Giáo trình Sinh học phân tử - Hoàng Trọng Phán (Phần 2)

Nội dung text: Giáo trình Sinh học phân tử - Hoàng Trọng Phán (Phần 2)

1. Chươ ng 5 PHIÊN MÃ VÀ D ỊCH MÃ Nói đến gen t ức là nói đến ADN và các quan h ệ c ủa nó v ới ARN và protein trong sơ đồ Lý thuy ết trung tâm của Sinh h ọc phân t ử; trong đó các s ợi đơn c ủa ADN được dùng làm khuôn cho tái bản (replication). M ặt khác, các gen có th ể làm khuôn cho s ự t ổng h ợp các ARN trong quá trình phiên mã (transcription). Đến l ượt, các phân t ử ARN này l ại làm khuôn cho s ự t ổng h ợp các chu ỗi polypeptide mà t ừ đó t ạo thành các protein, gọi là dịch mã (translation). Phiên mã và d ịch mã là hai giai đọan chính trong s ự bi ểu hi ện c ủa các gen mã hóa protein. Trong ch ươ ng này, chúng ta s ẽ l ần l ượt tìm hi ểu các v ấn đề sau: (i) Quá trình phiên mã; (ii) Cấu trúc và ch ức n ăng c ủa các lo ại ARN c ơ b ản trong t ế bào; (iii) Quá trình dịch mã; và (iv) So sánh nh ững điểm liên quan ở các t ế bào prokaryote và eukaryote. 1. Phiên mã (Transcription) 1.1. Đặc điểm chung c ủa phiên mã ở prokaryote và eukaryote Phiên mã (transcription) là quá trình t ổng h ợp các ARN khác nhau t ừ thông tin di truy ền ch ứa đựng trong ADN. Tr ừ các gen mã hóa protein trong các operon ở vi khu ẩn, nói chung, các ARN mới được t ổng h ợp ch ỉ là các bản sao s ơ c ấp (primary transcript) g ọi là các pre-ARN. Các pre-ARN này ph ải tr ải qua m ột quá trình s ửa đổ i để tr ở thành các ARN tr ưởng thành (mature) tr ước khi tham gia vào quá trình sinh t ổng h ợp protein c ủa t ế bào. Hình 5.1. Cấu trúc chung c ủa m ột gen hay đơn v ị phiên mã. Quá trình phiên mã (Hình 5.2) có các đặc điểm chung sau đây: (i) Di ễn ra d ưới tác d ụng c ủa các enzyme ARN polymerase . (ii) Vùng ADN ch ứa gen được m ở xo ắn c ục b ộ, và ch ỉ m ột m ạch đơn g ọi là mạch có ngh ĩa (sense) được dùng làm khuôn (template) cho t ổng h ợp ARN. (iii) Ph ản ứng t ổng h ợp ARN di ễn ra theo nguyên t ắc b ổ sung và được kéo dài theo chi ều 5' →3', ng ược v ới chi ều c ủa m ạch khuôn nh ư sau: Mạch khuôn: 3'-A-T-G-C-5' Mạch ARN: 5'-U-A-C-G-3' (iv) Nguyên li ệu là 4 lo ại ribonucleoside triphosphate : ATP, UTP, GTP, CTP. (v) S ản ph ẩm c ủa phiên mã là các ARN m ạch đơn. (vi) S ự kh ởi đầ u và k ết thúc phiên mã ph ụ thu ộc vào các tín hi ệu điều hoà là các trình t ự ADN đặ c thù n ằm tr ước và sau gen được phiên mã. 73
2. (vii) Quá trình phiên mã có th ể chia làm ba b ước: Mở đầ u là s ự t ươ ng tác gi ữa ARN polymerase v ới vùng promoter nh ằm xác đị nh m ạch khuôn c ủa gen và t ổng h ợp vài nucleotide; Kéo dài là giai đọan sinh tr ưởng ti ếp t ục c ủa chu ỗi ARN d ọc theo m ạch khuôn cho đế n cu ối gen; và Kết thúc phiên mã đặc tr ưng b ằng s ự gi ải phóng m ạch ARN và ARN polymerase ra kh ỏi khuôn ADN. Hình 5.2. Sự t ổng h ợp ARN trên mạch khuôn c ủa gen (ADN) d ưới tác d ụng c ủa ARN polymerase. 1.2. Phiên mã ở prokaryote 1.2.1. ARN polymerase ở prokaryote Ở các prokaryote, đạ i di ện là E. coli , ARN polymerase hoàn ch ỉnh (holoenzyme) là m ột protein có nhi ều ti ểu đơn v ị, g ồm hai ph ần chính là y ếu t ố sigma ( σ) và lõi enzyme. Yếu t ố sigma (sigma factor) giúp cho ARN polymerase nh ận bi ết và bám ch ặt vào promoter để có th ể b ắt đầ u phiên mã t ại v ị trí chính xác, và lõi enzyme (polymerase core) đóng vai trò chính trong t ổng h ợp mạch ARN. T ất c ả các l ớp ARN ở E. coli đều được phiên mã b ởi ch ỉ m ột ARN polymerase. Sau đây là m ột s ố đặ c tính ho ạt độ ng c ủa ARN polymerase c ủa E. coli (B ảng 5.1; Hình 5.3): Bảng 5.1. Các thành ph ần c ấu trúc c ủa ARN polymerase prokaryote Ti ểu đơn v ị Số l ượng Vai trò dùng để k ết h ợp holoenzyme ARN α 2 polymerase β 1 hình thành liên k ết phosphodiester β' 1 bám khuôn ADN σ 1 nh ận bi ết promoter và kh ởi đầ u phiên mã α2ββ 'σ ↔ ααα2ββ ' + σσσ Holoenzyme = Lõi enzyme + Yếu t ố sigma (i) Khi bám vào promoter, ARN polymerase gây tháo xo ắn ít nh ất 10 bp, nh ưng có l ẽ là kho ảng 17 bp ở vùng lân c ận điểm b ắt d ầu phiên mã. (ii) Búp phiên mã lan t ỏa cùng v ới ARN polymerase làm l ộ ra m ạch khuôn vì v ậy nó có th ể được phiên mã. Th ực t ế, ARN polymerase c ủa E. coli mở r ộng ít nh ất t ừ v ị trí -44 đến +3 trong ph ức h ợp m ở c ủa promoter. 74
3. Hình 5.3. Mô hình ch ức n ăng c ủa vùng đầu cu ối C (C-terminal domain = CTD) của ti ểu đơn v ị α ARN polymerase. (a) Trong lõi promoter, α CTD không được s ử d ụng, nh ưng (b) trong một promoter có y ếu t ố UP, thì α CTD ti ếp xúc v ới y ếu t ố UP. Lưu ý hai ti ểu đơn v ị α được mô t ả: một cái n ằm khu ất sau cái kia. (iii) Ti ểu đơn v ị α c ủa ARN polymerase có m ột vùng ch ức n ăng đầ u C (C-terminal domain = CTD) u ốn g ập m ột cách độ c l ập sao cho có th ể nh ận bi ết và bám vào y ếu t ố điều hòa ng ược dòng của promoter g ọi là UP. Điều này cho phép s ự t ươ ng tác ch ặt gi ữa polymerase và promoter. (iv) Ti ểu đơn v ị α dùng để k ết h ợp holoenzyme ARN polymerase. Và điều này gây ra s ự k ết hợp các g ốc ch ức n ăng ở vùng đầu mút N c ủa α ( α-NTD; N-terminal domain). Các điểm ti ếp xúc gi ữa α-NTD và các ti ểu đơn v ị β và β' n ằm trên các phía đối di ện c ủa dimer α-NTD so v ới các vùng đầu cu ối C c ủa dimer. (v) Ti ểu đơn v ị β lõi bám vào các nucleotide t ại v ị trí ho ạt độ ng c ủa ARN polymerase n ơi mà các liên k ết phosphodiester được hình thành. Y ếu t ố σ c ũng g ần k ề v ị trí bám nucleotide, ít nh ất trong pha kh ởi đầ u. 1.3. Các promoter ở prokaryote Các vùng kh ởi độ ng (promoter) nói chung n ằm k ề tr ước gen và có ch ứa các đoạn trình t ự đặ c thù cho phép ARN polymerase nh ận bi ết và bám ch ặt vào để kh ởi đầ u phiên mã t ại v ị trí chính xác trên m ạch khuôn c ủa gen. Các promoter c ủa các operon ở vi khu ẩn nói chung có c ấu trúc khá t ươ ng đồng. Đoạn trình t ự quan tr ọng nh ất c ủa promoter được g ọi là hộp TATA (TATA box) hay hộp Pribnow (Pribnow box). Đó là trình t ự TATAAT n ằm ở v ị trí “-10'' (Hình 5.4). Ngoài ra, trong các promoter vi khu ẩn còn có trình t ự TTGACA ở g ần v ị trí ''-30'', g ọi là đoạn nh ận bi ết (recognition sequence). Đối v ới các gen mã hóa protein eukaryote, n ằm phía tr ước điểm b ắt đầ u phiên mã ch ừng 75 nucleotide có trình t ự GGCCAAATCT, th ường được g ọi là hộp CCAAT (CCAAT box) - đọc là “hộp cat”; nó đóng vai trò điều hòa t ốc độ phiên mã (Hình 5.4). * Lưu ý: T ất c ả các trình t ự tín hi ệu đề u được quy ước trên mạch đối khuôn c ủa gen, vì chúng có trình t ự gi ống v ới ARN được t ổng h ợp (ch ỉ khác là baz ơ T trong gen được thay b ởi U trong ARN). Các ký hi ệu d ấu '−' và '+' ch ỉ các v ị trí tr ước và sau v ị trí b ắt đầ u phiên mã, còn gọi là các y ếu t ố ng ược dòng ( upstream ) và xuôi dòng ( downstream ). Hình 5.4. Mô hình c ấu trúc vùng kh ởi độ ng (promoter) c ủa E. coli. 75
4. 1.4. Các giai đoạn c ủa quá trình phiên mã ở E. coli - Giai đoạn bám và kh ởi đầ u: Tr ước tiên, enzyme ARN polymerase hoàn ch ỉnh (holoenzyme) nh ận bi ết và bám ch ặt vào promoter s ẽ tháo xo ắn m ột vùng có kích th ước kho ảng 12-17 cặp baz ơ. Tổng h ợp ARN th ường được kh ởi đầ u b ằng nucleotide đầ u tiên là ATP ho ặc GTP. Sau khi holoenzyme ARN polymerase t ổng h ợp được m ột vài nucleotide, nhân t ố sigma tách ra để đi vào một chu k ỳ phiên mã khác, g ọi là chu k ỳ sigma (sigma cycle) (Hình 5.5). - Giai đoạn kéo dài : Enzyme lõi ti ến hành kéo dài chu ỗi ARN theo chi ều 5' →3' dọc theo mạch khuôn có chi ều ng ược l ại. ARN polymerase lõi ti ến đế n đâu thì ADN được m ở xo ắn và phiên mã đến đấ y; và vùng ADN đã được phiên mã đóng xo ắn tr ở l ại. Hình 5.5. ARN polymerase bám promoter (trái) và các giai đoạn kh ởi đầ u phiên mã ở E. coli . - Giai đoạn k ết thúc : Khi quá trình phiên mã t ổng h ợp xong hai đoạn k ết thúc giàu GC và AT nằm đằ ng sau gen thì t ại vùng đuôi mạch ARN hình thành c ấu trúc ''k ẹp tóc'' làm d ừng s ự phiên mã của lõi ARN polymerase. Vi ệc k ết thúc m ột s ố b ản sao ARNc ần t ới y ếu t ố rho (ρ) có b ản ch ất protein, khi ến cho mạch ARN vừa được t ổng h ợp và enzyme lõi được gi ải phóng ra kh ỏi ADN khuôn (Hình 5.6 và 5.7). Hình 5.6. Mô hình c ấu trúc vùng k ết thúc phiên mã (terminator) c ủa prokaryote 76
5. Hình 5.7. Phiên mã ở E. coli, v ới s ự hình thành c ấu trúc “kẹp tóc” và tham gia c ủa y ếu t ố Rho ở giai đoạn k ết thúc phiên mã. L ưu ý, ở vi khu ẩn s ự d ịch mã mARN được b ắt đầ u trong khi phiên mã đang còn ti ếp di ễn. 1.5. Phiên mã và s ửa đổ i ARN sau phiên mã ở eukaryote 1.5.1. Các ARN polymerase ở eukaryote Ở các eukaryote, có ba lo ại ARN polymerase I, II và III v ới s ự phân b ố và ch ức n ăng chuyên hóa khác nhau đối v ới b ộ gen trong nhân, nh ư sau: ARN polymerase I ở trong h ạch nhân (nucleolus) phiên mã ph ức h ợp gen rARN cho s ản ph ẩm g ồm các rARN 18S, 28S và 5,8S; ARN polymerase II có trong d ịch nhân (nucleoplasm) phiên mã các gen mã hóa protein cho s ản ph ẩm là các hARN - ti ền ch ất c ủa các mARN và c ả gen cho các ki ểu snARN; ARN polymerase III có trong d ịch nhân phiên mã các gen tARN, rARN 5S, và c ả snARN U6. Ngoài ra, ARN polymerase ở ty th ể ch ịu trách nhi ệm t ổng h ợp t ất c ả các ARN c ủa ty th ể (B ảng 5.2). Bảng 5.2. Các ARN polymerase ở eukaryote Polymerase Định khu Sản ph ẩm ARN polymerase I hạch nhân các rARN 18S, 28S và 5,8S ARN polymerase II dịch nhân các mARN, snARN (và snARN U1, U2, U3, U4, U5) ARN polymerase III dịch nhân các tARN, ARN 5S, ( và snARN U6, ARN 7S hay 7SL) ARN polymerase ty th ể ty th ể tất c ả các ARN c ủa ty th ể 1.5.2. Các promoter ở eukaryote Các vùng kh ởi độ ng (promoter) nói chung n ằm k ề tr ước gen và có ch ứa các đoạn trình t ự đặ c thù cho phép ARN polymerase nh ận bi ết và bám ch ặt vào để kh ởi đầ u phiên mã t ại v ị trí chính xác trên m ạch khuôn c ủa gen. V ấn đề này t ươ ng đối ph ức t ạp ở các eukaryote, vì v ậy ở đây ta ch ỉ xét các promoter c ủa các gen mã hóa protein mà không đề c ập các lo ại promoter c ủa các gen mã hóa các ARN khác. Các promoter c ủa các gen mã hóa protein eukaryote và c ủa operon vi khu ẩn nói chung có c ấu trúc khá t ươ ng đồng nhau. Nếu nh ư hộp TATA ở vi khu ẩn, có trình t ự TATAAT n ằm ở v ị trí “-10'' thì đối v ới các gen mã hóa protein c ủa eukaryote, đó là trình t ự TATAAA n ằm g ần v ị trí “-30” (Hình 5.8) và nó đặc tr ưng riêng cho các ARN polymerase II. 77
6. Hình 5.8. Cấu trúc vùng kh ởi độ ng (promoter) c ủa eukaryote. Nói chung, các vùng này được b ảo t ồn cao và đặc thù cho t ừng lo ại ARN polymerase nh ất đị nh, được g ọi là các trình t ự điều hòa (consensus sequences). Các đột bi ến thay th ế baz ơ t ại các h ộp TATA, ngh ĩa là làm cho nó b ớt gi ống v ới trình t ự được b ảo t ồn (ví d ụ, TATAAT → TGTAAT) do đó sẽ làm y ếu kh ả n ăng phiên mã c ủa promoter ( down mutation ). Ng ược l ại, các độ t bi ến làm cho các trình t ự promoter tr ở nên gi ống v ới các trình t ự điều hòa (ví d ụ, TATCTT → TATAAT), s ẽ làm m ạnh kh ả n ăng phiên mã c ủa promoter ( up mutation ). 1.5.3. S ửa đổ i sau phiên mã đối v ới s ản ph ẩm c ủa các gen phân đoạn Để tr ở thành các phân t ử mRNA tr ưởng thành có kh ả n ăng tham gia vào quá trình d ịch mã trong tế bào ch ất, t ất c ả các b ản sao mARN (pre-mRNA) c ủa các gen mã hóa protein ở t ế bào eukaryote đều ph ải tr ải qua quá trình s ửa đổ i ARN sau phiên mã ở trong nhân (RNA processing). Sau đó các phân t ử mARN đi ra t ế bào ch ất để tham gia vào quá trình d ịch mã. Hai s ự ki ện s ửa đổ i chính y ếu đố i v ới b ản sao mARN, đó là: – Gắn thêm chóp m 7Gppp và đuôi poly(A); và – Cắt b ỏ các intron và n ối các exon hay còn g ọi là splicing. Các chóp 5' và đuôi poly(A) này có tác d ụng b ảo v ệ mARN kh ỏi b ị phân c ắt b ởi các enzyme trong t ế bào ch ất (Hình 5.9). V ề chi ti ết, xem ở ch ươ ng 6. Hình 5.9. Các b ước t ổng quát của quá trình phiên mã và s ửa đổ i sau phiên mã đối v ới b ản sao pre- mARN của các gen phân đoạn: (1) L ắp chóp 5’-m7Gppp cùng lúc phiên mã; (2) G ắn đuôi poly(A); và (3) Splicing – lo ại b ỏ các intron và nôi các exon. 78
