiện bằng cách chọn các dòng trên môi trường có thêm chất bromodeoxyuridin riboside (BUDR) là chất đồng đẳng với nitrogenous base được chuyển hóa bởi thymidin kinase (TK+) gắn vào ADN làm tế bào chết. Hậu quả, nuôi trên môi trường có BUDR là các dòng tế bào sống được không có gen TK+ và tương ứng với điều đó, chúng không có nhiễm sắc thể 17 của người. Dựa vào phương pháp này, người ta lập bản đồ nhiễm sắc thể người trên cơ sở sự có mặt của một sản phẩm do một gen nào đó thì tương ứng với sự có mặt nhiễm sắc thể trong tế bào. - Điều kiện để thực hiện được việc lập bản đồ nhiễm sắc thể người nhờ phương pháp này + Tính trạng nghiên cứu được mã hóa bởi một gen trên nhiễm sắc thể của người, mà nó được phân biệt rõ ràng với tính trạng tương ứng của chuột. Ví dụ: Dòng tế bào người chứa Lactatdehydrgenase A đột biến, enzyme này phải được phân biệt với protein được mã hóa bởi một gen tương ứng của chuột (LDHA của người và chuột được phân biệt bằng phương pháp điện di). + Khả năng có thể xác định được nhiễm sắc thể của người còn lại ở dòng tế bào Ví dụ: gen LDHA của người được phát hiện trong các dòng tế bào lai mà trong đó chỉ còn lại độc nhất một nhiễm sắc thể. Đó là nhiễm sắc thể số 2. Chứng tỏ LDHA nằm trên nhiễm sắc thể số 2. Phần lớn các gen được xác định theo phương pháp trên liên quan đến các enzyme, mà việc phát hiện chúng căn cứ theo phản ứng do chúng xúc tác. Về sau một số thủ thuật khác được sử dụng như dùng các "mất đoạn" để xác định vị trí gen. - Xác định nhóm liên kết của các gen bệnh Dựa vào các nhóm liên kết gen đã được xác định bằng lai tế bào soma, nhiều gen bệnh được gắn vào các nhiễm sắc thể. Việc xác định này căn cứ theo nhiều phả hệ của các gia đình có các bệnh di truyền. Gần đây (1993) vài bệnh di truyền được xác định bằng cách sử dụng gen dự tuyển (canđiate gene approach). Một trong các ví dụ là các đột biến của gen fibrillin gây hội chứng Marfan. Gen gây hội chứng Marfan được lập 121
27. bản đồ ở nhóm liên kết 15, ngay giưa vai dài của nhiễm sắc thể. Gen mã hóa cho fibrillin cũng có vị trí tương tự khi sử dụng phương pháp FISH (fluorescent in situ hybridization - phát hiện bằng huỳnh quang khi lai tại chỗ). Câu hỏi ôn tập 1. Cơ chế xác định giới tính ở người và động vật. 2. Đặc điểm của sự di truyền liên kết với giới tính. 3. Cơ sở của sự hình thành các nhiễm sắc thể tái tổ hợp. 4. Nêu ứng dụng của sự di truyền liên kết với giới tính. 5. Chứng minh trao đổi chéo xảy ra ở giai đoạn 4 chromatid. 6. Cơ sở tế bào học của trao đổi chéo. 7. So sánh quy luật di truyền liên kết hoàn toàn và quy luật hoán vị gen. 8. Di truyền học Morgan đã bổ sung cho di truyền học Mendel như thế nào? Tài liệu tham khảo Trịnh Văn Bảo, Phan Thị Hoan, Trần Thị Thanh Hương, Trần Thị liên, Trần Đức Phấn, Phạm Đức Phùng, Nguyễn Văn Rực, Nguyễn Thị Trang. 2002. Các nguyên lý sinh học. NXB Y học Hà Nội. Phạm Thành Hổ (2000). Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo Dục. Hoàng Trọng Phán (1995). Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế. Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Harlt D.L., Jones E.W. (1998). Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers. Toronto, Canada. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Inc., New York. 122
28. Chương 7 Di truyền học Vi khuân Mục tiêu của chương Giới thiệu cac hiện tương di truyền ơ vi khuẩn, sư chuyên vi va cơ sơ di truyền tinh khang thuôc cua cac vi khuẩn gây bệnh. Số tiết: 3 Nội dung I. Ưu thế và các đặc điểm của đối tượng vi sinh vật 1. Thời gian thế hệ ngắn, tốc độ sinh sản nhanh Trong điều kiện thuận lợi, tế bào E.coli có thể phân chia 1 lần trong 20 phút, còn bacteriophage trong thời gian 30-40 phút có thể tạo ra hàng trăm cá thể, nấm men có thể chia tế bào trong 2 giờ. Đặc điểm nghiên cứu di truyền học là theo dõi qua nhiều thế hệ nên các đối tượng vi sinh vật giúp rút ngắn đáng kể thời gian thí nghiệm. Nếu so sánh thời gian thế hệ của ruồi giấm (2 tuần), của chuột (2 tháng), của người (20 năm) thì các vi sinh vật ưu thế hơn hắn. 2. Có sự tăng vọt số lượng cá thể Trong điều kiện đủ dinh dưỡng các vi sinh vật sinh sản nhanh tạo quần thể có số lượng cá thể đủ lớn, có thể có số lượng 1010 -10 12 tế bào Tế bào E.coli có đường kính 1 µm nếu đủ dinh dưỡng thì trong 44 giờ có thể tạo sinh khối bằng quả đất. Ruồi dấm là đối tượng thuận lợi cho nghiên cứu di truyền học quần thể, nhưng cũng chỉ đạt 105 - 106 cá thể. Nhờ số lượng cá thể lớn có thể phát hiện được các sự kiện di truyền hiếm hoi với tần số 10-8- 10-11. Như vậy số lượng cá thể lớn sẽ giúp nâng cao năng suất phân giải di truyền tức khả năng phát hiện các đột biến và tái tổ hợp có tần số xuất hiện rất nhỏ. 123 123
29. Ngoài ra việc nuôi cấy vi sinh vật không cồng kềnh, ít tốn diện tích, môi trường nuôi cấy dễ kiểm soát theo các công thức chặt chẽ. 3. Có cấu tạo bộ máy di truyền đơn giản Ở vi sinh vật có cấu tạo bộ máy di truyền là DNA trần, dễ tiến hành thí nghiệm trực tiếp trên DNA cũng như dễ chiết tách, tinh sạch, số locus cũng ít hơn so với các sinh vật khác. Các vi nấm và vi tảo có thể tồn tại ở dạng đơn bội (n) với thời gian dài trong chu trình sống nên các gen lặn có thể được biểu hiện ra ở kiểu hình. Ngoài ra các vi sinh vật kể trên còn có trạng thái lưỡng bội (2n) nên cũng dễ dàng thực hiện phân tích tái tổ hợp. Các tính trạng ở vi sinh vật đơn giản. Đối với các tính trạng sinh hóa hay tính đề kháng dễ sử dụng môi trường chọn lọc để phát hiện. 4. Dễ nghiên cứu bằng các kỹ thuật vật lý và hóa học Đa số các vi sinh vật có cấu tạo đơn bào nên quần thể của chúng có độ đồng nhất cao hơn so với các sinh vật có bộ máy đa bào bắt nguồn từ nhiều loại mô khác nhau. Cấu tạo tế bào vi sinh vật đơn giản, dễ chết tách tinh sạch DNA Có thể nuôi vi sinh vật đồng nhất tức đa số các tế bào ở những giai đoạn phát triển gần giống nhau. Ví dụ: nấm men nuôi trên môi trường có bổ sung acetat, tất cả các tế bào nấm men đều tạo bào tử. Tảo Chlorella khi nuôi trong tối 18-19 giờ, tất cả chúng đều thực hiện phân chia giảm nhiễm. II. Đặc điểm của di truyền vi sinh vật - Khuẩn lạc (dòng tế bào) là 1 cụm tế bào có nguồn gốc từ 1 tế bào ban đầu - Chủng: dòng tế bào mang 1 đặc điểm di truyền nào đó. Các đột biến ở vi sinh vật thường được phát hiện theo sự biến đổi các tính trạng sau: - Hình thái: kích thước, hình dạng tế bào hay khuẩn lạc, có màng nhân hay không 124 124
30. - Sinh hóa: sự hiện diện của các sắc tố, màu sắc đặc trưng - Nuôi cấy: kiểu hô hấp, kiểu dinh dưỡng, nhu cấu đòi các nhân tố tăng trưởng - Tính đề kháng: kháng thuốc, kháng phage, chịu nhiệt - Miễn nhiễm: phản ứng kháng nguyên, kháng thể Các đột biến có thể xuất hiện ngẫu nhiên hay do gây tạo nhờ các tác nhân gây đột biến. Mỗi gen có tần số đột biến đặc trưng. Đặc điểm của tái tổ hợp ở vi khuẩn: Các sinh vật Prokaryote như vi khuẩn, virus có quá trình sinh sản tương đương sinh sản hữu tính gọi là quá trình sinh sản cận hữu tính (parasexuality), quá trình này có các đặc điểm: - Sự truyền thông tin một chiều từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận. - Sự tạo thành hợp tử một phần (merozygote). Tế bào thể cho (donor) chuyển một đoạn của bộ gen sang tế bào thể nhận (recipient), nên chỉ lưỡng bội một phần, còn các phần khác đơn bội. - Bộ gen thường chỉ là DNA trần, nên chỉ có một nhóm liên kết gen và tái tổ hợp thực chất là lai phân tử. III. Sinh học của vi khuẩn 1. Cấu tạo tế bào và sinh sản: Tế bào E.coli có chiều dài khoảng 2 µm. Bên ngoài có vách tế bào, kề trong là màng sinh chất. Mezosome là cấu trúc xếp lại của màng sinh chất có thể liên quan đến phân bào chất di truyền tạo nên nucleotid. Các tiêm mao giúp cho sự vận động của tế bào. Thông tin của tế bào vi khuẩn nằm trên một phân tử DNA mạch kép vòng tròn đơn được gọi là genophore, hay "NST". Gần đây đã phát hiện thấy rằng ít nhất ở một số vi khuẩn DNA tạo thành phức hợp với protein có tính base để hình thành sợi nhiễm sắc như histon ở NST Eukaryote. Ngoài ra ở một số vi khuẩn còn có thêm plasmid là phân tử DNA vòng tròn nhỏ có khả năng sao chép độc lập. 125 125
31. Phân tử DNA gắn trực tiếp vào màng sinh chất. Sự sao chép DNA tạo ra 2 bản sao gắn chung nhau trên màng sinh chất. Khi tế bào kéo dài ra các bản sao DNA tách xa nhau do phần màng giữa chúng lớn dần ra. Kiểu sinh sản vô tính này được gọi là ngắt đôi (Binary fission). Tế bào vi khuẩn chia nhanh hơn rất nhiều so với tế bào Eukaryote. Quá trình sao chép DNA được bắt đầu từ điểm xuất phát Ori kéo dài về 2 phiasong song với quá trình kéo dài màng sinh chất, nơi có điểm gắn vào của DNA bộ gen, mọc dài tách 2 phân tử DNA về 2 tế bào con. Hình 7.1 tế bào vi khuẩn E. coli 126 126
32. Hình 7.2 Tế bào vi khuẩn phân chia theo trực phân. 2. Đặc điểm nuôi cấy Tế bào vi khuẩn có thể nuôi trên môi trường lỏng có bổ sung các muối vô cơ thiết yếu. Mật độ có thể đạt 109 tế bào/ml. Có thể nuôi vi khuẩn trong môi trường rắn có agar trong các hộp petri để từng tế bào mọc thành khuẩn lạc dễ quan sát. IV. Biến nạp ( Transformation) 1. Hiện tượng và điều kiện - Định nghĩa: biến nạp là hiện tượng truyền thông tin di truyền bằng DNA. 127 127
