Giáo trình Trao đổi chất và năng lượng sinh học

287 trang hapham 1840

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Trao đổi chất và năng lượng sinh học", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

giao_trinh_trao_doi_chat_va_nang_luong_sinh_hoc.pdf

Nội dung text: Giáo trình Trao đổi chất và năng lượng sinh học

Trao đổi chất và năng lượng sinh học
Chương 1 Trao đổi chất và năng lượng sinh học 1.1. Khái niệm chung về trao đổi chất Mỗi cơ thể sống đều tồn tại trong môi trường và liên hệ mật thiết với môi trường đó. Hiện tượng cơ thể lấy một số chất từ môi trường kiến tạo nên sinh chất của mình và thải ra ngoài những chất cặn bã được gọi là sự trao đổi chất. Sự trao đổi chất ở giới vô sinh khác với giới hữu sinh. Ở giới vô sinh, trao đổi chất làm cho các chất hữu cơ và vô cơ bị phân huỷ. Ví dụ, đá vôi (canxi carbonate) bị xói mòn vì H2CO3 có trong nước tác dụng với đá vôi thành canxi bicarbonate, mỡ bị ôi hoá thành một số chất khác là do tác dụng với oxy. Ở thế giới sinh vật, mỗi cơ thể sống luôn luôn trao đổi chất với môi trường, lấy thức ăn vào chuyển hoá thành các chất sử dụng cho cơ thể và thải ra ngoài các chất cặn bã. Quá trình đó được thực hiện là do các biến đổi hoá học liên tục xảy ra trong cơ thể. Toàn bộ các biến đổi hoá học đó được gọi là sự trao đổi chất. Quá trình trao đổi chất gồm nhiều khâu chuyển hoá trung gian. Mỗi chuyển hoá là một mắt xích của một trong hai quá trình cơ bản: đồng hoá và dị hoá. Đồng hoá và dị hoá là hai quá trình đối lập, nhưng lại thống nhất với nhau trong một cơ thể: chúng xảy ra đồng thời và liên quan mật thiết với nhau. Các chất được tổng hợp nên trong quá trình đồng hoá là nguyên liệu cho qúa trình dị hoá (ví dụ gluxit là sản phẩm của quá trình quang hợp, là nguyên liệu cho qúa trình hô hấp). Năng lượng giải phóng ra trong quá trình dị hoá được sử dụng một phần cho quá trình tổng hợp. 1.2 Năng lượng sinh học Hệ thống sống cần năng lượng để chuyển động, lớn lên, tổng hợp các phân tử sinh học, sự vận chuyển ion và phân tử qua màng. Tất cả đòi hỏi năng lượng đưa vào. Các cơ thể lấy năng lượng từ môi trường sống và sử dụng năng lượng đó để thực hiện các quá trình sống có hiệu quả. Để nghiên cứu năng lượng sinh học đòi hỏi phải có hiểu biết về nhiệt động học, một số định luật, nguyên lý mô tả nguồn, trao đổi nhiệt, năng lượng và vật chất trong hệ thống nghiên cứu. 1
Nhiệt động học cho chúng ta xác định quá trình hoá học và phản ứng có thể tự xảy ra hay không. Mặc dù nhiệt động học là khái niệm phức tạp, nhưng nó dựa trên ba định luật tương đối đơn giản và dễ hiểu. Một vài nguyên lý của nhiệt động học cơ bản được đưa ra trong chương này bao gồm phân tích nguồn nhiệt, sản sinh entropy, hàm năng lượng tự do và mối liên quan giữa entropy và thông tin. Chương này cũng đề cập đến ATP và những hợp chất cao năng khác. Khái niệm về nhiệt động học cơ bản Bất kỳ một sự quan tâm nào của nhiệt động học phải phân biệt giữa hệ thống và môi trường. Hệ thống là một phần của vũ trụ mà chúng ta quan tâm, trong khi đó môi trường là gồm tất cả những gì còn lại. Có ba trạng thái cơ bản: hệ thống cô lập, hệ thống đóng và hệ thống mở. Hệ thống cô lập: Không có sự trao đổi chất và năng lượng với môi trường. Hệ thống đóng: Có trao đổi năng lượng, nhưng không có trao đổi chất với môi trường. Hệ thống mở: Có trao đổi chất và năng lượng với môi trường. Cơ thể sống là hệ thống mở điển hình mà trao đổi chất (dinh dưỡng và sản phẩm thải ra) và năng lượng (nhiệt từ trao đổi chất) với môi trường. Định luật 1: Nhiệt, công và các dạng năng lượng khác Trước đây trong sự phát triển của nhiệt động học người ta cho rằng nhiệt độ có thể biến đổi thành những dạng năng lượng khác và hơn nữa tất cả các dạng năng lượng một cách cơ bản có thể biến đổi thành một số dạng khác. Định luật 1 nói rằng: tổng năng lượng của một hệ thống cô lập là không thay đổi. Các nhà nhiệt động học đã mô phỏng thành một hàm toán học để nghiên cứu sự biến đổi nhiệt và sử dụng công trong những hệ thống nhiệt động học. Hàm này được gọi là năng lượng nội năng, thường ký hiệu là E hoặc U. Năng lượng này chỉ phụ thuộc vào trạng thái hiện tại của một hệ thống và vì vậy được coi là hàm trạng thái. Năng lượng nội năng không phụ thuộc vào hệ thống xảy ra như thế nào và vì vậy không phụ thuộc vào đường hướng. Một cách mở rộng suy nghĩ này là chúng ta có thể thay đổi hệ thống bằng bất cứ con đường nào và cho đến khi nào hệ thống trở về trạng thái ban đầu năng lượng nội năng sẽ không thay đổi. 2