7. 2. C ấu trúc và ch ức n ăng c ủa các ARN Trên nguyên t ắc, các ARN được c ấu t ạo t ừ các đơn phân là các ribonucleotide ; các ribonucleotide này n ối k ết v ới nhau b ằng các liên k ết 3',5'-phosphodiester t ạo thành các chu ỗi polyribonucleotide - cấu trúc s ơ cấp c ủa các phân t ử ARN (Chươ ng 1). Đường pentose đặ c tr ưng của ARN là ribose, còn thành ph ần baz ơ, ngoài b ốn lo ại c ơ b ản adenine (A), uracil (U), guanine (G) và cytosine (C), còn phát hi ện khá nhi ều d ạng baz ơ hi ếm có m ặt ch ủ y ếu trong các tARN. Có ba lo ại phân t ử ARN cơ b ản tham gia vào quá trình sinh t ổng h ợp protein c ủa các t ế bào, đó là: ARN thông tin (messenger RNA = mRNA), ARN vận chuy ển (transfer RNA = tRNA), và ARN ribosome (ribosomal RNA = rRNA). Nói chung, các phân t ử ARN có kích th ước bé h ơn các phân t ử ADN ở b ất k ỳ sinh v ật c ụ th ể nào. Các phân t ử ARN có th ể là mạch đơ n ho ặc mạch kép, m ạch th ẳng ho ặc m ạch vòng nh ưng ph ổ bi ến là d ạng mạch đơ n, th ẳng (nh ưng không th ấy có các phân t ử ARN mạch kép, vòng nào được mô tả). Lo ại ARN có hàm l ượng cao nh ất trong các t ế bào là rARN. Ở Bảng 5.3 cho th ấy hàm l ượng t ươ ng đối (%) và kích th ước (tr ọng lượng phân t ử và s ố nucleotide) c ủa các phân t ử ARN ở vi khu ẩn E. coli . Bảng 5.3. Các phân t ử ARN ở E. coli Lo ại ARN Ch ức n ăng (%) TLPT Số nucleotide mARN Mã hoá các protein 5 Bi ến thiên Bi ến thiên 1 tARN Mang axit amin 15 2,5.10 ~ 75 rARN 5S Thành ph ần ribosome 80 3,6.10 1 120 16S Thành ph ần ribosome 0,55.10 3 1542 23S Thành ph ần ribosome 1,2.10 3 2904 Ngoài ba lo ại ARN chính (rARN, tARN và mARN) có m ặt trong các tế bào prokaryote và eukaryote, các t ế bào eukaryote còn có các loại ARN khác, nh ư: (i) ARN dị nhân , hnARN (heterogenous nuclear RNA) với kích th ước sai bi ệt r ất l ớn, chúng là ti ền thân c ủa các mARN tr ưởng thành sau này; (ii) các ARN nhân kích th ước bé , snARN (small nuclear RNA), v ới các lo ại nh ư U1 → U10 trong đó sáu lo ại đầ u có vai trò quan tr ọng trong x ử lý pre-mARN của các gen phân đoạn; và (iii) ARN tế bào ch ất, scARN (small cytoplasmic RNA) 7SL c ần cho t ổng h ợp các protein ch ế ti ết và bám vào màng; và m ột vài ARN khác n ữa được gi ới thi ệu ở Bảng 5.4. Bảng 5.4. Các l ớp ARN ch ức n ăng chính và ph ụ trong các t ế bào. Loại ARN Ch ức n ăng 1. Các l ớp chính mARN ARN được phiên mã t ừ các gen mã hoá protein, mang thông tin cho d ịch mã. M ột s ố b ản sao t ươ ng t ự mARN không được d ịch mã, ví d ụ XIST, H19 do c ơ ch ế in d ấu b ộ gen bố m ẹ (parental imprinting). hnARN mARN tr ước khi c ắt-nối. Đó là các bản sao ch ưa (heterogenous được s ửa đổ i c ủa các gen eukaryote; s ở d ĩ g ọi nh ư 79
8. nuclear) vậy b ởi vì tính đa d ạng l ớn v ề kích th ước c ủa nó so với tARN và rARN. tARN Phân t ử thích ứng th ực hi ện vi ệc d ịch mã. tARN cũng làm m ồi cho tái b ản ADN trong s ự tái b ản c ủa các retrovirus. Thành ph ần c ấu trúc chính c ủa các ribosome, c ần cho rARN quá trình t ổng h ợp protein c ủa t ế bào. 2. Các l ớp ph ụ iARN Các trình t ự ARN ng ắn được dùng làm m ồi cho s ự (initiator) tổng hợp ADN ở mạch ra ch ậm. snARN (small Các phân t ử ARN tr ọng l ượng phân t ử th ấp phát hi ện nuclear) hay được trong d ịch nhân, là thành ph ần c ủa các enzyme U-RNA cắt b ỏ các intron và các ph ản ứng x ử lý (processing) (uridine-rich) khác; chúng ch ứa nhi ều g ốc uridine được s ửa đổ i. snoARN Các phân tử ARN tr ọng l ượng phân t ử th ấp phát hi ện (small được trong h ạch nhân, có th ể tham gia vào quá trình nucleolar) xử lý rARN (ARN processing). sc ARN (small Các phân t ử ARN tr ọng l ượng phân t ử th ấp phát hi ện cytoplasmic) được trong t ế bào ch ất v ới các ch ức n ăng khác nhau. Ví dụ ARN 7S thành ph ần c ủa ti ểu ph ần nh ận bi ết tín hi ệu và pARN (prosomal), m ột ARN bé k ết h ợp v ới kho ảng 20 protein và được b ọc gói v ới mARN trong mRNP hay th ể thông tin vốn có tác d ụng điều hoà s ự bi ểu hi ện c ủa gen. ARN c ủa Một ARN nhân có chứa khuôn cho các đoạn l ặp telomerase telomere và là thành ph ần c ủa enzyme telomerase . gARN Một lo ại ARN được t ổng h ợp trong các roi độ ng ở (guide RNA) Trypanosoma ; nó cung c ấp khuôn cho biên t ập ARN . ARN antisense ARN ng ược ngh ĩa bổ sung v ới mARN và có th ể tạo thành một m ạch đôi v ới nó để kìm hãm vi ệc t ổng h ợp protein. Nó có trong nhi ều h ệ th ống, nh ưng r ất ph ổ bi ến ở vi khu ẩn; và c ũng g ọi là ARN bổ sung gây nhi ễu mARN . Ribozyme Các phân t ử ARN mà có th ể xúc tác cho các ph ản ứng hoá học, các enzyme ch ứa ARN . Thông th ường nó có ho ạt tính t ự xúc tác (các intron t ự c ắt), nh ưng một ribonuclease P là m ột ch ất xúc tác đích th ực (ví dụ xử lý tARN ). Các ARN khác ho ạt độ ng hài hoà v ới các protein, ví d ụ MRP endonuclease trong tái b ản 80
9. ADN ty th ể. (i) Vùng d ẫn đầ u (5'UTR) không được d ịch mã nh ưng có c ấu trúc c ần thi ết cho s ự bám vào của ti ểu đơn v ị ribosome bé (Hình 5.10). (ii) Vùng mã hoá (coding region) n ằm k ề sau vùng 5'-UTR; nó mang thông tin c ấu trúc c ủa một chu ỗi polypeptide, n ếu là mARN c ủa eukaryote (monocistronic) ho ặc mang thông tin c ủa nhi ều polypeptide khác nhau và cách nhau b ởi các đoạn đệ m không được d ịch mã, n ếu là mARN prokaryote (polycistronic). (iii) Vùng kéo sau (3'-UTR) n ằm ở đuôi mARN, không được d ịch mã. 2.1. ARN thông tin (mARN) Các mARN là lo ại ARN quan tr ọng nh ất được dùng làm khuôn tr ực ti ếp cho quá trình t ổng hợp polypeptide trong t ế bào ch ất. Nhìn chung, các mARN có c ấu trúc m ạch th ẳng, v ới kích th ước khác nhau và đều có ba ph ần chính nh ư sau: Hình 5.10. Cấu trúc chung của mARN. Hình 5.11. Cấu trúc c ủa mARN prokaryote (a) và mARN eukaryote (b). Ở Hình 5.11 cho th ấy nh ững điểm khác nhau trong c ấu trúc c ủa các mARN ở prokaryote và eukaryote, cho th ấy c ấu trúc “mũ” đặc tr ưng có m ặt ở đầ u 5' c ủa t ất c ả các mARN tr ưởng thành ở eukaryote . Trong nhân các t ế bào eukaryote có các ARN nhân kích th ước l ớn và sai khác nhau r ất l ớn g ọi là hnARN (heterogenous nuclear RNA ) v ốn là ti ền thân c ủa các mARN, các ARN nhân kích th ước bé snARN (small nuclear RNA ) có m ặt trong thành ph ần c ủa các enzyme splicing, và các ARN tế bào ch ất kích th ước bé scARN (small cytoplasmic RNA ). Trong các t ế bào động v ật có vú, m ột vài lo ại mARN thì h ết s ức phong phú, trong khi đó h ầu nh ư m ức độ ph ức t ạp c ủa mARN (s ố l ượng lo ại mARN khác nhau) được đạ i di ện b ởi các mARN hi ếm. M ột điểm c ần chú ý là s ự bi ểu hi ện c ủa m ột gen tỷ l ệ v ới độ phong phú c ủa lo ại ARN tươ ng 81
10. ứng (m ột gen bi ểu hi ện càng m ạnh khi s ố b ản sao c ủa nó trong t ế bào càng l ớn). 2.2. Các ARN vận chuy ển (tARN) Mỗi phân t ử tARN có hai ch ức n ăng chính là mang axit amin đã được ho ạt hoá và đi đến ph ức hệ “ribosome-mARN” để ti ến hành vi ệc đọ c d ịch mã cho m ột codon c ụ th ể c ủa mARN. Trong thành ph ần nucleotide c ủa các tARN có khá nhi ều baz ơ chu ẩn b ị bi ến đổ i thành các baz ơ sửa đổ i nh ờ ho ạt độ ng xúc tác c ủa các enzyme sau phiên mã. Các baz ơ này (còn g ọi là các baz ơ hi ếm) t ập trung ch ủ y ếu ở các vòng thân (stem loops) nh ư: 5',6'-dihydrouridine (DHU), inosine (I), ribothymidine (T), pseudouridine ( Ψ) v.v. (Hình 5.12). Hình 5.12. Các baz ơ hi ếm có m ặt trong ARN, ch ủ y ếu là các tARN. Mỗi t ế bào có ch ừng 45-50 phân t ử tARN khác nhau. H ầu h ết các tARN có kho ảng 75-80 nucleotide v ới cấu trúc b ậc hai mở r ộng do các tươ ng tác c ặp baz ơ (A-U và G-C) ở m ột s ố đoạn của chúng (Hình 5.13) cũng nh ư cấu trúc b ậc ba . Đây là ki ểu c ấu trúc “lá ba thùy” gọn nh ẹ, vững ch ắc phù h ợp v ới các ch ức n ăng khác nhau c ủa các tARN. Nói chung, các phân t ử tARN th ường r ất gi ống nhau ở nhi ều đoạn và khác nhau ch ủ y ếu ở bộ ba đối mã (anticodon). Lưu ý r ằng, baz ơ hi ếm Inosine (I) có m ặt ở v ị trí 5' c ủa anticodon trong m ột số phân t ử tARN có th ể k ết c ặp linh ho ạt v ới C, U ho ặc A ở v ị trí 3' c ủa các codon trong mARN. Mỗi tARN th ường có 3-4 vòng trên thân (tính t ừ đầ u 5') v ới ch ức năng khác nhau nh ư sau (Hình 5.13): (i) vòng I - DHU nh ận bi ết aminoacyl-tARN synthetase; (ii) vòng II - anticodon đọc mã trên mARN bằng s ự k ết c ặp anticodon-codon (theo nguyên t ắc bổ nh ưng có s ự linh ho ạt; ch ươ ng 3); (iii) vòng III - ph ụ (extra loop) có th ể không có ở m ột s ố tARN; (iv) vòng IV - TΨC nh ận bi ết ribosome để đi vào đúng v ị trí ti ếp nh ận aminoacyl-tARN (v ị trí A). Và cu ối cùng, đoạn m ạch th ẳng -CCA ở đầ u 3' là v ị trí g ắn vào c ủa axit amin đã được ho ạt hoá để t ạo thành các aminoacyl-tARN. 82
11. (a) (b) Hình 5.13. (a) Cấu trúc b ậc hai (trái) và b ậc ba của tARN-Ala. (b) M ột s ơ đồ hóa khác v ề cấu trúc của tARN (trái) và ho ạt độ ng d ịch mã trên mARN theo nguyên t ắc b ổ sung – ng ược chi ều gi ữa anticodon và codon. 2.3. ARN ribosome (rARN) và ribosome Các rARN cùng v ới các protein đặ c thù là nh ững thành ph ần c ấu trúc nên các ribosome là “nhà máy” tổng h ợp protein c ủa t ế bào. Ở vi khu ẩn có 3 lo ại rARN có các h ệ s ố l ắng là 23S, 16S (Hình 5.14) và 5S, v ới s ố l ượng nucleotide t ươ ng ứng là 2904, 1542 và 120 (Bảng 5.5). Ở t ế bào eukaryote có 4 lo ại rARN với các hệ s ố l ắng là 28S, 18S, 5,8S và 5S (Hình 5.15). Riêng các t ế bào th ực v ật còn có các rARN được mã hoá bởi ADN l ạp th ể (chloroplast DNA = cpDNA). 83
12. Hình 5.14. Cấu trúc b ậc hai c ủa rARN 16S. Hình 5.15. Cấu trúc t ổng quát các đơn v ị phiên mã c ủa pre-rARN ở các eukaryote. Ba vùng mã hóa (màu xanh) mã hóa các rARN 18S, 5.8S và 28S phát hi ện được trong các ribosome c ủa các eukaryote b ậc cao ho ặc một s ố loài t ươ ng đươ ng v ới chúng. Th ứ t ự các vùng mã hóa trong các b ộ gen này luôn luôn theo chi ều 5' →3'. S ự thay đổ i v ề độ dài các đoạn đệ m được phiên mã (vàng nh ạt) nói lên s ự sai khác trong chi ều dài c ủa các đơn v ị phiên mã (transcription unit) c ủa pre-rARN ở các sinh v ật khác nhau. Mỗi ribosome hoàn ch ỉnh có hai ti ếu đơn v ị bé và lớn. Hai ti ểu đơn v ị này ch ỉ k ết h ợp v ới nhau t ạo ra m ột ribosome ho ạt độ ng khi quá trình d ịch mã trên mARN th ực s ự b ắt đầ u. Ti ểu đơn v ị bé bám vào mARN tr ước tiên trong d ịch mã. Ti ểu đơn v ị l ớn ch ứa hai v ị trí: v ị trí A là n ơi bám vào của aminoacyl-tARN và v ị trí P là ch ỗ d ừng t ạm c ủa peptidyl-tARN. Trong ti ểu đơn v ị l ớn có ch ứa peptidyl transferase . Enzyme này có ch ức n ăng tách g ốc peptidyl ra kh ỏi tARN của nó ( ở v ị trí P) và n ối v ới aminoacyl-tARN (ở v ị trí A) b ằng m ột liên k ết peptide làm cho chu ỗi polypeptide sinh tr ưởng dài ra theo chi ều N → C. Các h ợp phần c ấu t ạo nên các ribosome c ủa prokaryote và eukaryote được trình bày ở B ảng 5.5 và Hình 5.16. (a) (b) 84
13. (c) Hình 5.16. Cấu trúc ribosome c ủa E. coli . (a) Ribosome 70S nhìn t ừ m ặt bên với ti ểu ph ần 30S particle (màu vàng) và ti ểu ph ần 50S ( đỏ ) đang dính v ới nhau. (b) Ribosome 70S xoay m ột góc 90 độ so v ới hình (a). [Ngu ồn: J. Lake (1976), J. Mol. Biol. 105; p.155, fig.14]. (c) S ơ đồ các v ị trí ho ạt độ ng c ủa m ột ribosome. 3. D ịch mã (Translation) Dịch mã (translation) hay t ổng h ợp protein là m ột quá trình sinh h ọc quan tr ọng di ễn ra trong tế bào ch ất, và ph ụ thu ộc vào nhi ều y ếu t ố; quan tr ọng nh ất là các mARN, tARN và ribosome. mARN mang thông tin quy định trình t ự k ết h ợp các axit amin vào chu ỗi polypeptide, mà vi ệc d ịch mã mARN được th ực hi ện b ởi các aminoacyl-tARN, còn ribosome đóng vai trò ổn đị nh vi ệc k ết hợp gi ữa mARN v ới các tARN (Hình 5.18). Quá trình này được chia làm hai giai đoạn d ưới đây. Bảng 5.5. Thành ph ần c ấu t ạo c ủa ribosome ở Prokaryote và Eukaryote Vi khu ẩn Tế bào động v ật có vú RIBOSOME 70S 80S Đường kính 18-20 nm 20-22 nm Ti ểu đơn v ị l ớn 50S 60S rARN 23S (2904 nt) 28S (4.718 nt) 5S (120 nt) 5,8S (160 nt) 5S (120 nt) Protein 34 phân t ử ~50 phân t ử Ti ểu đơn v ị bé 30S 40S rARN 16S (1.542 nt) 18S (1.874 nt) Protein 21 phân t ử ~35 phân t ử 3.1. Ho ạt hoá axit amin Quá trình này di ễn ra trong bào t ươ ng t ạo ngu ồn các tARN mang các axit amin s ẵn sàng tham gia d ịch mã. M ỗi axit amin được đính vào tARN thích h ợp nh ờ m ột enzyme aminoacyl-tARN synthetase đặc thù. Tr ước tiên, enzyme này (E) xúc tác cho ph ản ứng ATP ho ạt hoá axit amin, v ới sự có m ặt c ủa Mg 2+ , t ạo ra ph ức h ợp [aminoacyl-AMP + E]. (Hình 5.17) R−CH(NH 2)−COOH + ATP → E*[R−CH(NH 2)−CO~AMP] + PP Ti ếp theo, c ũng d ưới tác d ụng c ủa enzyme đó, ph ức h ợp này k ết h ợp v ới tARN thích h ợp 85
14. bằng liên k ết đồ ng hoá tr ị để t ạo ra aminoacyl-tARN . E*[R−CH(NH 2)−CO~AMP] + tARN → R−CH(NH 2)−CO~tARN + AMP 3.2. C ơ ch ế d ịch mã (t ổng h ợp chu ỗi polypeptide) Bước 1: M ở đầ u (initiation) Quá trình d ịch mã b ắt đầ u khi m ột ti ểu đơn v ị ribosome bé bám vào mARN t ại v ị trí c ủa codon kh ởi đầ u AUG. Lúc này m ột phân t ử tARN kh ởi đầ u đặ c thù mang methionine ( ở vi khu ẩn là formyl-Met; c ấu trúc c ủa Met và f-Met được gi ới thi ệu d ưới đây) đi vào và kh ớp anticodon c ủa nó với codon m ở đầ u c ủa mARN. K ế đó, ti ểu đơn v ị ribosome l ớn bám vào ti ểu đơn v ị bé t ạo ra m ột ribosome ho ạt độ ng hoàn ch ỉnh. Lúc này Met-tARN ở v ị trí P và v ị trí A để tr ống; m ột tARN th ứ hai (aa 2- tARN) đi vào v ị trí A và kh ớp v ới codon th ứ hai (Hình 5.20). amino acid R O tRNA - = H2N-C-C-OH 3’ - H ATP R O - = H2N-C-C-O-P-O-ribose-adenine PPi - H amino acid đã được ho ạt hoá AMP R O - = H2N-C-C-O - Ho ạt hoá amino acid và H gắn aa vào tRNA aminoacyl-tRNA Hình 5.17. Sự ho ạt hoá axit amin và g ắn axit amin đã ho ạt hoá vào tARN. Hình 5.18. Một ribosome đang tham gia d ịch mã trên mARN cùng với các tARN mang các axir amin tươ ng ứng. Ở E. coli , b ước này có s ự tham gia c ủa các y ếu t ố m ở đầ u (IF-1, IF-2 và IF-3), GTP và đặc bi ệt là, s ự t ươ ng tác gi ữa trình t ự Shine-Dalgarno giàu purine ở vùng 5'-UTR c ủa mARN v ới trình tự b ổ sung c ủa rARN 16S có mặt trong ti ểu đơn v ị ribosome bé (R30S). Nh ờ đó R30S có th ể bám 86