33. Hinh 7.3 Biên nap cua vi khuân Trong biến nạp DNA trần từ một tế bào vi khuẩn thể cho này được truyền sang tế bào vi khuẩn thể nhận khác. Khi tế bào vi khuẩn bị vỡ do làm tan, DNA vòng tròn của chúng thoát ra môi trường thành các đoạn thẳng với chiều dài khác nhau có khả năng gây biến nạp cho các tế bào thể nhận khác. Hiện tượng biến nạp được nghiên cứu nhiều ở các đối tượng: Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Haemophilus parainfluenzae - Điều kiện thực hiện biến nạp: Hiệu quả của biến nạp phụ thuộc vào 3 yếu tố: + Tính dung nạp của tế bào thể nhận. Những tế bào dung nạp trên bề mặt có các nhân tố dung nạp. Người ta có thể tạo khả năng dung nạp của tế bào thể nhận bằng một số xử lý. Ví dụ: Streptococcus pneumoniae: 30 - 80 điểm nhận Haemophilus influenzae: 4-8 điểm nhận + DNA thực hiện biến nạp của thể cho phải ở dạng mạch kép, nếu DNA bị biến tính ở dạng mạch đơn riêng lẻ không cho hiệu quả biến nạp. Thường DNA biến nạp là một đoạn nhỏ. Ở vi khuẩn E.coli đoạn DNA biến nạp khoảng 1/250 - 1/500 genom của vi khuẩn. Đoạn từ tế bào cho xâm nhập vào tế bào nhận được gọi là đoạn ngoại lai (exogenote), DNA nguyên vẹn của tế bào nhậ được gọi là đoạn nội tại (endogenote). Tế bào vi khuẩn nhận đoạn ngoại lai sẽ lưỡng bội ở một phần bộ gen được gọi là hợp tử từng phần (merozygote). Tuy nhiên, đoạn ngoại lai mạch đơn không bền vững và bị phân hủy nếu không được gắn vào bộ gen thể nhận. Quá trình trao đổi thông tin di truyền bằng chuyển chỉ một phần vật liệu di truyền từ tế bào này sang tế bào khác được gọi là sự giao nạp từng phần (meromixis). 2. Cơ chế biến nạp 2.1. Xâm nhập của DNA Ở giai đoạn này, DNA có thể gắn với điểm nhận của màng tế bào.Quá trình gắn này có thể là thuận nghịch, nó có thể gắn vào rồi nhả ra. 128 128
34. Sợi DNA mạch kép của dòng vi khuẩn S sau khi chui qua màng tế bào của dòng vi khuẩn R thì một mạch của S sẽ bị nuclease của tế bào cắt, còn lại một mạch nguyên. 129 129
35. Hinh 7.4 Cơ chê biên nap tư nhiên 2.2. Bắt cặp DNA của thể nhận R sẽ biến tính tách rời 2 mạch ở một đoạn để bắt cặp với đoạn DNA thể cho S vừa chui vào. Đoạn DNA của R ở đoạn có DNA của S bắt cặp sẽ bị cắt đứt và đẩy ra. Trong quá trình bắt cặp, có những đoạn không tương đồng thì sẽ hình thành nên những vòng lồi, những đoạn đó gọi là Heteroduplex. Còn các đoạn bắt cặp tương đồng gọi là Homoduplex. 2.3. Sao chép Sau khi bắt cặp sẽ tạo phân tử DNA có đoạn lai R-S, tiến hành sao chép để tạo ra hai sợi kép: một sợi kép R-R và một sợi kép khác có mang đoạn DNA thể nhận S-S. 130 130
36. Hình 7.5 Sơ đồ các giai đoạn biến nạp V. Tải nạp (Transduction) 1. Phage là nhân tố chuyển gen Thí nghiệm được tiến hành trong ống hình chữ U. Giữa hai ống của hình chữ U được ngăn cách bằng màng lọc vi khuẩn, màng có lỗ nhỏ vi khuẩn không qua được nhưng phage qua được. Nhánh A của ống chứa vi khuẩn có khả năng tổng hợp tryptophan (trp+), còn nhánh B nuôi các vi khuẩn khác mất khả năng tổng hợp tryptophan (trp-). Sau khi nuôi một thời gian, ở nhánh B xuất hiện vi khuẩn có khả năng tổng hợp tryptophan. Nếu dùng màng ngăn không cho virus lọt qua thì không thấy hiện tượng này. Qua nhiều lần thí nghiệm, việc tải gen trp+ từ nhánh A sang nhánh B được chứng minh. 131 131
37. Hình 7.6 Thí nghiệm chứng minh hiện tượng tải nạp 2. cơ chế Quá trình xâm nhiễm của phage vào vi khuẩn xảy ra như sau: Tải nạp chuyển gen từ vi khuẩn A sang B nhờ phage Đầu tiên các phage bám trên bề mặt vi khuẩn. Sau 4’, phage bơm DNA của nó vào tế bào. Sau đó chúng sinh sản và khoảng 1/2 giờ sau thì chúng làm tan các tế bào vi khuẩn và giải phóng các phage mới. Khi DNA của phage xâm nhập vào tế bào vi khuẩn A, chúng cắt DNA của vi khuẩn A thành nhiều đoạn đồng thời DNA của phage được sao chép ra nhiều phân tử con và các vỏ phage cũng được tạo thành. Sau đó các vỏ lắp ruột DNA vào, phá vỡ tế bào vi khuẩn ra ngoài và tiếp tục xâm nhiễm vào các tế bào vi khuẩn khác. Trong quá trình lắp ráp khoảng 1-2% phage vô tình mang đoạn DNA của vi khuẩn có chứa gen. Phage mang gen vi khuẩn A xâm nhiễm vi khuẩn B, quá trình tái tổ hợp xảy ra làm gen vi khuẩn A gắn vào bộ gen vi khuẩn B. 132 132
38. Hinh 7.7 Chuyên gen tư vi khuân cho sang vi khuân nhân nhơ phage 3. Phân biệt các dạng tải nạp - Tải nạp chung (general transduction): phage mang bất kỳ gen nào của vi khuẩn A sang vi khuẩn B. Tải nạp chung có đặc điểm: + Bất kỳ gen nào của vi khuẩn cũng đều được tải nạp + Tải nạp do gói nhầm DNA của tế bào chủ khi phage trưởng thành + Các thể tái hợp đơn bội được tạo ra - Tải nạp chuyên biệt (Special transduction) hay tải nạp hạn chế: là quá trình tải nạp chỉ chuyển một vài gen nhất định, nó có 4 đặc điểm: + Những gen được chuyển nằm sát chỗ phage gắn vào + Chỉ prophage kiểu λ thực hiện + Do kết quả sự cắt sai của prophage khi tách khỏi NST của tế bào chủ Ví dụ: phage λ (kí sinh trên E.coli) chỉ chuyển gen gal (đồng hóa đường galactose) từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác. Điểm gắn của phage λ vào bộ gen của vi khuẩn nằm giữa 2 gen gal (galactose) và bio (tổng hợp biotin). Đầu của phage chỉ có thể chứa một lượng DNA giới hạn, nên khi prophage tách ra từ DNA của vi khuẩn nó chỉ tải nạp được gen gal hoặc bio. Sự cắt sai của phage λ rất hiếm nên tải nạp hạn chế có tần số thấp. 133 133
39. Hình 7.8 Tải nạp chuyên biệt VI. Giao nạp (Conjugation) - Định nghĩa: giao nạp là hiện tượng truyền vật chất di truyền từ tế bào thể cho sang thể nhận qua cầu tế bào chất 134 134
40. Hình 7.9 Sơ đô lai vi khuân 1. Chứng minh có lai ở vi khuẩn Vào năm 1946, J. Lederberg và E. Tatum sử dụng các dòng đột biến khuyết dưỡng khác nhau: -Dòng A: có kiểu gen met-bio-thr+leu+thi+ (có khả năng tổng hợp threonin, leucine, thiamin không có khả năng tổng hợp methionin và biotin) - Dòng B: có kiểu gen met+bio+thr-leu-thi- (có khả năng tổng hợp methionin, biotion nhưng không có khả năng tổng hợp threonin, leucine, thiamin) Từng dòng riêng rẻ khi cấy lên môi trường tối thiểu thì không có khả năng mọc lên khuẩn lạc. Trộn chung hai dòng này trong ống nghiệm, cấy lên môi trường tối thiểu. Các khuẩn lạc mọc trên môi trường tối thiểu, chứng tỏ có các dạng lai, chúng mọc được nhờ sự bù đắp cho nhau nhu cầu dinh dưỡng. Các dạng lai có kiểu gen met+bio+thr+leu+thi+. 2. Sự phân hóa giới tính ở vi khuẩn 1953, Hayes đã phát hiện ra ở vi khuẩn có các dạng khác nhau tương tự giống đực và cái ở sinh vật bậc cao. Các dạng đó được kí hiệu là tế bào F+ 135 135
41. và tế bào F- . F+ tương tự giống đực ở sinh vật bặc cao, nó truyền sạng F-. Tần số lai F+ với F- khoảng 10-6. Khi F+ tiếp xúc với F- một thời gian, F- biến thành F+ do nó nhận được một phần tử di truyền là episome. Episome F+ là phần tử di truyền ngoài NST, có thể tồn tại hoặc ở dạng DNA vòng tròn tự sao chép hoặc gắn vào phân tử DNA của tế bào chủ. Episome F+ được gọi là nhân tố giới tính. Về sau dạng Hfr (high frequency ò recombination) được phát hiện, dạng này có tần số lai với F- cao hơn F+ có thể đến 104 lần. Hình 7.10 Sơ đô câu tao cua plasmid Plasmid được định nghĩa là phân tử DNA vòng tròn nhỏ có khả năng sao chép độc lập với tế bào chủ và không có khả năng gắn vào NST tế bào chủ. Plasmid có thể mang một số gen khác nhau. Hiện nay plasmid được dùng cho cả 2 nghĩa là episome và plasmid. Plasmid có thể tồn tại độc lập hoặc gắn vào bộ gen vi khuẩn. Bản chất di truyền của các dòng F-, F+ và Hfr được xác định do các plasmid như sau: F- không chứa plasmid F+ chứa plasmid ở dạng độc lập Hfr có plasmid gắn vào bộ gen 136 136
42. Hinh 7.11. Sư găn cua plasmid vao nhiêm săc thê vi khuân tao vi khuân Hfr - Tai tô hơp giưa môt trinh tư IS trên plasmid va trinh tư IS cung loai trên nhiêm săc thê cua vi khuẩn tao ra nhiêm săc thê Hfr - Tai tô hơp xay ra giưa IS bât ky trên plasmid với IS bât ky tương ưng trên nhiêm săc thê cua vi khuẩn tao ra nhiều chung Hfr khac nhau 3. Các nhân tố F' và tính nạp (Sexduction) 137 137
43. Sự cắt rời nhân tố F từ NST của dòng Hfr nhiều khi không chính xác và lúc này một đoạn bộ gen của vi khuẩn thay thế cho một phần của F. Trong trường hợp này nhân tố F' được hình thành và nó có thể chuyển gen của vi khuẩn một cách độc lập với các tính trạng của tế bào thể cho. Hiện tượng này còn gọi là tính nạp, nghĩa là sự chuyển gen kèm theo nhân tố giới tính. Nhờ tính nạp mà có thể nhận được những thể lưỡng bội từng phần (merodiploid) theo các gen được gắn vào F+. 4. Cơ chế tái tổ hợp Khi có sự tiếp xúc giữa hai loại tế bào khác dấu như Hrf và F- hoặc F+ và F-. Dòng tế bào mang nhân tố F+ được coi là tế bào đực có khả năng tạo protein pilin, từ protein này tạo ống giao nạp gọi là pilus. Sự co lại của pilus nối 2 tế bào làm chúng gần nhau. Tế bào F- được coi là tế bào cái, sau khi giao nạp tế bào F- trở thành tế bào F+. Việc chuyển gen chỉ thực hiện khi plasmid gắn vào bộ gen của vi khuẩn. Trong quá trình chuyển vật chất di truyền sang F- thì DNA của tế bào chủ sao chép và mạch mới có Ori đi đầu và F đi cuối. Quá trình chuyển DNA từ F+ sang F- có thể bị ngắt quãng. Các gen a, b, c được chuyển một chiều từ Hfr sang F-. Dòng Hfr có tần số lai cao hơn nhiều vì plasmid đã nằm sẵn trong bộ gen. Còn F+ phải qua giai đoạn plasmid gắn vào bộ gen rồi mới chuyển gen. 138 138
