Giáo trình Di truyền học - Trần Trung (Phần 2)

Nội dung text: Giáo trình Di truyền học - Trần Trung (Phần 2)

1. Ch ươ ng 7 Di truy n h c Vi khuân Mc tiêu c a ch ươ ng Gi i thi u cac hin tương di truyn ơ vi khu n, sư chuyên vi va cơ s ơ di truyn tinh khang thuôc cua cac vi khun gây bnh. Ni dung I. Ưu th và các ñc ñim c a ñ i t ưng vi sinh v t 1. Th i gian th h ng n, t c ñ sinh sn nhanh Trong ñiu ki n thu n li, t bào E.coli có th phân chia 1 ln trong 20 phút, còn bacteriophage trong th i gian 30-40 phút có th to ra hàng tr ăm cá th , nm men có th chia t bào trong 2 gi . ð c ñim nghiên cu di truyn hc là theo dõi qua nhi u th h nên các ñi tưng vi sinh vt giúp rút ng n ñáng k th i gian thí nghi m. Nu so sánh th i gian th h ca ru i gi m (2 tu n), ca chu t (2 tháng), ca ng ưi (20 n ăm) thì các vi sinh v t ưu th h ơn h n. 2. Có s t ăng v t s l ưng cá th Trong ñiu ki n ñ dinh dưng các vi sinh vt sinh sn nhanh to qu n th có s lưng cá th ñ ln, có th có s lưng 1010 -10 12 t bào T bào E.coli có ñưng kính 1 µm nu ñ dinh dưng thì trong 44 gi có th to sinh kh i bng qu ñt. Ru i dm là ñi tưng thu n li cho nghiên cu di truyn hc qu n th , nh ưng cũng ch ñt 105 - 106 cá th . Nh s lưng cá th ln có th phát hi n ñưc các s ki n di truyn hi m hoi vi tn s 10-8- 10 -11. Nh ư vy s lưng cá th ln s giúp nâng cao năng sut phân gi i di truyn tc kh năng phát hi n các ñt bi n và tái t hp có tn s xu t hi n rt nh . 123
2. Ngoài ra vi c nuôi cy vi sinh vt không cng knh, ít tn di n tích, môi tr ưng nuôi cy d ki m soát theo các công th c ch t ch . 3. Có c u t o b máy di truy n ñơn gi n vi sinh vt có cu to b máy di truyn là DNA tr n, d ti n hành thí nghi m tr c ti p trên DNA cũng nh ư d chi t tách, tinh sch, s locus cũng ít hơn so vi các sinh vt khác. Các vi nm và vi to có th tn ti dng ñơ n bi (n) vi th i gian dài trong chu trình sng nên các gen ln có th ñưc bi u hi n ra ki u hình. Ngoài ra các vi sinh vt k trên còn có tr ng thái lưng b i (2n) nên cũng d dàng th c hi n phân tích tái t h p. Các tính tr ng vi sinh vt ñơ n gi n. ði vi các tính tr ng sinh hóa hay tính ñ kháng d s d ng môi tr ưng ch n l c ñ phát hi n. 4. D nghiên c u b ng các k thu t vt lý và hóa h c ða s các vi sinh vt có cu to ñơ n bào nên qu n th ca chúng có ñ ñng nh t cao hơn so vi các sinh vt có b máy ña bào bt ngu n t nhi u lo i mô khác nhau. Cu to t bào vi sinh vt ñơ n gi n, d ch t tách tinh s ch DNA Có th nuôi vi sinh vt ñng nh t tc ña s các t bào nh ng giai ñon phát tri n gn gi ng nhau. Ví d: nm men nuôi trên môi tr ưng có b sung acetat, tt c các t bào n m men ñu to bào t . To Chlorella khi nuôi trong ti 18-19 gi , tt c chúng ñu th c hi n phân chia gi m nhi m. II. ðc ñim ca di truyn vi sinh v t - Khu n lc (dòng t bào) là 1 cm t bào có ngu n gc t 1 t bào ban ñu - Ch ng: dòng t bào mang 1 ñc ñim di truyn nào ñó. Các ñt bi n vi sinh vt th ưng ñưc phát hi n theo s bi n ñi các tính tr ng sau: - Hình thái: kích th ưc, hình dng t bào hay khu n lc, có màng nhân hay không 124
3. - Sinh hóa: s hi n di n c a các sc t, màu s c ñ c tr ưng - Nuôi cy: ki u hô hp, ki u dinh dưng, nhu cu ñòi các nhân t tăng tr ưng - Tính ñ kháng: kháng thu c, kháng phage, ch u nhi t - Mi n nhi m: ph n ng kháng nguyên, kháng th Các ñt bi n có th xu t hi n ng u nhiên hay do gây to nh các tác nhân gây ñt bi n. M i gen có t n s ñ t bi n ñc tr ưng. ðc ñim c a tái t h p vi khu n: Các sinh vt Prokaryote nh ư vi khu n, virus có quá trình sinh sn tươ ng ñươ ng sinh sn hu tính gi là quá trình sinh sn cn hu tính (parasexuality), quá trình này có các ñc ñim: - S truyn thông tin mt chi u t t bào th cho sang t bào th nh n. - S to thành hp t mt ph n (merozygote). T bào th cho (donor) chuyn mt ñon ca b gen sang t bào th nh n (recipient), nên ch l ưng bi m t ph n, còn các ph n khác ñơn b i. - B gen th ưng ch là DNA tr n, nên ch có mt nhóm liên kt gen và tái t h p th c ch t là lai phân t . III. Sinh hc c a vi khu n 1. C u t o t bào và sinh s n: T bào E.coli có chi u dài kho ng 2 µm. Bên ngoài có vách t bào, k trong là màng sinh ch t. Mezosome là cu trúc xp li ca màng sinh ch t có th liên quan ñn phân bào ch t di truyn to nên nucleotid. Các tiêm mao giúp cho s v n ñ ng c a t bào. Thông tin ca t bào vi khu n nm trên mt phân t DNA mch kép vòng tròn ñơ n ñưc gi là genophore, hay "NST". Gn ñây ñã phát hi n th y rng ít nh t mt s vi khu n DNA to thành ph c hp vi protein có tính base ñ hình thành si nhi m sc nh ư histon NST Eukaryote. Ngoài ra mt s vi khu n còn có thêm plasmid là phân t DNA vòng tròn nh có kh n ăng sao chép ñ c l p. 125
4. Phân t DNA gn tr c ti p vào màng sinh ch t. S sao chép DNA to ra 2 bn sao gn chung nhau trên màng sinh ch t. Khi t bào kéo dài ra các bn sao DNA tách xa nhau do ph n màng gi a chúng ln dn ra. Ki u sinh sn vô tính này ñưc gi là ng t ñôi (Binary fission). T bào vi khu n chia nhanh hơn rt nhi u so vi t bào Eukaryote. Quá trình sao chép DNA ñưc b t ñu t ñim xu t phát Ori kéo dài v 2 phiasong song vi quá trình kéo dài màng sinh ch t, nơi có ñim gn vào ca DNA b gen, mc dài tách 2 phân t DNA v 2 t bào con. Hình 7.1 t bào vi khu n E. coli Hình 7.2 T bào vi khu n phân chia theo tr c phân. 1 26 1 26
5. 2. ðc ñim nuôi c y T bào vi khu n có th nuôi trên môi tr ưng l ng có b sung các mu i vô c ơ thi t yu. Mt ñ có th ñt 109 t bào/ml. Có th nuôi vi khu n trong môi tr ưng rn có agar trong các hp petri ñ tng t bào mc thành khu n lc d quan sát. IV. Bi n n p ( Transformation) 1. Hi n t ưng và ñiu ki n - ðnh ngh ĩa: bi n np là hi n tưng truyn thông tin di truyn bng DNA. 127
6. Hinh 7.3 Biên nap cua vi khuân Trong bi n np DNA tr n t mt t bào vi khu n th cho này ñưc truyn sang t bào vi khu n th nh n khác. Khi t bào vi khu n b v do làm tan, DNA vòng tròn ca chúng thoát ra môi tr ưng thành các ñon th ng vi chi u dài khác nhau có kh n ăng gây bi n np cho các t bào th nh n khác. Hi n tưng bi n np ñưc nghiên cu nhi u các ñi tưng: Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Haemophilus parainfluenzae - ðiu ki n th c hi n bi n np: Hi u qu ca bi n np ph thu c vào 3 y u t: + Tính dung np ca t bào th nh n. Nh ng t bào dung np trên b mt có các nhân t dung np. Ng ưi ta có th to kh năng dung np ca t bào th nh n b ng m t s x lý. Ví d : Streptococcus pneumoniae: 30 - 80 ñim nh n Haemophilus influenzae : 4-8 ñim nh n + DNA th c hi n bi n np ca th cho ph i dng mch kép, nu DNA b bi n tính dng mch ñơ n riêng l không cho hi u qu bi n np. Th ưng DNA bi n np là mt ñon nh . vi khu n E.coli ñon DNA bi n np kho ng 1/250 - 1/500 genom c a vi khu n. ðon t t bào cho xâm nh p vào t bào nh n ñưc gi là ñon ngo i lai (exogenote), DNA nguyên vn ca t bào nh ñưc gi là ñon ni ti (endogenote). T bào vi khu n nh n ñon ngo i lai s lưng bi mt ph n b gen ñưc gi là hp t tng ph n (merozygote). Tuy nhiên, ñon ngo i lai mch ñơ n không b n v ng và b phân h y n u không ñưc g n vào b gen th nh n. Quá trình trao ñi thông tin di truyn bng chuyn ch mt ph n vt li u di truyn t t bào này sang t bào khác ñưc gi là s giao np t ng ph n (meromixis). 2. C ơ ch bi n n p 2.1. Xâm nh p c a DNA giai ñon này, DNA có th gn v i ñim nh n ca màng t bào.Quá trình gn này có th là thu n ngh ch, nó có th gn vào ri nh ra. 128
7. Si DNA mch kép ca dòng vi khu n S sau khi chui qua màng t bào ca dòng vi khu n R thì mt mch ca S s b nuclease ca t bào ct, còn li mt m ch nguyên. 129 129
8. Hinh 7.4 C ơ chê biên nap tư nhiên 2.2. B t c p DNA ca th nh n R s bi n tính tách ri 2 mch mt ñon ñ bt cp v i ñon DNA th cho S v a chui vào. ðon DNA ca R ñon có DNA ca S bt cp s b ct ñt và ñy ra. Trong quá trình bt cp, có nh ng ñon không tươ ng ñng thì s hình thành nên nh ng vòng li, nh ng ñon ñó gi là Heteroduplex. Còn các ñon bt cp t ươ ng ñng g i là Homoduplex. 2.3. Sao chép Sau khi bt cp s to phân t DNA có ñon lai R-S, ti n hành sao chép ñ to ra hai si kép: mt si kép R-R và mt si kép khác có mang ñon DNA th nh n S-S. Hình 7.5 S ơ ñ các giai ñon bi n n p 130 130
9. V. Ti np (Transduction) 1. Phage là nhân t chuy n gen Thí nghi m ñưc ti n hành trong ng hình ch U. Gi a hai ng ca hình ch U ñưc ng ăn cách bng màng lc vi khu n, màng có l nh vi khu n không qua ñưc nh ưng phage qua ñưc. Nhánh A ca ng ch a vi khu n có kh năng tng hp tryptophan (trp+), còn nhánh B nuôi các vi khu n khác mt kh năng tng hp tryptophan (trp-). Sau khi nuôi mt th i gian, nhánh B xu t hi n vi khu n có kh năng tng hp tryptophan. Nu dùng màng ng ăn không cho virus lt qua thì không th y hi n tưng này. Qua nhi u ln thí nghi m, vi c ti gen trp+ t nhánh A sang nhánh B ñưc ch ng minh. 131 Hình 7.6 Thí nghi m ch ng minh hin tưng ti n p 131
10. 2. c ơ ch Quá trình xâm nhi m c a phage vào vi khu n x y ra nh ư sau: Ti n p chuyn gen t vi khu n A sang B nh phage ðu tiên các phage bám trên b mt vi khu n. Sau 4’, phage bơm DNA ca nó vào t bào. Sau ñó chúng sinh sn và kho ng 1/2 gi sau thì chúng làm tan các t bào vi khu n và gi i phóng các phage mi. Khi DNA ca phage xâm nh p vào t bào vi khu n A, chúng ct DNA ca vi khu n A thành nhi u ñon ñng th i DNA ca phage ñưc sao chép ra nhi u phân t con và các v phage cũng ñưc to thành. Sau ñó các v lp ru t DNA vào, phá v t bào vi khu n ra ngoài và ti p tc xâm nhi m vào các t bào vi khu n khác. Trong quá trình lp ráp kho ng 1-2% phage vô tình mang ñon DNA ca vi khu n có ch a gen. Phage mang gen vi khu n A xâm nhi m vi khu n B, quá trình tái t hp xy ra làm gen vi khu n A gn vào b gen vi khu n B. Hinh 7.7 Chuyên gen tư vi khuân cho sang vi khuân nhân nhơ phage 132 132
11. 3. Phân bi t các dng t i n p - Ti np chung (general transduction): phage mang bt kỳ gen nào ca vi khu n A sang vi khu n B. T i n p chung có ñ c ñim: + Bt kỳ gen nào ca vi khu n c ũng ñ u ñưc t i n p + Ti n p do gói nh m DNA c a t bào ch khi phage tr ưng thành + Các th tái h p ñơ n b i ñưc t o ra - Ti np chuyên bi t (Special transduction) hay ti np hn ch : là quá trình t i n p ch chuy n mt vài gen nh t ñnh, nó có 4 ñc ñim: + Nh ng gen ñưc chuyn nm sát ch phage g n vào + Ch prophage ki u λ th c hi n + Do kt qu s ct sai ca prophage khi tách kh i NST ca t bào ch Ví d: phage λ (kí sinh trên E.coli) ch chuyn gen gal (ñng hóa ñưng galactose) t vi khu n này sang vi khu n khác. ðim gn ca phage λ vào b gen ca vi khu n nm gi a 2 gen gal (galactose) và bio (t ng hp biotin). ðu ca phage ch có th ch a mt lưng DNA gi i hn, nên khi prophage tách ra t DNA ca vi khu n nó ch ti np ñưc gen gal ho c bio. S ct sai ca phage λ rt hi m nên ti np hn ch có t n s th p. 133 133
12. Hình 7.8 T i n p chuyên bi t VI. Giao n p (Conjugation) - ðnh ngh ĩa: giao np là hi n tưng truyn vt ch t di truyn t t bào t h cho sang th nh n qua c u t bào ch t 134 134
13. Hình 7.9 S ơ ñô lai vi khuân 1. Ch ng minh có lai vi khu n Vào năm 1946, J. Lederberg và E. Tatum s dng các dòng ñt bi n khuyt dưng khác nhau: -Dòng A: có ki u gen met -bio-thr+leu+thi+ (có kh năng tng hp threonin, leucine, thiamin không có kh n ăng t ng h p methionin và biotin) - Dòng B: có ki u gen met+bio+thr-leu-thi- (có kh năng tng hp methionin, biotion nh ưng không có kh năng tng hp threonin, leucine, thiamin) Tng dòng riêng r khi cy lên môi tr ưng t i thi u thì không có kh năng mc lên khu n lc. Tr n chung hai dòng này trong ng nghi m, cy lên môi tr ưng ti thi u. Các khu n lc mc trên môi tr ưng ti thi u, ch ng t có các dng lai, chúng mc ñưc nh s bù ñp cho nhau nhu cu dinh d ưng. Các d ng lai có ki u gen met+bio+thr+leu+thi+. 2. S phân hóa gi i tính vi khu n 1953, Hayes ñã phát hi n ra vi khu n có các d ng khác nhau tươ ng + t gi ng ñ c và cái sinh v t b c cao. Các d ng ñó ñưc kí hi u là t bào F 135 135