15. vào mARN, nh ận bi ết codon m ở đầ u AUG để có th ể b ắt đầ u quá trình d ịch mã tại v ị trí chính xác (Hình 5.19). Hình 5.19. Mở đầ u d ịch mã ở t ế bào E. coli (trên) và trình t ự Shine-Dalgarno ở vùng 5'UTR c ủa E. coli và các phage c ủa chúng. Bước 2: Kéo dài (elongation) Quá trình kéo dài b ắt đầ u sau khi liên k ết peptide đầu tiên được hình thành. Ph ản ứng này được xúc tác b ởi enzyme peptidyl transferase , và k ết qu ả là t ạo ra m ột peptidyl-tARN ở v ị trí A (fMet-aa 2-tARN). Sau đó, ribosome l ập t ức chuy ển d ịch sang m ột codon m ới d ọc theo mARN theo chi ều 5' →3'. Ph ản ứng này đẩy phân t ử tARN t ự do v ốn ở v ị trí P ra ngoài; lúc này peptidyl-tARN (fMet-aa 2-tARN) n ằm ở v ị trí P và v ị trí A l ại để tr ống. M ột chu k ỳ d ịch mã m ới l ại b ắt đầ u, m ột aminoacyl-tARN th ứ ba (aa 3-tARN) đi vào và kh ớp anticdon c ủa nó v ới codon đang để tr ống ở v ị trí A, m ột liên k ết peptid th ứ hai được hình thành (fMet-aa 2-aa 3-tARN), và ribosome l ại d ịch chuy ển sang codon k ế ti ếp. Quá trình nói trên di ễn ra m ột cách tu ần t ự d ọc theo mARN theo chu k ỳ ba bước nói trên, và làm cho chu ỗi polypeptide dài d ần ra cho đến d ịch mã xong codon có ngh ĩa cu ối cùng (Hình 5.21). Bước 3: K ết thúc (termination) Quá trình t ổng h ợp chu ỗi polypeptide s ẽ d ừng l ại khi m ột codon k ết thúc được đưa đối di ện với v ị trí A để tr ống, v ốn được nh ận bi ết b ởi m ột protein k ết thúc g ọi là nhân t ố gi ải phóng RF (release factor). S ự có m ặt c ủa nó cùng v ới transferase c ắt r ời chu ỗi polypeptide ra kh ỏi tARN cu ối cùng và phóng thích hai ti ểu đơn v ị ribosome c ũng nh ư chu ỗi polypeptide và tARN ra kh ỏi mARN (Hình 5.22). 87
16. Hình 5.20. Mở đầ u d ịch mã ở t ế bào E. coli . Hình d ưới phân bi ệt c ấu t ạo c ủa N-formylmethionine - axit amin Met đã được s ửa đổ i để ch ỉ chuyên làm nhi ệm v ụ m ở đầ u cho quá trình d ịch mã ở fMet tế bào vi khu ẩn (nó được nh ận bi ết và mang b ởi m ột lo ại tARN m ở đầ u g ọi là tRNA i ) v ới lo ại Methionine bình th ường. Hình 5.21. Quá trình tổng h ợp kéo dài chu ỗi polypeptide. 88
17. Hình 5.22. Quá trình k ết thúc tổng h ợp chu ỗi polypeptide . 4. Nh ững điểm khác bi ệt trong phiên mã và d ịch mã ở prokaryote và eukaryote (1) Trên đây m ới ch ỉ phân tích ho ạt độ ng c ủa m ột ribosome trên mARN. Th ực ra, trên m ột mARN có r ất nhi ều ribosome cùng ho ạt độ ng, g ọi là polyribosome hay polysome , t ạo ra nhi ều polypeptide gi ống nhau. Hình 5.23. Nhi ều ribosome (polysome) n ối đuôi nhau tr ượt qua mARN để t ổng h ợp hàng lo ạt polypeptide trên m ột phân t ử mARN. (2) Trên nguyên t ắc, axit amin mở đầ u s ẽ được c ắt b ỏ kh ỏi chu ỗi polypeptide (sau khi t ổng hợp được vài axit amin nh ư trong tr ường h ợp các vi khu ẩn) ho ặc tr ước khi chu ỗi được t ổng h ợp đầ y đủ (nh ư ở tr ường h ợp eukaryote). Tuy nhiên, ở các eukaryote không ph ải lúc nào axit amin mở đầ u này c ũng b ị tách b ỏ, mà trong m ột s ố protein nó v ẫn được gi ữ l ại. (3) Sau khi được t ổng h ợp, các chu ỗi polypeptide s ơ c ấp này s ẽ được s ửa đổ i và chuy ển sang các b ậc c ấu trúc cao h ơn theo cách đặc thù để tr ở thành các protein ho ạt độ ng ch ức n ăng. 89
18. (4) Tham gia vào các b ước m ở đầ u, kéo dài và k ết thúc còn có các y ếu t ố protein, v ới tên g ọi tươ ng ứng là các nhân t ố m ở đầ u (IF: initiation factor), nhân t ố kéo dài (EF: elongation factor; g ồm 2+ + + EF-Tu và EF-G), và nhân t ố gi ải phóng (release factor) v ới GTP và các ion Mg , K và NH 4. (5) Trong các t ế bào prokaryote, do không có màng nhân và các mARN đa cistron v ốn d ĩ không ph ải qua s ửa đổ i sau phiên mã, cho nên các ribosome và các aminoacyl-tARN sẽ bám vào đầu 5' c ủa mARN để b ắt đầ u quá trình d ịch mã ngay trong khi ở đầ u 3' c ủa nó quá trình phiên mã đang còn ti ếp di ễn. Ng ược l ại, ở các t ế bào eukaryote vì có màng nhân phân cách và các pre-mARN còn ph ải tr ải qua các công đoạn s ửa đổ i ph ức t ạp sau phiên mã (t ất c ả đề u di ễn ra trong nhân), còn dịch mã di ễn ra sau đó ở trong t ế bào ch ất. Vì th ế cho nên phiên mã và d ịch mã rõ ràng là hai quá trình tách bi ệt nhau c ả v ề c ả không gian l ẫn th ời gian. TÓM T ẮT (1) Phiên mã và d ịch mã là hai hai giai đọan chính trong s ự bi ểu hi ện c ủa các gen mã hóa protein ở các t ế bào. Phiên mã là quá trình t ổng h ợp các ARN t ừ m ạch khuôn c ủa các gen c ấu trúc, xảy ra d ưới tác d ụng c ủa các ARN polymerase theo nguyên t ắc b ổ sung và ng ược chi ều v ới m ạch khuôn c ủa gen. Còn quá trình t ổng h ợp protein di ễn ra t ại các ribosome trong t ế bào ch ất trên khuôn của mARN, v ới s ự tham gia c ủa các tARN (2) Trong khi s ự phiên mã t ất c ả các gen trong b ộ gen ở sinh v ật nhân s ơ ch ỉ do 1 lo ại ARN polymerase đảm nh ận, thì ở các t ế bào sinh v ật nhân chu ẩn có t ới 3 lo ại ARN polymerase I, II và III ch ịu trách nhi ệm t ổng h ợp các lo ại ARN khác nhau c ủa t ế bào. Promoter là c ơ ch ất tác độ ng chính của các ARN polymerase, chúng có các trình t ự b ảo t ồn cao độ - gọi là h ộp TATA. (3) Trong m ọi t ế bào đều có ba lo ại phân t ử ARN tham gia vào quá trình t ổng h ợp protein: mARN, tARN và rARN. Ở các tế bào nhân chu ẩn còn có nhi ều lo ại ARN khác n ữa th ực hi ện các ch ức n ăng khác nhau. (4) T ổng h ợp protein là quá trình ph ức t ạp có sự tham gia c ủa nhi ều y ếu t ố, trong đó quan tr ọng nh ất là các mARN, tARN và ribosome c ũng nh ư các enzyme và ngu ồn n ăng l ượng c ần thi ết. Kết qu ả là t ổng h ợp ra các phân t ử protein tham gia vào m ọi ho ạt độ ng s ống c ơ s ở c ủa t ế bào. CÂU H ỎI VÀ BÀI T ẬP 81. Trong quá trình d ịch mã, ribosome d ịch chuy ển trên mARN ngay sau khi kh ớp b ổ sung gi ữa anticodon và codon. (a) Đúng. (b) Sai. 82. Về m ặt t ổ ch ức, mARN tr ưởng thành c ủa prokaryote khác bi ệt m ột cách c ăn b ản v ới mARN c ủa eukaryote ch ủ y ếu ở vùng nào? A. Vùng kh ởi độ ng. B. Vùng mã hoá protein. C. Vùng theo sau hay 3'-UTR. D. Vùng d ẫn đầ u hay 5'-UTR. 83. Phiên mã là quá trình t ổng h ợp các ARN theo chi ều ___ d ưới tác d ụng c ủa ARN polymerase ho ạt độ ng d ọc theo m ạch khuôn có chi ều ___. A. 5' đến 3'; 5' đế n 3. B. 5' đến 3'; 3' đế n 5'. C. 3' đến 5'; 5' đế n 3'. D. 3' đến 5'; 3' đế n 5'. 90
19. 84. Phát bi ểu nào sau đây về các gen mã hoá các histone là không đúng? A. Đằng sau các gen không có trình t ự AATAAA. B. Các mARN tr ưởng thành không có đuôi poly(A). C. Các mARN c ủa chúng không có chóp m 7Gppp. D. Không có quá trình c ắt-nối (splicing) sau phiên mã. 85. Sự đọ c mã trên mARN di ễn ra trung th ực là do A. peptidyl transferase. B. đoạn -CCA (3’). C. aminoacyl~tARN synthetase. D. anticodon c ủa tARN. 86. Phân tích c ấu trúc và t ổ ch ức c ủa m ột gen điển hình cho b ộ gen các sinh v ật nhân chu ẩn và v ẽ một s ơ đồ minh h ọa. 87. Một đoạn trình t ự baz ơ ở mạch đố i khuôn của m ột gen mã hóa protein nh ư sau: 5'- AACGTATTCAACTCA-3'. Hãy cho bi ết: (a) Trình t ự baz ơ c ủa ARNm và trình t ự axit amin tươ ng ứng. (b) Đoạn polypeptid s ẽ nh ư th ế nào n ếu m ột đột bi ến đồ ng hoán x ảy ra đố i v ới nucleotid G trên m ạch này? 88. Một đoạn trình t ự c ủa gen được cho nh ư sau: Mạch 1: 5'-AAATCGATTGGCACA-3' Mạch 2: 3'-TTTAGCTAACCGTGT-5' Hãy cho bi ết trình t ự baz ơ c ủa ARNm (5' → 3') và trình t ự axit amin c ủa peptide khi: (a) m ạch 1 là m ạch khuôn, và (b) m ạch 2 là khuôn. 89. Gi ả s ử m ột ARNm có trình t ự mã hóa protein nh ư sau: 5'-AUG-UUC-AUU-GAA-GGC-AUC-AAC-GGU-UAA-3' Hãy xác định trình t ự nucleotide c ủa gen và trình t ự axit amin c ủa protein. 90. (a) Hàm l ượng GC c ủa ADN phage T3 là 53%. Bạn s ẽ k ỳ v ọng hàm l ượng G+C c ủa mARN T3 ra sao? (b) N ếu cho tr ước hàm l ượng purin c ủa ADN T3 và không bi ết m ạch nào được sao mã, bạn có th ể d ự đoán hàm l ượng purin c ủa mARN T3? T ại sao, ho ặc t ại sao không? 91. Phân tích ng ắn g ọn vai trò c ủa các y ếu t ố tham gia vào quá trình sinh t ổng h ợp protein ở t ế bào ch ất. 92. Anh (ch ị) hãy làm sáng t ỏ nh ận đị nh sau: Khác v ới các t ế bào ti ền nhân, s ự phiên mã và d ịch mã ở các t ế bào nhân chu ẩn là các quá trình gián đoạn, tách bi ệt nhau c ả v ề không gian l ẫn th ời gian. 93. Phân tích s ự t ươ ng tác gi ữa ba thành ph ần chính là mARN, các aminoacyl~ARNt và ribosome để làm n ổi b ật vai trò quan tr ọng c ủa chúng trong c ơ ch ế t ổng h ợp chu ỗi polypeptit. 94. Hãy ch ỉ ra nh ững đặ c điểm gi ống và khác nhau trong c ấu trúc c ủa các mARN tr ưởng thành c ủa các t ế bào prokaryote và eukaryote. 95. Nêu nh ững điểm chính trong s ửa đổ i sau phiên mã đối v ới s ản ph ẩm phiên mã s ơ c ấp c ủa các gen phân đoạn và vai trò c ủa các intron. 96. Phân tích s ự phù h ợp gi ữa c ấu trúc và ch ức n ăng c ủa các mARN. 97. Phân tích s ự phù h ợp gi ữa c ấu trúc và ch ức n ăng c ủa các tARN. 91
20. 98. Có nh ững lo ại rARN nào trong các t ế bào prokaryote và eukaryote? Chúng đóng vai trò gì trong tế bào? 99. Hãy cho bi ết s ự gi ống nhau và khác nhau trong thành ph ần c ấu t ạo c ủa các ribosome ở các t ế bào prokaryote và eukaryote. 100. Dưới đây là s ơ đồ c ủa m ột ADN s ợi kép được sao mã. 1. ___ 2. ___ 3. Sợi 1 là s ợi không làm khuôn. S ợi 3 là ARN sinh ra. Hãy đánh d ấu các đầ u 5’ và 3’ c ủa ARN và sợi không làm khuôn, và c ủa s ợi khuôn. 92
21. Chươ ng 6 ĐIỀU HOÀ S Ự BI ỂU HI ỆN C ỦA GEN Trên th ực t ế, các gen không t ồn t ại riêng r ẽ và ho ạt độ ng nh ư nh ững th ực th ể bi ệt l ập v ới m ột cường độ ổn đị nh. Trái l ại, gi ữa các gen trong b ộ gen có s ự ki ểm soát l ẫn nhau và ph ụ thu ộc vào điều ki ện môi tr ường. Mỗi bộ gen tế bào là m ột h ệ th ống m ở có kh ả n ăng t ự điều ch ỉnh, đả m b ảo s ự ho ạt độ ng c ủa các gen trong t ừng giai đoạn phát tri ển di ễn ra h ợp lý tr ước điều ki ện c ụ th ể c ủa môi tr ường. S ự điều hoà ho ạt độ ng c ủa các gen được bi ểu hi ện ở nhi ều m ức độ theo nh ững c ơ ch ế đặ c thù cho từng nhóm loài. Đây là khía c ạnh ph ức t ạp nh ất c ủa sinh h ọc phân t ử. Hi ểu được các nguyên lý của điều hòa ho ạt độ ng gen là nắm được chìa khóa đi vào bí ẩn c ủa sự tồn t ại được c ất gi ấu k ỹ trong các b ộ gen. Trong ch ươ ng này, chúng ta l ần l ượt tìm hi ểu các v ấn đề sau: (i) Các nguyên lý chung trong s ự điều hòa bi ểu hi ện c ủa gen ở các mức độ khác nhau c ủa c ả hai h ệ th ống, prokaryote và eukaryote, mà tr ọng tâm là điều hoà ho ạt độ ng gen của vi khu ẩn ở mức phiên mã. (ii) Mô hình operon là gì? Ở vi khu ẩn có các h ệ th ống operon nào và c ơ ch ế điều hòa ho ạt độ ng c ủa chúng ra sao? (iii) Ở eukaryote có các ki ểu điều hòa c ơ b ản nào? 1. Đại c ươ ng về sự điều hòa bi ểu hi ện c ủa gen Nói chung, sự điều hoà bi ểu hi ện c ủa gen ở các nhóm prokaryote và eukaryote di ễn ra ở nhi ều mức độ : phiên mã, sau phiên mã, d ịch mã và sau d ịch mã. Tuy nhiên, hai nhóm này có trình độ ti ến hóa khác nhau nên ph ươ ng th ức t ổ ch ức và điều hòa ho ạt độ ng c ủa các gen là r ất khác nhau. Ở vi khu ẩn, các gen liên quan v ới nhau v ề ch ức n ăng được xếp trong m ột t ổ ch ức g ọi là operon ; chúng được phiên mã chung trong m ột phân t ử mARN đa cistron và được d ịch mã thành các protein trong khi phiên mã mà không ph ải tr ải qua quá trình s ửa đổ i sau phiên mã, ngo ại tr ừ các gen mã hóa các tARN và rARN. S ự điều hòa sau d ịch mã ở vi khu ẩn, nh ư đã xét ở ch ươ ng tr ước, ch ủ y ếu x ảy ra ở giai đoạn m ở đầ u quá trình d ịch mã, do s ự t ươ ng tác gi ữa trình t ự Shine-Dalgarno ở vùng 5'-UTR c ủa mARN v ới trình t ự t ươ ng ứng trong rARN 16S c ủa ti ểu đơn v ị ribosome bé. Trong khi đó ở sinh v ật nhân chu ẩn, h ầu h ết các gen là gen phân đoạn và không có t ổ ch ức ki ểu operon nh ư ở sinh v ật nhân s ơ. Các gen phiên mã riêng bi ệt t ạo thành các b ản sao đơn s ơ c ấp gọi là pre-mARN đơ n cistron; nó c ũng có các exon và intron y nh ư trong gen. Để có th ể tr ỏ thành các phân t ử mARN tr ưởng thành đi ra t ế bào ch ất làm khuôn cho t ổng h ợp protein, các pre-mARN này ph ải tr ải qua các quá trình s ửa đổ i ở trong nhân, bao g ồm: Lắp chóp m7Gppp ở đầ u 5' và gắn đuôi poly(A) ở đầ u 3', và sau đó là c ắt b ỏ các intron trong m ột quá trình g ọi là splicing . Ở nhi ều gen còn có quá trình cắt n ối ch ọn l ọc tạo ra nhi ều phân t ử mARN khác nhau và do đó t ạo ra nhi ều protein hay peptide khác nhau t ừ s ản ph ẩm pre-mARN c ủa cùng m ột gen phân đoạn. 93