Năng lượng nội năng, E của bất kỳ hệ thống nào có thể thay đổi nếu nguồn năng lượng vào hoặc ra khỏi hệ thống ở dạng nhiệt hoặc công cho bất kỳ qúa trình nào biến đổi một trạng thái (1) sang một trạng thái khác (2) thay đổi năng lượng nội năng là: ΔE = E2 - E1 = q + w (1.1) q là lượng nhiệt được hệ thống hấp thụ từ môi trường w là công thực hiện trên hệ thống do môi trường Công cơ học được định nghĩa là sự chuyển động từ chỗ này đến chỗ khác, gây ra do sử dụng lực. Cả hai phải xảy ra công mới được thực hiện. Ví dụ: Một tàu chở khách đã chứa đầy khách nhưng không di chuyển, theo định nghĩa nhiệt động học công không được thực hiện. Trong hệ thống hoá sinh học và hoá học công thường liên quan với áp suất và thể tích của hệ thống. Công cơ học được xác định w = -PΔV Trong đó P là áp suất, ΔV là sự thay đổi thể tích và = V2-V1 Khi công được xác định theo cách này, ký hiệu bên phải của phương trình (1.1) là dương (đôi khi w được xác định là công được thực hiện bởi hệ thống, trong trường hợp này phương trình là ΔE = q - w). Công có thể được thực hiện ở nhiều dạng: cơ học, điện, từ và hoá học. ΔE, q, w phải có cùng đơn vị: calorie (cal) và kilocalorie (kcal) được sử dụng theo truyền thống, nhưng theo đơn vị SI: Joule được đề nghị nên dùng. Enthalpy: Hàm có nhiều tiện lợi cho hệ thống sinh học Nếu định nghĩa công được giới hạn bởi công cơ học, trong trường hợp này ΔE chỉ là thay đổi nhiệt ở thể tích không đổi. Vì vậy nếu V không đổi, không có công được thực hiện. ΔE = q. Vì vậy ΔE là một định lượng rất tiện lợi trong quá trình thể tích không thay đổi. ΔE không cần thiết bằng biến đổi nhiệt. Vì lý do này các nhà hoá sinh học, hoá học đã xác định một hàm đặc biệt phù hợp cho quá trình áp suất không đổi. Nó được gọi là enthalpy, H được định nghĩa: H = E + PV (1.2) Nếu áp suất không thay đổi chúng ta có: ΔH = ΔE +PΔV = q + w +PΔV = q - PΔV +PΔV = q (1.3) Rõ ràng ΔH tương đương với biến đổi nhiệt trong quá trình áp suất không đổi. Vì các phản ứng hoá sinh thường xảy ra trong thể lỏng hoặc rắn hơn là thể khí nên thay đổi thể tích là nhỏ và enthalpy và năng lượng nội năng thường là như nhau. Để so sánh các chỉ số nhiệt động học của các phản ứng khác nhau điều thuận lợi là xác định ở điều kiện tiêu chuẩn. Để hoà tan trong một dung dịch trạng thái tiêu chuẩn thường là hoạt tính đơn vị (đơn giản là nồng độ 1M). Enthalpy, năng lượng nội năng và những định lượng nhiệt 3
động học khác thường đưa ra hoặc xác định cho những điều kiện tiêu chuẩn và được ký hiệu là ΔH0, ΔE0 Enthalpy thay đổi ở các quá trình hoá sinh có thể được xác định bằng việc đo nhiệt độ hấp thụ (hoặc toả ra) bằng một calorimeter. Mặt khác cho bất kỳ quá trình nào A ' B ở trạng thái cân bằng, enthalpy ở trạng thái tiêu chuẩn thay đổi qúa trình có thể được xác định từ sự phụ thuộc vào nhiệt độ ở hằng số cân bằng: d (ln Keq) ΔH0 = (1.4) d (1/T) 1.1 Sự thay đổi enthapy, ΔH0, cho 1 phản ứng có thể được xác định độ dốc của sơ đồ RlnKeq ngược với 1/T. Để minh họa phương pháp này những giá trị hai bên của 327K (54,50C) được nêu ra. Số liệu được sử dụng để tính ΔH0 ở 54,50C Ở đây R là hằng số khí = 8.314 J/mol K Ví dụ: trong một nghiên cứu biến tính của protein chymotripsinogen (qúa trình thuận nghịch, gây biến tính bởi nhiệt độ). Trạng thái nguyên thuỷ (N) ' Trạng thái biến tính (D) Keq = [D] / [N] 4
John F. Brandts đo hằng số cân bằng cho sự biến tính ở một loạt pH và nhiệt độ, số liệu ở pH = 3 Biểu đồ của R (ln Keq) đối với 1/T (sơ đồ Van’t Hoff) được chỉ ra ở hình 1.1. ΔH0 cho quá trình biến tính ở bất kỳ nhiệt độ nào là giá trị âm của đường dốc của sơ đồ ở nhiệt độ đó như sơ đồ Giá trị ΔH0 có ý nghĩa gì đối với biến tính của protein? Giá trị dương của ΔH0 biểu diễn sự bẻ gãy liên kết hydro cũng như giải phóng những nhóm ưa nước từ bên trong phân tử protein ban đầu trong qúa trình biến tính, như vậy sẽ nâng năng lượng của dung dịch protein. Độ lớn của enthalpy này thay đổi (533 kJ/m) ở 54,50C là lớn so với giá trị tương tự của ΔH0 của protein khác nhau và cho cùng loại protein ở 25 0C (bảng 1.1). Nếu chúng ta xem xét sự chỉ sự thay đổi enthalpy dương của quá trình biến tính thì trạng thái gập tự nhiên là rất thuận lợi, những chỉ số khác phải được giải thích. Định luật thứ hai và entropy: Một cách trật tự và suy nghĩ về không trật tự Định luật thứ hai của nhiệt động học được mô tả và thể hiện trong nhiều cách bao gồm những điểm sau: Hệ thống có xu hướng tiến từ trạng thái trật tự sang trạng thái không trật tự (entropy lớn). Entropy của hệ thống + môi trường là không đổi bởi quá trình thuận nghịch. Entropy của hệ thống + môi trường tăng do quá trình không thuận nghịch. 5