14. và t bào F- . F+ tươ ng t gi ng ñc sinh vt bc cao, nó truyn sng F-. Tn s lai F+ vi F- kho ng 10 -6. Khi F+ ti p xúc vi F- mt th i gian, F- bi n thành F+ do nó nh n ñưc mt ph n t di truyn là episome. Episome F+ là ph n t di truyn ngoài NST, có th tn ti ho c dng DNA vòng tròn t sao chép ho c gn vào phân t DNA ca t bào ch . Episome F+ ñưc gi là nhân t gi i tính. V sau dng Hfr (high frequency ò recombination) ñưc phát hi n, dng này có t n s lai v i F- cao h ơn F+ có th ñ n 104 ln. Hình 7.10 Sơ ñô câu tao cua plasmid Pla smid ñưc ñnh ngh ĩa là phân t DNA vòng tròn nh c ó kh năng sao chép ñl p vi t bào ch và không có kh năng gn vào NST t bào ch . Plas mid có th mang mt s gen khác nhau. Hi n nay plasmid ñưc dùng cho c 2 ngh ĩa là episome và plasmid. Plasmid có th tn ti ñc lp ho c gn v ào b gen vi khu n. Bn ch t di truyn ca các dòng F - , F+ và Hfr ñưc xác ñ nh do các plasmid nh ư sau: F- không ch a plasmid F+ ch a plasmid d ng ñ c l p Hfr có plasmid g n vào b gen 136 136
15. Hinh 7.11. S ư găn cua plasmid vao nhiêm săc thê vi khuân tao vi khuân Hfr - Tai tô hơp giưa môt trinh tư IS trên plasmid va trinh tư IS cung loai trên nhiêm s ăc thê cua vi khun tao ra nhiêm săc thê Hfr - Tai tô hơp xay ra giưa IS bât ky trên plasmid vi IS bât ky tươ ng ưng trên nhiêm s ăc thê cua vi khun tao ra nhiu chung Hfr khac nhau 3. Các nhân t F ' và tính n p (Sexduction) 137
16. S ct ri nhân t F t NST ca dòng Hfr nhi u khi không chính xác và lúc này mt ñon b gen ca vi khu n thay th cho mt ph n ca F. Trong tr ưng hp này nhân t F' ñưc hình thành và nó có th chuyn gen ca vi khu n mt cách ñc lp vi các tính tr ng ca t bào th cho. Hi n tưng này còn gi là tính np, ngh ĩa là s chuyn gen kèm theo nhân t gi i tính. Nh tính np mà có th nh n ñưc nh ng th lưng bi tng ph n (merodiploid) theo các gen ñưc g n vào F+. 4. C ơ ch tái t h p Khi có s ti p xúc gi a hai lo i t bào khác du nh ư Hrf và F- ho c F+ và F-. Dòng t bào mang nhân t F+ ñưc coi là t bào ñc có kh năng to protein pilin, t protein này to ng giao np gi là pilus. S co li ca pilus ni 2 t bào làm chúng gn nhau. T bào F- ñưc coi là t bào cái, sau khi giao n p t bào F - tr thành t bào F +. Vi c chuyn gen ch th c hi n khi plasmid gn vào b gen ca vi khu n. Trong quá trình chuyn vt ch t di truyn sang F- thì DNA ca t bào ch sao chép và mch mi có Ori ñi ñu và F ñi cu i. Quá trình chuyn DNA t F+ sang F- có th b ng t quãng. Các gen a, b, c ñư c chu yn mt chi u t Hfr s ang F-. Dòng Hfr có tn s lai cao hơn nhi u vì plasmid ñã nm sn trong b gen. Còn F + ph i qua giai ñon plasmid g n vào b gen r i m i chuyn gen. 138 138
17. Hinh 7.12 Thi nghiêm giao nap ñê lâp ban ñô do ng ăt quang ơ cac khoang thơi gian khac nhau. S truyn DNA t t bào th cho sang t bào th nhân Trong ñiu ki n thí nghi m 370C, nguyên b gen ca t bào E.coli ñưc chuyn sang t bào nh n trong vòng 90 phút. Th ưng s giao np b ng t quãng gi a ch ng do cu pilus b gãy, lúc ñó t bào F- vn là t bào F-. Bng cách ng t quãng quá trình giao np mà bn ñ di truyn ca E.coli ñưc xây d ng nên có d ng vòng tròn. VII. Cơ s di truyn tính kháng thu c ca các vi khu n gây bnh ng ưi. Ý ngh ĩa c a các transposon vi khu n 139 139
18. Các transposon vi khu n là nh ng yu t làm thay ñi v trí gen, ki m soát tính kháng thu c ñi vi thu c kháng sinh và các thu c ch ng vi khu n khác. Chúng có th d dàng truyn t t bào này sang t bào khác. Ngay sau ñó, ng ưi ta ñã xác ñnh là các gen kháng thu c th ưng có trong plasmid. Các plasmid có th ñưc truyn t t bào m sang t bào con khi t bào va phân chia. Trong ñiu ki n th c nghi m cho th y 100% qu n th t bào nh y cm thu c ñu có th tr thành kháng thu c sau th i gian 1 gi ñưc tr n v i vi khu n kháng thu c. Các gen kháng thu c có th ñưc truyn t plasmid cho NST vi khu n, cho virus và c cho vi khu n các loài khác. Mi plasmid R ñu có t i thi u 2 thành ph n: - Mt ñon mang gen v truyn AD ti p hp (t ươ ng t nh ư transposon c a plasmid F) - Mt ñon mang gen kháng thu c ðon th nh t gi là yu t làm vt truyn tính kháng (RTF - Resistance transfer vector). ðon th hai mang gen kháng ñưc gi là yu t kháng R (R - determinant). mt s plasmid R, yu t kháng R ñưc cài gi a các ñon xen IS. Trong nhi u tr ưng hp chúng làm cho yu t kháng vn ñng t plasmid R này sang plasmid R khác. Các ñon IS thúc ñy s ti n hóa nhanh ca các plasmid vi khu n ngày càng mang nhi u yu t kháng thu c. Không ph i nh ng plasmid này ch ñưc truyn ñi trong ph m vi mt loài vi khu n. Mà chúng còn ñưc truyn qua các loài và c các dòng di truyn khác nhau ca vi khu n. Ví d: plasmid R ca E.coli ñã ñưc phát hi n mt s gi ng nh ư proteus, Samonella, Haemophilus, Pastugella Tt c các loài này ñu là loài gây b nh. Ngày nay ng ưi ta th y tn s tăng lên rõ rt ca các vi khu n mang plasmid R vi yu t kháng R có sc kháng ghê gm vi các thu c kháng sinh: penicylin, tetracylin, streptomycin và kanamycin. Các nghiên cu Nht Bn cho bi t trong vòng 10 năm tr li ñây, qu n th vi khu n t nhiên (trong cng, rãnh, h, ao b ô nhi m) tăng hn lên, t tn s th p là dưi 1% plasmid R có s kháng thu c lên ñn tn s cao là 50-80%. 140 140
19. Các kt qu nêu trên cho th y, cn hn ch và lưu ý ch s dng kháng sinh khi có nhi m trùng và không nên lm dng ñi vi các tr ưng hp nh . Nu không hn ch thì trong tươ png lai thu c s gi m hi u qu ho c không còn hi u qu . Tính kháng thu c ngày nay ñã ñưc phát hi n trong nhi u lo i gen gây bnh nh ư gen th ươ ng hàn, viêm d dày, ru t, dch hch, s t cao, viêm màng não, lu Câu hi ôn t p 1. Phân bi t các nòi vi khu n F+, F- và Hfr E. coli 2. Trình bày c ơ ch bi n n p 3. Phân bi t t i n p chung và t i np ñc hi u. 4. So sánh bi n n p và ti n p. 5. Th tái t hp các gen khác nhau theo th i gian xy ra trong giao np nh ư th nào? 6. ðc ñim c a tái t hp vi khu n. 7. T bào F- hình thành t bào F+ và t bào Hfr nh ư th nào? 141
20. 142 142
21. Ch ươ ng 8 Di truyn hc Virus Mc tiêu c a ch ươ ng Gi i thi u s di truyn ca th c khu n th , nghiên cu s sp xp các gen, các ñc tính ca virus và, trên cơ s bn ch t ca genome ca virus ñã xác ñnh ki u sao chép. Ni dung I. Di truyn h c th th c khu n (Bacteriophage hay phage) 1. S hình thành v t tan và các th ñ t bi n phage Phage ñưc phát hi n d dàng vì trong chu trình tan, mt t bào b nhi m phage v ra và gi i phóng các h t phage vào môi tr ưng (Hình 8.1) . S t o thành các ñm ñã ñưc quan sát. Mt s ln t bào vi khu n (kho ng 108 t bào) ñưc trãi lên trên môi trưng ñc. Sau mt th i gian sinh tr ưng, to mt lp t bào vi khu n màu tr ng ñc. Nu phage có mt th i ñim vi khu n ñưc trãi lên môi tr ưng, nó s nhi m vào t bào vi khu n. Sau ñó t bào nhi m phage b làm tan và gi i phóng nhi u phage mi. Th h sau này ca phage li nhi m vào vi khu n gn ñó, và tham gia vào chu trình tan khác, các vi khu n này b v gi i phóng ra nhi u phage, chúng có th nhi m vào các vi khu n khác vùng lân cn. Chu trình xâm nhi m ca phage ñưc ti p tc và sau nhi u gi , phage phá hu t t c các t bào vi khu n ca mt vùng, to ñm (plage) trong su t khác v i l p t bào vi khu n màu tr ng ñc. 143
22. T bào không b xâm nhi m Phân hy t Phage hp ph bào ch lên t bào ch Phage t do Phage lp Chu trình ghép bên sinh tan trong t bào ch Nucleic acid ca phage Phage Vt ch t di protein Nucleic acid tru n t ca phage bào ch b xâm nhp phá h y vào t bào Protein ca phage ñưc t ng h p, acid nucleic ñưc nhân lên, v t ch t di truy n t bào ch b phá hy Hình 8.1. Chu trình sinh tan c a bacteriophage Hình 8.2. S xâm nh p c a phage vào t bào v t ch theo c 2 d ng b m ñng th i. r+: ñm nh , r-: ñm l n, h+: ñm m , h-: ñm trong 144
23. Phage ch có th ñưc nhân lên ch khi sinh tr ưng trong t bào vi khu n, vì vy làm cn ngu n dinh dưng trong môi tr ưng sinh tr ưng, làm hn ch s nhân lên ca phage và kích th ưc ca ñm. Vì mi ñm là kt qu ca s nhi m mt ht phage ban ñu, có th ñm ñưc s lưng các ñm riêng bi t có trên môi tr ưng (Hình 8.2). Ki u gene ca các th ñt bi n phage có th ñưc xác ñnh nh nghiên cu các ñm. Trong mt s tr ưng hp, s xu t hi n ca các ñm là ñy ñ. Ch ng hn, ñt bi n phage làm gi m s lưng phage th h sau t nh ng t bào b nhi m th ưng to ñm nh hơn. Các ñm ln có th ñưc to ra bi các ñt bi n gây ra s tan sm các t bào b nhi m, nên mi ñm ñó ti p tc nhi m nhanh hơn. Ki u ñt bi n khác ca phage có th ñưc xác ñnh bi phage có kh năng ho c không có kh năng to ñm trên nh ng ch ng vi khu n ñ c bi t. 2. Tái t h p di truy n trong m t chu k ỳ sinh tan (Lytic cycle) 2.1. Chu trình tan (Lytic cycle) Hinh 8.3 S ư kêt hơp ñâu va ñuôi ñê tao phage hoan chinh 145
24. Các bacteriophage làm cht t bào ch gi là ñc, chúng sinh sn theo chu trình tan. Chu trình bt ñu khi si ñuôi ca phage gn vào ñim nh n b b ngoài ca E.coli. ng ñuôi co li to l th ng xuyên vách t bào và b ơm DNA c a nó vào. Capside ca phage còn li bên ngoài t bào. Sau khi b nhi m các t bào E.coli có quá trình phiên mã và dch mã các gen ca virus. Phage T4 có kho ng 100 gen và ph n ln ñã ñưc bi t rõ. Mt trong nh ng enzyme ñưc to ra ñu tiên ct DNA ca t bào ch . DNA ca phage ñưc phiên mã ñu tiên nh DNA polymerase ca t bào ch to ra mARN sm. Các mARN mu n hơn có th ñưc tng hp bi ARN polymerase ca phage ho c ARN polymerase ca vi khu n b bi n ñi ñ phiên mã các gen ca phage. Các mARN mu n ñưc dch mã to các lo i protein enzyme ñiu hòa và cu trúc. Các protein ñiu hòa ca phage ki m soát s phiên mã ni ti p c a các gen. Khi DNA ca t bào ch b phân hy, b gen ca phage ki m soát toàn b ho t ñng ca t bào ñ to ra các cu ph n ca nó. DNA ca phage ñưc sao chép ra hàng tr ăm bn sao. Các protein ca capsid ñưc tng hp thành 3 ph n riêng: ñu, ng ñuôi và các si ñuôi. Chúng t ráp vi nhau thành các virion con. Phage hoàn tt chu trình khi enzyme lysozyme ñưc to ra ñ tiêu hóa vách t bào vi khu n. T bào vi khu n b v, 100-200 virion thoát ra và chúng có th lp li chu trình mi. Toàn b chu trình t lúc phage ti p xúc ñn tan di n ra trong kho ng 0 20-30 phút 37 C. Trong th i gian ñó s lưng phage T4 tăng hơn c 100 ln, trong khi ñó s lưng t bào E.coli mc nhanh nh t cũng ch tăng gp ñôi. Ph n ln các phage ñc theo chu trình va nêu trên. Tuy nhiên có mt s ngo i l nh ư phage si M13 ca E.coli hu nh ư không bao gi làm ch t ho c làm tan t bào. Các t bào vi khu n và các phage kí sinh có s ñng ti n hóa. Các t bào vi khu n có các cơ ch bo v nh ư bi n ñi màng t bào ñ phage không bám vào ñưc ho c các enzyme ct hn ch ct DNA ca phage. Phage c ũng bi n ñ i ñ xâm nh p ñưc vào t bào vi khu n. Các phage tuy có kích th ưc nh bé ph i nhìn dưi kính hi n vi ñin t mi th y ñưc. Nh ưng các tính tr ng ca phage ñưc quan sát da theo các v t tan ho c biên ñ ch . Cho hai dòng phage T4 có ki u gene khác nhau nhi m vào mt t bào vi khu n E.coli, mt vài phage th h sau s th c hi n 146