22. Hình 6.1. Nh ững điểm khác bi ệt n ổi b ật trong tổ ch ức và ho ạt độ ng c ủa các gen mã hóa protein ở prokaryote (A) và eukaryote (B). 2. Điều hoà bi ểu hi ện gen ở prokaryote 2.1. Cấu trúc Operon Ph ần l ớn các gen trong b ộ gen vi khu ẩn được t ổ ch ức thành các đơ n v ị ho ạt độ ng ch ức n ăng đặc tr ưng, gọi là các operon . Các gen cấu trúc trong m ột operon được điều hoà chung trong quá trình chuy ển hoá m ột h ợp ch ất nh ất đị nh c ủa t ế bào. Mô hình operon được F. Jacob và J. Monod (1961) đư a ra l ần đầ u tiên là operon Lactose ( lac operon; để cho ti ện ta vi ết: operon Lac) v ốn được nghiên c ứu k ỹ nh ất cho đế n nay (Hình 6.2). Tham gia vào điều hòa ho ạt độ ng c ủa m ột operon g ồm có b ốn y ếu t ố thu ộc hai thành ph ần chính: (i) c ác locus c ấu trúc (structural loci) và (ii) các locus điều hòa (regulatory loci); trong đó nhóm sau bao g ồm y ếu t ố vận hành, vùng kh ởi độ ng và gen điều hòa. - Một nhóm các gen cấu trúc (structural genes) liên quan v ề m ặt ch ức n ăng, x ếp c ạnh nhau, khi phiên mã s ẽ t ạo ra m ột phân t ử mARN chung g ọi là mARN đa cistron (polycistronic mRNA). Đối v ới operon Lac, đó là ba gen: lacZ , lacY và lacA; trong đó lacZ mã hoá β-galactosidase (thu ỷ phân lactose thành galactose và glucose), lacY xác định permease (v ận chuy ển lactose qua màng) và lacA mã hoá transacetylase. - Một yếu t ố v ận hành (operator = O): trình tự ADN n ằm k ế tr ước nhóm gen c ấu trúc, là v ị trí tươ ng tác v ới ch ất ức ch ế. Đố i v ới operon-lac, đó là đoạn trình t ự ADN dài 34 c ặp baz ơ cách gen Z ch ừng 10 c ặp baz ơ v ề phía tr ước. Nó ch ứa trình t ự 24 c ặp baz ơ đối x ứng xuôi ng ược, giúp ch ất ức ch ế có th ể nhận bi ết và bám vào b ằng cách khu ếch tán d ọc theo ADN t ừ c ả hai phía (Hình 6.2). 94
23. Hình 6.2. Mô hình operon lactose ở E. coli (hình trên) và s ự phân gi ải phân t ử đường lactose thành glucose và galactose bởi enzyme β-galactosidase. - Một vùng kh ởi độ ng (promoter region = P): trình t ự ADN nằm tr ước y ếu t ố vận hành và có th ể trùm lên m ột ph ần ho ặc toàn b ộ vùng này, là v ị trí bám vào c ủa ARN polymerase. Đối v ới operon Lac, đó là đoạn ADN đặc thù vài ch ục cặp baz ơ nằm tr ước yếu t ố v ận hành O và gối lên nó 7 c ặp baz ơ. Điểm kh ởi đầ u phiên mã là v ị trí g ần cu ối c ủa vùng kh ởi độ ng P n ằm trong đoạn vận hành O. - Một gen điều hoà hay còn g ọi là gen ức ch ế (regulatory/ inhibitory gene = R/I): Gen này sinh ra lo ại protein điều hoà g ọi là ch ất ức ch ế (repressor) điều hòa ho ạt độ ng c ủa nhóm gen cấu trúc thông qua s ự t ươ ng tác v ới y ếu t ố vận hành. Đối v ới operon Lac, gen lacI nằm tr ước vùng kh ởi động P, nó mã hoá m ột ch ất ức ch ế g ồm b ốn polypeptide gi ống nhau đề u ch ứa 360 axit amin và t ự nó có ái l ực v ới vùng O. M ặc dù m ỗi gen điều hòa có m ột vùng kh ởi độ ng và không có y ếu t ố vận hành riêng, đôi khi ng ười ta v ẫn coi chúng là operon điều hòa (có tính ch ất c ơ định). Tóm l ại, operon là đơ n v ị điều hoà ho ạt độ ng gen của các prokaryote, đặc tr ưng b ởi ph ức h ợp liên k ết gi ữa vùng kh ởi độ ng cùng v ới y ếu t ố vận hành và nhóm gen cấu trúc do nó ki ểm soát. Một s ố điểm c ần l ưu ý: - Để nghiên c ứu vai trò c ủa m ỗi y ếu t ố, ng ười ta dùng ph ươ ng pháp gây đột bi ến gen đố i v ới các locus khác nhau c ủa operon. - Các locus ki ểu d ại ký hi ệu b ằng d ấu cộng (+) và các locus đột bi ến bằng d ấu tr ừ (–) ở phía trên locus. Đột bi ến có th ể là tr ội ho ặc l ặn, tùy tr ường h ợp. - Ở vi khu ẩn, m ỗi m ột độ t bi ến gen n ếu nh ư làm thay đổi m ột đặ c tính sinh lý - sinh hóa (ki ểu hình) c ủa t ế bào được coi là t ạo ra m ột nòi m ới. - Kiểu gen c ủa vi khu ẩn là đơ n b ội. Tuy nhiên, b ộ gen các t ế bào vi khu ẩn c ũng có th ể ở tr ạng thái lưỡng b ội m ột ph ần; ấy là do ở vi khu ẩn có các ph ươ ng th ức trao đổ i di truy ền thông qua các quá trình sau: ti ếp h ợp (conjugation), bi ến n ạp (transformation) và tải n ạp (transduction). Hình th ức sinh s ản này được g ọi là sinh s ản c ận h ữu tính (parasexual reproduction) ch ứ không ph ải h ữu tính. 2.2. Điều hoà ho ạt độ ng c ủa Operon lactose (lac operon) 2.2.1. Điều hoà âm tính Operon lactose Khi trong môi tr ường nuôi c ấy E. coli không có lactose (ch ất c ảm ứng) thì operon không ho ạt 95
24. động, ngh ĩa là các enzyme tham gia phân gi ải lactose không được sinh ra. Nguyên nhân là do ch ất ức ch ế bám ch ặt vào y ếu t ố v ận hành gây ức ch ế s ự phiên mã c ủa các gen c ấu trúc. Hình 6.3. Cơ ch ế điều hòa âm tính của operon Lac. (a) Khi môi tr ường v ắng m ắt lactose, operon r ơi vào tr ạng thái b ị ức ch ế. (b) Khi môi tr ường có m ắt lactose, operon được kh ử ức ch ế. Hình 6.4. Ch ất c ảm ứng allolactose (liên k ết β-1,6 glycoside) do lactose (liên k ết β-1,4) bi ến đổ i thành d ưới tác d ụng c ủa enzyme β-galactosidase. Ng ược l ại, n ếu b ổ sung lactose vào môi tr ường thì m ột th ời gian sau vi khu ẩn s ẽ b ắt đầ u h ấp th ụ và phân gi ải nó, ngh ĩa là các enzyme liên quan đã được sinh ra. Sự ki ện này được lý gi ải như sau: Ch ất c ảm ứng (inducer) ở đây là allolactose (liên k ết β-1,6 glycoside) – một d ạng đồ ng phân của lactose (liên k ết β-1,4) – tươ ng tác v ới ch ất ức ch ế (repressor) và làm bi ến đổ i hình dáng c ủa ch ất này. Vì v ậy ch ất ức ch ế m ất ái l ực và không th ể bám vào y ếu t ố v ận hành. Lúc này các gen c ấu trúc được phiên mã và t ổng h ợp các enzyme t ươ ng ứng giúp vi khu ẩn h ấp th ụ và phân gi ải đường lactose nh ư m ột ngu ồn n ăng l ượng và carbon. Lactose vì v ậy là tác nhân gây c ảm ứng (ho ạt hóa) operon. 2.2.2. Điều hoà d ươ ng tính Operon lactose Ho ạt độ ng c ủa operon-lac còn ch ịu s ự ki ểm soát c ủa m ột protein điều hoà d ươ ng tính liên quan v ới s ự có m ặt c ủa glucose. 96
25. Hình 6.5. Điều hòa d ươ ng tính c ủa operon Lac. Khi trong môi tr ường có m ặt đồ ng th ời c ả lactose và glucose thì operon Lac t ạm ng ưng ho ạt động g ọi là ức ch ế d ị hoá t ạm th ời. Khi glucose có m ặt ở n ồng độ cao thì hàm l ượng AMP vòng (cyclic AMP = cAMP) trong t ế bào r ất th ấp; và ng ược l ại, khi không có glucose ho ặc có không đáng k ể thì hàm l ượng cAMP t ăng cao. Vì v ậy, cAMP được xem là ch ất ch ỉ th ị c ủa s ự v ắng m ặt glucose. Ngoài ra còn phát hi ện m ột lo ại protein điều hoà d ươ ng tính có tên là protein ho ạt hoá d ị hoá (catabolite activator protein = CAP). Protein CAP gồm hai ti ểu đơn v ị gi ống nhau g ọi là homodimer ; nó ch ỉ ho ạt độ ng khi môi tr ường n ội bào có hàm l ượng cAMP cao. Lúc này cAMP k ết hợp v ới CAP t ạo ra ph ức h ợp CAP-cAMP ho ạt độ ng; ph ức h ợp này có kh ả n ăng nh ận bi ết và bám vào m ột đoạn 16 c ặp baz ơ v ề phía tr ước c ủa vùng kh ởi độ ng, v ới các đoạn l ặp đả o ng ược, g ọi là vị trí CAP . Qua đó ARN polymerase được kích thích bám vào v ị trí P và b ắt đầ u phiên mã ở m ức cao. Tóm l ại, ph ức h ợp CAP-cAMP kích thích phiên mã c ủa operon Lac ( lac operon) b ằng vi ệc bám vào v ị trí kích ho ạt (activator site) n ằm sát tr ước promoter và thúc đẩy ARN polymerase bám vào promoter. Hình 6.6. (a) CAP g ồm hai monomer gi ống nhau, m ỗi monomer nh ận bi ết m ột trình t ự ADN nh ờ vùng xo ắn alpha; (b) Trình t ự đố i x ứng c ủa v ị trí CAP được xem là các đoạn l ặp đả o ng ược; (c) C ấu trúc phân t ử cAMP; (d) Kích thích t ổng h ợp enzyme β-galactosidase 97
26. bằng cAMP v ới ki ểu d ại và CAP d ạng độ t bi ến. Pastan và cs thí nghi ệm trên các t ế bào vi khu ẩn s ống t ự do để t ạo ra β-galactosidase khi có mặt cAMP v ới ki ểu d ại, ho ặc m ột d ạng chi ết xu ất t ừ các t ế bào đột bi ến có CAP v ới ái l ực gi ảm sút đối v ới cAMP. Th ể độ t bi ến này t ạo ra hàm l ượng β-galactosidase ít h ơn nhi ều, điều đó làm ta kỳ v ọng n ếu nh ư ph ức h ợp CAP-cAMP là quan tr ọng trong phiên mã operon. Tuy nhiên, khi hàm lượng cAMP tăng cao quá hi ển nhiên là nó gây nhi ễu s ự t ổng h ợp β-galactosidase ở t ế bào ki ểu dại. Điều này không khi ến ta ng ạc nhiên vì cAMP có nhi ểu tác d ụng, và m ột s ố có th ể ức ch ế gián ti ếp một s ố b ước trong sự bi ểu hi ện in vitro của gen lacZ (Emmer et al, 1970). Hình 6.7. Vị trí bám c ủa CAP và c ủa ARN polymerase ở vùng kh ởi độ ng c ủa operon Lac (hình trên). Cấu trúc c ủa ph ức h ợp CAP-cAMP bám vào ADN (hình trái, d ưới) và gi ả thuy ết v ề sự kích ho ạt phiên mã operon Lac b ởi ph ức h ợp hay dimer CAP-cAMP (Theo S. Busby và R.H. Ebright 1994). 2.3. Điều hoà ho ạt độ ng c ủa Operon tryptophan (trp operon) Đại di ện cho t ất c ả các operon c ủa các lo ại axit amin và các vitamin là operon tryptophan ( trp operon). Để cho ti ện ta vi ết: operon Trp. 2.3.1. C ấu trúc c ủa trp operon Operon tryptophan c ủa E. coli có ch ứa n ăm gen cấu trúc ( trpE, trpD, trpC, trpB và trpA ) mã hoá cho các enzyme tham gia vào quá trình t ổng h ợp axit amin tryptophan. Ngoài ra, nó có m ột s ố đặc điểm khác nh ư: trình t ự operator n ằm l ọt trong promoter, còn gen điều hoà n ằm cách xa operon v ề phía tr ước, bình th ường ch ất ức ch ế (trp repressor hay aporepressor ) của operon t ự nó không bám được vùng vận hành O. Operon Trp cũng ch ịu s ự điều hoà âm tính nh ư operon Lac; nó ch ỉ ho ạt độ ng khi môi tr ường n ội bào thi ếu h ụt tryptophan và không ho ạt độ ng khi d ư th ừa tryptophan, s ản ph ẩm cu ối c ủa con đường sinh t ổng h ợp. Vì v ậy operon Trp được g ọi là operon ức ch ế (repressible) hay operon đồng hoá. 98
27. Hình 6.8. (a) C ấu trúc của operon tryptophan. (b) Ký hi ệu các vùng điều hòa c ủa operon Trp. (c) Đại c ươ ng v ề tr ạng thái ho ạt độ ng và b ất ho ạt c ủa operon. 2.3.2. C ơ ch ế điều hoà âm tính c ủa trp operon Khi trong t ế bào E. coli dư th ừa axit amin tryptophan (s ản ph ẩm cu ối cùng c ủa con đường chuy ển hoá) thì trp operon ng ừng ho ạt độ ng và do đó các enzyme t ổng h ợp chúng không được t ạo ra. S ự ki ện này được gi ải thích nh ư sau: Bình th ường ch ất ức ch ế c ủa operon này ( trp repressor) t ồn tại ở tr ạng thái b ất ho ạt, không có ái l ực đố i v ới y ếu t ố v ận hành ( trp operator). Nh ưng khi các axit amin này d ư th ừa s ẽ k ết h ợp vào ch ất ức ch ế và tạo ra ph ức h ợp có có ái l ực v ới y ếu t ố v ận hành. Tryptophan vì v ậy được g ọi là ch ất đồ ng ức ch ế (co-repressor). Ph ức h ợp này bám vào y ếu t ố v ận hành làm kìm hãm s ự phiên mã c ủa trp operon. Ng ược l ại, khi trong t ế bào v ắng m ặt hay thi ếu h ụt axit amin này, vì ch ất ức ch ế v ốn ở tr ạng thái b ất ho ạt không bám được vào y ếu t ố O, d ẫn đế n ARN polymerase bám promoter và ti ến hành phiên mã các gen. K ết qu ả là các enzyme tham gia t ổng h ợp tryptophan được sinh ra. M ột khi hàm lượng axit amin này được t ổng h ợp ở m ức dư th ừa s ẽ tác độ ng ng ược tr ở l ại, kìm hãm ho ạt độ ng của operon Trp. Hình 6.9. Operon tryptophan ở tr ạng thái b ị ho ạt độ ng (a) và kìm hãm (b). 99
28. Tóm l ại, nh ờ có các cơ ch ế điều hòa ho ạt độ ng gen theo ki ểu ph ản h ồi nh ư th ế mà bộ gen vi khu ẩn có th ể ho ạt độ ng m ột cách nh ịp nhàng hợp lý, từ đó vi khu ẩn có th ể thích nghi và phát tri ển tr ước các điều ki ện môi tr ường không ng ừng thay đổi. 2.3.3. S ự k ết thúc phiên mã s ớm ở trp operon Phiên mã d ở (attenuation ) là m ột c ơ ch ế điều hoà gây ra s ự kết thúc phiên mã s ớm dưới nh ững điều ki ện nh ất đị nh; bằng cách đó nó ng ăn c ản s ự bi ểu hi ện sản ph ẩm của mARN. Sự phiên mã d ở t ạo ra mARN uốn g ập m ột cách điển hình thành các c ấu trúc b ậc hai xen k ẻ, m ột trong s ố đó là y ếu t ố k ết thúc độ c l ập ρ (Rho-independent terminator). Đối v ới operon tryptophan, đó là vi ệc s ử d ụng d ịch mã để điều khi ển s ự phiên mã. Khi có m ặt tryptophan trong môi tr ường n ội bào, th ậm chí ở n ồng độ th ấp, s ẽ x ảy ra s ự d ịch mã m ột ph ần ở đoạn dẫn d ầu (leader) c ủa mARN đang được t ổng h ợp. K ết qu ả là làm d ừng sự phiên mã tr ước khi gen cấu trúc đầ u tiên ( trpE ) c ủa operon được phiên mã. Sự k ết thúc phiên mã s ớm ở operon tryptophan là k ết qu ả c ủa s ự t ươ ng tác b ổ sung n ội phân tử gi ữa các trình t ự ADN bên trong vùng leader c ủa b ản sao ARN. H ệ qu ả c ủa s ự k ết thúc phiên mã sớm này t ạo ra m ột mARN ch ứa 140 baz ơ. T ại vùng đầu mút 3' c ủa nó x ảy ra s ự t ự b ổ sung ở đoạn giàu GC t ạo thành m ột c ấu trúc hình vòng trên thân ARN và gây ra s ự k ết thúc phiên mã s ớm. Vùng này được g ọi là đoạn phiên mã d ở (trp attenuator) và ở ph ần đuôi c ủa mARN này c ũng có 8 baz ơ uridine. Ki ểu c ấu trúc “kẹp tóc” này là tín hi ệu ki ểm soát k ết thúc phiên mã ở prokaryote nói chung. Hình 6.10. (a) C ấu trúc đoạn d ẫn đầ u - TrpL c ủa trp operon. (b) Khi m ức tryptophan cao, x ảy ra s ự kết thúc phiên mã s ớm t ại trp attenuator v ới m ột cái đuôi 3' g ồm 8 uridine. (c) Khi m ức tryptophan th ấp, s ự phiên mã ti ếp di ễn. Với ki ểu c ấu trúc đặ c thù ở đoạn d ẫn đầ u của operon Trp làm cho nó có ý ngh ĩa quan tr ọng trong điều hoà phiên mã d ở, ở ch ỗ: (i) t ổng h ợp m ột peptide d ẫn đầ u ch ứa 14 axit amin; (ii) trên mARN của đoạn peptide này ch ứa hai codon c ủa Trp ở các v ị trí 10 và 11; (iii) ở b ốn vùng được đánh s ố 1–4 x ảy ra s ự t ự b ổ sung gi ữa các vùng 1 và 2, và gi ữa 3 và 4; ở m ột s ố tr ường h ợp có th ể xảy ra s ự k ết c ặp gi ữa các vùng 2 và 3. 100