44. Hinh 7.12 Thi nghiêm giao nap đê lâp ban đô do ngăt quang ơ cac khoang thơi gian khac nhau. Sự truyền DNA từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhân Trong điều kiện thí nghiệm ở 370C, nguyên bộ gen của tế bào E.coli được chuyển sang tế bào nhận trong vòng 90 phút. Thường sự giao nạp bị ngắt quãng giữa chừng do cầu pilus bị gãy, lúc đó tế bào F- vẫn là tế bào F-. Bằng cách ngắt quãng quá trình giao nạp mà bản đồ di truyền của E.coli được xây dựng nên có dạng vòng tròn. VII. Cơ sở di truyền tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh ở người. Ý nghĩa của các transposon vi khuẩn 139 139
45. Các transposon ở vi khuẩn là những yếu tố làm thay đổi vị trí gen, kiểm soát tính kháng thuốc đối với thuốc kháng sinh và các thuốc chống vi khuẩn khác. Chúng có thể dễ dàng truyền từ tế bào này sang tế bào khác. Ngay sau đó, người ta đã xác định là các gen kháng thuốc thường có trong plasmid. Các plasmid có thể được truyền từ tế bào mẹ sang tế bào con khi tế bào vừa phân chia. Trong điều kiện thực nghiệm cho thấy 100% quần thể tế bào nhạy cảm thuốc đều có thể trở thành kháng thuốc sau thời gian 1 giờ được trộn với vi khuẩn kháng thuốc. Các gen kháng thuốc có thể được truyền từ plasmid cho NST vi khuẩn, cho virus và cả cho vi khuẩn các loài khác. Mọi plasmid R đều có tối thiểu 2 thành phần: - Một đoạn mang gen về truyền AD tiếp hợp (tương tự như transposon của plasmid F) - Một đoạn mang gen kháng thuốc Đoạn thứ nhất gọi là yếu tố làm vật truyền tính kháng (RTF - Resistance transfer vector). Đoạn thứ hai mang gen kháng được gọi là yếu tố kháng R (R - determinant). Ở một số plasmid R, yếu tố kháng R được cài giữa các đoạn xen IS. Trong nhiều trường hợp chúng làm cho yếu tố kháng vận động từ plasmid R này sang plasmid R khác. Các đoạn IS thúc đẩy sự tiến hóa nhanh của các plasmid vi khuẩn ngày càng mang nhiều yếu tố kháng thuốc. Không phải những plasmid này chỉ được truyền đi trong phạm vi một loài vi khuẩn. Mà chúng còn được truyền qua các loài và cả các dòng di truyền khác nhau của vi khuẩn. Ví dụ: plasmid R của E.coli đã được phát hiện ở một số giống như proteus, Samonella, Haemophilus, Pastugella Tất cả các loài này đều là loài gây bệnh. Ngày nay người ta thấy tần số tăng lên rõ rệt của các vi khuẩn mang plasmid R với yếu tố kháng R có sức kháng ghê gớm với các thuốc kháng sinh: penicylin, tetracylin, streptomycin và kanamycin. Các nghiên cứu ở Nhật Bản cho biết trong vòng 10 năm trở lại đây, quần thể vi khuẩn tự nhiên (trong cống, rãnh, hồ, ao bị ô nhiễm) tăng hẳn lên, từ tần số thấp là dưới 1% plasmid R có sự kháng thuốc lên đến tần số cao là 50-80%. 140 140
46. Các kết quả nêu trên cho thấy, cần hạn chế và lưu ý chỉ sử dụng kháng sinh khi có nhiễm trùng và không nên lạm dụng đối với các trường hợp nhẹ. Nếu không hạn chế thì trong tươpng lai thuốc sẽ giảm hiệu quả hoặc không còn hiệu quả. Tính kháng thuốc ngày nay đã được phát hiện trong nhiều loại gen gây bệnh như gen thương hàn, viêm dạ dày, ruột, dịch hạch, sốt cao, viêm màng não, lậu Câu hỏi ôn tập 1. Phân biệt các nòi vi khuẩn F+, F- và Hfr ở E. coli 2. Trình bày cơ chế biến nạp 3. Phân biệt tải nạp chung và tải nạp đặc hiệu. 4. So sánh biến nạp và tải nạp. 5. Thể tái tổ hợp các gen khác nhau theo thời gian xảy ra trong giao nạp như thế nào? 6. Đặc điểm của tái tổ hợp ở vi khuẩn. 7. Tế bào F- hình thành tế bào F+ và tế bào Hfr như thế nào? Tài liệu Tham khảo Phạm Thành Hổ. 2000. Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo dục. Hoàng Trọng Phán. 1995. Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Cann AJ. 2001. Priciple of molecular virolory. Academic Press. London, UK. Flint SJ, Enquist LW, Krug RM, Racaniello VR, Skalka AM. 2000. Principles of Virology. Molecular Biology, Pathogenesis, and Control. ASM Press, Washington DC. Printed in the United States of America. 141 141
47. Harlt D.L., Jones E.W. 1998. Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers, Toronto, Canada. Hartwell et al. 2003. Genetics: From genes to genomes, Second editor. The McGraw-Hill Companies. Old RW & Primrose SB. 1989. Principles of gene manipulation. Blackwell Scientific Publication. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Companies, Inc., United States of America. Watson D.J, Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R. 2004. Molecular biology of the gene. Benjamine Cummings, San Francisco, United States of America. 142 142
48. Chương 8 Di truyền học Virus Mục tiêu của chương Giới thiệu sự di truyền của thực khuẩn thể, nghiên cứu sự sắp xếp các gen, các đặc tính của virus và, trên cơ sở bản chất của genome của virus đã xác định kiểu sao chép. Số tiết: 3 Nội dung I. Di truyền học thể thực khuẩn (Bacteriophage hay phage) 1. Sự hình thành vết tan và các thể đột biến phage Phage được phát hiện dễ dàng vì trong chu trình tan, một tế bào bị nhiễm phage vỡ ra và giải phóng các hạt phage vào môi trường (Hình 8.1). Sự tạo thành các đốm đã được quan sát. Một số lớn tế bào vi khuẩn (khoảng 108 tế bào) được trãi lên trên môi trường đặc. Sau một thời gian sinh trưởng, tạo một lớp tế bào vi khuẩn màu trắng đục. Nếu phage có mặt ở thời điểm vi khuẩn được trãi lên môi trường, nó sẽ nhiễm vào tế bào vi khuẩn. Sau đó tế bào nhiễm phage bị làm tan và giải phóng nhiều phage mới. Thế hệ sau này của phage lại nhiễm vào vi khuẩn gần đó, và tham gia vào chu trình tan khác, các vi khuẩn này bị vỡ giải phóng ra nhiều phage, chúng có thể nhiễm vào các vi khuẩn khác ở vùng lân cận. Chu trình xâm nhiễm của phage được tiếp tục và sau nhiều giờ, phage phá huỷ tất cả các tế bào vi khuẩn của một vùng, tạo đốm (plage) trong suốt khác với lớp tế bào vi khuẩn màu trắng đục. 142
49. Tế bào không bị xâm nhiễm Phân hủy tế Phage hấp phụ bào chủ lên tế bào chủ Phage tự do Phage lắp Chu trình ghép bên sinh tan trong tế bào chủ Nucleic acid của phage Phage Vật chất di protein Nucleic acid truền tế của phage bào chủ bị xâm nhập phá hủy vào tế bào Protein của phage được tổng hợp, acid nucleic được nhân lên, vật chất di truyền tế bào chủ bị phá hủy Hình 8.1. Chu trình sinh tan của bacteriophage Hình 8.2. Sự xâm nhập của phage vào tế bào vật chủ theo cả 2 dạng bố mẹ đồng thời. r+: đốm nhỏ, r-: đốm lớn, h+: đốm mờ, h-: đốm trong 143
50. Phage chỉ có thể được nhân lên chỉ khi sinh trưởng trong tế bào vi khuẩn, vì vậy làm cạn nguồn dinh dưỡng trong môi trường sinh trưởng, làm hạn chế sự nhân lên của phage và kích thước của đốm. Vì mỗi đốm là kết quả của sự nhiễm một hạt phage ban đầu, có thể đếm được số lượng các đốm riêng biệt có trên môi trường (Hình 8.2). Kiểu gene của các thể đột biến phage có thể được xác định nhờ nghiên cứu các đốm. Trong một số trường hợp, sự xuất hiện của các đốm là đầy đủ. Chẳng hạn, đột biến phage làm giảm số lượng phage thế hệ sau từ những tế bào bị nhiễm thường tạo đốm nhỏ hơn. Các đốm lớn có thể được tạo ra bởi các đột biến gây ra sự tan sớm các tế bào bị nhiễm, nên mỗi đốm đó tiếp tục nhiễm nhanh hơn. Kiểu đột biến khác của phage có thể được xác định bởi phage có khả năng hoặc không có khả năng tạo đốm trên những chủng vi khuẩn đặc biệt. 2. Tái tổ hợp di truyền trong một chu kỳ sinh tan (Lytic cycle) 2.1. Chu trình tan (Lytic cycle) Hinh 8.3 Sư kêt hơp đâu va đuôi đê tao phage hoan chinh 144
51. Các bacteriophage làm chết tế bào chủ gọi là độc, chúng sinh sản theo chu trình tan. Chu trình bắt đầu khi sợi đuôi của phage gắn vào điểm nhận bề bề ngoài của E.coli. Ống đuôi co lại tạo lỗ thủng xuyên vách tế bào và bơm DNA của nó vào. Capside của phage còn lại bên ngoài tế bào. Sau khi bị nhiễm ở các tế bào E.coli có quá trình phiên mã và dịch mã các gen của virus. Phage T4 có khoảng 100 gen và phần lớn đã được biết rõ. Một trong những enzyme được tạo ra đầu tiên cắt DNA của tế bào chủ. DNA của phage được phiên mã đầu tiên nhờ DNA polymerase của tế bào chủ tạo ra mARN sớm. Các mARN muộn hơn có thể được tổng hợp bởi ARN polymerase của phage hoặc ARN polymerase của vi khuẩn bị biến đổi để phiên mã các gen của phage. Các mARN muộn được dịch mã tạo các loại protein enzyme điều hòa và cấu trúc. Các protein điều hòa của phage kiểm soát sự phiên mã nối tiếp của các gen. Khi DNA của tế bào chủ bị phân hủy, bộ gen của phage kiểm soát toàn bộ hoạt động của tế bào để tạo ra các cấu phần của nó. DNA của phage được sao chép ra hàng trăm bản sao. Các protein của capsid được tổng hợp thành 3 phần riêng: đầu, ống đuôi và các sợi đuôi. Chúng tự ráp với nhau thành các virion con. Phage hoàn tất chu trình khi enzyme lysozyme được tạo ra để tiêu hóa vách tế bào vi khuẩn. Tế bào vi khuẩn bị vỡ, 100-200 virion thoát ra và chúng có thể lặp lại chu trình mới. Toàn bộ chu trình từ lúc phage tiếp xúc đến tan diễn ra trong khoảng 0 20-30 phút ở 37 C. Trong thời gian đó số lượng phage T4 tăng hơn cả 100 lần, trong khi đó số lượng tế bào E.coli mọc nhanh nhất cũng chỉ tăng gấp đôi. Phần lớn các phage độc theo chu trình vừa nêu trên. Tuy nhiên có một số ngoại lệ như phage sợi M13 của E.coli hầu như không bao giờ làm chết hoặc làm tan tế bào. Các tế bào vi khuẩn và các phage kí sinh có sự đồng tiến hóa. Các tế bào vi khuẩn có các cơ chế bảo vệ như biến đổi màng tế bào để phage không bám vào được hoặc các enzyme cắt hạn chế cắt DNA của phage. Phage cũng biến đổi để xâm nhập được vào tế bào vi khuẩn. Các phage tuy có kích thước nhỏ bé phải nhìn dưới kính hiển vi điện tử mới thấy được. Nhưng các tính trạng của phage được quan sát dựa theo các vết tan hoặc biên độ chủ. Cho hai dòng phage T4 có kiểu gene khác nhau nhiễm vào một tế bào vi khuẩn E.coli, một vài phage thế hệ sau sẽ thực hiện 145