25. - - tái t hp di truyn. Allele r tan nhanh, kt qu to ra ñm ln, allele h nhi m vào các t bào ch , k t qu t o ñ m trong. Phép lai nh ư sau: - + + - r h × r h Kt qu thu ñưc bn ki u ñm. Hai ki u ñm ñc, ln và ñm trong, nh tươ ng ng vi ki u hình ca phage b m. Hai ki u hình khác, ñm trong ln, ñm m nh là dng tái t hp tươ ng ng ki u gene r-h- và r+h+. Khi nhi u vi khu n b nhi m s dng tái t hp thu n ngh ch th ưng ñưc tìm th y trong s các phage th h sau. Trong thí nghi m, mi ki u gene trong s bn ki u gene trên sinh ra ki u hình khác nhau v dng ñm (Hình 8.2) . S lưng ki u gene có th xác ñnh ñưc bng ki m tra các ñm to thành. T n s tái t h p, ñưc bi u di n d ưi dng ph n tr ăm, ñưc xác ñ nh nh ư sau: S äúphagetaïitäø h åüp Tn s tái t h p = × 100 Täø nsgäúphage 3. S s p x p c a các gene trong nhi m s c th phage Tn s tái t hp có th ñưc s dng ñ xác ñnh kho ng cách ca bn ñ Eukaryote. Các thí nghim lp bn ñ cho th y ñt bi n T4 ñưc lp bn ñ thành 3 cm riêng bi t. C ba cm này có liên kt vi mt cm khác. George Streisinger và cng s (1964) ñã ch ng minh bn ñ di truyn ca phage T4 có d ng vòng tròn. Trong mi phép lai, lp ba ñn bn marker di truyn ln lưt vi mi nhóm và ti n hành qua toàn b genome ca T4. Nhi u gene khác ñã ñưc xác ñnh và lp bn ñ ñy ñ trên phân t vòng tròn (Hình 8.3) . Nh ng vùng vòng tròn bên trong là 3 cm ca marker T4 ñã ñưc xác ñnh và lp bn ñ di truyn. Vòng ngoài có mt ca nhi u b marker ln to thành toàn b vòng tròn ca bn ñ di truyn. Bn ñ di truyn phage T4 cho th y gene ca phage T4 to cm m rng theo ch c năng ca chúng. Ch ng hn có cm ln các gene dùng cho sao chép DNA v trí ph n tư bên trên phía ph i và có cm gene tng hp các cu ph n to nên ñu ca phage phía dưi c a vòng tròn. Phân t DNA ca phage T4 là phân t si ñơ n dng th ng, mi ñu tn cùng ca DNA phage T4 ñưc nhân lên ho c lp ñon ñu cu i (terminal redundant). Do vy, mi phân t DNA có kích th ưc tăng thêm 2%. Khi DNA ñưc sao chép trong t bào, s tái t hp gi a các ph n ñu 147
26. tn cùng ca b gen T4 vi nh ng trình t tươ ng ñng ca b gen T4 khác, kt qu to ra sn ph m DNA có kích th ưc ln hơn kh năng ch a ca ph n ñu. Nh ng phân t ch a lp ñon ñưc to thành vì s tái t hp trong b gen ca phage T4 xy ra th ưng xuyên, trung bình có kho ng 20% s ki n tái t hp xy ra trên mt nhi m sc th . Khi phân t DNA ñưc gói vào ph n ñu, nó ñưc ct bng enzyme ch còn ch a kho ng 102% ca chi u dài b gen phage T4, vì có ch a ñon l p l i ca ph n ñ u. Màng Si ñuôi Trao ñi Tng hp nucleotide DNA, tái bn và thay ñi Nhóm gen liên kt xác ñnh ngun g c ðĩa g c c a ñuôi ðu, c , np gp c ðĩa g c c a ñuôi ðu Hình 8.4. B n ñ di truy n c a T4 v i các marker 4. L p b n ñ c u trúc tinh vi vùng rII c a phage T4 Các nghiên cu chi ti t v các ñt bi n rII ca phage T4 làm sáng t hơn v c u trúc gene. Phage T4 dng hoang di r+ có kh n ăng nhi m ñ ng th i hai nòi E.coli B và K. Các ñt bi n rII ch nhi m nòi B nh ưng không nhi m nòi K. Seymour Benzer (1955) ñã nh n ñưc 2400 ñt bi n rII có ngu n gc ñc lp vi nhau. Ông ñã cho lai các ñt bi n vi nhau và căn c vào s xu t hi n các d ng tái t hp hoang di r+ mà lp bn ñ các ñim ñ t bi n. Mi ñt bi n có th tái t hp vi các ñt bi n khác. ðt bi n mt ñon ng ăn cn s tái t hp vi hai ho c nhi u ñt bi n ñim các v trí khác nhau ca gene. Mi mt ñon làm mt mt ph n b gene ca phage 148
27. bao gm c vùng rII. S dng ñt bi n mt ñon là ph ươ ng pháp ñơ n gi n ñ lp bn ñ ca hàng ngàn ñt bi n. Bn ñ mt ñon (Deletion mapping) da trên s có ho c không có dng tái t hp. Trong bt kỳ phép lai nào gi a m t ñt bi n ñim ch ưa bi t và mt ñt bi n m t ñon, s xu t hi n c a dng hoang di cho th y ñt bi n ñim nm ngoài vùng mt ñon. Ng ưc li, nu ñt bi n ñim xu t hi n trong vùng mt ñon, không xu t hi n dng tái t h p ki u hoang d i th h sau. rII A cistron rII B cistron Kho ng cách t A1 ñ n B ñưc xác ñ nh bng mt ñon các kho ng 1272 qua 638 Kho ng cách t 1 ñ n 47 ñưc xác ñnh bng mt ñon khong 1364 qua 1519 Hình 8.5 ðt bin mt ñon ñưc s d ng ñ chia locus rII c a bacteriophage T4 thành 7 vùng và 47 ti u vùng nh Nhi u phép lai ñã ñưc th c hi n ñ lp bn ñ ñt bi n chi ti t gene rII. Kho ng cách t A1 ñn A6 và B ñưc trình bày hình 8.4 . Mt ñt bi n ñc bi t ñã ñưc ki m tra ñnh v vùng A4. ðt bi n này không tái t hp to dng ki u di trong phép lai vi các ñt bi n mt ñon ln nh ư r1272, r1241, rJ3 và rPT1 nh ưng nó có th tái t hp to dng ki u di trong phép lai vi rPB242, rA105 và r638. Các ñt bi n ñưc to ra bi cùng mt khuôn, kt qu lai vi các ñt bi n mt ñon ln s ñưc xp vào vùng A4. Bn ñ di truyn trong vùng A4 có th ñưc to ra bi mt b các ñt bi n 149
28. mt ñon ñưc trình bày ph n dưi ca hình 8.5 . Xác ñnh 7 ti u vùng trong A4 (t a qua g). rII A cistron rII B cistron Vùng xác ñnh ñt bin mt ñon t A1 ñn A6 và B trong gen rII ðt bin trong vùng b s to ra dng tái t Mt ñon vùng xác hp hoang di vi tt c các mt ñon mà ñnh a ñn g c a trong ñó vùng b c a d ng hoang d i có mt vùng A4 Hình 8.6 Xác ñnh vùng rII liên quan vi các marker di truyn dng th ng ca bn ñ di truyn phage T4 Ví d, mt ñt bi n trong vùng A4 kt qu tái t hp to dng ki u di vi ñt bi n mt ñon r1368, nh ưng li không th th c hi n ñưc vi ñt bi n r221 s ñưc sp vào ti u vùng c. mc ñ chi ti t hơn, các ñt bi n trong mt ti u vùng ñưc sp xp nh lai gi a chúng vi nhau. phage T4, các ñim ñt bi n rt gn nhau, ñưc tách nhau nh tái t hp. 1% tái t hp tươ ng ng vi kho ng cách kho ng 100 bp. Vì vy, bt kỳ hai ñt bi n không th tái t hp ñưc vi nhau có th ñưc xp vào cùng v trí trong gene. Bn ñ di truyn cho s ln các ñt bi n rII có ngu n gc ñc lp ñưc mô t hình 8.6. Nghiên cu ñt bi n vùng rII và lp bn ñ di truyn có vai trò quan tr ng, qua ñó có th rút ra các k t lu n sau: + S trao ñi di truyn có th xy ra trong gene và có th gi a các nucleotide g n nhau. 150
29. + Các ñt bi n không ñưc to ra cùng tn s vi tt c các ñim trong gene, chúng phân b không ñu nhau. Ch ng hn, 2400 ñt bi n rII ñã ñưc xác ñnh ch 304 ñim. Mt trong nh ng ñim này có th có ñn 474 ñt bi n (Hình 8.6) . Nhũng ñim có tn s ñt bi n cao nh ư th ñưc gi là các ñim nóng (hotspot mutation). nh ng ñim khác, ñt bi n ñưc ph c hi m t l n ho c vài l n. Mi hp th hi n s xut hi n ngu nhiên ca các ñt bi n t i v trí ñó "ðim nóng" ñt bi n Nhi u ñt bi n xu t hi n mt ñim t o thành mt "ñim nóng" Hình 8.6 Bn ñ di truyn locus rII c a phage T4 Kt qu phân tích vùng rII rt quan tr ng, giúp cho chúng ta phân bit ñưc 3 khái ni m v gene. Ph bi n nh t, gene liên quan vi mt ñơ n v ch c năng. ðiu này tươ ng ng vi mt ñon DNA mã hóa cho mt phân t protein. Benzer ñư a ra thu t ng cistron ñ ch ch c năng này, thu t ng cistron th nh tho ng vn ñưc s d ng. ðơn v ch c n ăng ñưc xác ñnh qua th nghi m b sung (complementation test), xác ñnh ñưc 2 ñt bi n có allele v i nhau không. Tr ưc thí nghi m ca ông rII ñưc coi là mt locus. Thí nghi m cho th y các ñt bi n xp thành hai nhóm rIIA và rIIB. Lai các ñt bi n rIIA × 151
30. rIIB s có r+, nh ưng lai rIIA × rIIA và rIIB × rIIB thì thu ñưc ki u hình ñt bi n r. Ngoài ngh ĩa là ñơ n v ch c năng, gene còn là ñơ n v tái t hp (recon) và ñơ n v ñt bi n (muton). C hai ñơ n v này, ñu tươ ng ng vi nh ng nucleotide riêng l trong gene. 5. Tính ti m tan (Lysogeny) và phage λ Chu trình ti m tan bt ñu khi phân t DNA ca phage λ gn vào nhi m sc th ca vi khu n và ti n hành sao chép nh ư mt ph n nhi m sc th vi khu n. Các ht phage không ñưc to thành. Phân t DNA ca phage ñưc gn vào b gen ca vi khu n ñưc gi là prophage, t bào vi khu n sng sót ñưc gi là t bào ti m tan (lysogen). Mt ch ng ti m tan cho phage λ ñưc ký hi u theo tên ca phage. Ví d ch ng E. coli K12(λ) là ch ng K12 tr thành t bào ti m tan ca phage λ. Phage Phage t n công t Mt s prophage t n ti trên NST bào ch và b ơm vi khun, kh i ñ u cho chu trình sinh tan Phage DNA DNA vào Nhi u t bào phân chia to ra khun lc vi NST vi khun khun có ch a prophage Chu trình Chu trình T bào b sinh tan Tái t o vòng ti m tan phân gi i, DNA phage T bào vi khu n gii phóng phân chia bình phage Prophage thưng, sao chép prophage và truyn cho th h sau DNA và protein c a phage ñưc DNA ca phage tích hp vào tng h p và l p ghép to thành NST vi khun to thành dng phage mi prophage Hình 8.7 Chu trình tan và ti m tan phage λ Phân t DNA ca phage λ có ñu các ñu cu i ch a 12 nucleotide không kt cp, mà dng si ñơ n to ñu dính (cohesive end) b sung. Khi vào t bào, ñu cu i b sung gn li to phân t vòng tròn. S to vòng tròn xy ra sm c chu trình tan và chu trình ti m tan (Hình 8.7) . Có kho ng 75% t bào vi khu n b nhi m phage, phân t DNA vòng tròn sao chép và 152
31. chu trình tan xy ra ti p theo. Còn kho ng 25% t bào b nhi m, phân t DNA vòng tròn ca phage λ và phân t DNA vòng tròn ca E. coli tươ ng tác và xy ra tái t hp ñim chuyên bi t (site-specific recombination) và DNA c a phage gn vào nhi m sc th c a vi khu n. V trí ca tái t hp ñim chuyên bi t DNA ca vi khu n và phage ñưc gi là ñim gn vào ca vi khu n và phage (bacterial and phage attachment sites). Mi ñim gn có ch a 3 ñon: ñon trung tâm có cùng trình t nucleotide c 2 v trí gn và là vùng mà s tái t hp th c s xy ra. ðim gn vào ca phage ñưc ký hi u bi POP’ (P: phage) và ñim gn vào vi khu n ñưc bi u di n bng BOB’ (B: bacteria). So sánh bn ñ di truyn ca phage và prophage POP’ nm gn vùng trung tâm ca phân t DNA dng th ng. Mt protein ca phage, integrase, xúc tác cho tái t hp ñim chuyên bi t. Enzyme integrase nh n ra ñim gn vào ca phage và vi khu n, gây ra s trao ñi vt lý, kt qu là phân t DNA ca phage gn vào phân t DNA ca vi khu n. Kt qu ca s tái t hp làm bn ñ di truyn ca prophage khác vi bn ñ di truyn ca phage. Bn ñ di truyn prophage là s chuyn ñi vòng tròn bn ñ di truy n phage t do. Prophage ñưc chèn vào nhi m sc th ca E. coli gi a gene gal và gene bio. S chèn vào ca phage λ làm tăng kho ng cách gi a gene gal và gene bio. Kho ng cách gi a gene gal và gene bio t bào ti m tan vi phage λ là kho ng hai phút so v i m t phút t bào không ti m tan. Hình 8.8 Mô hình gn c a phage λ vào NST c a E.coli 153
32. Khi t bào ti m tan, các gene ca phage tr thành mt ph n nhi m sc th ca vi khu n vì vy có th làm ki u hình ca vi khu n b thay ñi. Nhưng hu ht các gene ca phage prophage ñu ñưc gi tr ng thái bt ho t nh protein repressor - sn ph m ca gene phage. Protein repressor ñưc b t ñu tng hp nh s nhi m vào ca phage và nó ñưc ti p tc tng hp nh prophage. Gene mã hóa cho repressor th ưng ch là gene ca prophage ñưc bi u hi n chu trình ti m tan. Nu t bào ti m tan b nhi m bi phage gi ng vi prophage, s có mt ca repressor trong prophage ng ăn cn s bi u hi n các gene ca phage nhi m vào. Tính kháng vi nh ng phage gi ng vi prophage ñưc gi là tính min nhi m (immunity). ðây là tiêu chu n ñ xác ñnh t bào vi khu n ch a phage ñc bi t. Ch ng hn phage λ không to ñm trên vi khu n ch a prophage λ. Trong t bào ti m tan, s sao chép không gi i phóng các phage mi. Tuy nhiên, các prophage ñôi khi tr nên có ho t tính, tr i qua chu trình tan, to ra s lưng ln phage th h sau. Hi n tưng này ñưc gi là s cm ng prophage (prophage induction), nó ñưc bt ñu bng s hư hi DNA ca vi khu n. ðôi khi prophage có th tách ra kh i DNA ca vi khu n mt cách ng u nhiên nh ưng th ưng nó ñưc gây ra do các tác nhân ca môi tr ưng nh ư hóa ch t ho c chi u x. Kh năng b cm ng là mt thu n li cho phage bi vì DNA ca phage có th thoát kh i t bào b hư hi. Cơ ch sinh hóa ca s cm ng là ph c t p nh ưng s thoát ra c a phage x y ra d dàng. S ct ra ca phage là s tái t hp ñim chuyên bi t khác, ng ưc vi quá trình gn vào. S ct này yêu cu enzyme ca phage, integrase thêm protein c a phage là excisionase. Nghiên cu di truyn ca s g n vt lý cho th y escisionase gn vi integrase và sau ñó nh n ra ñim gn vào ca prophage BOP’ và POB’, gn vi các ñim này. Integrase ct trình t O và t o ra l i BOB’ và POP’. Quá trình tách di n ra ng ưc l i v i s g n vào. II. ðc tính c a các virus 1. Tính ña d ng v c u trúc và thành ph n di truy n Virus có b gene rt ña dng. B máy di truyn ca virus có th là DNA mch kép (double strand - dsDNA), DNA mch ñơ n (single strand - ssDNA), RNA mch kép (dsRNA) hay RNA mch ñơ n (ssRNA). B gene RNA ca virus là mt phân t ho c mt ñon, si ñơ n phân cc mch (+) ho c mch (-), có th dng vòng tròn hay dng th ng. Virus nh nh t có nh t có kho ng 4 gene, virus ln có kho ng vài tr ăm gene. B gene ca 154