29. Do trong trình t ự mã hóa c ủa đoạn dẫn đầ u trpL có hai codon Trp, nên s ự d ịch mã đoạn này t ỏ ra nh ạy c ảm v ới s ố l ượng tARN trp đư a vào. N ếu môi tr ường cung c ấp đầ y đủ Trp, ribosome tr ượt qua các codon Trp để đi vào vùng 2. Và s ự có m ặt c ủa ribosome ở vùng 2 ng ăn c ản vùng này k ết cặp v ới vùng 3. Khi đó vùng 3 s ẽ c ặp v ới vùng 4 và t ạo ra điểm k ết thúc phiên mã s ớm (x ảy ra sau khi t ổng h ợp xong 8 uridine ở ngay sau vùng 4). Khi s ố l ượng tARN Trp đư a vào không đầy đủ , s ự dịch mã đoạn d ẫn đầ u d ừng lại độ t ng ột ở các codon Trp c ủa nó. Điều này ng ăn c ản ribosome ti ến vào vùng 2, do đó vùng này s ẽ c ặp v ới vùng 3 gây c ản tr ở vi ệc t ạo thành c ấu trúc phiên mã d ở ( trp attenuator). K ết qu ả là phân t ử mARN đa cistron c ủa operon Trp được t ạo thành m ột cách đầ y đủ. 2.4. Điều hoà ở m ức d ịch mã Hình 6.11. Sự t ươ ng tác gi ữa đoạn trình t ự Shine-Dalgarno c ủa mARN và trình t ự t ươ ng ứng ở đầ u 3' c ủa rARN 16S trong ti ểu đơn v ị ribosome bé của vi khu ẩn, qua đó ribosome bám vào vùng 5'UTR c ủa mARN (M.W.King 1996). Hi ệu qu ả c ủa s ự kh ởi đầ u d ịch mã th ường ph ụ thu ộc vào trình t ự giàu purine ở vùng 5'-UTR. Đó là 6-8 baz ơ (th ường g ặp là AGGAGGU) n ằm ngay tr ước codon kh ởi đầ u AUG c ủa mARN. Đoạn này bám vào ti ểu đơn v ị ribosome bé tr ước khi b ắt đầ u d ịch mã, đã được J. Shine và L. Dalgarno xác định l ần đầ u tiên n ăm 1974. Vì v ậy nó được g ọi là trình t ự Shine-Dalgarno (Hình 6.11). Các tác gi ả này cho r ằng h ầu nh ư có s ự b ổ sung chính xác gi ữa đoạn trình t ự này ( ở đầ u 5' của mARN) và vùng t ươ ng ứng ở đầ u 3' c ủa rARN 16S. Điều đó phù hợp v ới hi ện t ượng c ố đị nh bước đầ u phân t ử mARN trên ti ểu đơn v ị 30S. Thông th ường, ở các mARN được d ịch mã có hi ệu qu ả nh ất thì vùng bám vào ribosome th ường n ằm cách codon kh ởi đầ u kho ảng 8 nucleotide v ề phía tr ước. N ếu nh ư đột bi ến x ảy ra ở vùng này thì có th ể làm gi ảm độ t ng ột hi ệu qu ả d ịch mã trên mARN. Tuy nhiên, ch ỉ riêng s ự có m ặt c ủa trình t ự Shine-Dalgarno phân b ố chu ẩn v ẫn ch ưa đủ đảm b ảo cho s ự kh ởi đầ u d ịch mã. Trên th ực t ế, có nhi ều trình t ự nh ư th ế b ị che khu ất bởi các c ấu trúc “kẹp tóc”, vì vậy nó không th ể tham gia t ươ ng tác v ới vùng t ươ ng ứng c ủa rARN 16S. Các s ố li ệu thu được cho th ấy hi ệu qu ả c ủa vi ệc s ử d ụng trình t ự Shine-Dalgarno nh ất đị nh có th ể “ch ế tác” các protein mà đến l ượt chúng l ại bám vào trình t ự đó và ng ăn c ản nó. Được nghiên cứu chi ti ết nh ất là các protein c ủa ribosome ở E. coli . Khi t ốc độ t ổng h ợp các protein này v ượt quá mức s ản sinh các rARN thì s ẽ x ảy ra s ự tích lu ỹ các protein ribosome t ự do. S ố protein d ư th ừa này được g ọi là các protein “khoá”; chúng bám vào trình tự Shine-Dalgarno trong các mARN tươ ng 101
30. ứng. Nh ờ v ậy, t ốc độ t ổng h ợp các protein ribosome được duy trì ở m ức không v ượt quá kh ả n ăng sử d ụng chúng để c ấu thành các ribosome. Có th ể nói, s ự điều hoà ở m ức d ịch mã là s ự “cạnh tranh” gi ữa rARN và mARN của các protein ribosome, gây ra s ự k ết h ợp v ới các protein “khoá” này. Khi s ự d ịch mã mARN của các protein ribosome không th ể ti ếp di ễn được n ữa (do s ự bám dính b ởi các protein “khoá”) thì các mARN này s ẽ b ị thoái hoá nhanh h ơn bình th ường. 3. Điều hoà bi ểu hi ện gen ở eukaryote 3.1. Điều hoà bi ểu hi ện gen ở eukaryote Rõ ràng, v ới trình độ ti ến hoá cao h ơn và s ự phân hoá vô cùng phong phú đa d ạng c ủa nhóm eukaryote, s ự điều hòa bi ểu hi ện gen ở các eukaryote ph ức t ạp h ơn r ất nhi ều so v ới các prokaryote; th ậm chí ngay trong nhóm eukaryote các ph ươ ng th ức và chi ến l ược điều hoà c ũng r ất phong phú và đa d ạng. Cần l ưu ý r ằng, nh ững ước tính g ần đây cho th ấy m ột t ế bào ng ười ch ứa kho ảng 25.000 gen mã hoá protein, trong đó: (i) M ột s ố gen được bi ểu hi ện trong t ất c ả các t ế bào vào m ọi lúc. Các gen này được g ọi là gen nội tr ợ (housekeeping genes), chúng ch ịu trách nhi ệm cho các ch ức n ăng chuy ển hoá thông th ường ph ổ bi ến cho mọi tế bào (ví d ụ, hô h ấp); (ii) M ột s ố được bi ểu hi ện khi t ế bào đi vào m ột con đường bi ệt hoá c ụ th ể; (iii) M ột s ố được bi ểu hi ện m ọi lúc ch ỉ trong các t ế bào đã được bi ệt hoá theo m ột cách th ức c ụ th ể; (iv) M ột s ố ch ỉ được bi ểu hi ện khi các điều ki ện bên ngoài và trong t ế bào thay đổi, ví d ụ khi có m ột hormon đi đế n có th ể kích hoạt ho ặc kìm hãm các gen nào đó trong t ế bào. Vậy các gen ở eukaryote được điều hoà b ằng cách nào? Có nhi ều cách điều hoà được s ử d ụng bởi các t ế bào eukaryote, nh ư: thay đổi tỷ l ệ phiên mã của các gen. Đây là chi ến l ược quan tr ọng nh ất và được s ử d ụng r ộng rãi. Tuy nhiên, các eukaryote còn có nhi ều cách th ức điều hoà phiên mã khác, ví d ụ: (i) Biến đổ i t ỷ l ệ mà trong đó các b ản sao ARN được x ử lý ở trong nhân (xem sửa đổ i ARN ); (ii) Thay đổi độ ổn đị nh c ủa các phân t ử mARN, ngh ĩa là t ỷ l ệ mà chúng b ị suy thoái (ví d ụ, nhi ễu ARN ); (iii) Biến đổ i hi ệu su ất dịch mã c ủa các ribosome. Đối v ới các gen phân đoạn của tế bào eukaryote, các đoạn không mã hoá protein s ẽ được lo ại bỏ kh ỏi mARN tr ước khi nó đi ra t ế bào ch ất để làm khuôn cho dịch mã; c ũng nh ư các quá trình bổ sung chóp (cap) và đuôi poly(A) ở các đầ u 5' và 3' c ủa h ầu h ết các b ản sao mARN sơ c ấp. Nh ững v ấn đề quan tr ọng khác: vị trí kh ởi đầ u phiên mã , promoter , yếu t ố t ăng c ường (enhancer) và yếu tố gây b ất ho ạt (silencer) phiên mã. Các gen nằm k ề nhau (adjacent genes), k ể c ả các gen mã hoá các ARN và gen mã hoá protein, th ường phân cách nhau b ằng yếu t ố cách ly (insulator). Nh ờ v ậy chúng tránh được vi ệc l ấn sân và nh ầm l ẫn các promoter và enhancer ho ặc silencer c ủa nhau. 3.2. Vùng kh ởi độ ng (Promoter) Trong nhân các t ế bào eukaryote có ba ki ểu vùng kh ởi độ ng khác nhau được nh ận bi ết b ởi ba lo ại ARN polymerase khác nhau. S ự th ật là các polymerase I và II cùng nh ận bi ết m ột lo ại promoter, còn polymerase III s ử d ụng hai l ớp promoter hoàn toàn khác nhau. Hầu hết các promoter c ủa eukaryote được nh ận bi ết b ởi ARN polymerase II đều có ít nh ất một đặ c điểm chung, đó là: m ột trình t ự điều hoà n ằm tr ước v ị trí b ắt đầ u phiên mã ~30 c ặp baz ơ và ch ứa motif TATA. H ầu h ết các promoter c ủa polymerase II c ũng ch ứa các trình t ự quan tr ọng nằm tr ước h ộp TATA, ví d ụ h ộp CAAT và h ộp GC (Hình 6.12a). 102
31. Hơn n ữa, t ự thân các ARN polymerase này không th ể bám vào các promoter t ươ ng ứng c ủa chúng mà đòi h ỏi ph ải có các nhân t ố phiên mã (transcription factors) là nh ững protein điều hoà tổng h ợp mARN eukaryote. Có hai l ớp nhân t ố nh ư v ậy: các nhân t ố phiên mã chung (general transcription factors) và các nhân t ố phiên mã đặc thù-gen (gene-specific transcription factors). vïng ®iÒu hoµ locus (locus control region) LCR yÕu tè phiªn m· (transcription element) TE gene A P exon exon promoter gene B TE P exon exon (a) promoter (b) Hình 6.12. (a) Các y ếu t ố phiên mã (TE) và promoter đối v ới ARN polymerase II có th ể đị nh khu theo nhi ều ki ểu khác nhau. Ở đây ch ỉ cho th ấy ki ểu TE n ằm xa gen về phía tr ước; các gen được bi ểu hi ện ph ối h ợp cùng nhau thì có th ể ch ịu s ự điều hoà c ủa m ột y ếu t ố ki ểm soát chung, g ọi là “vùng điều hoà locus” (LCR) c ũng nh ư các y ếu t ố đặ c thù-gen. (b) Các protein bám enhancer - ngoài v ị trí bám ADN của chúng, còn có các v ị trí bám vào các nhân t ố phiên mã t ụ h ọp ở promoter c ủa gen nh ờ đó có th ể kích thích t ăng t ỷ l ệ phiên mã. 3.3. Các nhân tố phiên mã 3.3.1. Enhancer và Silencer Các nhân t ố phiên mã đặc thù-gen còn g ọi là các yếu t ố phiên mã (transcription elements = TE) là các trình t ự ADN điều hoà gen. Các TE xác định hi ệu su ất phiên mã. Chúng có th ể phân b ố tr ước gen, sau gen ho ặc bên trong gen (t ại các intron ch ẳng h ạn) và bao g ồm các enhancer, silencer, các y ếu t ố đáp ứng (response element) và các y ếu t ố cách ly . Nói chung các gen có th ể có v ố s ố y ếu tố phiên mã (Hình 6.12 và 6.13). Các enhancer là các y ếu t ố trình t ự ADN đặc thù có thể kích thích gia t ăng t ỷ l ệ phiên mã. Khác v ới các promoter ở ch ỗ, chúng có th ể ho ạt độ ng ở m ột kho ảng cách xa c ả ngàn c ặp baz ơ so với các gen mà chúng ki ểm soát. Nguyên do là ở ch ỗ: các protein bám enhancer - ngoài v ị trí bám ADN của chúng, còn có các v ị trí bám vào các nhân t ố phiên mã (TF) t ụ h ọp ở promoter c ủa gen (Hình 6.13). Các silencer cũng là các y ếu t ố ADN đặc thù có th ể đị nh khu và ho ạt độ ng ở t ầm nh ư các enhancer. Tuy nhiên, khi các nhân t ố phiên mã bám vào chúng thì s ự bi ểu hi ện c ủa gen do chúng ki ểm soát b ị kìm hãm. Các y ếu t ố đáp ứng là các trình t ự đích cho các phân t ử tín hi ệu. 103
32. Các y ếu t ố cách ly là nh ững đoạn ADN (~42 c ặp baz ơ) định khu gi ữa các enhancer và promoter ho ặc gi ữa các silencer và promoter c ủa các gen nằm sát nhau ho ặc các c ụm gen kề nhau. Ch ức n ăng c ủa chúng là ng ăn c ản m ột gen kh ỏi b ị ảnh h ưởng b ởi s ự ho ạt hoá (ho ặc ức ch ế) c ủa các gen lân c ận. Ví d ụ: enhancer cho promoter c ủa gen xác định chu ỗi delta c ủa th ể nh ận gamma/delta tế bào-T cho kháng nguyên (TCR) định khu g ần promoter đối v ới chu ỗi alpha c ủa alpha/beta TCR (trên nhi ễm s ắc th ể s ố 14 ở ng ười). M ột t ế bào T ph ải ch ọn l ựa gi ữa cái này ho ặc cái kia. Có m ột yếu t ố cách ly gi ữa promoter c ủa gen alpha và promoter c ủa gen delta nh ằm đả m b ảo s ự ho ạt hoá của m ột gen không lan r ộng sang gen khác. 3.3.2. Các nhân t ố phiên mã c ủa ARN polymerase II Promoter c ơ b ản có ch ứa trình t ự g ồm 7 baz ơ (TATAAAA) g ọi là h ộp TATA. Nó được bám bởi m ột ph ức h ợp l ớn có ch ừng 50 protein khác nhau, bao g ồm: (i) Nhân t ố phiên mã IID (transcription factor IID = TFIID) là m ột ph ức h ợp c ủa protein bám TATA (TATA-binding protein = TBP) v ới ch ức n ăng nh ận bi ết và bám vào h ộp TATA cùng v ới 14 nhân t ố protein khác bám vào TBP và bám vào nhau ch ứ không bám vào ADN. (ii) Nhân t ố phiên mã TFIIB bám c ả ADN và polymerase II. Nhìn chung, ki ểu promoter c ơ b ản này th ấy có trong t ất c ả các gen mã hoá protein; nhi ều gen khác nhau và nhi ều ki ểu t ế bào khác nhau cùng chia x ẻ chung các nhân t ố phiên mã; Pol II (m ột ph ức h ợp c ủa 12 protein khác nhau) bám vào promoter thông qua các nhân t ố thu ộc TFII. ARN polymerase II được h ỗ tr ợ b ởi ít nh ất 6 nhân t ố phiên mã chung (TFIIA, B, D, E, F và H), c ũng nh ư bởi các nhân t ố phiên mã đặc thù-gen mà h ầu h ết chúng bám vào các enhancer g ắn v ới các gen nào đó. TFIID có ch ứa protein bám h ộp TATA (TBP); protein này bám h ộp TATA c ủa promoter và làm trung tâm t ổ ch ức cho vi ệc hình thành ph ức h ợp ti ền kh ởi đầ u. F E B TFIID H TBP J +1 RNA pol II Hình 6.13. Bám vào promoter c ủa các nhân t ố phiên mã, ARN polymerase II, các TF chuyên hoá, và hình thành ph ức h ợp ti ền kh ởi đầ u. 3.4. Sửa đổ i ARN Nh ư đã đề c ập, t ất c ả các ARN eukaryote đều ph ải tr ải qua quá trình sửa đổ i sau phiên mã ở trong nhân (RNA processing) để t ạo ra các ARN tr ưởng thành. Sau đó các phân t ử mARN đi ra t ế bào ch ất để tham gia vào quá trình d ịch mã. Hai s ự ki ện s ửa đổ i chính y ếu, đó là: – Gắn thêm chóp m 7Gppp và đuôi poly(A); và – Lo ại bỏ các intron và n ối các exon hay còn g ọi là splicing. 3.4.1. Gắn thêm chóp m 7Gppp và đuôi poly(A) Tr ước tiên là l ắp thêm “chóp” 7-methylguanosine-triphosphate (m 7Gppp) ở đầ u 5' và sau đó là 104
33. “đuôi” poly(A) ở đầ u 3' của nó. Đối v ới các gen mã hóa protein không thu ộc ki ểu phân đoạn nh ư các gen histone ch ẳng h ạn, quá trình hoàn thi ện mARN dừng t ại đây. Nói chung, t ất c ả các mARN tr ưởng thành c ủa eukaryote đều có chóp 5' (5'cap) và h ầu h ết các mARN đề u ch ứa đuôi poly(A), ngo ại tr ừ các mARN histone. Chóp 5' và đuôi poly(A) có tác d ụng b ảo v ệ mARN kh ỏi b ị phân c ắt bởi các enzyme ribonuclease (RNase) trong t ế bào ch ất.
    Sự hình thành chóp 5' : Quá trình này đòi h ỏi nhi ều b ước, b ước th ứ nh ất x ảy ra ngay sau khi kh ởi đầ u phiên mã. Nucleotide kh ởi đầ u có m ột đầ u 5'-triphosphate được thu ỷ gi ải thành m ột đầ u monophosphate và pyrophosphate vô c ơ (PPi). Sau đó enzyme guanylyltransferase chuy ển m ột g ốc G cho đầu monophosphate b ằng cách s ử d ụng GTP nh ư là m ột c ơ ch ất, làm gi ải phóng Pi. Liên k ết được hình thành là m ột liên k ết 5'-5' triphosphate. Ti ếp đó enzyme methyltransferase gắn nhóm methyl (- 7 CH 3) vào v ị trí 7 của guanosine ở đầ u mút 5', t ạo thành methyl-7-guanosine triphosphate (m Gppp). Sau đó, x ảy ra s ự methyl hoá ở hai nucleotide t ại các v ị trí 2' ribose. Chóp 5' có ch ức n ăng b ảo v ệ đầ u 5' c ủa mARN (gia t ăng tính ổn đị nh mARN) và c ần thi ết cho kh ởi đầ u t ổng h ợp protein.