52. tái tổ hợp di truyền. Allele r- tan nhanh, kết quả tạo ra đốm lớn, allele h- nhiễm vào các tế bào chủ, kết quả tạo đốm trong. Phép lai như sau: r-h+ × r+h- Kết quả thu được bốn kiểu đốm. Hai kiểu đốm đục, lớn và đốm trong, nhỏ tương ứng với kiểu hình của phage bố mẹ. Hai kiểu hình khác, đốm trong lớn, đốm mờ nhỏ là dạng tái tổ hợp tương ứng kiểu gene r-h- và r+h+. Khi nhiều vi khuẩn bị nhiễm số dạng tái tổ hợp thuận nghịch thường được tìm thấy trong số các phage ở thế hệ sau. Trong thí nghiệm, mỗi kiểu gene trong số bốn kiểu gene trên sinh ra kiểu hình khác nhau về dạng đốm (Hình 8.2). Số lượng kiểu gene có thể xác định được bằng kiểm tra các đốm tạo thành. Tần số tái tổ hợp, được biểu diễn dưới dạng phần trăm, được xác định như sau: S ä úphage taïi täø håüp Tần số tái tổ hợp = × 100 Täøn sgä úphage 3. Sự sắp xếp của các gene trong nhiễm sắc thể phage Tần số tái tổ hợp có thể được sử dụng để xác định khoảng cách của bản đồ ở Eukaryote. Các thí nghiệm lập bản đồ cho thấy đột biến ở T4 được lập bản đồ thành 3 cụm riêng biệt. Cả ba cụm này có liên kết với một cụm khác. George Streisinger và cộng sự (1964) đã chứng minh bản đồ di truyền của phage T4 có dạng vòng tròn. Trong mỗi phép lai, lập ba đến bốn marker di truyền lần lượt với mỗi nhóm và tiến hành qua toàn bộ genome của T4. Nhiều gene khác đã được xác định và lập bản đồ đầy đủ trên phân tử vòng tròn (Hình 8.3). Những vùng ở vòng tròn bên trong là 3 cụm của marker T4 đã được xác định và lập bản đồ di truyền. Vòng ngoài có mặt của nhiều bộ marker lớn tạo thành toàn bộ vòng tròn của bản đồ di truyền. Bản đồ di truyền phage T4 cho thấy gene của phage T4 tạo cụm mở rộng theo chức năng của chúng. Chẳng hạn có cụm lớn các gene dùng cho sao chép DNA ở vị trí phần tư bên trên phía phải và có cụm gene tổng hợp các cấu phần tạo nên đầu của phage ở phía dưới của vòng tròn. Phân tử DNA của phage T4 là phân tử sợi đơn dạng thẳng, mỗi đầu tận cùng của DNA phage T4 được nhân lên hoặc lặp đoạn ở đầu cuối (terminal redundant). Do vậy, mỗi phân tử DNA có kích thước tăng thêm 2%. Khi DNA được sao chép trong tế bào, sự tái tổ hợp giữa các phần ở đầu 146
53. tận cùng của bộ gen T4 với những trình tự tương đồng của bộ gen T4 khác, kết quả tạo ra sản phẩm DNA có kích thước lớn hơn khả năng chứa của phần đầu. Những phân tử chứa lặp đoạn được tạo thành vì sự tái tổ hợp trong bộ gen của phage T4 xảy ra thường xuyên, trung bình có khoảng 20% sự kiện tái tổ hợp xảy ra trên một nhiễm sắc thể. Khi phân tử DNA được gói vào phần đầu, nó được cắt bằng enzyme chỉ còn chứa khoảng 102% của chiều dài bộ gen phage T4, vì có chứa đoạn lặp lại của phần đầu. Màng Sợi đuôi Trao đổi Tổng hợp nucleotide DNA, tái bản và thay đổi Nhóm gen liên kết xác định nguồn gốc Đĩa gốc của đuôi Đầu, cổ, nếp gấp cổ Đĩa gốc của đuôi Đầu Hình 8.4. Bản đồ di truyền của T4 với các marker 4. Lập bản đồ cấu trúc tinh vi vùng rII của phage T4 Các nghiên cứu chi tiết về các đột biến rII của phage T4 làm sáng tỏ hơn về cấu trúc gene. Phage T4 ở dạng hoang dại r+ có khả năng nhiễm đồng thời hai nòi E.coli B và K. Các đột biến rII chỉ nhiễm nòi B nhưng không nhiễm nòi K. Seymour Benzer (1955) đã nhận được 2400 đột biến rII có nguồn gốc độc lập với nhau. Ông đã cho lai các đột biến với nhau và căn cứ vào sự xuất hiện các dạng tái tổ hợp hoang dại r+ mà lập bản đồ các điểm đột biến. Mỗi đột biến có thể tái tổ hợp với các đột biến khác. Đột biến mất đoạn ngăn cản sự tái tổ hợp với hai hoặc nhiều đột biến điểm ở các vị trí khác nhau của gene. Mỗi mất đoạn làm mất một phần bộ gene của phage 147
54. bao gồm cả vùng rII. Sử dụng đột biến mất đoạn là phương pháp đơn giản để lập bản đồ của hàng ngàn đột biến. Bản đồ mất đoạn (Deletion mapping) dựa trên sự có hoặc không có dạng tái tổ hợp. Trong bất kỳ phép lai nào giữa một đột biến điểm chưa biết và một đột biến mất đoạn, sự xuất hiện của dạng hoang dại cho thấy đột biến điểm nằm ngoài vùng mất đoạn. Ngược lại, nếu đột biến điểm xuất hiện trong vùng mất đoạn, không xuất hiện dạng tái tổ hợp kiểu hoang dại ở thế hệ sau. rII A cistron rII B cistron Khoảng cách từ A1 đến B được xác định bằng mất đoạn các khoảng 1272 qua 638 Khoảng cách từ 1 đến 47 được xác định bằng mất đoạn khoảng 1364 qua 1519 Hình 8.5 Đột biến mất đoạn được sử dụng để chia locus rII của bacteriophage T4 thành 7 vùng và 47 tiểu vùng nhỏ Nhiều phép lai đã được thực hiện để lập bản đồ đột biến chi tiết gene rII. Khoảng cách từ A1 đến A6 và B được trình bày ở hình 8.4. Một đột biến đặc biệt đã được kiểm tra định vị ở vùng A4. Đột biến này không tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại trong phép lai với các đột biến mất đoạn lớn như r1272, r1241, rJ3 và rPT1 nhưng nó có thể tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại trong phép lai với rPB242, rA105 và r638. Các đột biến được tạo ra bởi cùng một khuôn, kết quả lai với các đột biến mất đoạn lớn sẽ được xếp vào vùng A4. Bản đồ di truyền trong vùng A4 có thể được tạo ra bởi một bộ các đột biến 148
55. mất đoạn được trình bày ở phần dưới của hình 8.5. Xác định 7 tiểu vùng ở trong A4 (từ a qua g). rII A cistron rII B cistron Vùng xác định đột biến mất đoạn từ A1 đến A6 và B trong gen rII Đột biến ở trong vùng b sẽ tạo ra dạng tái tổ Mất đoạn vùng xác hợp hoang dại với tất cả các mất đoạn mà định a đến g của trong đó vùng b của dạng hoang dại có mặt vùng A4 Hình 8.6 Xác định vùng rII liên quan với các marker di truyền dạng thẳng của bản đồ di truyền phage T4 Ví dụ, một đột biến trong vùng A4 kết quả tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại với đột biến mất đoạn r1368, nhưng lại không thể thực hiện được với đột biến r221 sẽ được sắp vào tiểu vùng c. Ở mức độ chi tiết hơn, các đột biến trong một tiểu vùng được sắp xếp nhờ lai giữa chúng với nhau. Ở phage T4, các điểm đột biến ở rất gần nhau, được tách nhau nhờ tái tổ hợp. 1% tái tổ hợp tương ứng với khoảng cách khoảng 100 bp. Vì vậy, bất kỳ hai đột biến không thể tái tổ hợp được với nhau có thể được xếp vào cùng vị trí trong gene. Bản đồ di truyền cho số lớn các đột biến rII có nguồn gốc độc lập được mô tả ở hình 8.6. Nghiên cứu đột biến ở vùng rII và lập bản đồ di truyền có vai trò quan trọng, qua đó có thể rút ra các kết luận sau: + Sự trao đổi di truyền có thể xảy ra trong gene và có thể giữa các nucleotide ở gần nhau. 149
56. + Các đột biến không được tạo ra ở cùng tần số với tất cả các điểm trong gene, chúng phân bố không đều nhau. Chẳng hạn, 2400 đột biến rII đã được xác định chỉ ở 304 điểm. Một trong những điểm này có thể có đến 474 đột biến (Hình 8.6). Nhũng điểm có tần số đột biến cao như thế được gọi là các điểm nóng (hotspot mutation). Ở những điểm khác, đột biến được phục hồi một lần hoặc vài lần. Mỗi hộp thể hiện sự xuất hiện ngẫu nhiên của các đột biến tại vị trí đó "Điểm nóng" đột biến Nhiều đột biến xuất hiện ở một điểm tạo thành một "điểm nóng" Hình 8.6 Bản đồ di truyền locus rII của phage T4 Kết quả phân tích vùng rII rất quan trọng, giúp cho chúng ta phân biết được 3 khái niệm về gene. Phổ biến nhất, gene liên quan với một đơn vị chức năng. Điều này tương ứng với một đoạn DNA mã hóa cho một phân tử protein. Benzer đưa ra thuật ngữ cistron để chỉ chức năng này, thuật ngữ cistron thỉnh thoảng vẫn được sử dụng. Đơn vị chức năng được xác định qua thử nghiệm bổ sung (complementation test), xác định được 2 đột biến có allele với nhau không. Trước thí nghiệm của ông rII được coi là một locus. Thí nghiệm cho thấy các đột biến xếp thành hai nhóm rIIA và rIIB. Lai các đột biến rIIA × 150