33. virus cu trúc ña dng nh ưng ñu ñm bo yêu cu chung là ph i sao chép ñưc trong t bào ch to ra c genome cho lp ráp virion th h sau và các mRNA ph i tng h p protein c a virus. 2. Tính ñc thù v v t ch (Host specificity) Mi ki u virus có th nhi m và kí sinh ch mt biên ñ gi i hn ca t bào ñưc gi là biên ñ ch (host range). Các virus nh n bi t t bào ch theo nguyên tc “ng khóa và chìa khóa” các protein bên ngoài ca virion lp va các ñim nh n trên b mt t bào. Mt s virus có biên ñ ch rng ñ ñ xâm nh p vào vài loài. Ch ng hn, các virus bnh di có th nhi m nhi u loài có vú gm gm nh m, chó và ng ưi. Biên ñ có th rt hp nh ư nhi u phage ch nhi m vi khun E. coli . III. Tái b n c a các virus Bn ch t genome ca virus xác ñnh ki u sao chép. Virus ñưc phân lo i d a trên các ñc ñim: - Phân lo i theo bnh: chia ra virus gây bnh ng ưi, ñng vt và cây tr ng Vn ñ ch yu ñi vi h th ng phân lo i này là nhi u lo i virus khác nhau li gây ra cùng mt tri u ch ng. Ch ng hn, s nhi m trùng hô hp v i st có th ñưc gây ra do nhi u virus khác nhau. - Phân lo i theo hình thái: phân lo i virus cơ bn da trên cu trúc ca ht virus. Ki u phân lo i này có hn ch trong phân bi t gi a các virus có hình thái t ươ ng t nh ưng gây ra tri u ch ng b nh khác nhau. - Phân lo i theo ch c năng: trong nh ng năm gn ñây, nhi u nghiên cu ñưc ti n hành da trên ph ươ ng th c sao chép ca virus. Cn xác ñnh thành ph n và c u trúc genome c a virus và t ñó xác ñ nh cách sao chép. Ki u t bào b nhi m bi virus có nh hưng quan tr ng ñi vi quá trình sao chép. ði v i virus c a prokaryote, s sao chép ph n ánh m i quan h m rng ñơ n gi n ca các t bào ch . ði vi virus ca t bào eukaryote, vn ñ ph c tp hơn. Kh năng mã hoá ca genome bu c virus ch n mt ph ươ ng th c sao chép. Ph ươ ng th c sao chép ca virus ph thu c vào bn ch t vt li u di truyn ca chúng. V ph ươ ng di n này, virus ñưc chia thành 7 nhóm: Nhóm I: Virus ch a DNA s i ñôi. Nhóm này ñưc chia nh thành hai lo i: 155
34. + Sao chép là ch ca nhân. S sao chép ca các virus này ph thu c tươ ng ñi vào các yu t c a t bào. + Sao chép xy ra trong t bào ch t. Nh ng virus này có liên quan vi các yu t cn thi t cho phiên mã và sao chép genome ca chúng và vì vy ph thu c nhi u vào b máy t bào. Nhóm II: virus ch a DNA si ñơ n. S sao chép xy ra trong nhân liên quan s to thành qua trung gian si kép ñưc xem nh ư là khuôn cho tng hp li DNA s i ñơn th h sau. Nhóm III: virus ch a RNA si kép. Nhng virus này có b gene ñưc chia ñon. Nhng ñon này ñưc phiên mã riêng ñ to ra các monocistronic mRNA. Nhóm IV: Virus ch a RNA si ñơ n mch (+), có th chia nh thành 2 nhóm: + Virus v i polycistronic mRNA. RNA genome to ra mRNA, phân t này dch mã to sn ph m là mt polyprotein, th ưng ñưc phân ct ñ to các protein tr ưng thành. + Virus phiên mã ph c tp. Cách dch mã (nh ư Togavirus) ho c các RNA c a subgenome (Tobamovirus) cn thi t ñ t o RNA c a b gene. Nhóm V: Virus ch a RNA si ñơ n mch (-), genome ca virus này ñưc chia thành 2 nhóm: - Genome không chia ñon (Mononegvirales). Bưc ñu tiên trong sao chép là phiên mã RNA si (-) ca genome nh RNA polymerase ph thu c RNA ca ht virus ñ to ra monocistronic mRNA, ñưc xem là khuôn cho sao chép genome. - Genome ñưc chia ñon (Orthomyxoviridae). Sao chép xy ra trong nhân vi monocistronic mRNA cho mi gene ca virus ñưc to ra nh enzyme transcriptase t genome ñy ñ c a virus. Nhóm VI: Virus ch a mRNA si ñơ n mch (+) qua trung gian DNA. B gene ca retrovirus là mRNA mch (+) nh ưng dng lưng bi. Chúng không tr c ti p to ra mRNA mà phiên mã ng ưc t o DNA. Nhóm VII: DNA si ñôi qua trung gian RNA. Virus nhóm này da vào enzyme phiên mã ng ưc, nh ng khác vi retrovirus, quá trình này xy ra bên trong h t virus trong sut quá trình tr ưng thành. 156
35. Si RNA (-) virus b phân ct Phân t duy nh t 5' C C C C Tng h p mRNA Tng h p mRNA 3' 5' 3' 5' si RNA (-) genome Tái b n Tái b n 5' 3' 5' 3' si (+) có chi u dài ñy ñ si RNA (-) 3' 5' 3' 5' genome Si RNA (+) virus Alphaviruses Flavi và picornaviruses C C si RNA (+) 5' 5' genome Tái b n Tái b n (mRNA) 3' 5' 3' 5' si (-) có chi u dài ñy ñ C Tng hp mRNA 5' C 5' 5' C si RNA (+) genome (mRNA) Ambisence RNA virus RNA virus si ñôi si (+) 5' C C RNA si (-) 3' 5' 5' genome Tng h p Tng hp mRNA mRNA C 5' mRNA C C 3' 5' 3' 5' 3' 5' Anti Si (+) có chi u dài -genome ñy ñ (mRNA) Tng h p RNA Tái b n mRNA Dch mã C 5' mRNA si (+) 5' C Protein si (-) 3' 5' RNA genome Hình 8.9 Sao chép RNA c a virus 157
36. 1. Các virus c a vi khu n Có 3 pha b t ñ u cho xâm nhi m c a virus. - B t ñ u nhi m - Sao chép và bi u hi n genome c a virus - Gi i phóng các virion tr ưng thành t t bào b nhi m Bacteriophage ñưc thêm vào nuôi cy vi khu n ñang sinh tr ưng mnh và sau mt vài phút nuôi cy b gi m, ng ăn cn tươ ng tác gi a các ht phage và t bào. Ngay sau khi làm gi m nuôi cy, có giai ñon kho ng 10- 15 phút không phát hi n th y các ht phage, ñây là giai ñon che khu t (eclipse period). ðiu này xy ra mt th i gian sau khi nhi m vào t bào, liên quan vi genome ca chúng nh ư là ñiu ki n tr ưc tiên cho sao chép. giai ñon này không có s nhi m na vì vy không th phát hi n nh vt ñm. Giai ñon mu n là th i gian tr ưc khi ht virus mi ñu tiên xu t hi n và kho ng 20-25 phút cho hu ht các bacteriophage. Kho ng 40 phút sau khi t bào b nhi m, ñưng cong v s lưng ht virus tng s và virus ngo i bào hp nhau thành mt vì lúc này, t bào b nhi m làm tan và gi i phóng các ht phage ngo i bào. Các bacteriophage làm ch t t bào ch gi là ñc (virulent) và chúng sinh s n theo chu trình tan Các virus ôn hoà (temperate virus) có th sinh sn mà không là ch t t bào ch . Chúng có hai kh năng sinh sn: chu trình tan và chu trình ti m tan không làm ch t t bào ch . Chu trình sng b t ñu khi phage gn vào b m t t bào E. coli và bơm DNA vào trong gây nhi m. DNA ca phage sau khi vào t bào to DNA vòng tròn và s tham gia vào mt trong hai chu trình. DNA ca phage có th ho c tham gia vào chu trình ti m tan ca phageT4 ho c gn vào nhi m sc th ca vi khu n nh tái t hp ñim chuyên bi t ñ bưc vào chu trình ti m tan. 2. Các virus th c vt Hu ht virus th c vt có genome RNA, tuy nhiên 2 nhóm virus th c vt ñưc nghiên cu nhi u nh t có ch a genome DNA: Cauliflower mosaic virus (CaMV) và gemini virus. - Các virus RNA Ph n ln virus th c vt có b gene RNA si ñơ n mch (+) và nhi u dng có capsid hình que, các protein capsomer hình xon. 158
37. + Tobacco mosaic virus (TMV) Genome TMV là RNA si ñơ n. Genome ca chúng mã hoá ít nh t 4 chu i polypeptid. Protein 130 và 180 kDal ñưc dch mã tr c ti p t cùng mt codon bt ñu trên RNA b gene. Hai protein khác, 30 kDal và protein v ñưc dch mã t ñon RNA. Protein 130 và 180 kDal liên quan vi sao chép virus, trong khi ñó protein 30 kDal c n cho s di chuyn ca virus t t bào này ñn t bào khác. Vì vy 3 lo i protein này cn cho s nhân lên ca virus trong toàn b cây. - Các virus DNA Virus th c vt có b gene DNA r t hi m, ch g m 2 nhóm: + Cauliflower mosaic virus: CaMV ñưc nghiên cu nhi u nh t trong nhóm Caulimovirus. ðây là nhóm virus dng cu, ch a genome DNA vòng tròn, mch kép, kích th ưc kho ng 8 kb. Caulimovirus gây ra mt s bnh làm thi t hi kinh t cy tr ng. Chúng có ph vt ch hn ch , ch nhi m cây 2 lá mm. DNA ca CaMV có cu trúc không bình th ưng, có 3 ñim gián ñon trên si kép, hai ñim trên mt si và mt ñim trên si còn li vi nh ng vùng trình t overlap. Ngoài ra DNA CaMV có ribonucleotide gn vi ñu cu i 5’ ca ñim gián ñon. T các nghiên cu CaMV, Hull và Covey (1983), Pfeiffer và Hohn (1983) cho rng sao chép CaMV liên quan vi phiên mã ng ưc qua trung gian RNA ca b gene. Chu trình sao chép gi ng vi retrovirus và hepatitis B virus. + Gemini virus: Gemini virus là nhóm virus có ph xâm nhi m rng, c cây mt lá mm và 2 lá mm.Virus sc vn lá ngô (maiz streak virus – MSV) là mt gemini virus lây nhi m qua lá, ñưc truyn do côn trùng. B gene ca geminivirus ch a phân t DNA vòng tròn si ñơ n. Sao chép DNA virus ñưc ngh ĩ là xy ra nh trung gian DNA và genome ca virus sao chép cho nhi u bn sao trong nhân ca nh ng t bào tăng sinh nhanh. Virus gây ra s c ch sinh tr ưng và lá có sc vàng ca nh ng cây ngô b nhi m. 3. Các virus ñng v t Chu trình sao chép ca virus ñng vt có nhi u ñim tươ ng t vi các virus khác vi nhi u bi n dng ñáng k. Virus ñng vt th ưng có promoter mnh, có th áp d ng cho bi u hi n gene. Trong nhi u tr ưng h p, chúng có kh năng sao chép genome ca chúng vi s lưng ln bn sao trong t bào. 159
38. Mt s virus ñng vt nh ư retrovirus gn DNA ca chúng vào nhi m sc th t bào ch nh ư là m t ph n chu trình sao chép c a chúng. - Các virus RNA nh ư retrovirus, paramyxo virus Retrovirus có ph vt ch rng gm chim, ñng vt có vú và nh ng ñng vt khác. S nhi m ca retrovirus không dn ñn làm ch t t bào. Bi u hi n gene ca virus mnh nh promoter mnh. Retrovirus ch a genome RNA. Ht virus ch a 2 bn sao RNA. Mi genome RNA có nhi u tính ch t tươ ng t vi mRNA eukaryote: có trình t poly(A) kho ng 200 ñơ n v ñ u mút 3 và cu trúc mũ ñu 5’. Virus xâm nhi m vào t bào kèm theo enzyme reverse transcriptase và intergrase. Enzyme reverse transcritase tham gia ph n ng tng hp cDNA, dn ñn s hình thành bn sao DNA mch kép ca RNA virus, ñưc gi là DNA provirus. DNA provirus ñưc ñóng vòng tròn nh protein intergrase và ñưc xen vào genome t bào ch . Th ưng ch có mt bn sao DNA provirus ñưc gn vào trong mt t bào ch . ðim g n vào genome là ng u nhiên. Retrovirus là mt tác nhân gây ung th ư. Hu ht chúng có cu trúc genome ch a trình t oncogene. Oncogene virus th ưng ñưc to thành t gene ca t bào và th ưng là kt qu ca s dung hp gene t bào vi gene ca virus. Kt qu là nh ng virus gây ung th ư nh ư th b mt ch c năng gene ca virus. Chúng có th sao chép trong lây nhi m hn hp vi mt helper virus cung c p ch c năng b mt. - Các virus DNA: SV40, Bovine papilloma virus (BPV) Ht virus SV40 ch a DNA mch kép, vòng tròn, kho ng 5,2 kb ñưc gn vi 4 phân t histon: H4, H2a, H2b và H3. SV40 có th tham gia vào hai ki u chu trình sng ph thu c vào t bào ch . Trong t bào cho phép virus xâm nhi m (permissive cell) th ưng là các dòng t bào n ñnh có ngu n gc t kh châu Phi, s sao chép virus xy ra nh ư các tr ưng hp nhi m bình th ưng. Trong t bào không cho phép (non-permissive cell), th ưng là nh ng dòng t bào chu t, không có s nhi m làm tan t bào vì virus không th sao chép toàn b DNA ca chúng. nh ng t bào kh b nhi m và làm tan do SV40, có th phân ra 3 giai ñon. Trong sut 8 gi ñu tiên, ht virus không v và DNA ca chúng di chuyn ñn nhân t bào ch . 4 gi ti p theo là pha sm (early phase), có s tng hp mRNA sm và protein sm và có s kích thích tng hp DNA ca t bào ch . Trong pha mu n xy ra 36 gi ti p theo, trong giai ñon này có s tng hp DNA ca virus, mRNA mu n và protein mu n, l p ráp virus và làm tan t bào. 160