Tất cả các quá trình xảy ra trong tự nhiên hướng tới trạng thái cân bằng, đó là trạng thái năng lượng nhỏ nhất. Một số điểm của định luật 2 dẫn đến khái niệm entropy, đó là thước đo sự mất trật tự và sự ngẫu nhiên của hệ thống, trong đó trạng thái mất trật tự là trạng thái có entropy cao. Entropy có thể được xác định theo một vài cách. Nếu W là số cách để sắp xếp thành phần của một hệ thống mà không thay đổi năng lượng nội năng hoặc enthalpy (đó là số lượng của trạng thái kính hiển vi được đưa ra ở nhiệt độ, ánh sáng và tổng vật chất). Entropy được tính: S = klnW (1.5) k là hằng số Boltzmann = 1,38.10-23 J/K Định nghĩa này có lợi cho tính toán thông kê, nhưng dạng phổ biến hơn liên quan entropy đến sự biến đổi nhiệt trong một quá trình. dq dS thuận nghịch = (1.6) T dS thuận nghịch là thay đổi entropy của hệ thống trong một quá trình thuận nghịch, q là nhiệt độ được biến đổi, T là nhiệt độ ở đó sự biến đổi nhiệt xảy ra. Định luật 3: Tại sao”0 tuyệt đối” quan trọng như vậy? Định luật 3 của nhiệt động học nói rằng: entropy của bất kỳ chất nào hoàn toàn có trật tự, tinh thể phải tiến đến 0. Ở nhiệt độ tiến đến 0 K và T= 0 K entropy chính xác = 0. Dựa trên điều này có khả năng thiết lập một hệ thống tỷ lệ entropy tuyệt đối, số lượng T S = Cp ∫0 d lnT (1.7) Cp: khả năng biến đổi nhiệt ở áp suất không đổi. Khả năng nhiệt của một chất là tổng số nhiệt của 1 M có thể dự trữ khi nhiệt độ của chất đó được nâng lên 1 độ. Đối với quá trình áp suất không đổi nó được mô tả bằng toán học dH Cp = (1.8) dt Nếu khả năng nhiệt có thể được tính ở tất cả nhiệt độ giữa 0 K và nhiệt độ nào đó, entropy tuyệt đối được tính đối với quá trình sinh học thay đổi entropy có nhiều tiện lợi hơn entropy tuyệt đối. Thay đổi entropy 6
cho một quá trình có thể được tính nếu thay đổi enthalpy và năng lượng tự do đã biết. Năng lượng tự do: Một giả thuyết nhưng là công cụ tiện lợi Một câu hỏi quan trọng đối với nhà hoá học, đặc biệt đối với nhà hoá sinh học là: Phản ứng sẽ xảy ra theo hướng từ phải sang trái? Gibbs, một trong những người xây dựng nên nhiệt động học nhận thấy câu trả lời cho câu hỏi này nằm trong sự so sánh thay đổi enthalpy và thay đổi entropy ở một nhiệt độ nào đó, năng lượng tự do Gibbs được định nghĩa như sau: G = H - TS (1.9) Cho bất kỳ quá trình A ' B ở nhiệt độ và áp suất không đổi. Sự thay đổi năng lượng tự do được tính: ΔG = ΔH - T ΔS (1.10) Nếu ΔG gần = 0 quá trình ở cân bằng, không đi theo hướng thuận hoặc ngược lại khi ΔG = 0 ΔS = ΔH/T và thay đổi enthalpy và entropy là cân bằng chính xác. Bất kỳ quá trình với ΔG khác 0 thực hiện tự động đến trạng thái cuối cùng có năng lượng tự do thấp. Nếu ΔG âm thì quá trình xảy ra theo hướng từ trái sang phải. Nếu ΔG > 0 phản ứng xảy ra theo hướng ngược lại (ký hiệu và giá trị của ΔG cho phép xác định quá trình sẽ xảy ra nhanh như thế nào). Nếu quá trình có ΔG âm thì quá trình tự xảy ra, nếu ΔG dương thì quá trình không tự xảy ra (hay tự xảy ra theo chiều nghịch). Thay đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn Thay đổi năng lượng tự do ΔG cho bất kỳ phản ứng nào phụ thuộc vào chất tham gia phản ứng và sản phẩm phản ứng và cũng bị ảnh hưởng bởi điều kiện phản ứng kể cả nhịêt độ, áp suất và pH và nồng độ của chất phản ứng và sản phẩm. Như đã giải thích, rất tiện lợi để xác định trạng thái tiêu chuẩn cho những qúa trình như vây. Nếu thay đổi năng lượng tự do cho một phản ứng là nhạy cảm với điều kiện hoà tan, điều gì đặc biệt có ý nghĩa cho sự thay đổi năng lượng tự do ở trạng thái tiêu chuẩn. Để trả lời cho câu hỏi này xem xét một phản ứng giữa hai chất A và B để tạo nên sản phẩm C và D A + B → C + D (1.11) Thay đổi năng lượng tự do cho nồng độ không ở trạng thái tiêu chuẩn là [C ] [D ] 7
ΔG = ΔG0 + RT ln (1.12) [A] x [B ] [C ] [D ] = Keq [A] x [B ] Ở trạng thái cân bằng ΔG = 0 Chúng ta có 0 ΔG = - RT ln Keq (1.13) hoặc logarit cơ số 10 0 ΔG = - 2,3 RT/ log 10 Keq (1.14) -ΔG/2,3 RT Nó được biến đổi Keq =10 (1.15) Trong bất cứ dạng nào mối liên hệ cho phép xác định thay đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn cho bất kỳ quá trình nào nếu hằng số cân bằng được biết. Quan trọng hơn, điều đó nói rằng cân bằng thiết lập cho một phản ứng trong dung dịch là một hàm của sự thay đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn cho quá trình, nghĩa là ΔG0 là cách viết khác của hằng số cân bằng. Ví dụ hằng số cân bằng xác định bởi Brandts ở một số nhiệt độ với sự biến tính của chymotrypsinogen có thể được dùng để tính sự thay đổi năng lượng tự do cho quá trình biến tính. Ví dụ hệ số cân bằng ở 54,50C là 0,27, như vậy ΔG0 = - (8,314 J/mol. K (327,5K) ln (0,27) ΔG0 = - (2,72 kJ/mol . ln (0,27) ΔG0 = 3,56 kJ/mol Ký hiệu dương của ΔG0 nghĩa là quá trình biến tính không ưu thế. Dạng gập là dạng bền của protein ở 54,50C. Mặt khác độ lớn tương đối nhỏ của ΔG0 nghĩa là dạng gập chiếm ưu thế nhỏ. 8