57. rIIB sẽ có r+, nhưng lai rIIA × rIIA và rIIB × rIIB thì thu được kiểu hình đột biến r. Ngoài nghĩa là đơn vị chức năng, gene còn là đơn vị tái tổ hợp (recon) và đơn vị đột biến (muton). Cả hai đơn vị này, đều tương ứng với những nucleotide riêng lẽ trong gene. 5. Tính tiềm tan (Lysogeny) và phage λ Chu trình tiềm tan bắt đầu khi phân tử DNA của phage λ gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn và tiến hành sao chép như một phần nhiễm sắc thể vi khuẩn. Các hạt phage không được tạo thành. Phân tử DNA của phage được gắn vào bộ gen của vi khuẩn được gọi là prophage, tế bào vi khuẩn sống sót được gọi là tế bào tiềm tan (lysogen). Một chủng tiềm tan cho phage λ được ký hiệu theo tên của phage. Ví dụ chủng E. coli K12(λ) là chủng K12 trở thành tế bào tiềm tan của phage λ. Phage Phage tấn công tế Một số prophage tồn tại trên NST bào chủ và bơm vi khuẩn, khởi đầu cho chu trình sinh tan Phage DNA DNA vào Nhiều tế bào phân chia tạo ra khuẩn lạc vi NST vi khuẩn khuẩn có chứa prophage Chu trình Chu trình Tế bào bị sinh tan Tái tạo vòng tiềm tan phân giải, DNA phage Tế bào vi khuẩn giải phóng phân chia bình phage Prophage thường, sao chép prophage và truyền cho thế hệ sau DNA và protein của phage được DNA của phage tích hợp vào tổng hợp và lắp ghép tạo thành NST vi khuẩn tạo thành dạng phage mới prophage Hình 8.7 Chu trình tan và tiềm tan ở phage λ Phân tử DNA của phage λ có đầu các đầu cuối chứa 12 nucleotide không kết cặp, mà ở dạng sợi đơn tạo đầu dính (cohesive end) bổ sung. Khi vào tế bào, đầu cuối bổ sung gắn lại tạo phân tử vòng tròn. Sự tạo vòng tròn xảy ra sớm ở cả chu trình tan và chu trình tiềm tan (Hình 8.7). Có khoảng 75% tế bào vi khuẩn bị nhiễm phage, phân tử DNA vòng tròn sao chép và 151
58. chu trình tan xảy ra tiếp theo. Còn khoảng 25% tế bào bị nhiễm, phân tử DNA vòng tròn của phage λ và phân tử DNA vòng tròn của E. coli tương tác và xảy ra tái tổ hợp điểm chuyên biệt (site-specific recombination) và DNA của phage gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Vị trí của tái tổ hợp điểm chuyên biệt ở DNA của vi khuẩn và phage được gọi là điểm gắn vào của vi khuẩn và phage (bacterial and phage attachment sites). Mỗi điểm gắn có chứa 3 đoạn: ở đoạn trung tâm có cùng trình tự nucleotide ở cả 2 vị trí gắn và là vùng mà sự tái tổ hợp thực sự xảy ra. Điểm gắn vào của phage được ký hiệu bởi POP’ (P: phage) và điểm gắn vào ở vi khuẩn được biểu diễn bằng BOB’ (B: bacteria). So sánh bản đồ di truyền của phage và prophage POP’ nằm gần vùng trung tâm của phân tử DNA dạng thẳng. Một protein của phage, integrase, xúc tác cho tái tổ hợp điểm chuyên biệt. Enzyme integrase nhận ra điểm gắn vào của phage và vi khuẩn, gây ra sự trao đổi vật lý, kết quả là phân tử DNA của phage gắn vào phân tử DNA của vi khuẩn. Kết quả của sự tái tổ hợp làm bản đồ di truyền của prophage khác với bản đồ di truyền của phage. Bản đồ di truyền prophage là sự chuyển đổi vòng tròn bản đồ di truyền phage tự do. Prophage được chèn vào nhiễm sắc thể của E. coli giữa gene gal và gene bio. Sự chèn vào của phage λ làm tăng khoảng cách giữa gene gal và gene bio. Khoảng cách giữa gene gal và gene bio ở tế bào tiềm tan với phage λ là khoảng hai phút so với một phút ở tế bào không tiềm tan. Hình 8.8 Mô hình gắn của phage λ vào NST của E.coli 152
59. Khi tế bào tiềm tan, các gene của phage trở thành một phần nhiễm sắc thể của vi khuẩn vì vậy có thể làm kiểu hình của vi khuẩn bị thay đổi. Nhưng hầu hết các gene của phage ở prophage đều được giữ ở trạng thái bất hoạt nhờ protein repressor - sản phẩm của gene ở phage. Protein repressor được bắt đầu tổng hợp nhờ sự nhiễm vào của phage và nó được tiếp tục tổng hợp nhờ prophage. Gene mã hóa cho repressor thường chỉ là gene của prophage được biểu hiện ở chu trình tiềm tan. Nếu tế bào tiềm tan bị nhiễm bởi phage giống với prophage, sự có mặt của repressor trong prophage ngăn cản sự biểu hiện các gene của phage nhiễm vào. Tính kháng với những phage giống với prophage được gọi là tính miễn nhiễm (immunity). Đây là tiêu chuẩn để xác định tế bào vi khuẩn chứa phage đặc biệt. Chẳng hạn phage λ không tạo đốm trên vi khuẩn chứa prophage λ. Trong tế bào tiềm tan, sự sao chép không giải phóng các phage mới. Tuy nhiên, các prophage đôi khi trở nên có hoạt tính, trải qua chu trình tan, tạo ra số lượng lớn phage ở thế hệ sau. Hiện tượng này được gọi là sự cảm ứng prophage (prophage induction), nó được bắt đầu bằng sự hư hại DNA của vi khuẩn. Đôi khi prophage có thể tách ra khỏi DNA của vi khuẩn một cách ngẫu nhiên nhưng thường nó được gây ra do các tác nhân của môi trường như hóa chất hoặc chiếu xạ. Khả năng bị cảm ứng là một thuận lợi cho phage bởi vì DNA của phage có thể thoát khỏi tế bào bị hư hại. Cơ chế sinh hóa của sự cảm ứng là phức tạp nhưng sự thoát ra của phage xảy ra dễ dàng. Sự cắt ra của phage là sự tái tổ hợp điểm chuyên biệt khác, ngược với quá trình gắn vào. Sự cắt này yêu cầu enzyme của phage, integrase thêm protein của phage là excisionase. Nghiên cứu di truyền của sự gắn vật lý cho thấy escisionase gắn với integrase và sau đó nhận ra điểm gắn vào của prophage BOP’ và POB’, gắn với các điểm này. Integrase cắt ở trình tự O và tạo ra lại BOB’ và POP’. Quá trình tách diễn ra ngược lại với sự gắn vào. II. Đặc tính của các virus 1. Tính đa dạng về cấu trúc và thành phần di truyền Virus có bộ gene rất đa dạng. Bộ máy di truyền của virus có thể là DNA mạch kép (double strand - dsDNA), DNA mạch đơn (single strand - ssDNA), RNA mạch kép (dsRNA) hay RNA mạch đơn (ssRNA). Bộ gene RNA của virus là một phân tử hoặc một đoạn, sợi đơn phân cực mạch (+) hoặc mạch (-), có thể ở dạng vòng tròn hay dạng thẳng. Virus nhỏ nhất có nhất có khoảng 4 gene, virus lớn có khoảng vài trăm gene. Bộ gene của 153
60. virus cấu trúc đa dạng nhưng đều đảm bảo yêu cầu chung là phải sao chép được trong tế bào chủ tạo ra cả genome cho lắp ráp virion thế hệ sau và các mRNA phải tổng hợp protein của virus. 2. Tính đặc thù về vật chủ (Host specificity) Mỗi kiểu virus có thể nhiễm và kí sinh chỉ ở một biên độ giới hạn của tế bào được gọi là biên độ chủ (host range). Các virus nhận biết tế bào chủ theo nguyên tắc “ống khóa và chìa khóa” các protein bên ngoài của virion lấp vừa các điểm nhận trên bề mặt tế bào. Một số virus có biên độ chủ rộng đủ để xâm nhập vào vài loài. Chẳng hạn, các virus bệnh dại có thể nhiễm nhiều loài có vú gồm gậm nhấm, chó và người. Biên độ có thể rất hẹp như nhiều phage chỉ nhiễm vi khuẩn E. coli. III. Tái bản của các virus Bản chất genome của virus xác định kiểu sao chép. Virus được phân loại dựa trên các đặc điểm: - Phân loại theo bệnh: chia ra virus gây bệnh ở người, động vật và cây trồng Vấn đề chủ yếu đối với hệ thống phân loại này là nhiều loại virus khác nhau lại gây ra cùng một triệu chứng. Chẳng hạn, sự nhiễm trùng hô hấp với sốt có thể được gây ra do nhiều virus khác nhau. - Phân loại theo hình thái: phân loại virus cơ bản dựa trên cấu trúc của hạt virus. Kiểu phân loại này có hạn chế trong phân biệt giữa các virus có hình thái tương tự nhưng gây ra triệu chứng bệnh khác nhau. - Phân loại theo chức năng: trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu được tiến hành dựa trên phương thức sao chép của virus. Cần xác định thành phần và cấu trúc genome của virus và từ đó xác định cách sao chép. Kiểu tế bào bị nhiễm bởi virus có ảnh hưởng quan trọng đối với quá trình sao chép. Đối với virus của prokaryote, sự sao chép phản ánh mối quan hệ mở rộng đơn giản của các tế bào chủ. Đối với virus của tế bào eukaryote, vấn đề phức tạp hơn. Khả năng mã hoá của genome buộc virus chọn một phương thức sao chép. Phương thức sao chép của virus phụ thuộc vào bản chất vật liệu di truyền của chúng. Về phương diện này, virus được chia thành 7 nhóm: Nhóm I: Virus chứa DNA sợi đôi. Nhóm này được chia nhỏ thành hai loại: 154
61. + Sao chép là chỉ của nhân. Sự sao chép của các virus này phụ thuộc tương đối vào các yếu tố của tế bào. + Sao chép xảy ra trong tế bào chất. Những virus này có liên quan với các yếu tố cần thiết cho phiên mã và sao chép genome của chúng và vì vậy phụ thuộc nhiều vào bộ máy tế bào. Nhóm II: virus chứa DNA sợi đơn. Sự sao chép xảy ra trong nhân liên quan sự tạo thành qua trung gian sợi kép được xem như là khuôn cho tổng hợp lại DNA sợi đơn thế hệ sau. Nhóm III: virus chứa RNA sợi kép. Những virus này có bộ gene được chia đoạn. Những đoạn này được phiên mã riêng để tạo ra các monocistronic mRNA. Nhóm IV: Virus chứa RNA sợi đơn mạch (+), có thể chia nhỏ thành 2 nhóm: + Virus với polycistronic mRNA. RNA genome tạo ra mRNA, phân tử này dịch mã tạo sản phẩm là một polyprotein, thường được phân cắt để tạo các protein trưởng thành. + Virus phiên mã phức tạp. Cách dịch mã (như Togavirus) hoặc các RNA của subgenome (Tobamovirus) cần thiết để tạo RNA của bộ gene. Nhóm V: Virus chứa RNA sợi đơn mạch (-), genome của virus này được chia thành 2 nhóm: - Genome không chia đoạn (Mononegvirales). Bước đầu tiên trong sao chép là phiên mã RNA sợi (-) của genome nhờ RNA polymerase phụ thuộc RNA của hạt virus để tạo ra monocistronic mRNA, được xem là khuôn cho sao chép genome. - Genome được chia đoạn (Orthomyxoviridae). Sao chép xảy ra trong nhân với monocistronic mRNA cho mỗi gene của virus được tạo ra nhờ enzyme transcriptase từ genome đầy đủ của virus. Nhóm VI: Virus chứa mRNA sợi đơn mạch (+) qua trung gian DNA. Bộ gene của retrovirus là mRNA mạch (+) nhưng ở dạng lưỡng bội. Chúng không trực tiếp tạo ra mRNA mà phiên mã ngược tạo DNA. Nhóm VII: DNA sợi đôi qua trung gian RNA. Virus nhóm này dựa vào enzyme phiên mã ngược, những khác với retrovirus, quá trình này xảy ra bên trong hạt virus trong suốt quá trình trưởng thành. 155