39. + Bovine papilloma virus (BPV) BPV gây nên bnh bưu (wart) trâu bò. BPV có genome DNA si kép, vòng tròn kho ng 7,9 kb. 4. Các virus gây ung th ư, HIV/AIDS Kho ng 15% ung th ư ng ưi có cơ ch hình thành liên quan vi virus. Chúng có các nhóm sau : + DNA virus: h Apovavirus (Papilloma virus), h HepDNAavirus (Hepative-B virus), h Herpesvirus (Eptein-Barr virus) + RNA virus: h Retrovirus (HIV-1, virus AIDS) Các virus gây ung th ư có th tác ñng do xen ñon DNA ca chúng vào b gene ch . Ngoài ra có th th c hi n : + Ho t hoá b máy sao chép DNA c a t bào ch . + Kìm hãm tác ñng ca các tumour suppressor gene ch yu ñ ho t hoá sao chép DNA Như vy bng nhi u cách khác nhau các virus khi xâm nh p t bào có th làm t bào m t s ki m soát bình th ưng. AIDS là hi ch ng do virus làm suy gi m mi n dch ng ưi (HIV). Ht virus là mt kh i cu, b ngoài g gh , gm v bên ngoài, trong là ch t nn protein bao quanh lõi có mt ct dng nón. Trong lõi có genome gm 2 si RNA gi ng nhau gn vi enzyme DNA polymerase là reverse transcriptase. Trong quá trình nhi m, virus HIV bám và nhi m lõi ca nó vào t bào h th ng min dch ca ng ưi. Ti p theo chúng s dng enzyme reverse transcriptase ñ sao RNA genome ca chúng thành phân t DNA s i kép trong t bào ch t ca t bào ch . Phân t xo n kép này chuyn ñn nhân, gn vào nhi m sc th t bào ch nh mt enzyme khác. Khi ñã gn vào nhi m sc th ca t bào ch , genome ca virus. Mt khi ñã gn vào nhi m s c th ca t bào ch , genome c a virus có th th c hi n mt trong 2 quá trình. Nó có th tr ưng dng b máy tng hp protein ca t bào ch ñ có th to ra hàng tr ăm ht virus mi sinh sn bng ny ch i, tách kh i màng t bào và ñôi khi làm ch t t bào ch . Nó cũng có th ti m tàng trong nhi m sc th ca t bào ch , ri sao chép và truyn genome virus sang 2 t bào m i khi t bào phân chia. 161
40. Màng bao Glycoprotein HIV xâm nh p Capsid vào t bào T BÀO CH Enzyme sao RNA virus mã ngưc Lai RNA (2 si DNA-RNA Enzyme sao phân bi t) mã ng ưc DNA DNA NST Protein virus Provirus a. Cu trúc c a HIV RNA NHÂN b. S sinh s n c a HIV HIV m i Hình 8.10 Chu trình sinh sn c a virus HIV Ngoài ra sinh hc hi n ñi còn phát hi n ra hai dng sng ñc bi t là các viroid và prion - Viroid: là nh ng phân t RNA rt nh (200-400 nucleotide), dng que có mc ñ cu trúc bc hai cao (Hình 8.11) . Chúng không có capsid và v bao (envelope) và ch ch a mt phân t acid nucleic ñơ n. Viroid gn li n vi bnh th c vt. Viroid ñu tiên ñưc phát hi n và nghiên cu ñy ñ nh t là viroid ng thoi khoai tây (potato spindle tuber viroid-PSTVd). Viroid không mã hóa cho bt kì mt protein nào và nó ñưc sao chép nh RNA polymerase ca t bào ch ho c có th nh mt sn ph m ca mt gene RNA polymerase ph thu c RNA trong mt vài t bào eukaryote. Chi ti t ca sao chép ñn nay ngưi ta ch ưa rõ, dưng nh ư nó xy ra nh cơ ch vòng tròn xoay có s ct (autocatalytic cleavage) và gn (self-ligation) ñ to ra viroid tr ưng thành. Trantrung_k49@yahoo.com 162
41. Vùng kt Vùng kt thúc bên Vùng gây Vùng trung tâm có Vùng thúc bên trái bnh tính bo th bi n d ph i Hình 8.11 Các vùng ch c n ăng c a phân t RNA viroid Gi a các viroid khác nhau có các trình t khác nhau, nó ñưc s dng trong phân loi ñ chia viroid thành gi ng (genera) và loài (species). Tuy nhiên, tt c viroid ñu có ñc ñim chung là vùng trung tâm có tính ch t bo th liên quan vi sao chép ca chúng (Hình 8.12) . Mt nhóm các viroid có kh năng to thành cu trúc « ñu búa » (hammerhead) làm cho chúng có tính ch t enzyme ca mt ribozyme. Hot tính này ñưc s dng ñ ct cu trúc nhi u ñơn phân t o ra trong quá trình sao chép. Các viroid khác s d ng các enzyme ch ưa ñưc bi t trong t bào ch ñ th c hi n ñiu này. Mt vài viroid gây bnh tr m tr ng và gây ch t th c vt ch . Các viroid khác gm các lo i t không có bi u hi n b nh bên ngoài ñn có tri u ch ng b nh nh . Hình 8.12 C u trúc RNA viroid - Prion: Mt nhóm bnh lây nhi m h th n kinh kinh niên, phát tri n nhanh chóng và gây ch t ñưc bi t nh ư là bnh xp não lây nhi m (Transmissible spongiform encephalopathics - TSE). Tác nhân lây nhi m liên quan ñn TSE không ph i là acid nucleic (Tikvah Alper, 1967). Các bnh TSE ng ưi nh ư là bnh Kuru và Creutzfeldt-Jacob có th gây nên do các ph n t protein gây nhi m và Standley Prusiner (1982) gi chúng là prion (proteinacious infectious particle). Bn ch t ca prion là ch ưa ñưc ch ng minh mt cách ch c ch n. Chúng là mt hi n tưng mi vưt ra ngoài hi u bi t thông th ưng. Tt c các bnh prion ñu có bnh lý gi ng nhau cơ bn, mc dù gi a chúng có s khác bi t có ý ngh ĩa nh ng ñiu 163
42. ki n khác nhau. Các bnh khác nhau ñưc ñc tr ưng bi s lng (deposition) ca các protein bt th ưng trong các mô khác nhau nh ư th n, lách, gan ho c não S lng các « amyloid » này bao gm s tích lu các protein khác nhau dng tm ho c dng cu n ri to ra protein β amyloid. Chúng là kt qu t nh ng sai hng ca b gene trong trao ñi ch t do nhi u lo i nhân t ch ưa ñưc bi t Mc dù cơ ch phân t liên quan vi s ch t ca t bào là ch ưa rõ ràng, nh ưng tác ñng gây ra xp nào do to l mô não ñã ñưc quan sát th y dưi kính hi n vi. Nh ng l này gây ra do s mt t bào th n kinh và gliosid. Phép ch n ñoán xác ñnh TSE không ch ti n hành trên lâm sàng mà yêu cu ch ng minh s lng protein prion (prp) bng nhu m hoá h c mi n nhi m mô não ng ưi sau khi ch t. Câu hi và Bài tp 1. Hãy trình bày quá trình tái t h p genome ca bacteriophage. 2. Genome ca vi khu n và virus t ươ ng tác vt lý theo cách nào? 3. Ý ngh ĩa ca vi c phân tích c u trúc locus rII c a phage T4. 4. Hãy nêu ñc ñim v chu trình sng c a phage. 5. Virus th c vt có nh ng nhóm nào? 6. Hãy trình bày ph ươ ng th c sao chép c a virus ch a RNA s i ñơ n. 7. ðc ñim chu trình sinh s n c a virus HIV. 8. Hãy nêu tên các d ng sng ch có acid nucleic ho c ch có protein. 9. Có bao nhiêu ñm tan ca phage ñưc to thành trên môi tr ưng nuôi cy t mt phage riêng l ban ñ u? 10. Bacteriophage có tr t t các gene là ABC att DEF. Hi tr t t ca các gene này prophage nh ư th nào? 164
43. Ch ươ ng 9 Di truyn hc Vi n m và Vi t o Mc tiêu c a ch ươ ng Phân tích di truyn mt s vi to và vi nm, ch yu tp trung nghiên cu các ñc ñim ca vi nm, vi to nh ư tính không dung hp, phân tích b bn, phân tích di truyn trong chu trình cn hu tính, nhi m sc th nhân t o Ni dung I. ði c ươ ng v nghiên c u di truyn m t s vi t o thông d ng Loài vi t o ñưc s d ng s m nh t và nghiên c u di truy n chi ti t h ơn c là Chlamydomonas reinhardii. Ưu th ca ñi tưng này là có th ti n hành lai và phân tích b b n không x p theo th t . các loài này, các t bào ñơ n b i có th sinh sn vô tính mt th i gian dài. Các t bào ñơ n bi gm 2 lo i: mt (+) và mt (-), t bào ñơ n bi ca mi lo i không kt hp vi nhau. S kt hp hai t bào khác ki u bt cp mt (+) vi mt (-) to ra hp t. Hp t qua gi m phân cho t l phân ly ca mt gen là 2 t bào mt (+) : 2 t bào mt (-). Trong ñiu ki n thí nghi m, có th nuôi các t bào Chlamydomonas reinhardii ñ nh n các t bào ñng nh t (synchronous culture), khi thay ñi chu kì 12 gi sáng 12 gi ti ñu ñn. Theo dõi tng hp DNA cho th y DNA ca lc lp tng hp vào gi th 5-6 ngoài sáng, còn DNA ca nhân tng h p kho ng gi th 16-18, sau ñó chia t bào ñng lo t. Mt s ñt bi n kháng streptomycine ñã ñưc thu nh n và nh n th y m t s có s di truyn trong nhân, s khác có s di truy n ngoài nhân. Trantrung_k49@yahoo.com 166
44. Cp giao t S to c p Dung h p t bào Dung h p Tp h p l i + Kt h p nhân và NST Hp t (NH + hay Gi m Phát tri n hp t 4 Hình thành Gim phân phân ánh sáng) cp (NH +) Hp t Ny trưng thành chi + T l 2:2 c a (NH hay + + - - 4 + - yl yl yl yl yl và yl ánh sáng) T l 4:0 c a sm-r sm-r sm-r sm-r sm-r và sm-s Sn ph m ñơn bi sau gi m phân Hình 9.1 Gen nhân (yl) phân ly 2:2 trong quá trình to giao t còn gen ca lc lp (sm) phân ly theo t l 4:0 II. Phân tích di truyn vi n m 1. Tính không dung h p (incompatibility) vi n m Khái ni m tính không dung hp nm ñưc dùng ñ ch kh năng kt hp vi nhau gi a các dòng nm trong sinh sn hu tính. Cho ñn nay gn 450 loài nm ñã ñưc nghiên cu v các ki u không dung hp. S không dung hp ñưc xác ñnh v mt di truyn. Theo ki u dung hp thì nm ñưc phân làm 2 lo i: - ðng tn (Homothallic) là khi có s kt hp vi nhau gi a các t bào (hay h si tơ-mycellium) gi ng nhau trong sinh sn hu tính. Ví d, t bào a kt hp vi t bào a, hay α vi α to dng lưng bi 2n tươ ng ng aa hay αα. - D tn (Heterothallic) là ki u khi có s lai nhau gi a 2 lo i t bào khác nhau nh ư a vi α to dng d hp t lưng bi aα. Các nm d tn có th chia thành: l ưng c c (bipolar) và t c c (tetrapolar). ði di n ñin hình ca nm d tn lưng cc (bipolar heterothallic) là nm men Saccharomyces cerevisiae. n m men, s hp bào (cytogamy) và 167
45. hp nhân (karyogamy) ch xy ra gi a các t bào (hay nang bào t - ascospora) có ki u bt cp (matting type) khác nhau nh ư a và α và các allele khác nhau ca locus MAT. Do có s tham gia ca 2 allele nên gi là lưng cc. Nm mc vàng bánh mì Neurospora crassa cũng thu c ki u không dung hp này. Nm rơm (Volvariella volvacea) và nm m (Agaricus bisporus) c ũng thu c lo i này. Ki u d tn t cc (tetrapola heteropolic) ñc tr ưng cho nhi u lo i nm ñm Bacidiomycetes mà ñi di n là Schizophyllum communae . Nm bào ng ư (Pleurotus) và nm hươ ng (Lentinus edodes ) thu c ki u không dung hp này. S xác ñnh di truyn không dung hp các loài n m này do 2 gen A và B. Mi gen có 2 allele ho c nhi u hơn, th ưng là A1, A2 và B1, B2. S kt hp gi a các dòng ñơ n bi ch to dng hu th có ki u gene A1A2B1B2 tc b n nhân t khác nhau, do ñó g i là t c c. S ña dng ca các chu trình sng và các ki u không dung hp nm có nh hưng ñn các ph ươ ng pháp phân tích di truyn. mt s nm sinh sn hu tính th c hi n trên cơ s d hp bào (heterogamy) nh ư Neurospora crassa. nh ng loài khác trên cơ s ñng hp bào (isogamy). Song song vi sinh s n h u tính còn có chu trình cn h u tính hoàn toàn hay không hoàn toàn ph thu c vào lo i nm. Chu trình sinh sn cn hu tính là quá trình kt hp và tái t hp gene di n ra trong nguyên phân ch không ph i gi m phân, không có s th tinh nh ư sinh s n h u tính. 2. Phân tích b b n và l p bn ñ vi n m Nm men có nhi u ñc tr ưng ñ tr thành mô hình lý tưng cho nghiên cu di truyn eukaryote. Nm men là mt eukaryote ñơ n bào, chu kỳ sng ch kho ng 90 phút, có th thu ñuc nm men vi s lưng ln khi nuôi trên môi tr ưng ñc. B gen ca nm men ch a kho ng 12 megabase vi 6.000 gen phân b trên 16 nhi m sc th . Nm men là eukaryote ñu tiên ñưc gi i mã b gen. Chu trình sng ca nm men gm hai giai ñon có th chuyn ñi qua li. T bào có th tn ti c dng lưng bi và c dng ñơ n bi. Trong c hai tr ưng hp, t bào m to ch i gi ng ht nó. Nh ng t bào lưng bi này có th ti p tc sinh tr ưng bng mc ch i và có th trãi qua gi m phân to 4 bào t ñơ n bi (haploid) trong mt nang (ascus) ñưc gi là tetrad. Bào t ñơ n bi (haploid spore) ca ki u kt cp khác nhau (a vi α) s qua 168