1.2 Sự phụ thuộc của ΔG0 vào nhiệt nhiệt độ trong quá trình biến tính của chymotrypsinogen Hình 1.2 chỉ sự phụ thuộc của ΔG0 vào nhiệt độ biến tính ở pH = 3. Tính cả ΔH0 và ΔG0 của sự biến tính chymotrypsin, có thể tính ΔS0 sử dụng phương trình (3.10). (ΔG0 - ΔH0) ΔS0 = (1.16) T Ở 54,50C (327,5 K) ΔS0 = - (3560 - 533,000 J/mol) / 327,5 K ΔS0 = 1,620J/mol.K Hình 1.3 biểu diễn sự phụ thuộc của ΔS0 vào nhiệt độ biến tính của chymotrypsin ở pH = 3. Giá trị dương ΔS0 chỉ rằng dung dịch protein đã trở nên không trật tự khi protein bị biến tính. So sánh giá trị 1,62 kJ/mol.K với giá trị ΔS0 ở bảng 1.1 chỉ ra rằng giá trị hiện tại cho chymotrypsin ở 54,50C là hoàn toàn lớn. Ý nghĩa vật lý của chỉ số nhiệt động học cho sự biến tính của chymotrypsin sẽ rõ hơn trong phần sau. Ý nghĩa vật lý của đặc tính nhiệt động học Những chỉ số nhiệt động học cho ta biết những hiện tượng sinh hoá gì? Cách tốt nhất để trả lời câu hỏi này là một chỉ số riêng rẽ (ví dụ ΔH 9
hoặc ΔG ) không có nhiều ý nghĩa. Một giá trị dương ΔH0 cho sự biến tính của một protein có thể phản ánh hoặc là sự gãy các liên kết hydro trong protein hoặc sự xuất hiện các nhóm ưa nước ra bên ngoài. Tuy vậy sự so sánh một số chỉ tiêu nhiệt động học có thể cung cấp những hiểu biết bên trong có ý nghĩa về một quá trình. 1.3 Sự phụ thuộc của ΔS0 vào nhiệt độ trong quá trình biến tính của chymotrypsinogen Ảnh hưởng của nồng độ đến thay đổi năng lượng tự do thực tế Phương trình (3.12) chỉ ra rằng thay đổi năng lượng tự do đối với một phản ứng rất khác nhau so với giá trị ở trạng thái tiêu chuẩn nếu nồng độ của chất phản ứng và sản phẩm khác với nồng độ hoạt động (1M cho dung dịch). Xem xét sự thuỷ phân của phosphocreatine: Phosphocreatine + H2O → Creatine + Pi Phản ứng này toả nhiệt rất mạnh và ΔG0 ở 370C là -42,8 kJ/mol Nồng độ sinh lý của phosphocreatine, creatine và Pi thường là giữa 1 mM và 10 mM. Cho rằng nồng độ 1 mM và sử dụng phương trình (3.12) ΔG cho thuỷ phân phosphocreatine là 10
[0,001] [0,001] ΔG = - 42,8 kJ/M + (8.314J/M) (310 K) ln [0,001] ΔG = - 60,5 kJ/M Ở 370C sự khác nhau giữa trạng thái tiêu chuẩn và nồng độ 1 mM cho một phản ứng như vậy là khoảng -17,7 kJ/mol Tầm quan trọng của các quá trình kết hợp trong cơ thể sống Nhiều phản ứng cần thiết để giữ tế bào và cơ thể chống lại thế nhiệt động học, đó là theo hướng ΔG dương. Trong đó có sự tổng hợp ATP và những phân tử cao năng khác và tạo nên gradient ion trong tất cả tế bào động vật có vú. Những quá trình này được thực hiện theo hướng bắt buộc nhiệt động học. Bằng sự kết hợp với các quá trình có khả năng tự xảy ra nhiều quá trình gắn liền với nhau được đề cập ở phần sau của chương này. Chúng rất quan trọng trong trao đổi chất trung gian, phosphoryl hoá oxy hoá và vận chuyển qua màng. Chúng ta có thể đoán những cặp phản ứng kết hợp sẽ xảy ra tự động bằng sự thay đổi tổng năng lượng tự do cho mỗi phản ứng. Ví dụ, xem xét phản ứng từ quá trình đường phân liên quan đến sự biến đổi phosphoenolpyruvic acid đến pyruvat. Sự thuỷ phân PEP giải phóng năng lượng và được sử dụng để phosphoryl hoá ADP thành ATP, một quá trình mà về mặt năng lượng không tự xảy ra. 1.2.1 Đặc tính năng lượng của sự trao đổi chất Năng lượng của các quá trình trao đổi chất (năng lượng sinh học) khác với năng lượng được thực hiện trong bản chất không sống ở ba đặc điểm sau đây: Đặc tính thứ nhất là sự chuyển hoá năng lượng thành công và thành những dạng khác mà không kèm theo sự chuyển hoá sơ bộ năng lượng này thành nhiệt năng. Xuất phát từ nguyên tắc này chúng ta cần xem hệ thống sống như là một động cơ hoá động học chứ không phải là động cơ nhiệt. Đặc tính thứ hai là việc giải phóng năng lượng trong các quá trình oxy hoá sinh học sinh ra từ từ, từng phần một, trong một chuỗi dài các quá trình kế tiếp nhau cho đến khi nào tất cả các nguyên tử hydro và cacbon đều biến thành các sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O. Ví dụ sự oxy hoá một phân tử gam đường giải phóng ra 686 kcal. Nếu năng lượng này được 11
giải phóng ra cùng một lúc thì sẽ gây tiếng nổ và hệ thống sống không thể sử dụng toàn bộ năng lượng trong một khoảng thời gian ngắn như vậy. 1.4 Tiến trình giải phóng năng lượng hoá học trong sự trao đổi chất được chia làm 3 giai đoạn Đặc tính thứ ba là năng lượng hoá học được giải phóng ra khi phân giải glucid, lipid và những hợp chất cao phân tử khác đều có thể được tích luỹ trong những hợp chất tích trữ năng lượng đặc thù, được gọi là hợp chất cao năng. 12
Tiến trình của việc giải phóng năng lượng hoá học cơ bản được chia làm 3 giai đoạn (hình 1.4): Giai đoạn thứ nhất các hợp chất cao phân tử (tinh bột, glycogen, proteine, lipid ) bị thuỷ phân thành các chất có phân tử bé (monosaccharide, amino acid, axit béo, glycerine ). Năng lượng giải phóng ra trong giai đoạn này không đáng kể, chỉ bằng gần 1% dự trữ năng lượng tự do của các chất này được giải phóng ra dưới dạng nhiệt. Giai đoạn thứ hai là quá trình đường phân, oxy hoá các axit béo và các amino acid. Năng lượng giải phóng ra trong giai đoạn này gần bằng 1/3 năng lượng tự do dự trữ trong các chất đó. Sản phẩm chính của giai đoạn này là acetyl-CoA, ∝-xetoglutaric acid và oxaloaxetic acid. Giai đoạn thứ ba là oxy hoá tiếp tục các chất trên trong chu trình Krebs. Khoảng 2/3 năng lượng được giải phóng ra ở giai