62. Sợi RNA (-) virus bị phân cắt Phân tử duy nhất 5' C C C C Tổng hợp mRNA Tổng hợp mRNA 3' 5' 3' 5' sợi RNA (-) genome Tái bản Tái bản 5' 3' 5' 3' sợi (+) có chiều dài đầy đủ sợi RNA (-) 3' 5' 3' 5' genome Sợi RNA (+) virus Alphaviruses Flavi và picornaviruses C C sợi RNA (+) 5' 5' genome Tái bản Tái bản (mRNA) 3' 5' 3' 5' sợi (-) có chiều dài đầy đủ C Tổng hợp mRNA 5' 5' C 5' C sợi RNA (+) genome (mRNA) Ambisence RNA virus RNA virus sợi đôi sợi (+) 5' C C RNA sợi (-) 3' 5' 5' genome Tổng hợp Tổng hợp mRNA mRNA C 5' mRNA C C 3' 5' 3' 5' 3' 5' Anti Sợi (+) có chiều dài Tổng hợp -genome đầy đủ (mRNA) RNA Tái bản mRNA Dịch mã C 5' mRNA sợi (+) 5' C Protein sợi (-) 3' 5' RNA genome Hình 8.9 Sao chép RNA của virus 156
63. 1. Các virus của vi khuẩn Có 3 pha bắt đầu cho xâm nhiễm của virus. - Bắt đầu nhiễm - Sao chép và biểu hiện genome của virus - Giải phóng các virion trưởng thành từ tế bào bị nhiễm Bacteriophage được thêm vào nuôi cấy vi khuẩn đang sinh trưởng mạnh và sau một vài phút nuôi cấy bị giảm, ngăn cản tương tác giữa các hạt phage và tế bào. Ngay sau khi làm giảm nuôi cấy, có giai đoạn khoảng 10- 15 phút không phát hiện thấy các hạt phage, đây là giai đoạn che khuất (eclipse period). Điều này xảy ra một thời gian sau khi nhiễm vào tế bào, liên quan với genome của chúng như là điều kiện trước tiên cho sao chép. Ở giai đoạn này không có sự nhiễm nữa vì vậy không thể phát hiện nhờ vết đốm. Giai đoạn muộn là thời gian trước khi hạt virus mới đầu tiên xuất hiện và khoảng 20-25 phút cho hầu hết các bacteriophage. Khoảng 40 phút sau khi tế bào bị nhiễm, đường cong về số lượng hạt virus tổng số và virus ngoại bào hợp nhau thành một vì lúc này, tế bào bị nhiễm làm tan và giải phóng các hạt phage ngoại bào. Các bacteriophage làm chết tế bào chủ gọi là độc (virulent) và chúng sinh sản theo chu trình tan Các virus ôn hoà (temperate virus) có thể sinh sản mà không là chết tế bào chủ. Chúng có hai khả năng sinh sản: chu trình tan và chu trình tiềm tan không làm chết tế bào chủ. Chu trình sống bắt đầu khi phage gắn vào bề mặt tế bào E. coli và bơm DNA vào trong gây nhiễm. DNA của phage sau khi vào tế bào tạo DNA vòng tròn và sẽ tham gia vào một trong hai chu trình. DNA của phage có thể hoặc tham gia vào chu trình tiềm tan của phageT4 hoặc gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn nhờ tái tổ hợp điểm chuyên biệt để bước vào chu trình tiềm tan. 2. Các virus thực vật Hầu hết virus thực vật có genome RNA, tuy nhiên 2 nhóm virus thực vật được nghiên cứu nhiều nhất có chứa genome DNA: Cauliflower mosaic virus (CaMV) và gemini virus. - Các virus RNA Phần lớn virus thực vật có bộ gene RNA sợi đơn mạch (+) và nhiều dạng có capsid hình que, các protein capsomer hình xoắn. 157
64. + Tobacco mosaic virus (TMV) Genome TMV là RNA sợi đơn. Genome của chúng mã hoá ít nhất 4 chuỗi polypeptid. Protein 130 và 180 kDal được dịch mã trực tiếp từ cùng một codon bắt đầu trên RNA bộ gene. Hai protein khác, 30 kDal và protein vỏ được dịch mã từ đoạn RNA. Protein 130 và 180 kDal liên quan với sao chép virus, trong khi đó protein 30 kDal cần cho sự di chuyển của virus từ tế bào này đến tế bào khác. Vì vậy 3 loại protein này cần cho sự nhân lên của virus trong toàn bộ cây. - Các virus DNA Virus thực vật có bộ gene DNA rất hiếm, chỉ gồm 2 nhóm: + Cauliflower mosaic virus: CaMV được nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm Caulimovirus. Đây là nhóm virus dạng cầu, chứa genome DNA vòng tròn, mạch kép, kích thước khoảng 8 kb. Caulimovirus gây ra một số bệnh làm thiệt hại kinh tế cấy trồng. Chúng có phổ vật chủ hạn chế, chỉ nhiễm cây 2 lá mầm. DNA của CaMV có cấu trúc không bình thường, có 3 điểm gián đoạn trên sợi kép, hai điểm trên một sợi và một điểm trên sợi còn lại với những vùng trình tự overlap. Ngoài ra DNA CaMV có ribonucleotide gắn với đầu cuối 5’ của điểm gián đoạn. Từ các nghiên cứu ở CaMV, Hull và Covey (1983), Pfeiffer và Hohn (1983) cho rằng sao chép CaMV liên quan với phiên mã ngược qua trung gian RNA của bộ gene. Chu trình sao chép giống với retrovirus và hepatitis B virus. + Gemini virus: Gemini virus là nhóm virus có phổ xâm nhiễm rộng, cả cây một lá mầm và 2 lá mầm.Virus sọc vằn lá ngô (maiz streak virus – MSV) là một gemini virus lây nhiễm qua lá, được truyền do côn trùng. Bộ gene của geminivirus chứa phân tử DNA vòng tròn sợi đơn. Sao chép DNA virus được nghĩ là xảy ra nhờ trung gian DNA và genome của virus sao chép cho nhiều bản sao trong nhân của những tế bào tăng sinh nhanh. Virus gây ra sự ức chế sinh trưởng và lá có sọc vàng của những cây ngô bị nhiễm. 3. Các virus động vật Chu trình sao chép của virus động vật có nhiều điểm tương tự với các virus khác với nhiều biến dạng đáng kể. Virus động vật thường có promoter mạnh, có thể áp dụng cho biểu hiện gene. Trong nhiều trường hợp, chúng có khả năng sao chép genome của chúng với số lượng lớn bản sao trong tế bào. 158
65. Một số virus động vật như retrovirus gắn DNA của chúng vào nhiễm sắc thể tế bào chủ như là một phần chu trình sao chép của chúng. - Các virus RNA như retrovirus, paramyxo virus Retrovirus có phổ vật chủ rộng gồm chim, động vật có vú và những động vật khác. Sự nhiễm của retrovirus không dẫn đến làm chết tế bào. Biểu hiện gene của virus mạnh nhờ promoter mạnh. Retrovirus chứa genome RNA. Hạt virus chứa 2 bản sao RNA. Mỗi genome RNA có nhiều tính chất tương tự với mRNA eukaryote: có trình tự poly(A) khoảng 200 đơn vị ở đầu mút 3 và cấu trúc mũ ở đầu 5’. Virus xâm nhiễm vào tế bào kèm theo enzyme reverse transcriptase và intergrase. Enzyme reverse transcritase tham gia phản ứng tổng hợp cDNA, dẫn đến sự hình thành bản sao DNA mạch kép của RNA virus, được gọi là DNA provirus. DNA provirus được đóng vòng tròn nhờ protein intergrase và được xen vào genome tế bào chủ. Thường chỉ có một bản sao DNA provirus được gắn vào trong một tế bào chủ. Điểm gắn vào genome là ngẫu nhiên. Retrovirus là một tác nhân gây ung thư. Hầu hết chúng có cấu trúc genome chứa trình tự oncogene. Oncogene virus thường được tạo thành từ gene của tế bào và thường là kết quả của sự dung hợp gene tế bào với gene của virus. Kết quả là những virus gây ung thư như thế bị mất chức năng gene của virus. Chúng có thể sao chép trong lây nhiễm hỗn hợp với một helper virus cung cấp chức năng bị mất. - Các virus DNA: SV40, Bovine papilloma virus (BPV) Hạt virus SV40 chứa DNA mạch kép, vòng tròn, khoảng 5,2 kb được gắn với 4 phân tử histon: H4, H2a, H2b và H3. SV40 có thể tham gia vào hai kiểu chu trình sống phụ thuộc vào tế bào chủ. Trong tế bào cho phép virus xâm nhiễm (permissive cell) thường là các dòng tế bào ổn định có nguồn gốc từ khỉ châu Phi, sự sao chép virus xảy ra như các trường hợp nhiễm bình thường. Trong tế bào không cho phép (non-permissive cell), thường là những dòng tế bào chuột, không có sự nhiễm làm tan tế bào vì virus không thể sao chép toàn bộ DNA của chúng. Ở những tế bào khỉ bị nhiễm và làm tan do SV40, có thể phân ra 3 giai đoạn. Trong suốt 8 giờ đầu tiên, hạt virus không vỏ và DNA của chúng di chuyển đến nhân tế bào chủ. 4 giờ tiếp theo là pha sớm (early phase), có sự tổng hợp mRNA sớm và protein sớm và có sự kích thích tổng hợp DNA của tế bào chủ. Trong pha muộn xảy ra ở 36 giờ tiếp theo, trong giai đoạn này có sự tổng hợp DNA của virus, mRNA muộn và protein muộn, lắp ráp virus và làm tan tế bào. 159
66. + Bovine papilloma virus (BPV) BPV gây nên bệnh bướu (wart) ở trâu bò. BPV có genome DNA sợi kép, vòng tròn khoảng 7,9 kb. 4. Các virus gây ung thư, HIV/AIDS Khoảng 15% ung thư ở người có cơ chế hình thành liên quan với virus. Chúng có các nhóm sau : + DNA virus: họ Apovavirus (Papilloma virus), họ HepDNAavirus (Hepative-B virus), họ Herpesvirus (Eptein-Barr virus) + RNA virus: họ Retrovirus (HIV-1, virus AIDS) Các virus gây ung thư có thể tác động do xen đoạn DNA của chúng vào bộ gene chủ. Ngoài ra có thể thực hiện : + Hoạt hoá bộ máy sao chép DNA của tế bào chủ. + Kìm hãm tác động của các tumour suppressor gene chủ yếu để hoạt hoá sao chép DNA Như vậy bằng nhiều cách khác nhau các virus khi xâm nhập tế bào có thể làm tế bào mất sự kiểm soát bình thường. AIDS là hội chứng do virus làm suy giảm miễn dịch ở người (HIV). Hạt virus là một khối cầu, bờ ngoài gồ ghề, gồm vỏ bên ngoài, trong là chất nền protein bao quanh lõi có mặt cắt dạng nón. Trong lõi có genome gồm 2 sợi RNA giống nhau gắn với enzyme DNA polymerase là reverse transcriptase. Trong quá trình nhiễm, virus HIV bám và nhiễm lõi của nó vào tế bào hệ thống miễn dịch của người. Tiếp theo chúng sử dụng enzyme reverse transcriptase để sao RNA genome của chúng thành phân tử DNA sợi kép trong tế bào chất của tế bào chủ. Phân tử xoắn kép này chuyển đến nhân, gắn vào nhiễm sắc thể tế bào chủ nhờ một enzyme khác. Khi đã gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ, genome của virus. Một khi đã gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ, genome của virus có thể thực hiện một trong 2 quá trình. Nó có thể trưng dụng bộ máy tổng hợp protein của tế bào chủ để có thể tạo ra hàng trăm hạt virus mới sinh sản bằng nảy chồi, tách khỏi màng tế bào và đôi khi làm chết tế bào chủ. Nó cũng có thể tiềm tàng trong nhiễm sắc thể của tế bào chủ, rồi sao chép và truyền genome virus sang 2 tế bào mới khi tế bào phân chia. 160