46. th tinh to th lưng bi. Nh ng bào t ca ki u kt cp gi ng nhau s ti p tc sinh tr ưng bng n y ch i. Nm men ñưc xem là E. coli ca các t bào eukaryote, có th s d ng nm men ñ phân tích ñt bi n. T bào nm men ñơ n bi ñưc gây ñt bi n bng tia X, sau ñó sàng lc các ki u hình ñt bi n trên môi tr ưng nuôi cy. ðu tiên nuôi c y t bào n m men trên môi tr ưng giàu dinh dưng ñ tt c các t bào phát tri n. ðĩa nuôi cy này sau ñó ñưc nhân lên qua ñĩa sao chép ch a môi tr ưng ch n lc ho c ñiu ki n sinh tr ưng ñc bi t. Ch ng hn, các ñt bi n nh y cm nhi t ñ có th sinh tr ưng trên các ñĩa gc nh ưng li không sinh tr ưng trên các ñĩa sao chép nhi t ñ gi i hn. So sánh các khu n lc ñĩa gc vi ñĩa sao chép s phát hi n ñưc nh ng ñt bi n nh y c m vi nhi t ñ . Nang ch a 4 bào t túi d h p Dinh Dinh ư Ny ch i d ng dưng Ny chi Hình thành bào t Vòng ñi Vòng ñi s.d ưng s.d ưng (ñơn b i) (ñơn b i) Gi m phân Ny ch i Ny chi Thi u nitrogen Kt h p hình thành h p t Vòng ñi s.d ưng (ñơn b i) Ny chi Hình 9.2 Chu trình s ng c a n m men. 169
47. Lp nang khu n (Ascomycetes) có ñc ñim là khi các t bào lưng bi phân chia gi m nhi m s to ra các bào t nm trong mt v bao ñưc gi là nang (ascus). Các cơ th này có các ñc ñim thu n li cho phân tích di truyn: Các vi nm có th tn ti dng ñơ n bi, nên tt c các gene có th bi u hi n tr c ti p thành ki u hình. Các vi nm này có th to ra s lưng cá th ln th h sau nên có th phát hi n các s ki n di truyn hi m và có th ưc lưng ñưc tn s tái t h p m t cách chính xác. T bào nm men có th sng dng sinh dưng ñơ n bi hay d bi. Tín hi u chuyn t ñơ n bi sang d bi xu t hi n theo dng kt hp và tín hi u chuyn t d bi sang ñơ n bi là s gi m phân trong quá trình hình thành bào t . T bào phân chia sau khi hình thành chromatid Gi m phân I Gi m phân II Nguyên phân Hình 9.3 M c vàng bánh mì (Neurospora crassa) là mô hình nghiên cu phân li trong gi m phân Trong chu trình sng, ch có hp t là lưng bi, s tr i qua gi m phân ngay sau khi ñưc to thành, to các bào t ñơ n bi, bào t ny mm hình thành giai ñon cây. mt s loài các b bn to thành tr i qua mt ln phân chia nguyên nhi m na ñ to ra tng cp gm hai bào t gi ng ht 170
48. nhau. mc vàng bánh mì (N. crassa), các bào t xp th ng hàng trong nang theo mt tr t t xác ñnh liên quan tr c ti p ñn ti n trình ca gi m phân (Hình 9.3) . Hu ht các lo i nm mc khác, sn ph m ca gi m phân không s p x p theo m t tr t t ñ c bi t trong nang nh ư m c vàng bánh mì. - L p b n ñ di truyn bng phân tích b b n ði vi tr ưng h p b b n không theo th t : Ví d: khi lai các t hp ca hai gene AB × ab. S th tinh cho nhân lưng b i AB/ab và nó chia gi m nhi m ngay. Nu không có trao ñi chéo xy ra ho c trao ñi chéo ñôi xy ra trên cùng hai chromatid thì s có b bn: 2 AB : 2ab, gi là ki u ñôi cha m (parental ditype – PD). Nu trao ñi chéo xy ra trên c bn chromatid ca mi cp nhi m sc th kép, s có 2AB : 2aB, gi là b bn ki u ñôi không cha m (Nonparental ditype – NPD) hay còn gi là ki u ñôi tái t hp (Reconbinational ditype- RD) Tr ưng hp to ra mi nang bn lo i bào t có ki u gene khác nhau: 1AB : 1Ab : 1aB : 1ab ñưc g i là ki u b n (tetratype) Phân tích b bn cho phép xác ñnh hai gene liên kt. Khi hai gene không liên kt thì tn s b bn ki u ñôi b m và ki u ñôi không b m bng nhau (PD = NPD). Ng ưc li khi hai gene liên kt, ki u PD có tn s ln h ơn ki u NPD. Tn s tươ ng ñi ca các ki u b bn khác nhau ñưc s dng ñ xác ñ nh b n ñ kho ng cách gi a hai gene liên k t. 171
49. Parent ditype Nonparent ditype Tetratype PD NPD T Hình 9.4 Phân tích b b n 3. Phân tích di truy n trong chu trình cn hu tính (tái t hp trong nguyên phân) Nhi u lo i nm có si dinh dưng kt hp vi nhau, làm cho các nhân ñơ n bi t các dòng cùng chung trong t bào ch t. Các th d nhân (heterocaryon) ñưc to nên có th tn ti lâu dài nh ư N. crassa. S to thành các th d nhân ñưc s d ng r ng rãi ñ nghiên c u s t ươ ng tác gi a các gene, gi a các allele và gi a các gene ca nhân vi t bào ch t. Trong mt s tr ưng hp, s so sánh các d hp t và d nhân cho th y s khác nhau trong t ươ ng tác gi a các allele, có l do: 172
50. - T l s lưng nhân và tươ ng ng các allele trong th d nhân có th khác nhau - Các allele ca các gene mt nhân không ñưc ng ăn cách nh ư gi a các th d nhân. Các nhân th d nhân ñôi khi hp nhau to nên ñon lưng bi. Hơn na trong quá trình chia nguyên phân ti p theo, nhân lưng bi có th ch u tác ñng c a hai quá trình: ñơ n b i hoá ho c tái t hp nguyên phân. 3.1. S ñơn b i hoá (Haploidisation) S ñơ n bi hoá có th xy ra ng u nhiên ho c ñưc gây to bi ch t n- fluorphenylalanin. Nu nh ư các nhân trong nhi u nguyên phân b 1 nhi m sc th (2n – 1) thì nhân lch bi va xu t hi n tr nên không n ñnh và ti p tc mt các nhi m sc th khác ca mt b ñơ n bi, cho ñn khi tr thành nhân ñơ n bi (n) n ñnh. Trong quá trình ñó nhi m sc th b mt ñc lp nhau, các gene ca cùng mt nhi m sc th có s liên kt hoàn toàn. Da vào ñc ñim này có th xác l p s liên k t da vào gene ñánh d u trên m i nhi m sc th . 3.2. Tái t h p trong nguyên phân (Mitotic recombination) Tái t hp trong nguyên phân là hi n tưng th ưng gp nhi u sinh vt, khi xy ra trao ñi chéo gi a các nhi m sc th tươ ng ñng trong nguyên phân. Trong tr ưng hp này kho ng cách ca gene ñánh du xa tâm ñng nh t, s ñng hp t hoá th ưng xy ra hơn c (ñưc coi là 100%) và s phân b các gene ñưc tính theo công th c: D = Nab/Nb x 100% D: kho ng cách c a gene ñ n tâm ñ ng Nb - t ng s các d ng phân li, ñng h p t theo b. Nab - s các dng phân li ñng hp c a và b, nu nh ư b là gene ñánh du xa tâm ñng nh t. Bn ñ liên kt gene ñưc xây dng bng tái t hp gi m phân và tái t hp nguyên phân (trong chu trình cn hu tính) có th t gene xp gi ng nhau Aspergillus nidulans. 173
51. III. N m men nh ư là E. coli ca các t bào eukaryote 1. Các nhi m s c th n m men nhân t o (YAC) ð xây dng nhi m sc th nhân to có ch c năng nh ư mt ph n b gene ca t bào, ñ ñm bo s phân chia ca nhi m sc th cn có tâm ñng (centromere). Th hai, ph n ñu mút ca nhi m sc th th ng dài ñưc gi nguyên vn khi ñư a vào t bào, tránh ñưc s phân gi i ca nuclease nh ñon trình t DNA lp li ñc bi t và ph c hp protein bao ñu nhi m sc th là telomer. Cu i cùng, DNA ph i sao chép tr ưc khi t bào phân chia vì vy ñ nhi m sc th nhân to sao chép ph i có ít nh t mt ñim xu t phát sao chép. Plasmid ðc ñim a. - Không th sao chép t ñ ng AMP - ðim g n vào vùng tương ñng là LEU2 Ori 2 - Mi t bào có mt phiên b n LEU2 Ori 1 b. - Sao chép t ñ ng - Mi t bào có nhiu phiên bn Ori 2 LEU2 ARS c. CEN - Sao chép t ñ ng AMP - Mi t bào có mt phiên b n - Phân ly trong gim nhi m như là mt nhim s c th Ori 2 LEU2 Hình 9.5 Plasmid ca n m men a. YIp: không ch a ori và không th sao chép t ñ ng b. YEp: ch a ñim ori 1 và sao chép t ñ ng c. YCp: ch a tâm ñ ng và phân ly trong quá trình gi m phân LEU2: gen nm men, Ori 1: xut phát sao chép ca plasmid nm men, Ori 2: xu t phát sao chép ca vi khu n, AMP: gen kháng kháng sinh c a vi khu n 174
52. Vào nh ng n ăm 1980, các nhà di truyn hc phân t ñã ñư a ra 3 y u t chìa khóa cho mt nhi m s c th : centromere, telomer và ñim xu t phát sao chép và s dng vt li u t t bào nm men là plasmid ñ cu to nhi m sc th n m men nhân t o. Cho ñn nay, eukaryote ch tìm ñưc mt lo i plasmid duy nh t ñó là plasmid vòng tròn 2 µm dài kho ng 6300 cp base có nhi u trong t bào nm men Saccharomyces cerevisiae. S ci ti n plasmid này qua nhi u bưc to thành nhi m sc th nhân to nm men, gi là YAC (yeast artificial chromosome), có ch a các trình t nucleotide quan tr ng: ARS (autonomously replicating sequence): trình t sao chép tươ ng t ori plasmid. CEN (centromere): trình t ca tâm ñng, ñm bo s chia ñôi và ñi v 2 cc ca t bào nh ư tâm ñng. 2 TEL (telomere): hai trình t duy trì hai ñu mú t nhi m sc th th ng mà không b c t, v n sao chép và phân chia Ch c t b ng EcoRI Hình 9.6 NST nhân t o c a n m men 2. Nh ng hi u bi t mi v t ch c c a các nhi m sc th c a n m men 175
53. Nm men là cơ th eukaryote ñơ n bào, b máy di truyn ca nó gi ng vi t bào ca cơ th bc cao. Các ñim xu t phát sao chép, tâm ñng và telomer ñưc xác ñnh là mt ñon DNA nh , t do. T bào nm men ñơ n bi có 16 nhi m sc th trong nhân, xp thành dãy có chi u dài kho ng 235.000 ñn h ơn 2 tri u bp. T t c có c u trúc theo cùng b n ñ chi ti t. M i nhi m sc th ch a mt tâm ñng. Hai ñu nhi m sc th ch a ñon lp li dài theo sau trình t telomer ng n. Trên nhi m sc th có ch a nhi u ñim xu t phát sao chép, cách nhau kho ng 30-40 kb. Nhi m sc th nm men cũng to thành các ñơ n v là các nucleosome ch a lõi histon gm H2A, H2B, H3 và H4. ðin di trên gel vi tr ưng dao ñng (pulse field gel electrophoresis), tách ra nh ng nhi m sc th nguyên vn và lp ñưc karyotype phân t ca nhi m sc th nm men. Da vào karyotype có th quan sát ñưc các bi n ñi ch yu trong cu trúc nhi m sc th . Qua karyotype cho th y, nhi m sc th s I dài kho ng 235 kb là nhi m sc th nm men nh nh t. Nhi m sc th s XII ln nh t vi kích th ưc kho ng 2060 – 3060 kb, s khác nhau v kích th ưc ca nhi m sc th này do s lưng gen ca rRNA lp li vi s lưng khác nhau, th ưng dao ñng kho ng 100 – 200 bn sao nh ng ch ng khác nhau. Trình t DNA ca nm men ñưc gi i mã 100% vào tháng 4/1996. a. ðon g n cu i b. NST lp li Tâm ñng ðim kh i s 30 - 40 kb sao chép ðon cu i Hình 9.7 Nhi m s c th n m men a. Các thành ph n ca NST. Mi si ch a 1 tâm ñng, nhiu ñim kh i s sao chép, các ñon g n cu i l p l i và ñon cu i c a chu i DNA. b. H gen c a NST nm men trên hình nh ñin di. 176
54. Bn ñ di truyn ca nm men ñưc xác ñnh bng phân tích b bn. Mt ñơ n v ch c năng ca tn s tái t hp trong gi m phân kho ng 4400 cM, trung bình kho ng 3 kb/cM. Kho ng cách di truyn t l vi kho ng cách vt lý. Bn ñ di truyn ca nm men dài khác th ưng so vi bn ñ di truyn ca các cơ th nm khác. Ví d: Neurospora crassa có cùng hàm lưng DNA nh ư nm men nh ưng bn ñ di truyn ch dài kho ng 15% bn ñ di truyn ca nm men. S lưng gene mã hoá protein ca nm men ít hơn kho ng 6 – 10 ln s lưng gene ca ng ưi. T khi ch ươ ng trình gi i mã genome nm men hoàn thành vào năm 1996, không th nói chính xác có bao nhiêu gene mã hoá cho protein nm men. S lưng gene mã hoá protein c a n m men kho ng 6.000 – 6.500 gene n m men. 3. Nh ng hi u bi t mi v tái b n và phiên mã c a b gen n m men Nm men có th hoàn thành mt chu trình sao chép và phân chia kho ng 1,4 gi . Xut phát cho sao chép DNA ca nm men gm nhi u ñim gi ng vi oriC ca E. coli . ðó là vùng giàu AT ñưc tách ra khi có mt protein kh i ñng gn vào ñim k bên. Các ñim xu t phát sao chép dài hàng ngàn ñn hàng ch c ngàn nucleotide. Khác vi prokaryote, mi nhi m sc th eukaryote có nhi u ñim xu t phát sao chép ñ quá trình sao chép genome ca eukaryote có kích th ưc ln hơn nhi u xy ra mt cách nhanh chóng. Có kho ng 400 ñim xu t phát sao chép phân b trên toàn b 16 nhi m sc th ca nm men. S sao chép xy ra tr c ti p trên nhi u ñim xu t phát sao chép. Si mch kép ñưc to thành mi ñim xu t phát sao chép kéo dài và ni vi si kép ñưc to thành mt ñim khác. Khi sao chép trên 2 mch ñơ n hoàn thành s to ra 2 phân t DNA con gi ng ht nhau. S t ng h p DNA ch xy ra mt giai ñon trong chu trình t bào, ñó là pha S. nm nm men có 3 protein cn cho lp ráp ca replisome. ðó là ph c hp DNA polymerase ph i hp ho t ñng ch ba sao chép. Ph c hp nh n bi t ñim xu t phát (Origin recognition complex – ORC) s gn vào trình t xu t phát ca nm men nh ư DnaA protein ca E. coli. Nhng ph c tươ ng t ñưc tìm th y tt c các eukaryote. S có mt c a ORC làm b sung thêm 2 protein khác, Cdc6 và Cdt. C 2 protein này và ORC làm kích ho t helicase và nh ng thành ph n khác ca replisome. S gn vào ca helicase ñưc xem là s “xác nh n” (license) cho ñim xu t phát, giúp lp ráp replisome và b t ñ u t ng hp DNA. 177