đoạn này. 1.2.2 Các hợp chất cao năng Những hợp chất cao năng: Tất cả sự sống trên trái đất phụ thuộc vào năng lượng mặt trời, trong những dạng sống có một hệ thống thứ bậc về năng lượng. Một số tiếp nhận năng lượng mặt trời trực tiếp, một số khác nhận năng lượng từ nhóm trên trong những quá trình tiếp theo. Những sinh vật hấp thu năng lượng ánh sáng trực tiếp được gọi là cơ thể tự dưỡng. Những cơ thể này dự trữ năng lượng mặt trời trong các phân tử hữu cơ khác nhau. Những sinh vật sử dụng những phân tử đó, giải phóng năng lượng dự trữ trong một loạt các phản ứng oxy hoá khử được gọi là sinh vật hoá dưỡng. Mặc dù khác nhau cả hai loại đều có cơ chế chung về tái sinh một dạng năng lượng hoá học, năng lượng có thể được giải phóng trong những phản ứng toả nhiệt để thực hiện các quá trình sống đa dạng (cần năng lượng). Một nhóm nhỏ các phân tử là chất trung gian chuyển năng lượng từ các phản ứng giải phóng năng lượng đến các phản ứng cần năng lượng của cơ thể. Những phân tử này là coenzyme dạng khử, những hợp chất phosphate được gọi là cao năng nếu chúng giải phóng ra năng lượng tự do có giá trị âm lớn khi thuỷ phân (ΔG 0’ có giá trị âm lớn hơn -25 kJ/M). Ở bảng 1.2 sau đây là danh sách những hợp chất cao năng quan trọng nhất, những phân tử như phosphoric anhydric (ATP, ADP), enol phosphate (PEP), acyl phosphate (acetyl phosphate), guanidinophosphate (creatine phosphate). Cả những hợp chất thioeste, như acetyl CoA không chứa phospho nhưng giải phóng một năng lượng tự do lớn khi thuỷ phân. 13
Tổng số năng lượng chính xác giải phóng ra khi thuỷ phân phụ thuộc vào nồng độ, pH, nhiệt độ nhưng giá trị ΔG 0’ khi thuỷ phân những hợp chất này có giá trị dương lớn hơn đáng kể so với những chất trao đổi khác. Chúng có hai đặc điểm quan trọng: Những chất phosphate cao năng (high- energy phosphate compounds) không phải là chất dự trữ năng lượng lâu dài, chúng là những chất chuyển tiếp năng lượng dự trữ, là chất mang năng lượng từ điểm này sang điểm khác, từ một hệ thống này đến một hệ thống khác. Năng lượng hoạt hoá được cung cấp đáng kể từ ATP khi thuỷ phân nhóm γ-phosphat. 15
Năng lượng để làm gãy liên kết O-Pα thường là 200-400 kJ/M, lớn hơn đáng kể so với 30,5 kJ/M khi thuỷ phân ATP. Các nhà hoá sinh học quan tâm nhiều đến năng lượng giải phóng thực tế. Vai trò trung tâm của ATP trong năng lượng sinh học ATP chứa hai pyrophosphoryl (hình 1.4). Những phân tử có liên kết anhydric, ADP, GTP, GDP và các nucleoside triphosphate khác, nucleotide-đường như UDP-glucose và pyrophosphate vô cơ thể hiện năng lượng tự do ΔG0’ lớn khi thuỷ phân. Nguyên nhân hoá học của giá trị ΔG0’ âm lớn là do sự không bền vững của chất phản ứng do sự căng liên kết gây ra bởi sự đẩy tĩnh điện. Sự bền vững của sản phẩm phản ứng do sự ion hoá, sự cộng hưởng và những yếu tố entropy gây ra do thuỷ phân và sự ion hoá tiếp theo. Mặc dù PEP, cyclic AMP, 13 DPG, phosphocreatine, acetylphosphate và pyrophosphate đều có giá trị ΔG0’ lớn hơn, nhưng ATP là duy nhất định vị giữa các chất phosphate cao năng, (ATP được tổng hợp khi phân giải các chất hữu cơ) và các chất nhận năng lượng (khi các chất này được phosphoryl hoá để tham gia các phản ứng tiếp theo trong trao đổi chất). Nói một cách khác ATP là mắt xích nối liền hai qúa trình ngược nhau, là đồng hoá và dị hoá. Việc hình thành tất cả các hợp chất cao năng khác cũng xảy ra do sự tiêu phí năng lượng vốn tích luỹ trong ATP. ADP có thể nhận cả phosphate và năng lượng từ các phosphate cao năng. ATP cho cả gốc phosphate và năng lượng đối với các phân tử có năng lượng thấp. Như vậy ATP có vai trò dự trữ năng lượng cũng như tiêu hao năng lượng. Xét về cơ chế biến đổi và chuyển hoá năng lượng trong sự phân giải ATP và các hợp chất cao năng tương tự ATP ta thấy năng lượng cần thiết để thực hiện phản ứng hoá học được giải phóng ra ở một điểm, có thể được chuyển đến một điểm khác, ở đây năng lượng được sử dụng một cách trực tiếp. Điều này có nghĩa là trong cơ thể sống không nhất thiết phải tiếp xúc với nhau bằng cách va chạm (đặc trưng cho ngoài cơ thể sống) giữa các phân tử cho và nhận năng lượng. 16
1.5 Chuỗi ba gốc phosphat của ATP chứa 2 liên kết pyrophosphat, cả hai liên kết này giải phóng nhiều năng lượng khi thuỷ phân 17