    Sự hình thành đuôi poly(A) : Ở đầ u 3' c ủa h ầu h ết các gen mã hóa protein eukaryote có ch ứa trình t ự AATAAA là tín hi ệu cho vi ệc g ắn “đuôi” poly(A) vào đầu 3' c ủa mARN. S ự phiên mã th ường v ẫn còn ti ếp di ễn sau khi đi qua vị trí polyadenyl hoá này. Trình t ự AAUAAA ở đầ u 3' c ủa mARN báo hi ệu cho endonuclease nh ận bi ết và c ắt chu ỗi ARN tại m ột điểm n ằm sau nó ~10-30 baz ơ. Sau đó, enzyme poly(A)-polymerase sẽ l ắp thêm vào đầu 3' c ủa mARN một dãy adenine dài kho ảng 150-200 baz ơ g ọi là đuôi poly(A). Đuôi này có ch ức n ăng b ảo v ệ mARN kh ỏi b ị suy thoái và trong nhi ều tr ường h ợp nó còn kích thích s ự d ịch mã. Hình 6.14. Các b ước t ổng quát c ủa quá trình phiên mã và s ửa đổ i sau phiên mã đối v ới b ản sao pre- mARN c ủa các gen phân đoạn: (1) L ắp chóp 5’-m7Gppp cùng lúc phiên mã; (2) G ắn đuôi poly(A); và (3) Splicing. 3.4.2. Sự c ắt-nối pre-mARN của các gen phân đọan Vi ệc lý gi ải c ơ ch ế cắt-nối (splicing) trong quá trình x ử lý b ản sao pre-mARN dựa ch ủ y ếu trên hai s ự ki ện: 105
34. Hình 6.15. Mô hình splicing pre-mARN b ằng th ể c ắt n ối spliceosome (Ph ỏng theo T. Villa et al., 2002, Cell 109:149). (1) K ết qu ả phân tích trình t ự baz ơ t ại các ch ỗ ti ếp giáp exon/intron (v ị trí cho ) và intron/exon (v ị trí nh ận) cho th ấy ở hai đầ u mút c ủa m ỗi intron có hai nucleotide r ất ổn đị nh, g ọi là 'trình t ự chu ẩn': 5'-GU AG-3'. V ậy b ằng cách nào b ộ máy c ắt-nối có th ể xác đị nh m ột cách chính xác và hi ệu qu ả các v ị trí c ắt n ối n ếu nh ư x ảy ra s ự bi ến đổ i trong các v ị trí này? Điều đó c ũng đặ t ra kh ả năng là s ự bi ến đổ i hay độ t bi ến c ủa các v ị trí c ắt n ối này t ại các g ốc then ch ốt có thể làm r ối lo ạn ch ức n ăng c ủa chúng. (2) Ở m ột s ố snARN ch ứa trong thành ph ần c ủa enzyme splicing cũng có các trình t ự dinucleotide b ổ sung v ới các trình t ự chu ẩn trong intron. Các snARN (U1-U6) trong ph ức h ợp enzyme này, snRNP (small nuclear ribonucleoprotein ), t ươ ng tác v ới các đầ u mút c ủa m ỗi intron, kéo chúng xích l ại g ần nhau t ạo ra c ấu trúc hình vòng, nh ờ đó enzyme ti ến hành c ắt b ỏ intron và n ối các exon l ại v ới nhau. Ví d ụ, gen ovalbumin g ồm 7 intron xen k ẽ gi ữa 8 exon có độ dài 7.700 c ặp baz ơ sau khi enzyme splicing c ắt b ỏ các intron và n ối t ất c ả các exon thì mARN tr ưởng thành có trình t ự mã hóa protein dài 1.872 baz ơ. 3.4.3. Cắt n ối ch ọn l ọc tạo ra các mARN khác nhau t ừ m ột gen Một trong nh ững tr ường h ợp thú v ị là vi ệc c ắt n ối sau phiên mã theo các cách khác nhau (có tính ch ất bi ệt hoá và ch ọn l ọc) d ẫn t ới t ạo ra các mARN khác nhau (Hình 6.16 và 6.17). Ví d ụ điển hình là gen phân đoạn mã hóa calcitonin và s ản ph ẩm pre-mARN c ủa nó (xem Hình 6.16). 106
35. Hình 6.16. Cùng m ột b ản sao pre-mARN được t ạo ra từ s ự phiên mã gen calcitonin, qua quá trình sửa đổ i theo ki ểu c ắt n ối ch ọn l ọc đặ c thù t ạo ra hai mARN tr ưởng thành khác nhau: mARN của calcitonin được sinh ra ch ủ y ếu b ởi tuy ến giáp và mARN cho s ản ph ẩm h ọ hàng v ới calcitonin sinh ra ch ủ y ếu ở tuy ến d ưới đồi th ị. Quá trình xử lý ARN này x ảy ra theo nh ững con đường đặ c thù, tu ỳ theo tuy ến giáp hay tuy ến dưới đồ i th ị. K ết qu ả là t ạo ra hai mARN tr ưởng thành gi ống nhau ở đầ u 5' và khác nhau ở đầ u 3'. Cụ th ể, con đường c ắt-nối ở tuy ến giáp d ẫn t ới hình thành mARN mà ở đầ u 3' là trình t ự mã hoá calcitonin, còn con đường đặ c tr ưng cho tuy ến d ưới đồ i th ị d ẫn đế n hình thành mARN mà ở phía đầu 3' là trình t ự mã hoá s ản ph ẩm có liên quan h ọ hàng v ới calcitonin nh ưng l ượng calcitonin được tạo ra ở đây r ất ít, và thay vào đó là protein có quan h ệ h ọ hàng v ới calcitonin mà ch ức n ăng c ủa nó còn ch ưa rõ. 3.4.4. Vai trò của các intron Vấn đề đặ t ra là s ự có m ặt cu ả các intron trong các gen phân đoạn nh ư th ế có ý ngh ĩa gì? B ởi vì trong quá trình c ắt n ối pre-mARN có th ể x ảy ra dù là m ột sai sót nh ỏ c ũng đủ để t ạo ra mARN có khung đọc mã b ị thay đổ i. Được bi ết kho ảng 90% b ản sao mARN b ị suy thoái và ch ỉ để l ại ~10% mARN tr ưởng thành đi ra t ế bào ch ất. Theo hi ểu bi ết hi ện nay, các intron có th ể có các vai trò sau: (i) các intron là các đoạn đệ m t ạo thu ận l ợi cho s ự tái t ổ h ợp (gi ữa các exon) bên trong m ột gen; (ii) các intron là các vùng đệm phân cách các vùng ch ức n ăng c ủa gen (t ức các exon) và c ủa một s ố protein; (iii) các intron là n ơi phân b ố m ột s ố y ếu t ố phiên mã (TE); (iv) các intron là các vùng phân cách các exon cho phép quá trình cắt-nối ch ọn l ọc (alternative splicing) để t ạo ra các mARN tr ưởng thành khác nhau và d ịch mã thành các polypeptide khác nhau t ừ m ột gen. Con đường s ử d ụng exon có ch ọn l ọc này mang tính đặc thù cho t ừng lo ại gen c ủa các t ế bào thu ộc các mô nh ất đị nh ở các eukaryote b ậc cao. 107
36. Hình 6.17. Các ki ểu s ử d ụng exon trong c ắt n ối ch ọn l ọc có th ể sinh ra nhi ều protein khác nhau t ừ một gen. TÓM T ẮT (1) Các gen của m ỗi b ộ gen không t ồn t ại riêng rẽ và ho ạt độ ng nh ư nh ững th ực th ể độc lập mà trái l ại, gi ữa chúng có s ự ki ểm soát lẫn nhau cũng nh ư ph ụ thu ộc vào các y ếu t ố c ủa môi tr ường. Mỗi b ộ gen c ủa t ế bào là m ột h ệ th ống m ở có kh ả n ăng t ự điều ch ỉnh, đả m b ảo s ự ho ạt độ ng c ủa các gen di ễn ra h ợp lý tr ước điều ki ện c ụ th ể c ủa môi tr ường trong t ừng giai đoạn của quá trình phát tri ển cá th ể. (2) Sự điều hoà ho ạt độ ng c ủa các gen bi ểu hi ện ở nhi ều m ức độ khác nhau nh ư phiên mã, sau phiên mã, d ịch mã và sau d ịch mã và theo các ph ươ ng th ức và cơ ch ế đặ c thù cho từng nhóm loài. Đặc điểm chung nh ất cho ho ạt độ ng c ủa các gen trong các bộ gen khác nhau th ể hi ện ch ủ y ếu ở s ự điều hòa phiên mã, trong đó x ảy ra s ự t ươ ng tác gi ữa vùng kh ởi độ ng (promoter) với ARN polymerase và v ới nhi ều y ếu t ố khác. (3) Ở sinh v ật nhân s ơ, sự điều hoà ho ạt độ ng c ủa các gen có liên quan đến các quá trình chuy ển hóa c ủa t ế bào. Các gen cấu trúc liên quan v ề ch ức n ăng được t ổ ch ức và ki ểm soát ho ạt động ch ặt ch ẽ theo c ụm g ọi là operon. Các y ếu t ố điều hòa m ột operon gồm có vùng vận hành, vùng kh ởi độ ng và gen ức ch ế. Mỗi t ế bào vi khu ẩn có các operon c ảm ứng và operon ức ch ế với phươ ng th ức điều hòa chung là điều hòa âm tính, ngoài ra còn có các ki ểu điều hòa d ươ ng tính, phiên mã dở tùy lo ại operon. (4) Ở sinh v ật nhân chu ẩn sự điều hòa bi ểu hi ện c ủa các gen ph ức t ạp h ơn nhi ều. Điều này th ể 108
37. hi ện ở sự bi ến đổ i c ấu hình ch ất nhi ễm s ắc tr ước khi các gen có th ể phiên mã. Có nhi ều y ếu t ố ADN và protein tham gia điều hòa ở m ức phiên mã. S ự điều hòa sau phiên mã di ễn ra trong nhân theo nhiều c ơ ch ế khác nhau, nh ư: g ắn thêm chóp m7Gppp, l ắp thêm đuôi poly(A), c ắt n ối có ch ọn l ọc các exon để t ạo ra nhi ều ki ểu ARN tr ưởng thành khác nhau từ m ột gen ở các mô khác nhau c ủa sinh vật bậc cao. CÂU H ỎI VÀ BÀI T ẬP 101. Thông th ường, th ứ t ự s ắp x ếp t ừ trái sang ph ải c ủa các y ếu t ố trong m ột operon là: ___(a)___, ___(b)___, ___(c)___ và ___(d)___. 102. Theo định ngh ĩa ch ặt ch ẽ, m ột operon bao g ồm m ột nhóm các ___(a)___ có liên quan v ới nhau v ề m ặt ___(b)___ được liên k ết ch ặt ch ẽ v ới m ột y ếu t ố ___(b)___ n ằm k ề sát tr ước chúng. 103. Đoạn trình t ự đặ c thù 5’-AAUAAA-3’ n ằm đằ ng sau c ủa h ầu h ết các pre-mARN sinh v ật nhân chu ẩn đóng vai trò là tín hi ệu điều hòa A. k ết thúc phiên mã. B. c ắt và g ắn đuôi polyA. C. kéo dài phiên mã. D. t ốc độ phiên mã. 104. Quá trình x ử lý các b ản sao ARN s ơ c ấp ở t ế bào nhân chu ẩn được xem là s ự điều hoà bi ểu hi ện gen ở m ức A. phiên mã. B. sau phiên mã. C. d ịch mã. D. sau d ịch mã. 105. Lo ại ARN nào sau đây có m ặt trong thành ph ần c ủa enzyme c ắt-nối (splicing) đố i v ới s ản ph ẩm phiên mã s ơ c ấp c ủa các gen phân đoạn? A. rARN. B. mARN. C. snARN. D. tARN. 106. Khi môi tr ưòng nuôi c ấy E.coli không có đường lactose thì operon Lac không ho ạt độ ng, ch ủ y ếu b ởi vì: A. ch ất ức ch ế bám ch ặt vùng v ận hành. B. ARN polymerase b ị các phân t ử hi ệu ứng ng ăn c ản t ừ xa. C. Operator ho ặc promoter b ị m ất ch ức n ăng tín hi ệu. D. ph ức h ợp “ch ất ức ch ế - ch ất c ảm ứng” gắn vào vùng v ận hành. 107. Th ế nào là Operon? S ơ l ược các thành ph ần tham gia vào s ự điều hòa ho ạt độ ng c ủa m ột operon. V ẽ m ột s ơ đồ operon. 108. Phân tích và ch ỉ ra nh ững điểm gi ống nhau và khác nhau trong c ấu trúc, ch ức n ăng và c ơ ch ế điều hòa âm tính c ủa operon Lactose và operon Tryptophan. T ừ đó nêu ý ngh ĩa sinh h ọc c ủa chúng. 109. Nếu trong môi tr ường nuôi c ấy E. coli được b ổ sung c ả hai lo ại đường lacto và gluco thì vi khuẩn s ẽ s ử d ụng ch ất nào tr ước? T ại sao? Khi glucose đã được s ử d ụng h ết thì vi ệc ức ch ế d ị hóa còn ti ếp t ục di ễn ra n ữa hay không, t ại sao? 110. Xét 3 nòi vi khu ẩn có ki ểu gen c ủa operon Lac nh ư sau (d ấu + bi ểu th ị cho locus bình 109
38. th ường t ức ki ểu d ại, và d ấu “–” ch ỉ locus b ị độ t bi ến). Hãy gi ải thích và cho bi ết ki ểu hình c ủa mỗi nòi vi khu ẩn sau: (1) R + P+ O+ Z– Y+ A+; (2) R + P+ O+ Z+ Y– A+; (3) R + P+ O+ Z+ Y+ A+. 111. Một nòi vi khu ẩn có ki ểu gen operon Lac nh ư sau: R + P+ O– Z+ Y+ A+. Hãy gi ải thích và xác định kiểu hình c ủa vi khu ẩn. 112. Một nòi E. coli có ki ểu gen operon Lac là R + P– O+ Z+ Y+ A+. Hãy gi ải thích và xác định ki ểu hình c ủa vi khu ẩn. 113. Một vi khu ẩn có ki ểu gen operon Lac là: R – P+ O+ Z+ Y+ A+. Hãy gi ải thích và xác định ki ểu hình c ủa vi khu ẩn. 114. Phân bi ệt các c ặp khái ni ệm sau: (a) ch ất c ảm ứng v ới ch ất ức ch ế; (b) điều hoà âm tính v ới điều hoà d ươ ng tính; (c) điều hoà theo ki ểu c ảm ứng - âm tính v ới ức ch ế - âm tính. Hãy v ẽ s ơ đồ m ột operon và gi ải thích m ối quan h ệ gi ữa các y ếu t ố điều hoà ho ạt độ ng c ủa m ột operon. 115. Hãy gi ải thích các tình tr ạng đóng-mở c ủa lac operon d ưới các điều ki ện sau đây và cho các hình v ẽ minh ho ạ: (a) ch ỉ có glucose; (b) ch ỉ có lactose; (d) có c ả glucose và lactose; và (c) không có đường nào c ả. 116. Sự điều hòa d ịch mã ở vi khu ẩn x ảy ra nh ư th ế nào? Nêu ý ngh ĩa c ủa ki ểu điều hòa ấy. 117. Phân tích c ơ ch ế s ửa đổ i sau phiên mã đối v ới s ản ph ẩm c ủa các gen phân đoạn và v ẽ m ột s ơ đồ minh h ọa. 118. Phân tích m ột ví d ụ v ề sửa đổ i sau phiên mã theo ki ểu cắt n ối ch ọn l ọc đối v ới s ản ph ẩm c ủa gen phân đoạn. V ẽ m ột s ơ đồ minh h ọa. 119. Trình bày vai trò và ý ngh ĩa c ủa các intron trong các gen phân đoạn. 120. Trình bày s ơ l ược các y ếu t ố điều hòa bi ểu hi ện gen ở m ức phiên mã đối v ới các gen eukaryote. 110
39. Chươ ng 7 CÁC BI ẾN ĐỔ I C ỦA B Ộ GEN Một trong nh ững đặ c tính c ăn b ản c ủa v ật ch ất di truy ền là kh ả n ăng b ị bi ến đổ i, t ạo ra nh ững vật li ệu m ới. Ở m ức độ phân t ử đó là sự phát sinh các đột bi ến gen t ự phát di ễn ra trong quá trình tái bản c ủa b ộ gen c ũng nh ư do tác động c ủa các y ếu t ố môi tr ường nh ư hóa ch ất, các tia phóng x ạ ; sự phát sinh các bi ến d ị t ổ h ợp và các y ếu t ố di truy ền v ận độ ng. B ằng cách đó các ngu ồn bi ến d ị di truy ền s ơ c ấp và th ứ c ấp được t ạo ra và cung c ấp cho quá trình ch ọn l ọc và tiến hóa c ủa sinh gi ới. Bên c ạnh đó b ộ gen các t ế bào c ũng có các h ệ thống sửa ch ữa nh ằm h ạn ch ế phát sinh đột bi ến c ũng nh ư các t ổn th ươ ng trong ADN. Trong ch ươ ng này, chúng ta sẽ tìm hi ểu và gi ải đáp các v ấn đề sau: (i) Đột bi ến gen là gì, có các lo ại c ơ b ản nào? Vai trò và ý ngh ĩa c ủa chúng trong ti ến hóa và ch ọn gi ống? (ii) Đột bi ến gen xảy ra do nh ững tác nhân, nguyên nhân và c ơ ch ế nào? (iii) Các t ế bào có th ể h ạn ch ế s ự phát sinh các đột bi ến gen t ự phát nh ư th ế nào? Các t ổn th ươ ng trong ADN được sửa ch ữa ra sao? (iv) S ự tái tổ h ợp của ADN di ễn ra nh ư th ế nào? (v) Bản ch ất c ủa các yếu t ố di truy ền v ận độ ng là gì? Các đoạn xen và gen nh ảy khác nhau ở nh ững điểm nào? 1. Đột bi ến gen 1.1. Đại c ươ ng v ề độ t bi ến gen
    
    
    Định ngh ĩa: Đột bi ến gen (gene mutation) là nh ững bi ến đổ i x ảy ra bên trong c ấu trúc c ủa một gen ho ặc m ột vùng nh ỏ c ủa b ộ gen, liên quan ch ủ y ếu t ới s ự thay đổ i trình t ự nucleotide v ốn có của nó (ki ểu d ại), làm phát sinh các alen (allele ) mới.
    Nguyên nhân : Các đột bi ến gen xảy ra có th ể do sai sót trong quá trình tái b ản, ho ặc do trong b ộ gen có các vùng d ễ phát sinh độ t bi ến g ọi là các '' điểm nóng'' (hot spots), ho ặc các t ổn th ươ ng t ự phát d ưới ảnh h ưởng c ủa các tác nhân lý-hoá t ừ môi tr ường ngoài.