67. Màng bao Glycoprotein HIV xâm nhập Capsid vào tế bào TẾ BÀO CHỦ RNA Enzyme sao virus mã ngược Lai RNA (2 sợi DNA-RNA Enzyme sao phân biệt) mã ngược DNA DNA NST Protein virus Provirus a. Cấu trúc của HIV RNA NHÂN b. Sự sinh sản của HIV HIV mới Hình 8.10 Chu trình sinh sản của virus HIV Ngoài ra sinh học hiện đại còn phát hiện ra hai dạng sống đặc biệt là các viroid và prion - Viroid: là những phân tử RNA rất nhỏ (200-400 nucleotide), dạng que có mức độ cấu trúc bậc hai cao (Hình 8.11). Chúng không có capsid và vỏ bao (envelope) và chỉ chứa một phân tử acid nucleic đơn. Viroid gắn liền với bệnh thực vật. Viroid đầu tiên được phát hiện và nghiên cứu đầy đủ nhất là viroid ống thoi khoai tây (potato spindle tuber viroid-PSTVd). Viroid không mã hóa cho bất kì một protein nào và nó được sao chép nhờ RNA polymerase của tế bào chủ hoặc có thể nhờ một sản phẩm của một gene RNA polymerase phụ thuộc RNA trong một vài tế bào eukaryote. Chi tiết của sao chép đến nay người ta chưa rõ, dường như nó xảy ra nhờ cơ chế vòng tròn xoay có sự cắt (autocatalytic cleavage) và gắn (self-ligation) để tạo ra viroid trưởng thành. 161
68. Vùng kết Vùng kết thúc bên Vùng gây Vùng trung tâm có Vùng thúc bên trái bệnh tính bảo thủ biến dị phải Hình 8.11 Các vùng chức năng của phân tử RNA viroid Giữa các viroid khác nhau có các trình tự khác nhau, nó được sử dụng trong phân loại để chia viroid thành giống (genera) và loài (species). Tuy nhiên, tất cả viroid đều có đặc điểm chung là vùng trung tâm có tính chất bảo thủ liên quan với sao chép của chúng (Hình 8.12). Một nhóm các viroid có khả năng tạo thành cấu trúc « đầu búa » (hammerhead) làm cho chúng có tính chất enzyme của một ribozyme. Hoạt tính này được sử dụng để cắt cấu trúc nhiều đơn phân tạo ra trong quá trình sao chép. Các viroid khác sử dụng các enzyme chưa được biết trong tế bào chủ để thực hiện điều này. Một vài viroid gây bệnh trầm trọng và gây chết thực vật chủ. Các viroid khác gồm các loại từ không có biểu hiện bệnh bên ngoài đến có triệu chứng bệnh nhẹ. Hình 8.12 Cấu trúc RNA viroid - Prion: Một nhóm bệnh lây nhiễm hệ thần kinh kinh niên, phát triển nhanh chóng và gây chết được biết như là bệnh xốp não lây nhiễm (Transmissible spongiform encephalopathics - TSE). Tác nhân lây nhiễm liên quan đến TSE không phải là acid nucleic (Tikvah Alper, 1967). Các bệnh TSE ở người như là bệnh Kuru và Creutzfeldt-Jacob có thể gây nên do các phần tử protein gây nhiễm và Standley Prusiner (1982) gọi chúng là prion (proteinacious infectious particle). Bản chất của prion là chưa được chứng minh một cách chắc chắn. Chúng là một hiện tượng mới vượt ra ngoài hiểu biết thông thường. Tất cả các bệnh prion đều có bệnh lý giống nhau cơ bản, mặc dù giữa chúng có sự khác biệt có ý nghĩa ở những điều 162
69. kiện khác nhau. Các bệnh khác nhau được đặc trưng bởi sự lắng (deposition) của các protein bất thường trong các mô khác nhau như thận, lách, gan hoặc não Sự lắng các « amyloid » này bao gồm sự tích luỹ các protein khác nhau ở dạng tấm hoặc dạng cuộn rối tạo ra protein β amyloid. Chúng là kết quả từ những sai hỏng của bộ gene trong trao đổi chất do nhiều loại nhân tố chưa được biết Mặc dù cơ chế phân tử liên quan với sự chết của tế bào là chưa rõ ràng, nhưng tác động gây ra xốp nào do tạo lỗ ở mô não đã được quan sát thấy dưới kính hiển vi. Những lỗ này gây ra do sự mất tế bào thần kinh và gliosid. Phép chẩn đoán xác định TSE không chỉ tiến hành trên lâm sàng mà yêu cầu chứng minh sự lắng protein prion (prp) bằng nhuộm hoá học miễn nhiễm mô não người sau khi chết. Câu hỏi và Bài tập 1. Hãy trình bày quá trình tái tổ hợp genome của bacteriophage. 2. Genome của vi khuẩn và virus tương tác vật lý theo cách nào? 3. Ý nghĩa của việc phân tích cấu trúc locus rII của phage T4. 4. Hãy nêu đặc điểm về chu trình sống của phage. 5. Virus thực vật có những nhóm nào? 6. Hãy trình bày phương thức sao chép của virus chứa RNA sợi đơn. 7. Đặc điểm chu trình sinh sản của virus HIV. 8. Hãy nêu tên các dạng sống chỉ có acid nucleic hoặc chỉ có protein. 9. Có bao nhiêu đốm tan của phage được tạo thành trên môi trường nuôi cấy từ một phage riêng lẽ ban đầu? 10. Bacteriophage có trật tự các gene là ABC att DEF. Hỏi trật tự của các gene này ở prophage như thế nào? Tài liệu Tham khảo Phạm Thành Hổ. 2000. Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo dục. Hoàng Trọng Phán. 1995. Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế 163
70. Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Cann AJ. 2001. Priciple of molecular virolory. Academic Press. London, UK. Flint SJ, Enquist LW, Krug RM, Racaniello VR, Skalka AM. 2000. Principles of Virology. Molecular Biology, Pathogenesis, and Control. ASM Press, Washington DC. Printed in the United States of America. Harlt D.L., Jones E.W. 1998. Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers, Toronto, Canada. Hartwell et al. 2003. Genetics: From genes to genomes, Second editor. The McGraw-Hill Companies. Old RW & Primrose SB. 1989. Principles of gene manipulation. Blackwell Scientific Publication. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Companies, Inc., United States of America. Watson D.J, Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R. 2004. Molecular biology of the gene. Benjamine Cummings, San Francisco, United States of America. 164
71. Chương 9 Di truyền học Vi nấm và Vi tảo Mục tiêu của chương Phân tích di truyền ở một số vi tảo và vi nấm, chủ yếu tập trung nghiên cứu các đặc điểm của vi nấm, vi tảo như tính không dung hợp, phân tích bộ bốn, phân tích di truyền trong chu trình cận hữu tính, nhiễm sắc thể nhân tạo Số tiết: 3 Nội dung I. Đại cương về nghiên cứu di truyền ở một số vi tảo thông dụng Loài vi tảo được sử dụng sớm nhất và nghiên cứu di truyền chi tiết hơn cả là Chlamydomonas reinhardii. Ưu thế của đối tượng này là có thể tiến hành lai và phân tích bộ bốn không xếp theo thứ tự. Ở các loài này, các tế bào đơn bội có thể sinh sản vô tính một thời gian dài. Các tế bào đơn bội gồm 2 loại: mt (+) và mt (-), tế bào đơn bội của mỗi loại không kết hợp với nhau. Sự kết hợp hai tế bào khác kiểu bắt cặp mt (+) với mt (-) tạo ra hợp tử. Hợp tử qua giảm phân cho tỷ lệ phân ly của một gen là 2 tế bào mt (+) : 2 tế bào mt (-). Trong điều kiện thí nghiệm, có thể nuôi các tế bào Chlamydomonas reinhardii để nhận các tế bào đồng nhất (synchronous culture), khi thay đổi chu kì 12 giờ sáng 12 giờ tối đều đặn. Theo dõi tổng hợp DNA cho thấy DNA của lục lạp tổng hợp vào giờ thứ 5-6 ngoài sáng, còn DNA của nhân tổng hợp khoảng giờ thứ 16-18, sau đó chia tế bào đồng loạt. Một số đột biến kháng streptomycine đã được thu nhận và nhận thấy ở một số có sự di truyền trong nhân, số khác có sự di truyền ngoài nhân. 165
72. Cặp giao tử Sự tạo cặp Dung hợp tế bào Dung hợp Tập hợp lại + Kết hợp nhân và NST Hợp tử (NH + hay Giảm Phát triển hợp tử 4 Hình thành Giảm phân phân ánh sáng) cặp (NH +) 4 Hợp tử Nảy trưởng thành chồi + Tỷ lệ 2:2 của (NH hay + + - - 4 yl+ và yl- yl yl yl yl ánh sáng) Tỷ lệ 4:0 của sm-r sm-r sm-r sm-r sm-r và sm-s Sản phẩm đơn bội sau giảm phân Hình 9.1 Gen nhân (yl) phân ly 2:2 trong quá trình tạo giao tử còn gen của lục lạp (sm) phân ly theo tỷ lệ 4:0 II. Phân tích di truyền ở vi nấm 1. Tính không dung hợp (incompatibility) ở vi nấm Khái niệm tính không dung hợp ở nấm được dùng để chỉ khả năng kết hợp với nhau giữa các dòng nấm trong sinh sản hữu tính. Cho đến nay gần 450 loài nấm đã được nghiên cứu về các kiểu không dung hợp. Sự không dung hợp được xác định về mặt di truyền. Theo kiểu dung hợp thì nấm được phân làm 2 loại: - Đồng tản (Homothallic) là khi có sự kết hợp với nhau giữa các tế bào (hay hệ sợi tơ-mycellium) giống nhau trong sinh sản hữu tính. Ví dụ, tế bào a kết hợp với tế bào a, hay α với α tạo dạng lưỡng bội 2n tương ứng aa hay αα. - Dị tản (Heterothallic) là kiểu khi có sự lai nhau giữa 2 loại tế bào khác nhau như a với α tạo dạng dị hợp tử lưỡng bội aα. Các nấm dị tản có thể chia thành: lưỡng cực (bipolar) và tứ cực (tetrapolar). Đại diện điển hình của nấm dị tản lưỡng cực (bipolar heterothallic) là nấm men Saccharomyces cerevisiae. Ở nấm men, sự hợp bào (cytogamy) và 166