Chương 2 Vitamin Vitamin là những chất hữu cơ có trọng lượng phân tử bé, có cấu tạo hoá học rất khác nhau và đều có hoạt tính sinh học nhằm đảm bảo cho các quá trình hoá sinh và sinh lý trong cơ thể tiến hành được bình thường, và do đó, có ảnh hưởng rất lớn đối với sự trao đổi chất. Vitamin không được tổng hợp ở động vật bậc cao, vì vậy chúng phải được tiếp nhận cùng với thức ăn. Nhiều vitamin là tiền chất của cofactor (vitamin nhóm B) tham gia vào các phản ứng enzyme, trong khi đó những vitamin khác tham gia vào quá trình nhìn và điều khiển sự sao chép (vitamin A), các phản ứng khử (vitamin C và E), tạo xương (vitamin D), đông máu (vitamin K) v.v Các vitamin thuộc các nhóm hoá học khác nhau. Thường chúng được phân loại dựa vào độ hoà tan: Nhóm vitamin hoà tan trong nước: B1, B2, B6, B12, folate, pantothenate, biotin, C. Chúng được tích luỹ chỉ với lượng ít. Lượng dư thừa được thải ra qua nước tiểu. Nhóm vitamin hoà tan trong chất béo: A, D, E, K. Chúng được tích luỹ. Lượng tiếp nhận dư thừa dẫn đến hiện tượng thừa vitamin (đặc biệt vitamin A và E). 2.1 Các vitamin hoà tan trong nước 2.1.1 Thiamin (vitamin B1) Thiamin được pyrophosphoryl hoá thành coenzyme thiaminpyrophosphate (TPP), ở đây phản ứng khử carboxyl hoá bằng cách oxihoá và phản ứng chuyển nhóm aldehyd hoạt hoá đóng một vai trò quan trọng. TPP là nhóm prostetic của pyruvat-dehydrogenase và pyruvat- decarboxylase, của 2-oxoglutarat-dehydrogenase và của transcetolase và vì vậy nó tham gia vào quá trình đường phân, chu trình citrate, pentose- phosphate và Calvin. a. Decarboxylase: xúc tác cho phản ứng loại nhóm carboxyl của các pyruvic acid, α-cetoglutaric acid. b. Transcetolase: xúc tác cho phản ứng vận chuyển glycoaldehyd (CH2OH-CO-). Ví dụ phản ứng chuyển đoạn 2C (C1 và C2) của xylulose 5-phosphate đến ribose 5-phosphate tạo thành sedoheptulose 7-phosphate và glyceraldehyd-3-phosphate. 1
Sinh tổng hợp Hai thành phần của thiamine là pyrimidine và thiazol được tổng hợp riêng và sau đó được kết hợp. Các con đường tổng hợp khác nhau ở sinh vật nhân chuẩn và sinh vật nhân sơ (nấm men, thực vật). Trong E.coli và S.thyphimurium có 1 (5’-phosphoribosyl-5- aminoimidazol (AIR) là tiền chất của gốc pyrimidine, trong khi ở nấm men chất này được tạo nên bằng cách khác. Trong E.coli pyruvat và D- glyceraldehyd là những tiền chất của thiazol. Chúng lắng kết thành 1- desoxy-D-xylulose, chất này được gắn các nguyên tử C 4’, 4, 5, 6, 7. Nguồn gốc của C2 và N3 là tyrosine, nguyên tử S bắt nguồn từ cysteine. Pyrophosphatester của thành phần pyrimidine tham gia vào phản ứng gắn. Bằng một phản ứng pyrophosphoryl hoá vitamin được chuyển thành coenzyme. B1B có nhiều trong cám gạo, gan, thận mầm ngũ cốc và nấm men là nguồn rất giàu vitamin này. Lượng tiếp nhận hằng ngày đối với người là 1-1,5 mg. Thiếu vitamin này ảnh hưởng đến quá trình trao đổi carbohydrate dẫn đến bệnh phù thủng, hay còn gọi là bệnh beri-beri, rối loạn thần kinh và ảnh hưởng đến chức năng của tim. B1 chỉ bền với nhiệt trong môi trường acid, còn trong môi trường kiềm nó bị phân huỷ nhanh chóng khi đun nóng. Khi oxy hoá B1 chuyển thành một hợp chất gọi là thiocrome phát huỳnh quang. Tính chất này được sử dụng để định lượng vitamin B1. Hàm lượng B1 trong nguyên liệu có thể thay đổi đáng kể tuỳ thuộc điều kiện bảo quản và chế biến. Ví dụ: gạo xát kỹ hàm lượng B1 có thể bị giảm đến 4 lần so với ban đầu. Độ ẩm khi bảo quản nguyên liệu (thóc, gạo) càng cao, hàm lượng vitamin B1 bị giảm càng mạnh. 2
2.1.2 Riboflavin (vitamin B2) Trước kia được gọi là lactoflavin vì lần đầu tiên được tách ra từ sữa. Bên cạnh nicotinamid-nucleotide NAD+ và NADP+ flavin-nucleotide: flavin-adenin-dinucleotide (FAD) và flavin-mononucleotide (FMN) là những nhóm vận chuyển hydro quan trọng. Chúng tham gia hơn 100 phản ứng oxy hoá khử. Ví dụ, quá trình khử carboxyl hoá bằng cách oxihoá pyruvic acid, oxy hoá acid béo, khử amin hoá bằng cách oxihoá amino acid Coenzyme này được tạo nên từ vitamin riboflavin bằng phosphoryl hoá (FMN) và tiếp theo adenyl hoá (FAD). 3
Sinh tổng hợp và biến đổi Vitamin riboflavin được tạo nên từ GTP và ribulose-5-P trong thực vật, nấm men và nhiều vi sinh vật, có ít hơn trong sản phẩm ngũ cốc. Phản ứng tổng hợp bắt đầu bằng việc mở vòng imidazol của GTP và tách ra một gốc pyrophosphate. Bằng phản ứng khử amin hoá, phản ứng khử và tách ra gốc phosphate còn lại làm xuất hiện 5-amino-6- ribitylamino-2,4-pyrimidindion. Phản ứng của hợp chất này với 3,4- dihydroxy-2-butanon-4-P (chất này xuất hiện từ ribulose-5-P) tạo nên phân tử có hai vòng 6,7 dimethyl-8-ribityllumazin. Hợp chất này kết hợp với 5-amino-6-ribitylamino-2,4-pyrimidindion thành riboflavin. Phosphoryl hoá vitamin này tạo nên flavinmononucleotide (FMN). Bằng phản ứng adenyl hoá tiếp theo làm xuất hiện flavin-adenin-dinucleotide (FAD). Sự phosphoryl hoá riboflavin ở động vật được điều khiển chính xác bằng hormone tuyến giáp trạng. 5