55. Trong s các gene mã hoá protein, intron ch có kho ng 4-5% tt c các gene ca nm men (276 gene ch a mt intron ñơ n và 7 gene ch a 2 intron riêng r), kích th ưc trung bình ca intron kho ng 2000 nucleotide. Tn s th p ca intron nm men có l liên quan vi tn s th p ca các gene gi (pseudogene) gi ng nh ư intron, ph bi n eukaryote bc cao. Gene gi ch a trình t mã hoá, nh ưng vì thi u intron và promoter phiên mã nên trình t mã hoá không ñưc bi u hi n. Gene mã hoá protein không ch là nh ng dng gene ch c năng. Genome ca nm men ch a s ln gen to ra RNA không mã hoá, bao gm các gene lp li mã hoá cho rRNA, 274 gene ca tRNA, trong ñó có 80 gene ch a nhóm intron ñc bi t, 71 RNA nhân nh (smRNA) tham gia ch c năng ch bi n rRNA, 5 smRNA tham gia ch bi n intron, mt vài RNA ch ưa bi t ch c năng và 3 RNA nh ư là các ti u ñơ n v ch c năng ca enzyme Rnase, endoribonuclease và telomer. 4. Nh ng hi u bi t mi v ADN ty th c a n m men DNA ty th nm men dài 4 ln hơn DNA ty th ca ng ưi và nh ng ñng vt khác. Hai yu t trên DNA ty th nm men ñưc cho là có kích th ưc ln hơn so vi các ñi tưng khác: trình t gi a các gen (intergenic) và intron. Trình t dài, giàu A-T ca vùng ñm “spacer” tách bi t vi các gene ca mtDNA. Hu ht DNA ca spacer ñu ñưc dch mã và mt s trong chúng ñưc duy trì trên mRNA nh ư ñu 5’ và 3’ kéo dài, không dch mã. Yu t th hai là intron, chi m kho ng 25% genome ty th nm men và nó ñưc xem là to ra s khác nhau v kích th ưc gi a mt DNA ca nm men và ng ưi. 178
56. RNA tái t hp ln RNA tái t hp nh Hình 9.8 DNA ty th n m men Câu hi và Bài tp 1. Hãy trình bày quá trình sinh sn vô tính ca to Chlamydomonas reihardii. 2. Hãy cho bi t các ki u dung h p vi n m. 3. S xác ñ nh gi i tính vi nâm nh ư th nào? Cho ví d . 4. Các ki u b bn nào ñưc to ra do dòng nm men lưng bi có ki u gene AB/ab, n u A và B liên k t hoàn toàn? 5. Trong 100 chu trình gi m nhi m c a Neurospora theo cách bình th ưng có bao nhiêu bào t ñưc to thành? 6. Ý ngh ĩa ca phân tích b b n trong nghiên c u di truy n. 7. Hãy trình bày c u t o nhi m s c th nhân t o c a n m men và ng d ng ca chúng. 8. Mt ch ng kháng kháng sinh ca nm men ñưc phân lp, cho kt cp vi mt ch ng hoang di nh y cm vi kháng sinh to th lưng bi. Sau khi sinh sn mt vài th h, chúng ñưc kích thích ñ sinh bào t. Kt qu thu ñưc b bn nguyên phân ch a 8 bào t gm 4 bào t kháng kháng sinh và 4 bào t nh y cm kháng sinh. Hãy kt lu n v s di truyn ca tính kháng kháng sinh. 179
57. Chươ ng 10 Di truyn T bào ch t Mc tiêu c a chươ ng Gii thi u DNA ca các bào quan ty th , lp th và s di truy n do các gene trong t bào cht quy ñinh. Ni dung I. S di truyn t bào cht Hình 10.1 Cu trúc t bào 1. S di truy n ca các gene lp th Trong s th ph n c a th c vt bc cao, mt t bào trng có kích th ưc ln có nhiu t bào cht phi hp vi nhân ca ht phn không có t bào cht chung quanh. Do ñó hp t nh n ñưc phn ln t bào cht ca t bào trng. Nu hai b m có thành ph n nguyên li u di truy n trong t bào cht 181
58. khác nhau thì th h con s nh n ñưc nhiu nguyên liu di truy n trong t bào cht ca m. Do ñó s xy ra s di truy n theo th h m. Hi n tưng di truy n lá ñm ñưc phát hin rt sm Mirabilis jalapa (Correns, 1908), Pelargonium zonale (E.Bauner, 1909). Các cây có lá ñm có th có nguyên cành vi lá trng không có chlorophylle. Hình 10.2 Th khm ñm lá Thí nghim: Tp giao gia cây Mirabilis jalapa có nh ng cành khm trng xanh theo các phép lai như sau: - Th phn cho hoa trên cành lá trng bng ht phn ca hoa trên cành lá xanh lc, cho th h con nh ng cây ging cá th m có lá trng không có chlorophylle. Các cây này cht vì không có kh năng quang hp - Tp giao hoa trên cành lá xanh lc bng ht phn ca hoa trên cành lá trng, tt c th h con có lá màu xanh lc bình th ưng. - Nu th phn các hoa ca cành lá ñm bi ph n hoa ca cây xanh lc thì ñi con có các cá th lá trng, lá ñm và lá xanh lc. - Nu th phn cho hoa ca cành lá xanh lc vi ph n hoa cây lá ñm thì ñi con g m toàn cá th lá xanh lc. * Gii thích: Trong trưng hp này ngưi ta th y nh ng cht cơ s hình thành lp th có trong t bào trng s hình thành tin lp th , sau ñó hình 182
59. thành lc lp. Ht ph n không có cht cơ s ñ hình thành lp th nên ht ph n không th truy n lc lp ñưc. S khác nhau gia con cái và b m v mt ho c nhiu tính trng khi tp giao thu n nghch chng t có s tham gia ca nguyên li u di truy n trong t bào cht. S di truy n theo h m quy ñnh s th hin tính trng ph thu c vào cá th m. Hình 10.3 Sư di truyn các gene lp th th c vt Pelargonium zonale có trưng hp di truy n theo dòng cha. Nu hoa ca cây lá ñm ñưc th phn ca cây lá xanh lc thì 30% cây lai có lá ñm, 70% lá xanh lc. Khi lai hoán ñi cha m thì 70% cây lai lá ñm và 30% lá xanh lc. 183
60. 2. S di truy n ca các gene ty th 2.1. ðc ñim di truy n ca các gene ty th Theo Mendel, khi tp giao nhng sinh vt lưng bi thì có s phân ly tính trng theo ñúng ñnh lut ca Mendel vì nh ng gene trong nhân ñu nm trên nhim sc th và trong gim phân ñưc phân chia cho các giao t cùng vi nhim sc th . ði vi nh ng tính trng trong t bào cht không có mt h thng phân chia nào ñm nh n nên không có s phân ly theo mt quy lut nht ñnh. nm men có mt th ñt bin có th hình thành nhng khun lc petite kích th ưc nh hơn bình th ưng, ñưng kính ch bng 1/2 - 1/2 khun lc bình th ưng. Các t bào to nên khun lc petite có kích th ưc ging kích th ưc t bào bình th ưng. Nguyên nhân to nên khun lc kích th ưc nh là do các t bào ñt bin petite b hng h thng hô hp, tc là nhng enzyme oxy hóa trong ti th là các cytochrom b, c, a, a3 và cytochrom oxydase b phá hy. ðây là nhng enzyme ca màng trong ty th . Khác vi kiu di, các ñt bin petite không th c hin ñưc ph n ng phosphoryl hóa ñ sn ra năng lưng, vì vy tc ñ sinh trưng và phân bào ca chúng th p hơn. ty th ca nm men (Saccharomyces cerevisiae) có 3 kiu ñt bin ch y u: petite, antR và mit -. Mt ví d v ty th là ñt bin thi u năng hô hp nm men. Vào nhng năm 1940, Boris Ephrussi và cs. ñã mô t các ñt bin ñc bit nm men.Các ñt bin này ñưc gi là petite, có khun lc nh hơn nhiu so vi khun lc hoang di. Theo phương th c di truy n, các ñt bin petite chia làm 3 loi khác nhau: - Petite phân ly (Segregation petites): khi lai vi dng hoang di khun lc bình th ưng thì t l phân ly trong các nang bào t (ascospore) là 1 khun lc to: 1 petite. - Petite trung tính (Neutral petites): khi lai vi khun lc to thì s phân ly trong nang bào t ch có dng khun lc to bình th ưng, th hin s di truy n theo mt cha m (Uniparental) - Petite c ch (Suppressive petites): khi lai to các nang bào t, mt s mc thành khun lc to bình th ưng, mt s khác to khun lc petite. T l gia khun lc to và nh dao ñng nhưng có tính ñc hiu c a chng, mt s petite c ch ch to th h con khun lc petite. Qua các petite c ch cho 184
61. th y có s di truy n ngoài nhân t bào và mt s có s di truy n theo mt cha m. Khi lai nm men 2 t bào cha m, hai t bào cha m kt hp vi nhau và góp t bào cht như nhau vào t bào con lưng bi. S di truy n ca các petite trung tính và c ch ñc lp vi kiu bt cp th hin rõ s di truy n ngoài nhân nên ñưc gi là petite t bào cht. Qua nghiên cu chúng có các ñc ñim kiu hình như sau: - Chui chuyn ñin t ca ty th b sai hng các petite t bào cht. Do sai hng này, chúng lên men ñ to ATP kém nên mc chm. - Không có sinh tng hp protein các petite t bào cht. Các ty th có h thng sinh tng hp riêng g m tRNA, các ribosome khác vi t bào cht. - mtDNA các ñt bin petite có bin ñi ln. Ty th ca tt c các Eukaryote có mtDNA riêng tuy s lưng nh, nh ưng khác vi DNA ca nhân t bào. các petite trung tính, mtDNA b mt hoàn toàn, còn các petite c ch có s thay ñi ñáng k t l base so vi mtDNA ca dng khun lc to bình th ưng. Nhóm các ñt bin th hai ca nm men là antR (antR mutants), có kiu hình ñ kháng vi các kháng sinh khác nhau. Ví d: capR (chloramphenicol resistance) kháng chloramphenicol, eryR kháng erythromycine, spiR kháng spiromycine, parR kháng paranomycine và oliR kháng oligomycine. Các ñt bin này khi lai (ví d eryR × eryS) cho t l phân ly không theo quy lut Mendel, ging như các petite c ch nhưng s di truy n có khác. Khi các t bào cha m kt hp, sn ph m lưng bi là hp t hai cha m cytohet (cytoplasmically heterozygote). Các diploid này có th sinh sn vô tính bng mc chi.Trong nguyên phân, quá trình phân ly t bào cht và tái t hp xy ra và các t bào con tr thành eryS hay eryR. Nhóm ñt bin quan trng th ba là mit- (mit- mutants) ñưc phát hin sau cùng nh k thu t chn lc ñc bit. Các ñt bin này, tươ ng t các ñt bin petite ch có khun lc nh và các chc năng bt th ưng ca chui chuyn ñin t, nh ưng ñim khác căn bn là sinh tng hp protein bình th ưng và có kh năng hi bin. Như vy, các kiu ñt bin mit- là ñt bin ñim. S di truy n cu kiu ñt bin mit- ging vi kiu antR, có s phân ly t bào cht và s di truy n theo mt cha m trong gim phân. 185
62. Trong th h con ca nh ng t bào thu c khun lc bình th ưng, có kho ng vài ph n trăm t bào hình thành nh ng khun lc petite. Nhng t bào khun lc petite luôn luôn phát trin thành nhng khun lc petite. ðiu ñó chng t có s thay ñi v cu trúc di truy n. Ngoài ñt bin xy ra kiu bào gene nói trên dn ñn sinh ra nhng khun lc petite, còn có nh ng khun lc petite do nhng gene trong nhân quy ñnh. Hình 10.4 S di truyn các gen ca ty th trong hình thành khu n lc petite Thí nghim: Tp giao ca mt nòi nm men kích th ưc khun lc bình th ưng vi mt nòi có kích th ưc khun lc petite, th h con hình thành khun lc bình th ưng. Còn ñi vi nhng gene trong nhân (gene ade), thì s 186
63. phân ly th h con v nhng gene này cho t l 1:1, do chúng nm trên NST và ñưc chia ñu cho các t bào con. ñây, nguyên liu di truy n trong t bào s ñưc trn ln nhau trong hp t và khi to thành bào t thì mi bào t ñu nh n ñưc các gene trong ti th nh ư nhau, nên chúng ñu có chc năng hô hp bình th ưng. Thí nghim cho th y s di truy n khun lc không theo quy lut Mendel. 2.2. Hin tưng bt dc bào cht ñc Tính bt dc do nhiu nguyên nhân, bt dc ñc (không to phn hoa hay to phn hoa không có kh năng th tinh) th c vt có các trưng hp sau: - Do gene nhân quy ñnh, như gene ms cây ngô - Do nh hưng ca ñiu kin môi trưng như ñ m, quang chiu, kh năng cung cp cht dinh dưng không ñáp ng ñúng nhu cu sinh lý ca cây Ví d: gene ms cây ngô - Do lai xa cũng ñưa ñn các cơ th lai không có ht phn vì NST có ngun gc khác nhau không th tip hp nhau trong gim phân. Nhng hin tưng bt dc này ñu có ý nghĩa hn ch ch có bt dc bào cht ñc là có vai trò quan trng. ðó là trưng hp bt dc ca ht phn bt ngu n t t bào cht, còn nhân thì có th có ñiu chnh ñưc nh ñó có th dùng các cây bt dc bào cht ñc ñ phát huy ưu th lai các ñi tưng ngô, cao lương, c ci ñưng 187
64. Hình 10.5 Sơ ñ thí nghim chng minh s di truyn theo h m ca bt th ñc Ví d: Xét mi quan h gia kiu gene, kiu bào gene và kiu hình ca bp ñưc s d ng trong lai mt tính mà không cn kh ñc cây m ST Ki u gene kiu bào gene kiu hình (ht T ph n) 1 Rfrf S (bt dc) hng 2 Rfrf N (hu dc) tt 3 RfRf ho c Rfrf N tt 4 RfRf ho c Rfrf S tt 188