73. hợp nhân (karyogamy) chỉ xảy ra giữa các tế bào (hay nang bào tử - ascospora) có kiểu bắt cặp (matting type) khác nhau như a và α và các allele khác nhau của locus MAT. Do có sự tham gia của 2 allele nên gọi là lưỡng cực. Nấm mốc vàng bánh mì Neurospora crassa cũng thuộc kiểu không dung hợp này. Nấm rơm (Volvariella volvacea) và nấm mỡ (Agaricus bisporus) cũng thuộc loại này. Kiểu dị tản tứ cực (tetrapola heteropolic) đặc trưng cho nhiều loại nấm đảm Bacidiomycetes mà đại diện là Schizophyllum communae. Nấm bào ngư (Pleurotus) và nấm hương (Lentinus edodes) thuộc kiểu không dung hợp này. Sự xác định di truyền không dung hợp ở các loài nấm này do 2 gen A và B. Mỗi gen có 2 allele hoặc nhiều hơn, thường là A1, A2 và B1, B2. Sự kết hợp giữa các dòng đơn bội chỉ tạo dạng hữu thụ có kiểu gene A1A2B1B2 tức bốn nhân tố khác nhau, do đó gọi là tứ cực. Sự đa dạng của các chu trình sống và các kiểu không dung hợp ở nấm có ảnh hưởng đến các phương pháp phân tích di truyền. Ở một số nấm sinh sản hữu tính thực hiện trên cơ sở dị hợp bào (heterogamy) như ở Neurospora crassa. Ở những loài khác trên cơ sở đồng hợp bào (isogamy). Song song với sinh sản hữu tính còn có chu trình cận hữu tính hoàn toàn hay không hoàn toàn phụ thuộc vào loại nấm. Chu trình sinh sản cận hữu tính là quá trình kết hợp và tái tổ hợp gene diễn ra trong nguyên phân chứ không phải giảm phân, không có sự thụ tinh như sinh sản hữu tính. 2. Phân tích bộ bốn và lập bản đồ ở vi nấm Nấm men có nhiều đặc trưng để trở thành mô hình lý tưởng cho nghiên cứu di truyền ở eukaryote. Nấm men là một eukaryote đơn bào, chu kỳ sống chỉ khoảng 90 phút, có thể thu đuợc nấm men với số lượng lớn khi nuôi trên môi trường đặc. Bộ gen của nấm men chứa khoảng 12 megabase với 6.000 gen phân bố trên 16 nhiễm sắc thể. Nấm men là eukaryote đầu tiên được giải mã bộ gen. Chu trình sống của nấm men gồm hai giai đoạn có thể chuyển đổi qua lại. Tế bào có thể tồn tại ở cả dạng lưỡng bội và cả dạng đơn bội. Trong cả hai trường hợp, tế bào mẹ tạo chồi giống hệt nó. Những tế bào lưỡng bội này có thể tiếp tục sinh trưởng bằng mọc chồi và có thể trãi qua giảm phân tạo 4 bào tử đơn bội (haploid) trong một nang (ascus) được gọi là tetrad. Bào tử đơn bội (haploid spore) của kiểu kết cặp khác nhau (a với α) sẽ qua 167
74. thụ tinh tạo thể lưỡng bội. Những bào tử của kiểu kết cặp giống nhau sẽ tiếp tục sinh trưởng bằng nẩy chồi. Nấm men được xem là E. coli của các tế bào eukaryote, có thể sử dụng nấm men để phân tích đột biến. Tế bào nấm men đơn bội được gây đột biến bằng tia X, sau đó sàng lọc các kiểu hình đột biến trên môi trường nuôi cấy. Đầu tiên nuôi cấy tế bào nấm men trên môi trường giàu dinh dưỡng để tất cả các tế bào phát triển. Đĩa nuôi cấy này sau đó được nhân lên qua đĩa sao chép chứa môi trường chọn lọc hoặc điều kiện sinh trưởng đặc biệt. Chẳng hạn, các đột biến nhạy cảm nhiệt độ có thể sinh trưởng trên các đĩa gốc nhưng lại không sinh trưởng trên các đĩa sao chép ở nhiệt độ giới hạn. So sánh các khuẩn lạc ở đĩa gốc với đĩa sao chép sẽ phát hiện được những đột biến nhạy cảm với nhiệt độ. Nang chứa 4 bào tử túi dị hợp Dinh Dinh Nảy chồi dưỡng dưỡng Nảy chồi Hình thành bào tử Vòng đời Vòng đời s.dưỡng s.dưỡng (đơn bội) (đơn bội) Giảm phân Nảy chồi Nảy chồi Thiếu nitrogen Kết hợp hình thành hợp tử Vòng đời s.dưỡng (đơn bội) Nảy chồi Hình 9.2 Chu trình sống của nấm men. 168
75. Lớp nang khuẩn (Ascomycetes) có đặc điểm là khi các tế bào lưỡng bội phân chia giảm nhiễm sẽ tạo ra các bào tử nằm trong một vỏ bao được gọi là nang (ascus). Các cơ thể này có các đặc điểm thuận lợi cho phân tích di truyền: Các vi nấm có thể tồn tại ở dạng đơn bội, nên tất cả các gene có thể biểu hiện trực tiếp thành kiểu hình. Các vi nấm này có thể tạo ra số lượng cá thể lớn ở thế hệ sau nên có thể phát hiện các sự kiện di truyền hiếm và có thể ước lượng được tần số tái tổ hợp một cách chính xác. Tế bào nấm men có thể sống ở dạng sinh dưỡng đơn bội hay dị bội. Tín hiệu chuyển từ đơn bội sang dị bội xuất hiện theo dạng kết hợp và tín hiệu chuyển từ dị bội sang đơn bội là sự giảm phân trong quá trình hình thành bào tử. Tế bào phân chia sau khi hình thành chromatid Giảm phân I Giảm phân II Nguyên phân Hình 9.3 Mốc vàng bánh mì (Neurospora crassa) là mô hình nghiên cứu phân li trong giảm phân Trong chu trình sống, chỉ có hợp tử là lưỡng bội, sẽ trải qua giảm phân ngay sau khi được tạo thành, tạo các bào tử đơn bội, bào tử nẩy mầm hình thành giai đoạn cây. Ở một số loài các bộ bốn tạo thành trải qua một lần phân chia nguyên nhiễm nữa để tạo ra từng cặp gồm hai bào tử giống hệt 169
76. nhau. Ở mốc vàng bánh mì (N. crassa), các bào tử xếp thảng hàng trong nang theo một trật tự xác định liên quan trực tiếp đến tiến trình của giảm phân (Hình 9.3). Hầu hết các loại nấm mốc khác, sản phẩm của giảm phân không sắp xếp theo một trật tự đặc biệt trong nang như mốc vàng bánh mì. - Lập bản đồ di truyền bằng phân tích bộ bốn Đối với trường hợp bộ bốn không theo thứ tự: Ví dụ: khi lai các tổ hợp của hai gene AB × ab. Sự thụ tinh cho nhân lưỡng bội AB/ab và nó chia giảm nhiễm ngay. Nếu không có trao đổi chéo xảy ra hoặc trao đổi chéo đôi xảy ra trên cùng hai chromatid thì sẽ có bộ bốn: 2 AB : 2ab, gọi là kiểu đôi cha mẹ (parental ditype – PD). Nếu trao đổi chéo xảy ra trên cả bốn chromatid của mỗi cặp nhiễm sắc thể kép, sẽ có 2AB : 2aB, gọi là bộ bốn kiểu đôi không cha mẹ (Nonparental ditype – NPD) hay còn gọi là kiểu đôi tái tổ hợp (Reconbinational ditype- RD) Trường hợp tạo ra mỗi nang bốn loại bào tử có kiểu gene khác nhau: 1AB : 1Ab : 1aB : 1ab được gọi là kiểu bốn (tetratype) Phân tích bộ bốn cho phép xác định hai gene liên kết. Khi hai gene không liên kết thì tần số bộ bốn kiểu đôi bố mẹ và kiểu đôi không bố mệ bằng nhau (PD = NPD). Ngược lại khi hai gene liên kết, kiểu PD có tần số lớn hơn kiểu NPD. Tần số tương đối của các kiểu bộ bốn khác nhau được sử dụng để xác định bản đồ khoảng cách giữa hai gene liên kết. 170
77. Parent ditype Nonparent ditype Tetratype PD NPD T Hình 9.4 Phân tích bộ bốn 3. Phân tích di truyền trong chu trình cận hữu tính (tái tổ hợp trong nguyên phân) Nhiều loại nấm có sợi dinh dưỡng kết hợp với nhau, làm cho các nhân đơn bội từ các dòng cùng ở chung trong tế bào chất. Các thể dị nhân (heterocaryon) được tạo nên có thể tồn tại lâu dài như ở N. crassa. Sự tạo thành các thể dị nhân được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự tương tác giữa các gene, giữa các allele và giữa các gene của nhân với tế bào chất. Trong một số trường hợp, sự so sánh các dị hợp tử và dị nhân cho thấy sự khác nhau trong tương tác giữa các allele, có lẽ do: 171
78. - Tỷ lệ số lượng nhân và tương ứng các allele trong thể dị nhân có thể khác nhau - Các allele của các gene ở một nhân không được ngăn cách như ở giữa các thể dị nhân. Các nhân ở thể dị nhân đôi khi hợp nhau tạo nên đoạn lưỡng bội. Hơn nữa trong quá trình chia nguyên phân tiếp theo, nhân lưỡng bội có thể chịu tác động của hai quá trình: đơn bội hoá hoặc tái tổ hợp nguyên phân. 3.1. Sự đơn bội hoá (Haploidisation) Sự đơn bội hoá có thể xảy ra ngẫu nhiên hoặc được gây tạo bởi chất n- fluorphenylalanin. Nếu như các nhân trong nhiều nguyên phân bị 1 nhiễm sắc thể (2n – 1) thì nhân lệch bội vừa xuất hiện trở nên không ổn định và tiếp tục mất các nhiễm sắc thể khác của một bộ đơn bội, cho đến khi trở thành nhân đơn bội (n) ổn định. Trong quá trình đó nhiễm sắc thể bị mất độc lập nhau, các gene của cùng một nhiễm sắc thể có sự liên kết hoàn toàn. Dựa vào đặc điểm này có thể xác lập sự liên kết dựa vào gene đánh dấu trên mỗi nhiễm sắc thể. 3.2. Tái tổ hợp trong nguyên phân (Mitotic recombination) Tái tổ hợp trong nguyên phân là hiện tượng thường gặp ở nhiều sinh vật, khi xảy ra trao đổi chéo giữa các nhiễm sắc thể tương đồng trong nguyên phân. Trong trường hợp này khoảng cách của gene đánh dấu xa tâm động nhất, sự đồng hợp tử hoá thường xảy ra hơn cả (được coi là 100%) và sự phân bố các gene được tính theo công thức: D = Nab/Nb x 100% D: khoảng cách của gene đến tâm động Nb - tổng số các dạng phân li, đồng hợp tử theo b. Nab - số các dạng phân li đồng hợp cả a và b, nếu như b là gene đánh dấu xa tâm động nhất. Bản đồ liên kết gene được xây dựng bằng tái tổ hợp giảm phân và tái tổ hợp nguyên phân (trong chu trình cận hữu tính) có thứ tự gene xếp giống nhau ở Aspergillus nidulans. 172
79. III. Nấm men như là E. coli của các tế bào eukaryote 1. Các nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC) Để xây dựng nhiễm sắc thể nhân tạo có chức năng như một phần bộ gene của tế bào, để đảm bảo sự phân chia của nhiễm sắc thể cần có tâm động (centromere). Thứ hai, phần đầu mút của nhiễm sắc thể thẳng dài được giữ nguyên vẹn khi đưa vào tế bào, tránh được sự phân giải của nuclease nhờ đoạn trình tự DNA lặp lại đặc biệt và phức hợp protein bao đầu nhiễm sắc thể là telomer. Cuối cùng, DNA phải sao chép trước khi tế bào phân chia vì vậy để nhiễm sắc thể nhân tạo sao chép phải có ít nhất một điểm xuất phát sao chép. Plasmid Đặc điểm a. - Không thể sao chép tự động AMP - Điểm gắn vào ở vùng tương đồng là LEU2 Ori 2 - Mỗi tế bào có một phiên bản LEU2 Ori 1 b. - Sao chép tự động - Mỗi tế bào có nhiều phiên bản Ori 2 LEU2 c. ARS CEN - Sao chép tự động AMP - Mỗi tế bào có một phiên bản - Phân ly trong giảm nhiễm như là một nhiễm sắc thể Ori 2 LEU2 Hình 9.5 Plasmid của nấm men a. YIp: không chứa ori và không thể sao chép tự động b. YEp: chứa điểm ori 1 và sao chép tự động c. YCp: chứa tâm động và phân ly trong quá trình giảm phân LEU2: gen nấm men, Ori 1: xuất phát sao chép của plasmid nấm men, Ori 2: xuất phát sao chép của vi khuẩn, AMP: gen kháng kháng sinh của vi khuẩn 173