Thiếu vitamin B2 ảnh hưởng đến quá trình oxy hoá khử làm ảnh hưởng đến quá trình tạo năng lượng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cơ thể. Thiếu vitamin gây ra những rối loạn về sinh trưởng và các bệnh về da. Tuy nhiên những bệnh này tương đối hiếm. Nhu cầu vitamin B2 hàng ngày của người lớn khoảng 1,4 - 2 mg. Sản phẩm phân giải và sản phẩm thải ra ở người là riboflavin. Các bước phân giải khác (đặc biệt ở vi khuẩn) là hydroxyl hoá các gốc methyl và làm ngắn chuỗi ribityl. Chức năng hoá sinh Chức năng oxy hoá khử của FMN và FAD là do vòng isoalloxazin chịu trách nhiệm. Ở một phản ứng khử hoàn toàn hai điện tử và hai proton được tiếp nhận. Dạng oxy hoá hoàn toàn của riboflavin là những tinh thể vàng da cam, hấp thụ ở bước sóng 370 và 450 nm. Dạng khử của nó không màu và mất tính hấp thụ ở 450 nm. Các coenzyme flavin nucleotide dạng khử cũng có thể bị oxy hoá trở lại khi có các chất nhận điện tử như xanh methylen, 2,6-diclorophenolindophenol FADH2 + xanh methylen → FAD + xanh methylen (dạng oxy hoá màu xanh) (dạng khử không màu) Có thể sử dụng các tính chất trên để theo dõi các phản ứng do flavin dehydrogenase xúc tác. Tinh thể vitamin B2 ở dạng khô tương đối bền với nhiệt hơn vitamin B1B , tuy nhiên vitamin này không bền dưới tác dụng của ánh sáng. Ngược với vitamin B1, hàm lượng vitamin B2 trong gạo, thịt, trứng, sữa biến đổi không nhiều trong quá trình bảo quản và chế biến. 2.1.3 Pyridoxin (vitamin B6) Pyridoxin (pyridoxol), pyridoxal và pyridoxamine tạo nên nhóm vitamin B6. Cả 3 dạng này dễ dàng chuyển hoá lẫn nhau. Dẫn xuất của vitamin B6 là pyridoxalphosphate (PLP) là coenzyme của nhiều enzyme xúc tác. Pyridoxal- và pyridoxamin-phosphate là coenzyme quan trọng cùng tác động ở một số lớn các phản ứng biến đổi amino acid, ví dụ ở phản ứng transaminase, decarboxylasevà dehydratase. Vitamin B6 cũng là thành phần cấu tạo của phosphorylase xúc tác cho phản ứng phân giải glycogen. Ngoài ra vitamin B6 còn có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp NAD+, coenzyme A Do đó thiếu vitamin này ảnh hưởng 7
đến nhiều quá trình trao đổi proteine, saccharide, lipid, đặc biệt dẫn đến rối loạn về thần kinh và trao đổi amino acid. Sinh tổng hợp và biến đổi Một số vi khuẩn, nấm men và thực vật tạo nên pyridoxine. Động vật nhai lại cũng không cần có vitamin B6 trong thức ăn vì vi sinh vật trong ruột của chúng có thể tổng hợp vitamin này đủ cung cấp cho cơ thể động vật chủ. Một số vi khuẩn khác và động vật cần phải được cung cấp từ bên ngoài. Sản phẩm ngưng tụ của pyruvate và D-glyceraldehyd là 1-desoxy-D- xylulose cung cấp nguyên tử C 2’, 2, 3, 4 và 4’. Erythrose 4-P được biến đổi thành 4-hydroxy-L-threonine. Hợp chất này cung cấp nguyên tử C 5’, 5, 6 và N-1. Pyridoxine điều khiển tỷ lệ tổng hợp bằng ức chế ngược. Loại hydro của pyridoxine thành pyridoxal cho đến nay chỉ được quan sát thấy trong vi khuẩn. Ở động vật pyridoxine, pyridoxal và pyridoxamine sau khi hấp thụ được phosphoryl hoá. Kinase này bị ức chế bằng sản phẩm của nó. Bằng một phản ứng oxy hoá pyridoxinephosphate và pyridoxaminephosphate biến đổi thành pyridoxalphosphate. Phản ứng này cũng bị ức chế bằng sản phẩm của nó. Lượng bổ sung hàng ngày cần thiết ở người lớn khoảng 2 mg. Sự phân giải bắt đầu bằng phản ứng do phosphatase xúc tác. Sự phân giải tiếp theo của vitamin này thực hiện bằng một phản ứng oxy hoá để tạo thành carbonic acid-4-pyridoxat, chất không có hoạt tính sinh học. 2.1.4 Cobalamin (vitamin B12) Cobalamin là một trong những phân tử sinh học không trùng hợp lớn nhất. Nguyên tử coban ở trung tâm gắn liên hợp với 6 thành phần. Bốn thành phần trong đó là pyrrol của vòng corrin, một thành phần là 8
nucleotide bất thường dimethylbenzimidazol và thành phần thứ 6 có thể là gốc hydroxyl (vitamin B12), gốc methyl (methylcobalamin), hoặc gốc 5’- desoxyadenosyl (desoxyadenosylcobalamin, coenzyme B12). Dạng bán ở thị trường: thành phần thứ 6 là một gốc cyanid. Sinh tổng hợp coenzyme và phản ứng khử vitamin Coenzyme B12 được tổng hợp nhiều bước trong vi sinh vật. Bước thứ nhất giống nhau giữa hem và chlorophyll. Những phản ứng tiếp theo có nhiều biến đổi. 9
Sau nhiều bước methyl hoá vòng porphyrin biến thành vòng corrin. Sau nhiều lần methyl hoá tiếp theo và amid hoá Co++ được đưa vào và được khử thành Co+, rồi kết hợp với adenosine. Tiếp theo α-ribazol được gắn vào qua một cầu propionate-aminpropanol và tạo nên thành phần thứ 6 của Co. Co nằm trong phức hệ liên hợp là Co+++. Ở động vật có vú nhu cầu B12 (ở người < 10 μg/ngày) được đáp ứng do vi khuẩn ở ruột. Để hấp thu vitamin B12 từ ruột cần protein đặc hiệu (yếu tố nội tại, 50 kDa). Nếu thiếu loại protein này sẽ dẫn đến hiện tượng thiếu vitamin B12B trầm trọng (thiếu máu ác tính). Để vận chuyển trong máu B12 liên kết với nhiều plasmglobulin khác nhau, được gọi là transcobalamin. Phần lớn +++ B12B được tiếp nhận ở dạng oxy hoá (hydroxy-cobalamin, Co ). Sau hai bước phản ứng xuất hiện trở lại dạng desoxyadenosyl (coenzym B12). Vitamin B12 tham gia trong thành phần cấu tạo của các enzyme xúc tác cho các phản ứng: - Phản ứng chuyển ribonucleotide thành desoxyribonucleotide - Phản ứng chuyển nhóm methyl - Sắp xếp lại các nhóm thế của 2 carbon liền nhau trong phân tử. 2.1.5 Vitamin H (Biotin) Biotin là một vitamin cần thiết cho các phản ứng carboxyl