    Phân lo ại: Các đột bi ến gen có th ể được phân lo ại theo các cách khác nhau. Ch ẳng h ạn, d ựa vào các hi ệu qu ả c ủa chúng lên ki ểu hình (các đột bi ến hình thái, đột bi ến gây ch ết, các độ t bi ến soma và dòng m ầm) ho ặc lên chính b ản thân v ật ch ất di truy ền ADN. C ăn c ứ vào ngu ồn g ốc, chúng được chia thành các đột bi ến t ự phát và đột bi ến c ảm ứng .
    Hậu qu ả: Các đột bi ến gen nói chung làm suy y ếu ho ặc bi ến đổ i ch ức n ăng c ủa gen hơn là tăng c ường ch ức n ăng c ủa nó. T ừ đó ảnh h ưởng lên các đặc tính sinh lý-hoá sinh c ủa t ế bào c ũng nh ư s ức s ống và sinh s ản c ủa c ơ th ể sinh v ật nói chung.
    Vai trò và ý ngh ĩa: Đột bi ến gen vì v ậy được xem là c ơ s ở c ủa hi ện t ượng đa hình di truy ền trong các qu ần th ể và là ngu ồn bi ến d ị di truy ền s ơ c ấp vô cùng phong phú và đa d ạng cho các quá trình ch ọn l ọc và ti ến hoá. Ng ười ta l ợi d ụng đặc tính bi ến đổ i n ầy c ủa các sinh v ật để xây d ựng các ph ươ ng pháp gây đột bi ến khác nhau và có th ể k ết h ợp v ới lai h ữu tính ho ặc s ử d ụng k ỹ thu ật di truy ền để c ải bi ến b ộ gen của các v ật nuôi, cây tr ồng v ề các tính tr ạng c ần quan tâm.
    Tỷ l ệ độ t bi ến gen (ở ng ười): N ếu nh ư đột bi ến b ộ gen (genome mutation) và đột bi ến nhi ễm sắc th ể xảy ra v ới t ần s ố trung bình t ươ ng ứng là 10 -2 và 6 ×10 -4 mỗi l ần phân bào, thì v ới đột bi ến gen tỷ l ệ là 10 -10 cho m ỗi c ặp baz ơ trong m ỗi l ần phân bào ho ặc có th ể bi ến thiên t ừ 10 -4 đến 10 -7 (tính b ằng s ố độ t bi ến / locus / th ế h ệ) tu ỳ thu ộc vào kích th ước gen và b ản ch ất c ủa nó. T ỷ l ệ này ở 111
40. hầu h ết locus là 10 -5-10 -6.
    Hi ện t ượng đa hình (polymorphism) trong b ộ gen : Ở ng ười, con s ố các đa hình t ồn t ại là ~1 trên m ỗi 500 c ặp baz ơ. Nh ư v ậy có kho ảng 5,8 tri ệu sai khác trong m ỗi b ộ gen đơ n b ội là do các đột bi ến gây ra. 1.2. Các ki ểu đột bi ến điểm (point mutations) 1.2.1. Các đột bi ến thay th ế baz ơ (base substitution) • Đồng hoán và d ị hoán Đồng hoán (transition) là d ạng độ t bi ến trong đó m ột purine này được thay b ởi m ột purine khác (A → G ho ặc G → A) ho ặc m ột pyrimidine này được thay b ởi m ột pyrimidine khác (T → C ho ặc C → T). Dị hoán (transversion) là d ạng độ t bi ến trong đó m ột purine được thay th ế b ằng m ột pyrimidine, ho ặc ng ược lại: A D T; A D C; G D C; G D T. (xem s ơ đồ) • Các đột bi ến nh ầm ngh ĩa và vô ngh ĩa + Đột bi ến nh ầm ngh ĩa (missense mutation) - bi ến đổ i ngh ĩa c ủa m ột codon kéo theo s ự thay th ế một axit amin. Hi ệu qu ả c ủa nó ph ụ thu ộc vào vị trí và tính ch ất c ủa axit amin b ị bi ến đổ i (B ảng 7.1; Hình 7.1 và 7.5). Hình 7.1. Ba ki ểu độ t bi ến điểm. (a) Trình t ự ADN ban đầ u ở m ạch đố i khuôn c ủa gen mã hóa cho 1 trình t ự axit amin; (b) Độ t bi ến thay th ế 1 baz ơ dạng nh ầm ngh ĩa; (c) Độ t bi ến thêm 1 baz ơ; (d) Đột bi ến m ất 1 baz ơ. 112
41. Hình 7.2. Đột bi ến vô ngh ĩa. Đột bi ến thay th ế 1 baz ơ làm bi ến đổ i 1 b ộ ba có ngh ĩa c ủa trình t ự mã hóa thành b ộ ba vô ngh ĩa ( độ t bi ến vô ngh ĩa), h ậu qu ả là protein được t ổng h ợp ng ắn m ột cách b ất th ường. + Đột bi ến vô ngh ĩa (nonsense mutation) - bi ến đổ i m ột baz ơ ở codon có ngh ĩa (sense codon) bên trong trình t ự mã hoá c ủa gen t ạo thành codon k ết thúc chu ỗi (Hình 7.2). Đột bi ến này gây ra chu ỗi polypeptide ng ắn b ất th ường và không có ho ạt tính. Ví d ụ, các d ạng thi ếu máu vùng bi ển β- thalasemie mà không t ổng h ợp được β- globin là do đột bi ến điểm ở các codon 17 ho ặc 39 c ủa gen β-globin. Ng ược l ại, n ếu độ t bi ến làm bi ến đổ i codon k ết thúc thành codon có ngh ĩa s ẽ d ẫn t ới h ậu qu ả là chu ỗi polypeptide được t ổng h ợp dài h ơn bình th ường. Đây là tr ường h ợp đặ c bi ệt c ủa độ t bi ến nh ầm ngh ĩa (Hình 7.1). Điển hình là d ạng hemoglobin Constant Spring (HbCS). Phân t ử mARN c ủa chu ỗi alpha bình th ường có codon k ết thúc là UAA v ới polypeptide dài 141 axit amin, còn ở mARN d ạng b ệnh này nó là CAA mã hoá cho glutamine, v ới chu ỗi alpha có t ới 172 axit amin. Hình 7.3. Đột bi ến lặp b ộ ba . Một b ộ ba nào đó trong trình t ự mã hóa protein c ủa gen có th ể b ị l ặp lại nhi ều l ần, do dó kéo theo s ự b ổ sung nhi ều l ần 1 lo ại axit amin nào đó. M ột s ố b ệnh t ật ở ng ười là do ki ểu độ t bi ến này gây ra. 113
42. Hình 7.4. Đột bi ến thay th ế 1 baz ơ ở 1 codon có th ể t ạo ra 9 codon m ới, trong đó có lo ại nh ầm ngh ĩa, có lo ại vô ngh ĩa. Bảng 7.1. Các đột bi ến nh ầm ngh ĩa điển hình ở chu ỗi β-globin ng ười Chu ỗi β Vị trí axit Thay th ế axit Thay đổi ở Ki ể u thay th ế ở amin amin β-mARN gen β-globin HbS 6 Glu → Val GAA → GUA Dị hoán A → T HbC 6 Glu → Lys GAA → AAA Đồng hoán G → A HbE 26 Glu → Lys GAA → AAA Đồng hoán G → A (a) (b) (c) Hình 7.5. Bệnh h ồng c ầu hình l ưỡi li ềm. (a) S ơ d ồ điện di hemoglobin c ủa ba ki ểu gen cho th ấy: ki ểu HbA/HbA ch ỉ có m ột v ạch c ủa chu ỗi β-hemoglobin A, ki ểu HbS/HbS có m ột v ạch c ủa chu ỗi β-hemoglobin S, còn ki ểu HbA/HbS cho 2 v ạch ứng v ới 2 chu ỗi β-globin A và S. (b) Các t ế bào hồng c ầu bình th ường (hình trên) và các t ế bào d ạng l ưỡi li ềm v ới kích th ước phóng đạ i g ần g ấp đôi. (c) M ột đoạn trình t ự axit amin của các chu ỗi β-globin bình th ường (HbA) và b ệnh (HbS) khác 114
43. nhau ch ỉ m ột axit amin ở v ị trí s ố 6, Glu (có tính axit) → Val (trung tính); hình d ưới gi ải thích c ơ s ở của độ t bi ến HbA → HbS. Các đột bi ến im l ặng và trung tính Các đột bi ến làm bi ến đổ i thành ph ần baz ơ c ủa m ột codon nh ưng v ẫn mã hoá cùng m ột axit amin, g ọi là các đột bi ến im l ặng (silent mutation) hay đột bi ến đồ ng ngh ĩa (synonymous). Ph ần l ớn các đột biến này x ảy ra ở v ị trí th ứ ba c ủa các codon, và chúng x ảy ra v ới t ốc độ cao h ơn r ất nhi ều so v ới các v ị trí khác. Đây được coi là m ột trong nh ững b ằng ch ứng quan tr ọng c ủa Thuy ết trung tính v ề s ự ti ến hoá phân t ử (xem Kimura 1983). 1.2.2. Đột bi ến d ịch khung (frameshift mutation) Dạng độ t bi ến m ất ho ặc xen thêm m ột baz ơ trong gen d ẫn đế n khung đọ c mã b ị d ịch chuy ển một baz ơ, k ể t ừ v ị trí b ị bi ến đổ i cho đế n cu ối gen, được g ọi là đột bi ến d ịch khung (Hình 7.1c,d). H ậu qu ả là vùng protein được t ổng h ợp t ươ ng ứng có trình t ự axit amin b ị bi ến đổ i đáng k ể. Điển hình là dạng hemoglobin Wayne (HbWl); do m ất m ột baz ơ th ứ ba c ủa codon ở v ị trí 138 trên chu ỗi α (141 aa) gây h ậu qu ả là ba axit amin ở các v ị trí 139 - 141 sát đầu C c ủa polypeptide b ị bi ến đổ i, đồ ng th ời do codon k ết thúc ở v ị trí 142 c ũng b ị bi ến đổ i đã kéo dài thêm 5 axit amin. 1.3. Các đột bi ến t ự phát (spontaneous mutations) Về nguyên t ắc, t ất c ả các độ t bi ến đề u ph ải có m ột nguyên nhân, nh ưng đôi khi các đột bi ến xảy ra mà không có các tác nhân gây đột bi ến (mutagens). Các đột bi ến t ự phát nh ư v ậy có nhi ều nguyên nhân khác nhau gây ra mà không ph ải t ừ bên ngoài. 1.3.1. Các đột bi ến gây ra b ởi b ộ máy tái b ản ADN Dù cho s ự tái b ản được coi là chính xác, nh ưng không ph ải là hoàn h ảo. Nh ư th ế m ột s ố độ t bi ến nào đó x ảy ra đơn thu ần là do t ổng h ợp sai. T ần s ố k ết c ặp baz ơ sai có th ể là 10 -5 và b ản thân các ADN polymerase có kh ả n ăng đọc s ửa trong khi t ổng h ợp ADN, nh ờ v ậy h ạn ch ế đáng k ể t ần số phát sinh độ t bi ến do tái b ản (10 -5 ×10 -5 = 10 -10 ). 1.3.2. Sai sót trong tái b ản do sự h ỗ bi ến c ủa các baz ơ Các baz ơ trong ADN th ường t ồn t ại ở m ột trong hai tr ạng thái bi ến đổ i qua l ại gi ữa chúng g ọi là các dạng h ỗ bi ến (tautomer). Hi ện t ượng h ỗ bi ến (tautomerism) x ảy ra có th ể đơn thu ần là do s ự sắp x ếp l ại c ủa các liên k ết và do s ự thay đổ i v ị trí c ủa các nguyên t ử hydro trong các baz ơ. Các baz ơ purine và pyrimidine có th ể t ồn t ại d ưới các d ạng hỗ bi ến: amino ↔ imino (đối với adenine và cytosine), ho ặc keto ↔ enol (đối v ới guanine và thymine). Đó là s ự bi ến đổ i qua lại gi ữa hai tr ạng thái t ồn t ại b ền (ph ổ bi ến) và kém b ền (hi ếm g ặp) c ủa các baz ơ trong ADN do sự d ịch chuy ển v ị trí c ủa các nguyên t ử hydro (Hình 7.6). Chính hi ện t ượng h ỗ bi ến này d ẫn t ới sự thay đổ i kh ả n ăng k ết c ặp bình th ường c ủa các baz ơ và làm phát sinh các đột bi ến gen d ạng thay th ế m ột c ặp baz ơ. Nói chung, các baz ơ này đều ít tan trong n ước và có kh ả n ăng h ấp thu ánh sáng c ực đạ i ở b ước sóng 260-270 nanomet. Vì v ậy chúng có th ể được tách ra b ằng các ph ươ ng pháp s ắc ký và điện di. 115
44. Hình 7.6. Các d ạng h ỗ bi ến qua l ại gi ữa keto và enol c ủa các baz ơ G và T. Các d ạng ph ổ bi ến (b ền v ững) c ủa adenine và cytosine là các d ạng amino ; chúng có th ể s ắp xếp l ại thành các d ạng hi ếm imino kém b ền h ơn. Chính s ự thay đổ i v ị trí c ủa các hydro làm thay đổi đặc tính k ết c ặp c ủa các baz ơ. H ậu qu ả c ủa nó là d ẫn t ới s ự k ết c ặp nh ầm gi ữa các baz ơ trong tái bản, do đó trong nh ững l ần tái b ản ti ếp theo s ẽ t ạo ra các th ể độ t bi ến đồ ng hoán t ươ ng ứng. Ví d ụ, ADN cha m ẹ ch ứa c ặp CG, trong lúc tái b ản C chuy ển sang d ạng imino (hi ếm) và c ặp nh ầm v ới A (thay vì v ới G) t ạo thành c ặp C-A trong m ột ADN con. Trong l ần tái b ản ti ếp theo, A s ẽ c ặp bình th ường v ới T t ạo ra c ặp T-A thay ch ỗ c ặp CG tr ước đây. Đây là c ơ ch ế c ủa độ t bi ến đồ ng hoán CG → TA. 1.3.3. Các đột bi ến d ịch khung t ự phát trong khi tái b ản Các tác nhân xen vào gi ữa là nhóm tác nhân quan tr ọng khác gây bi ến đổ i ADN, bao g ồm các thu ốc nhu ộm acridine. Chúng là các phân t ử mô ph ỏng các baz ơ và có th ể xen vào gi ữa các baz ơ nit ơ c ủa chu ỗi xo ắn kép ADN. B ằng cách đó chúng gây ra s ự xen thêm ho ặc m ất m ột c ặp nucleotide trên gen (acridine lớn gấp đôi m ột nucleotide), d ẫn đế n khung đọ c mã thay đổi và các protein được t ổng h ợp th ường không có ho ạt tính. 1.3.4. Các đột bi ến t ự phát gây ra b ởi deamine hoá Các đột bi ến t ự phát có th ể x ảy ra b ằng các c ơ ch ế k ết c ặp sai khác trong tái b ản ADN. Ch ẳng hạn, các baz ơ đặc bi ệt là cytosine, có xu h ướng m ất đi nhóm amin c ủa chúng trong m ột quá trình gọi là deamine hoá (deamination). Phổ bi ến nh ất là đảo cytosine thành uracil, th ường thì không d ẫn tới độ t bi ến, b ởi vì các t ế bào có m ột c ơ ch ế tách b ỏ uracil (nh ờ uracil-ADN glycosylase). Enzyme này c ắt liên k ết gi ữa uracil và deoxyribose c ủa nó, để r ồi m ột enzyme khác t ới b ổ sung m ột cytosine vào g ốc đường này để nó c ặp v ới guanine ở s ợi đối di ện. 1.4. Tác nhân gây đột bi ến 1.4.1. Các tác nhân hoá h ọc • Đột bi ến gây ra b ởi các ch ất t ươ ng t ự nucleoside Một s ố h ợp ch ất hoá h ọc có th ể làm t ăng t ần s ố h ỗ bi ến và qua đó gây ra các đột bi ến. Ví d ụ kinh điển là 5-bromodeoxyuridine (BrdU), th ường gọi là 5-bromouracil (5-BU; Hình 7.7 và 7.8), một ch ất gi ống nh ư thymidine ngo ại tr ừ thay m ột nguyên t ử bromine (Br) cho m ột nhóm methyl ở vị trí 5. Tuy nhiên, m ột khi 5-BU được k ết h ợp vào ch ỗ c ủa thymidine, nó có th ể gây r ắc r ối. R ắc rối b ắt ngu ồn t ừ ch ỗ 5-BU có xu h ướng t ăng c ường b ật sang d ạng h ỗ bi ến enol để có th ể k ết c ặp baz ơ gi ống nh ư C thay vì T, t ạo ra c ặp 5-BU-G (Hình 7.7). Và ở l ần tái b ản sau tạo thành c ặp GC 116
45. thay ch ỗ AT. K ết qu ả là t ạo ra đồ ng hoán AT → GC. Do h ỗ bi ến mà 5-BU có th ể gây đồ ng hoán hai chi ều, AT D GC. Hình 7.7. Các ki ểu k ết c ặp baz ơ c ủa 5-BU v ới A (ph ổ bi ến) và v ới G (hi ếm). Một hóa ch ất gây độ t bi ến khác là 2-aminopurine (2-AP), ch ất t ươ ng t ự c ủa A, có th ể c ặp v ới T. Khi b ị proton hóa, 2-AP có th ể k ết c ặp nh ầm v ới C để gây độ t bi ến đồ ng hoán AT → GC ở l ần tái b ản sau. • Đột bi ến gây ra b ởi s ự alkyl hoá c ủa các baz ơ Một s ố ch ất trong môi tr ường là các ch ất có ái l ực v ới điện t ử (electrophyle); chúng tìm các trung tâm điện tích âm trong các phân t ử khác và bám vào. Nhi ều ch ất khác thu ộc môi tr ường được chuy ển hoá trong c ơ th ể thành ra các h ợp ch ất có ái l ực điện t ử. M ột trong nh ững trung tâm điện tích âm rõ nh ất trong sinh h ọc là phân t ử ADN. M ỗi nucleotide ch ứa m ột điện tích âm toàn ph ần trên phosphate và các điện tích âm t ừng ph ần trên các baz ơ. Khi các ch ất ái l ực điện t ử b ắt g ặp các trung tâm điện tích âm này, chúng s ẽ t ấn công, thông th ường là g ắn thêm các nhóm ch ứa carbon - nhóm alkyl, gọi là alkyl hoá (alkylation). Nhi ều tác nhân gây ung th ư (carcinogen) là các ch ất ái l ực điện tử d ường nh ư ho ạt độ ng b ằng cách t ấn công ADN và alkyl hoá nó. Nhi ều tác nhân độ t bi ến được s ử d ụng trong phòng thí nghi ệm để gây t ạo các độ t bi ến c ũng là các tác nhân alkyl hoá, ví d ụ ethylmethane sulfonate (EMS). Khi x ử lý b ằng EMS (Hình 7.9), hoá ch ất này nh ường nhóm ethyl (CH 3-CH 2) cho ADN mà c ụ th ể là cho oxy O 6 của guanine t ạo ra O 6-alkylguanine. Baz ơ được alkyl hoá này c ặp v ới thymine thay vì cytosine. K ết qu ả là sinh ra đồng hoán GC → AT ở l ần tái b ản sau. 117