65. Vy ht phn ca ngô ch b m t ho t tính khi có yu t bt dc trong t bào cht mà l i thi u thi u gene ph c h i hu d c (Rf) trong nhân, alen ca gene này là rf là gene c ũng c tính bt dc. Cây ñưc phc hi hu dc RfrfS cho t th ph n thì ñi sau s có 1/4 rfrf có ht phn hng. Nu ly bp ca dng rfrfS th phn ca rfrfN, thì ph n hoa ca toàn b ñi sau s b hng, cây này ch còn bp mang nh cái. ðó là cách dùng ph ương pháp di truy n ñ kh c ngô. Khi sn xu t ht ging, nhng cây này mun có ht thì phi th phn hu dc ca nhng cây bình th ưng. Nu mun dùng nhng ht ñó ñ sau này trng li thì cây b ph i có kiu gene RfRf và kiu bào gene N ho c S. Trong sn xut ging ngô có th dùng t hp dòng thu n dng 1 làm cây m và dng 3 ho c dng 4 ñng hp t làm cây b. Như th s ñ mt công kh ñc cây m và ht lai thu ñưc t cây m s có kiu gene Rfrf, kiu bào gene S. Kiu gene này ñm bo ñưc s th phn bình th ưng lúc trng trong sn xut. Bt th ñc t bào cht ngô liên quan ñn 2 plasmid dng th ng S1 và S2. Chúng trong ty th cùng vi mtADN. Mt trong nhng tính cht khó hiu ca plasmid này là chúng có th th c hin tái t hp vi mtADN. 3. Hi u qu dòng m lên chi u xo n v c Tr ng và phôi chu nh hưng ca môi trưng cơ th m nhiu hơn cơ th b. Ngay c khi b tách khi cơ th m t mt giai ñon rt sm, chúng cũng ñã nh n ñưc t bào cht, các cht dinh dưng trong trng t m và nhng nh hưng ñc bit lên ho t ñng ca gene. Nhng tim năng nht ñnh ca trng ñưc xác ñnh trưc khi th tinh và trong mt s trưng hp chúng ñã chu nh hưng c a môi trưng m bao quanh. S quyt ñnh trưc như vy do các gene ca m hơn là các gene ca con, ñưc gi là hiu ng m. S tn ti ca hiu ng m nói chung ñưc chng minh bng phương pháp lai thu n nghch, khi ñó kt qu phép lai thu n nghch s khác nhau. Ví d v hiu qu dòng m: chiu xo n ca v c Limnaea peregra. Chiu xo n này ñưc xác ñnh bi mt cp alen. D là xon phi, d là xo n trái. Các phép lai cho th y D là tri so vi d và chiu xo n luôn luôn ñưc xác ñnh bi kiu gene ca m. 189
66. Ti n hành phép lai thu n nghch gia ñng hp t DD xo n phi và ñng hp t dd xo n trái: Khi trng bt ngu n t c xon phi thì F1 là Dd v kiu gene và c có kiu hình xo n phi. Cho các con c này t phi thì sinh ra th h sau có t l phân li v kiu gene là 1DD : 2 Dd : 1 dd, tt c các con c th m chí c con có kiu gene dd ñu có chiu xo n ph i. Nhưng khi mi con c ca th h này t phi riêng bit thì ch có nhng con có kiu gene DD và Dd cho th h sau xo n ph i, còn nh ng con dd mc dù có kiu hình xo n ph i nhưng li cho th h sau xon trái. Ngưc li nu dùng c dd xo n trái làm m thì F1 Dd ñu xon trái ging m. Cho các c con này t phi thì tt c c th h sau có xo n ph i vì kiu gene ca m chúng là Dd. Nu cho mi con ca th h này t phi thì kt qu nhn ñưc như phép lai thu n trên, nghĩa là th h sau có t l phân ly 3 xo n ph i : 1 xo n trái. Hình 10.6 Hiu qu dòng m lên chiu xo n v c 190
67. Như vy hiu qu dòng m ch kéo dài mt th h và trưng hp này không th xem là di truy n qua t bào cht bi vì ñây các ñc tính ca t bào cht ñã ñưc xác ñnh trưc bi tác dng ca các gene trong nhân ch không ph i bi các gene trong t bào cht. Nói cách khác ñây cơ ch di truy n nhim sc th làm bin ñi t bào cht ca trng trưc khi nó th tinh. II. Lp bn ñ l p th và ty th 1. Lp bn ñ gene ca DNA lp th Các gene c a lc lp Chlamydomonas reinhardii S di truy n lc lp ñưc nghiên cu chi tit hơn c vi to Chlamydomonas reinhardii. T bào ca vi to này có mt lc lp ln vi ñưng kính trung bình 5 µm cha 50 ñn 80 bn sao ca phân t DNA vòng tròn dài 196 kb. Theo Sager (1975), chlamydomonas reinhardii có các ñt bin trong nhóm liên kt gene c a lc lp. Các ñt bin có biu hin kiu hình như sau: - Mt kh năng quang hp ñ mc ñưc ngoài ánh sáng và trong ti cn b sung ñưng kh là acetat - Nhy cm vi nhit ñ cao ho c th p - Tính ñ kháng vi thuc kháng sinh hoc có nhu cu ñưc cung cp thu c kháng sinh. Tt c các ñt bin trên có s di truy n theo mt cha m, có kiu bát cp mt+ (có th coi là dòng m). ðiu này liên quan ñn s hình thành lc lp trong hp t , bng cách nào ñó, ch nhn DNA t lc l p mt+. Năm 1954, R. Sager ñã nghiên cu các ñt bin kháng streptomycine C. reinhardii t dng hoang di nh y cm sm-s. Mt s ñt bin sm-r có s di truy n nhim sc th vi s phân ly 1 : 1. Tuy nhiên mt s ñt bin có s di truy n khác th ưng nh ư sau: sm-r mt+ × sm-s mt- → tt c th h con ñu sm-r vi t l 1 mt+ : 1 mt-. sm-s mt+ × sm-r mt- → tt c th h con ñu sm-s vi t l 1 mt+ : 1 mt- Như vy ñây khi có s hoán ñi cha m trong lai, th h con ñu có kiu hình streptomycine ca mt+. S truy n th tính trng này ñưc gi là s 191
68. di truy n theo mt cha m. Sager coi mt+ nh ư dòng m và trưng hp trên ging như di truy n theo dòng m. Các kiu bt cp mt có t l phân ly c a gene trong nhân là 1 : 1. H ình 10.7 Bn ñ vòng tròn ca cpDNA Chlamydomonas Hình 10.8 Bn ñ DNA chloroplast ca Marchantia polymorpha IR A và IR B là nh ng trình t ño ng ưc (theo K. Umesono và H. Ozeki, 1987) 192
69. Trong t hp lai mt+ sm-r × mt- sm-s có kho ng 0,1% th h hp t con mang c sm-r và sm-s. Các hp t nh ư vy gi là hp t hai cha m cytohet (cytoplasmically heterozygote). Tn s các cytohet có th tăng lên 40-100% th h hp t con nu mt+ ñưc chiu tia t ngo i trưc khi lai. Chlamydomonas, các hp t 2 cha m ñưc dùng làm ñim xut phát cho tt c các nghiên cu v s phân ly và tái t hp ca các gene lc l p. Trên cơ sơ nhiu t hp lai, R. Sager ñã nêu ra bn ñ vòng tròn ca cpDNA vi các gene t ươ ng ng. 2. Lp bn ñ gene ca DNA ty th * Lp bn ñ b gene ty th ca nm men Có c ác ph ương pháp khác nhau xây dng bn ñ b gene ty th : - Lp bn ñ tái t hp (recombination mapping): nm men s phân li t bào cht và tái t hp xy ra trong quá trình mc chi cytohet lưng bi. S phân li và tái t hp có th phát hin trc tip các dng lưng bi mc chi hay quan sát sn ph m gim phân khi chi ñưc kích thích to bào t. Ví d khi lai eryRspiR × erySspS có th nh n ñưc các kiu b bn vi s lưng như sau: eryRspiR 63 b bn erySspiS 48 b bn erySspiR 7 b bn eryRspiS 1 b bn Các kiu gene erySspiR và eryRspiS là các d ng tái t hp. - Lp bn ñ bng phân tích petite: Mt s k thu t lp bn ñ có hiu qu da trên s phi hp c 3 loi ñt bin petite, antR và mit -. Phn ln các tip cn này da vào s mt ñon ca mtDNA ca các ñt bin petite. S kt hp các kiu phân tích di truy n ñc bit vi k thu t tái t hp DNA ñã dn ñn xây dng bn ñ di truy n hoàn chnh ca mtDNA. - Lp bn ñ bng phân tích restriction enzyme: các restriction enzyme là công c hu hiu mi ñ phân tích di truy n. Nó ñưc s dng không 193
70. nhng ñ phân tích mtDNA ca nm men, mà c mtDNA ca bt kỳ sinh v t nào min chit tách và tinh sch ñưc DNA di truy n. * Bn ñ mtDNA ca nm men và ngưi Vi c xây dng bn ñ mtDNA hoàn chnh ca nm men và ngưi là nhng thành tu ñáng k ca nghiên cu di truy n t bào cht. - Mt s trình t có codon kh i s và codon kt thúc cu i nhưng chưa bit chc năng - mtDNA ca ngưi rt ít dư th a Hình10.9 Bn ñ mtDNA ca ng ưi (Theo Larson N.G và Clayton D.A, 1995) III. Di truyn hc phân t các bào quan 1. Các b gene lp th (cpDNA) Là bào quan có kh năng t tái sinh t bào th c vt. S phân chia ca các bào quan này v v các t bào con trong phân bào là không ñu nh ư s phân chia ca nhim sc th trong nguyên phân và gim phân. Chúng có s 194
71. lưng ln và phân chia ng u nhiên v các t bào con nên mi t bào có th cha nhiu ho c ít lc lp. DNA ca lc lp ñưc ký hiu là cpDNA (Chloroplast DNA). B gene này dng DNA vòng tròn, th ưng dài hơn DNA ca ty th 8-9 ln. Trong lc lp còn tìm th y b máy sinh tng hp protein khác rt nhiu vi h th ng trong t bào cht ca Eukaryota nhưng ging vi b máy sinh tng hp protein ca Prokaryota. Mc dù s di truy n ca lc lp ñưc phát hin rt sm, nhưng trong mt th i gian dài s hiu bit chi tit v các gene ca lc lp không có bưc tin ñáng k. Các nghiên cu phân t ñã góp phn ch yu cho s phân tích chi tit các gene các bào quan. Ngoài các nghiên cu Mirabilis jalapa và Chlamydomonas, b n ñ chi tit cpDNA ca th c vt Marchantia polymorpha ñã ñưc xây dng. CpADN ñin hình dài kho ng 120-200 kb tùy loài th c vt. Marchantia, kích th ưc phân t là 121 kb. Trên cpDNA ca Marchantia có tt c 136 gene gm 4 loi mã hóa tng hp rRNA, 31 loi mã hóa t ng hp tRNA và kho ng 90 gene t ng hp protein. Trong s 90 gene mã hóa tng hp protein, có 20 gene mã hóa tng hp enzyme cho quang hp và chui chuyn ñin t. Các gene mã hóa cho các chc năng dch mã chim kho ng mt na b gene ca lc lp và bao gm các protein và các RNA cn thi t cho dch mã bên trong lc l p. Thc t DNA ca lc lp, ty th và nhân t bào có s phi hp cht ch trong vic to ra các tiu ph n ca nhng protein ñưc s d ng bên trong lc lp. Ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/ oxygenase là enzyme di dào nht ca lc lp. Nó xúc tác 2 phn ng cnh tranh nhau, c ñnh CO2 và bưc ñu tiên ca quang hô hp (photorespiration) vi s to ra glycolate. Enzyme gm 8 tiu phn ln LS (large unit) ging nhau và 8 tiu phn nh ging nhau ñưc mã hóa tương ng bi các gene ca lc lp và nhân t bào. Ti u phn ln LS mang trung tâm xúc tác, còn vai trò ca các tiu phn nh chưa rõ. Gene LS nm trên cpDNA ca mt s th c vt như bp, Chlamydomonas reinhardii, thuc lá, Euglena Trong tt c các trưng hp, gene LS hin din 1 bn sao cho 1 DNA ca lc lp. Ngưc li, các gene ca tiu ph n nh ñưc tìm th y các trình t DNA ca nhân t bào vi s bn sao ít. 195
72. 2. Các b gene ty th (mtDNA) Bào quan ti th có tt c các t bào ca Eukaryote. B gene ca ti th ñưc ký hiu là mtDNA (Mitochodrial DNA). mtDNA mã hóa cho s tng hp nhiu thành phn ca ti th như h th ng 2 loi rRNA, 22-25 loi tRNA và nhiu loi protein có trong thành phn màng bên trong ti th . Trong khi ñó, ph n ln protein ca ribosom ca ti th thì do các gene trong nhân xác ñnh. B gene c a ti th có hai chc năng ch y u: - Mã hóa cho mt s protein tham gia chui chuyn ñin t - Mã hóa cho h th ng sinh tng hp protein gm mt s protein, tt c các tRNA và c 2 loi rRNA. Tuy nhiên trong c hai trưng hp, nhng cu phn còn li ca h thng ñưc mã hóa do các gene nhân và ñưc dch mã bào tươ ng (cytosol) ri chuyn vào ti th . Như vy, vic nghiên cu các gene ca ti th cho th y t bào Eukaryote không lc lp có ít nh t 2 h th ng sinh tng hp protein ñc lp tương ñi nhưng luôn hp tác cht ch vi nhau. các Eukaryote có lc lp thì 3 h th ng sinh tng hp protein ñc lp tươ ng ñi nhưng hp tác vi nhau. C 2 bào quan ty th và lc lp tham gia trc tip vào chuyn hóa năng lưng ca t bào. Di truy n t bào cht là hin tưng di truy n do các gene nm trên nhim sc th ngoài nhân quy ñnh. Câu hi ôn t p 1. Hãy nêu các kiu ñt bin ca ty th . 2. Trình bày chng minh th c nghim v di truy n lp th . 3. So sánh s ging nhau và khác nhau c a mtDNA và cpDNA. 4. Nu có ht bp t dòng bt thu ñc, làm sao xác ñnh s bt th do gene trong nhân hay ngoài nhân? 5. Nêu các ñc ñim riêng ca di truy n ngoài nhim sc th và nêu các sai khác cơ bn so vi di truy n ca gene nhân. 6. Hãy phân bit hiu qu dòng m vi s di truy n ngoài nhân. 7. Hãy phân bit các loi ñt bin petite nm men. 196
73. 8. Cho 2 dòng bp bt dc ñc: mt dòng bt dc bào cht, mt dòng bt dc do gene nhân di truy n theo Mendel. Hãy trình bày ph ương pháp xác ñnh hai dòng bt dc trên. 9. Mt con c loài Limnaea peregra có v xo n trái qua t phi cho tt c th h sau xo n phi. Hãy xác ñnh genotype ca con c này. Nu th h sau cho t phi riêng r, hi chiu xon v ca các con c th h này như th nào? 10. T l tin hóa DNA ca ty th ñưc tính b ng s bin ñi 1 nucleotid ca 1 ty thêr trong th i gian 1.500 ñn 3.000 năm. DNA ty th ngưi có kho ng 16.500 nucleotid. Hi t l bin ñi ca 1 nucleotid trong 106 năm là bao nhiêu? 197