46. Hình 7.8. Các ch ất t ươ ng t ự nucleoside . Dạng keto ph ổ bi ến c ủa 5-BU là ch ất t ươ ng t ự thymidine, có th ể c ặp v ới A (a); còn d ạng ion hoá (enol) c ủa 5-BU có th ể c ặp v ới G (b). 2-aminopurine (2-AP) là ch ất tươ ng t ự adenosine, có th ể c ặp v ới T (c); khi ở d ạng proton hoá, nó có th ể c ặp v ới C (d). Hình 7.9. Alkyl hóa c ủa b ởi EMS . Bên trái là c ặp baz ơ guanine–cytosine bình th ường. Lưu ý oxy O6 t ự do (màu đỏ) trên guanine. Ethylmethane sulfonate (EMS) cho m ột nhóm ethyl ( đậm có g ạch) vào oxy O6, tạo ra O6-ethylguanine (hình bên ph ải), ở đó x ảy ra k ết c ặp baz ơ v ới thymine thay vì cystosine. Sau nhi ều h ơn m ột l ần tái b ản, một c ặp baz ơ A–T sẽ thay th ế m ột c ặp G–C. Đây là đột bi ến đồng hoán GC → AT. 1.4.2. Các tác nhân v ật lý Trong s ố tác nhân phóng x ạ gây độ t bi ến, các tia t ử ngo ại, tia gamma và tia X là phổ bi ến trong tự nhiên và trong các thí nghi ệm gây độ t bi ến. Các lo ại b ức x ạ khác nhau gây ra các ki ểu t ổn th ươ ng khác nhau. Các tia c ực tím (ultraviolet radiation = UV) có n ăng l ượng t ươ ng đối th ấp, và chúng gây ra ki ểu t ổn th ươ ng v ừa ph ải, đó là các dimer pyrimidine mà ph ổ bi ến là dimer thymine (–T=T–; Hình 7.11). T ổn th ươ ng này bi ểu hi ện ở s ự bi ến d ạng c ủa chu ỗi xo ắn kép, làm cản tr ở s ự k ết c ặp c ủa các baz ơ purine (Adenine) trong tái b ản. H ậu qu ả là có th ể làm ch ết t ế bào ho ặc t ạo ra độ t bi ến do vi ệc lắp sai nucleotide vào v ị trí đố i di ện v ới dimer trong khi tái b ản. Lo ại b ức x ạ c ực tím làm t ổn th ươ ng ADN n ặng nh ất ở b ước sóng kho ảng 260 nm, là vùng sóng mà ADN h ấp th ụ m ạnh nh ất. Bức x ạ này có r ất nhi ều trong ánh sáng m ặt tr ời và có nguy c ơ gây ung th ư da (Hình 7.10). Hình 7.10. Các bi ểu hi ện ở ki ểu hình lâm sàng c ủa nh ững ng ười b ị b ệnh ung th ư da (Xeroderma pigmentosum), ch ủ y ếu do tác độ ng c ủa các tia c ực tím. Các t ổn th ươ ng do b ức x ạ c ực tím đố i v ới ADN (dimer thymine) có th ể được s ửa ch ữa tr ực ti ếp bằng photolyase; enzyme này s ử d ụng n ăng l ượng ánh sáng t ừ b ước sóng g ần v ới tia UV đế n ánh sang xanh để c ắt đứ t các liên k ết gi ữ hai pyrimidine v ới nhau. Các tia gamma và tia X có n ăng l ượng l ớn h ơn nhi ều; chúng ion hóa các phân t ử xung quanh ADN và t ạo thành các g ốc t ự do có kh ả n ăng ph ản ứng cao: t ấn công ADN, bi ến đổ i các baz ơ ho ặc làm đứt gãy các s ợi. 118
47. Hình 7.11. Sự hình thành dimer thymine b ởi tia c ực tím (UV) . (a) Ví d ụ dimer T; (b) T ổng quát cho dimer pyrimidine, chú ý vòng cyclobutan.  Hồi bi ến (reversion) hay đột bi ến ng ược (back-mutation) là đột bi ến quay l ại ki ểu hình ban đầu. Các độ t bi ến gây ra b ởi các baz ơ tươ ng đồng ho ặc HNO 2 có th ể h ồi bi ến b ằng cách ti ếp t ục xử lý chính tác nhân đó. Tuy nhiên m ột s ố ch ất nh ư hydroxylamine vì ch ỉ ph ản ứng đặ c thù v ới cytosine và làm phát sinh đồng hoán m ột chi ều GC → AT, nên không th ể h ồi bi ến b ằng chính nó. 2. Tổn th ươ ng và s ửa ch ữa ADN Sửa ch ữa ADN là đặc tính thi ết y ếu c ủa các tế bào nh ằm ph ục h ồi c ấu trúc ADN bị t ổn th ươ ng do các tác nhân lý-hoá ho ặc t ự phát trong quá trình tái b ản ADN. Có nhi ều h ệ th ống s ửa sai trong các t ế bào. T ựu trung có các c ơ ch ế c ơ b ản sau: đọc s ửa trong lúc tái b ản nh ờ m ột s ố ADN polymerase (nh ư đã đề c ập), quang ph ục ho ạt, cắt b ỏ baz ơ ho ặc nucleotide và sửa ch ữa sau tái b ản. Tỷ l ệ độ t bi ến t ự nhiên nói chung th ấp là nh ờ tính hi ệu qu ả c ủa các h ệ th ống s ửa sai này. 2.1. S ửa ch ữa b ằng quang ph ục ho ạt Quang ph ục ho ạt (photoreactivation) là ki ểu s ửa ch ữa x ảy ra d ưới tác d ụng c ủa ánh sáng, nên còn g ọi là sửa ch ữa ngoài sáng (light repair). Nó được xúc tác b ởi enzyme ADN photolyase . C ơ ch ế sửa ch ữa dimer thymine b ởi enzyme này được hình dung nh ư sau: (i) phát hi ện và bám vào v ị trí ADN b ị t ổn th ươ ng; (ii) enzyme h ấp th ụ ánh sáng có b ước sóng 320-370 nm, và được kích ho ạt để có th ể c ắt đứ t các liên k ết v ốn t ạo ra dimer, làm ph ục h ồi tr ạng thái b ổ sung gi ữa các baz ơ c ủa hai sợi; và (iii) h ư h ại được ch ữa xong, và enzyme r ời kh ỏi ADN. 119
48. Hình 7.12. Mô hình v ề quang ph ục ho ạt (xem gi ải thích trong bài). 2.2. S ửa ch ữa b ằng c ắt bỏ Sự sửa ch ữa b ằng c ắt b ỏ (excision repair) được th ực hi ện b ởi các enzyme đặ c thù và không cần ánh sáng, nên g ọi là sửa ch ữa trong t ối (dark repair). S ự tách b ỏ vùng ADN h ư h ại và thay b ằng ADN m ới x ảy ra bằng cách ho ặc cắt b ỏ baz ơ ho ặc cắt b ỏ nucleotide . (Hình 7.12 và 7.13) Đối v ới s ự s ửa ch ữa b ằng cách c ắt b ỏ nucleotide (nucleotide excision repair), ch ẳng h ạn, t ổn th ươ ng baz ơ hàng lo ạt, k ể c ả dimer thymine, c ũng có th ể tách b ỏ tr ực ti ếp mà không c ần s ự giúp đỡ của ADN glycosylase. Ở E. coli, enzyme ch ủ chốt c ủa quá trình này là urvABC endonuclease (vì nó ch ứa ba polypeptide c ủa các gen urvA, urvB và urvC ). Enzyme này c ắt m ột đoạn dài 12-13 nucleotide trên m ột s ợi, tu ỳ thu ộc vào sai h ỏng ảnh h ưởng lên m ột nucleotide (alkyl hoá) ho ặc hai nucleotide (dimer). Kho ảng tr ống này s ẽ được l ấp đầ y nh ờ ADN polymerase I . Và cu ối cùng, ADN ligase sẽ hàn g ắn các khe h ở (Hình 7.14). Hình 7.13. Sửa ch ữa b ằng cách c ắt bỏ baz ơ ở E. coli . (a) ADN glycosylase nh ận bi ết baz ơ b ị t ổn th ươ ng. (b) ADN glycosylase lo ại b ỏ baz ơ, để l ại v ị trí apurine hay apyrimidinine g ọi là AP trên s ợi ADN phía d ưới. (c) M ột AP endonuclease cắt ADN ở đầ u 5' c ủa v ị trí AP. (d) ADN phosphodiesterase lo ại b ỏ AP- deoxyribose phos-phate mà đã b ị c ắt rời b ởi ADN glycosylase, (e) ADN polyme-rase I l ấp kho ảng tr ống và ti ếp tục s ửa ch ữa m ột s ố nucle-otide m ới theo chi ều 5' →3'. (f) ADN ligase hàn li ền khe h ở. Hình 7.14. Sửa ch ữa b ằng cách c ắt bỏ nucleotide ở E. coli . (a) UrvABC excinuclease c ắt b ỏ m ột trong hai bên của baz ơ t ổn th ươ ng có d ạng búp. (b) 120
49. Điều này giúp lo ại b ỏ m ột oligonucleotide ~12 nucleotide. N ếu tổn th ươ ng là m ột dimer pyrimidine lúc đó oligonu-cleotide dài 13 đơ n phân thay vì 12. (c) ADN polymerase I lấp đầ y kho ảng tr ống, b ằng cách s ử dụng đầ u 3' c ủa s ợi trên để làm khuôn, sau đó ADN ligase hàn li ền khe h ở. 3. Tái t ổ h ợp (Recombination) Tái t ổ h ợp là s ự trao đổ i v ật li ệu di truy ền t ạo ra các t ổ h ợp gen mới trong các phân t ử ADN th ế h ệ con, là nhân t ố quan tr ọng trong ti ến hoá. Nói đế n tái t ổ h ợp là nói đến s ự trao đổi s ợi hay trao đổi chéo có th ể x ảy ra n ội trong phân t ử (do s ự v ặn xo ắn và đứt-nối c ủa m ột s ợi) ho ặc có liên quan gi ữa hai phân t ử v ới c ơ ch ế thu ận ngh ịch ho ặc không thu ận ngh ịch. Có ba ki ểu tái t ổ h ợp khác nhau v ề c ăn b ản: (1) Tái t ổ h ợp đặ c hi ệu vị trí (site-specific recombination) ph ụ thu ộc vào trình t ự t ươ ng đồng được gi ới h ạn gi ữa các ADN tái t ổ h ợp. Ví d ụ điển hình là s ự xen c ủa ADN phage λ vào ADN vật ch ủ. (2) Tái t ổ h ợp t ươ ng đồng (homologous) hay đôi khi được g ọi là tái tổ h ợp chung (generalized) là lo ại tái t ổ h ợp x ảy ra trong gi ảm phân. Đây là d ạng ph ổ bi ến nh ất c ủa tái t ổ h ợp, ph ụ thu ộc vào độ t ươ ng đồng v ề trình t ự r ộng rãi gi ữa các phân t ử ADN tham gia. (3) Tái t ổ h ợp không chính th ức (illegimate) c ũng c ần có một s ự t ươ ng đồng nh ỏ nào đó gi ữa các ADN tái t ổ h ợp, nh ưng không đặc thù. Các y ếu t ố di truy ền v ận độ ng th ường s ử d ụng con đường tái t ổ h ợp ngo ại l ệ này. Hình 7.15. Ảnh hi ển vi điện t ử v ề s ự tái t ổ h ợp của ADN plasmid. Các mô hình hi ện nay v ề c ơ ch ế tái t ổ h ợp t ươ ng đồng th ống nh ất g ồm các b ước thi ết y ếu nh ưng không nh ất thi ết theo th ứ t ự, nh ư sau: (1) k ết c ặp c ủa hai ADN t ươ ng đồng; (2) đứ t gãy c ủa hai trong s ố các s ợi ADN t ươ ng đồng; (3) tái t ạo các liên k ết phosphodiester để n ối li ền hai s ợi tươ ng đồng (ho ặc các vùng c ủa cùng một s ợi trong tái t ổ h ợp n ội phân t ử); (4) đứ t gãy hai s ợi khác và n ối chúng l ại. C ơ ch ế c ơ s ở do Robin Holliday đưa ra vào n ăm 1964 nên g ọi là mô hình Holliday . T ổng quát, mô hình này d ựa trên vi ệc t ạo ra m ột c ầu chéo có th ể di chuy ển d ọc theo hai 121
50. chu ỗi xo ắn kép khác nhau và sau đó c ắt đứ t c ấu trúc trung gian theo m ột trong hai cách để t ạo ra các ki ểu phân t ử ADN tái t ổ h ợp khác nhau. Hình 7.16 v ề tái t ổ h ợp t ươ ng đồng là mô hình Holliday đã được c ải biên. DNA c ủa m ột chromatid không ch ị em (''1') bị c ắt đứ t xuyên qua c ả hai sợi (m ột s ự “đứt gãy s ợi kép”) Một enzyme g ặm d ần phía đầ u 5' c ủa m ỗi s ợi, để l ại hai cái “đuôi” 3' c ủa DNA s ợi đơn. Kho ảng này có th ể dài 600-800 baz ơ và có l ẽ được ổn đị nh b ằng các protein chuyên hoá cho ch ức n ăng đó. 1. M ột trong các đuôi s ợi đơn t ự nó xen gi ữa chu ỗi xo ắn kép c ủa chromatid không ch ị em “2” (màu đỏ) làm tách các s ợi đơn c ủa nó. 2. N ếu s ợi “xâm nh ập” tìm th ấy m ột trình t ự các nucleotide b ổ sung v ới nó thì s ẽ x ảy ra s ự k ết c ặp. 3. S ợi th ế ch ỗ (màu đỏ phía trên) c ặp v ới đuôi 3' th ứ hai của chromatid 1. 4. T ổng h ợp DNA l ấp c ả hai kho ảng tr ống (các s ọc xanh) nh ờ s ử d ụng c ả hai s ợi c ủa chromatid 2 ( đỏ ) làm khuôn. Tất c ả các s ợi được c ắt và các đầu mút b ị c ắt c ủa m ột chromatid được trao đổ i và n ối l ại b ằng liên k ết đồ ng hoá tr ị v ới các đầ u mút b ị c ắt c ủa chromatid khác. N ếu điều này x ảy ra, các chromatid không ch ị em s ẽ có các vai trao đổi và trao đổi chéo là hoàn toàn (phía d ưới). Hình 7.16. Con đường tái t ổ h ợp t ươ ng đồng v ới s ự tham gia c ủa các protein tái t ổ h ợp RecBCD . Đầu tiên, RecBCD t ạo các v ết đứ t; sau đó các protein RecA và SSB xúc ti ến s ự xâm nh ập sợi, t ạo ra b ắt chéo hay là ch ỗ n ối Holliday; RuvA và B thúc đẩy s ự di chuy ển theo nhánh bên; RuvC tạo các v ết n ứt làm dung gi ải c ấu trúc này thành ra các ADN tái t ổ h ợp. 122
51. 4. Các y ếu t ố di truy ền v ận độ ng 4.1. Đại c ươ ng v ề các y ếu t ố di truy ền v ận độ ng Yếu t ố di truy ền v ận độ ng (transposable genetic element = TGE) là nh ững đoạn ADN có kh ả năng di chuy ển sang các v ị trí m ới trong b ộ gen t ế bào, ngh ĩa là không có v ị trí c ố đị nh trên nhi ễm sắc th ể. Trong quá trình này, chúng có th ể gây ra các độ t bi ến và gia t ăng ho ặc gi ảm hàm l ượng ADN trong b ộ gen. Hi ện t ượng này được phát hi ện l ần đầ u tiên b ởi B. McClintock n ăm 1952 ở ngô (Zea mays ). Chính công trình này đã mang l ại cho bà gi ải th ưởng Nobel n ăm 1984. Ngày nay, các yếu t ố di truy ền v ận độ ng được phát hi ện ở nhi ều virus, vi khu ẩn và eukaryote. 4.2. Các y ếu t ố di truy ền v ận độ ng ở prokaryote 4.2.1. Đoạn xen Đoạn xen (insertion sequence = IS) là lo ại y ếu t ố di truy ền v ận độ ng đơn gi ản nh ất, có c ấu trúc khá gi ống nhau ở các sinh v ật và c ần thi ết cho quá trình tách và xen c ủa các y ếu t ố này. Ở E. coli có các nhóm đoạn xen: IS1, IS2, IS3, IS4, IS5 ; chúng có th ể phân b ố r ải rác trên NST và các plasmid. Ví d ụ, IS1 (Hình 7.17) có kho ảng 5-8 b ản sao trên NST với chi ều dài 768 bp; g ồm m ột gen transposase mã hoá enzyme chuy ển v ị 720 bp, n ằm gi ữa hai đoạn l ặp đả o ng ược hay ng ược chi ều (inverted repeat = IR) dài 24 bp. Hình 7.17 Cấu trúc c ủa m ột đoạn xen, ở đây là IS1. [T ừ Russell, 2009] 4.2.2. Gen nh ảy Các y ếu t ố IS riêng l ẻ không ch ỉ có kh ả n ăng t ự di chuy ển mà khi hai y ếu t ố này n ằm đủ g ần nhau thì chúng có th ể v ận độ ng nh ư m ột đơn v ị hoàn ch ỉnh và mang theo các gen nằm gi ữa chúng. Cấu trúc ph ức t ạp nh ư th ế g ọi là gen nh ảy (jumping gene) mà thu ật ng ữ là transposon (Tn ). Ví d ụ gen nh ảy Tn 1681 ở E. coli gồm hai đoạn xen IS1 nằm ở hai đầ u c ủa m ột gen xác định độ c t ố ch ịu nhi ệt gây ỉa ch ảy có kích th ước 552 bp. Có hai ki ểu tổ ch ức transposon ở vi khu ẩn: (1) Transposon h ỗn h ợp, ví d ụ Tn10 (Hình 7.18a) mang gen kháng tetracylin n ằm gi ữa hai yếu t ố IS10 ng ược chi ều (bên trái và bên ph ải, ký hi ệu là IS10L và IS10R). (2) Transposon đơ n gi ản, ví d ụ Tn3 (Hình 7.18b) mang c ụm [gen transposase + gen phân tách resolvase + gen β-lactamase] và ở hai đầ u là các đoạn l ặp ng ược chi ều IR với 38 bp gi ống nhau. 123