hoá, được gắn kết đồng hoá trị với enzyme bằng nhóm ε-amin của gốc lysine. Sinh tổng hợp và biến đổi Quá trình tổng hợp xảy ra ở vi khuẩn (cả vi khuẩn ở ruột của động vật), nấm men và thực vật bậc cao. Phân tử ban đầu là pimeloyl-CoA. Nguồn gốc của phân tử này chưa được giải thích đầy đủ, nó xuất hiện có thể do sự ngưng tụ của 3 phân tử malonyl-CoA và giải phóng ra 2 phân tử CO2. Tiếp theo nó ngưng tụ với L-alanine tách ra pyridoxal-pp, CO2 và HS-CoA. 8-amino-7- oxopelargonat (7-KAP) xuất hiện được biến đổi thành 7,8- diaminopelargonate bằng một phản ứng do transaminase xúc tác. Ở phản ứng này S-adenosylmethionine là chất cho nhóm amin (thay vì chức năng thường xuyên là chất cho nhóm methyl). Với sự gắn CO2 vào (phụ thuộc vào ATP) vòng imidazol được đóng lại. Sau đó xảy ra sự gắn S (từ L- cysteine) và đóng vòng thiophan. Kết quả là tạo nên (+)-Biotin. Sự gắn kết biotin vào enzyme tương ứng cần hoạt hoá bởi ATP, được xúc tác bằng enzyme đặc hiệu biotin-ligase. Người lớn cần 100-200 μg/ngày. Biotin có trong nhiều thực phẩm và được tổng hợp bởi vi khuẩn đường ruột, vì vậy ít khi bị bệnh thiếu 10
vitamin này trừ khi ăn nhiều trứng sống có nhiều avidin kết hợp rất chặt với biotin, ngăn cách việc hấp thu nó qua ruột non. Phân giải bằng vi khuẩn Pseudomonas (có thể các loại vi khuẩn khác) có thể làm ngắn chuỗi bằng β-oxy hoá và nguyên tử C của vòng thiophan được tách ra. Gốc của vòng imidazol được thải ra ở nước tiểu. Động vật có vú chỉ có thể tách chuỗi bên và tạo nên hợp chất sulfoxid. Tuy nhiên thành phần chính của biotin được thải ra ở dạng không biến đổi. 2.1.6 Ascorbate (vitamin C) Vitamin C tham gia vào nhiều phản ứng biến đổi chất và thường có chức năng bảo vệ. Sinh tổng hợp và trao đổi chất Thực vật bậc cao, tảo, nấm men và phần lớn động vật có thể tổng hợp ascorbate. Một số động vật có vú (ví dụ người) cũng như côn trùng, phần lớn các loài cá không có khả năng này. Ở những động vật có vú cần cung cấp vitamin C, vì thiếu enzyme L-Gu-ionolacton-oxidase. 11
Sinh tổng hợp ở động vật và phần lớn thực vật từ D-glucose và đi qua UDP-glucose, UDP-glucuronate, D-glucuronate, L-gulonate, L- gulonolacton và 2-dehydro-L-gulonolacton. Do đó ta thấy vitamin C là sản phẩm oxy hoá của các đường. Nó được tổng hợp từ glucose (ở động vật và thực vật), từ galactose (ở một số thực vật). Phân tử vitamin C có chứa en- điol, dễ dàng bị loại hydro tạo thành dehydroascorbic acid (cũng có hoạt tính vitamin C). Vitamin C mất hoạt tính khi vòng lacton bị thuỷ phân. Trong tự nhiên, vitamin C có thể tồn tại ở dạng liên kết với các chất khác, gọi là ascorbigen là dạng dự trữ vitamin C quan trọng. Vitamin C hoà tan tốt trong nước, dung dịch có vị acid, có tính hoạt quang và có tính khử mạnh. Ascorbic acid có khả năng khử dung dịch Fehling, AgNO3. Có thể sử dụng tính chất này để định lượng ascorbic acid. Ngoài ra, cũng có thể sử dụng vitamin này làm chất chống oxy hoá trong công nghiệp thực phẩm. Ascorbate đi vào cùng thức ăn được vận chuyển đến các cơ quan khác nhau. Ở một số cơ quan sự tiếp nhận là một quá trình chủ động, được kích thích bởi insulin. Nồng độ ascorbate cao nhất tìm thấy ở nang trên thận, não thuỳ, mắt, gan, dạ dày và não. Bệnh hoại huyết ở người được ngăn ngừa khi tiếp nhận 10mg ascorbate /ngày. Stress, người hút thuốc và người có thai cần nhiều ascorbate hơn. Người ta khẳng định rằng, một liều lượng cao ascorbate tăng cường hệ thống miễn dịch, giảm sự mệt mỏi và nguy cơ bệnh ung thư. Tuy nhiên sự phân giải ascorbate xảy ra mạnh mẽ, vì vậy khi lượng cần hàng ngày là 50 mg thì cần đưa vào cơ thể là 1 500 mg. Vitamin C có nhiều trong rau quả tươi, đặc biệt là các loại: cam, chanh, dưa chuột Vitamin C tham gia trong nhiều quá trình quan trọng của cơ thể sống như: - Quá trình hydroxyl hoá do oxygenase. Ví dụ hydroxyl hoá proline, lysine trong phân tử collagen. Thiếu vitamin C, collagen mới được tạo thành không được hydroxyl hoá, không tạo được dạng xoắn ba nên có độ bền kém, do đó da bị tổn thương và thành mạch máu mỏng manh dễ bị vỡ, gây ra bệnh hoại huyết. Vitamin C tham gia trong quá trình chuyển hoá protocollagen thành collagen nên có tác dụng làm cho vết thương chóng thành sẹo - Vận chuyển hydro trong quá trình oxy hoá - khử ở thực vật - Làm tăng tính đề kháng của cơ thể đối với những điều kiện không thuận lợi của môi trường ngoài, các độc tố nhiễm trùng. Ngoài ra vitamin C còn tham gia trong nhiều quá trình tổng hợp, chuyển hoá các chất khác nhau. 12
- Duy trì cân bằng giữa các ion Fe2+ /Fe3+ , Cu+ /Cu 2+ Phân giải và sự loại thải Ở loài linh trưởng (primat) một phần ascorbate tồn tại trong cơ thể được thải ra ngoài ở dạng không biến đổi qua nước tiểu. Những sản phẩm loại thải khác là oxalate và dioxogulonate (xuất hiện từ dehydroascorbate bằng một phản ứng không thuận nghịch và không xúc tác). Ascorbate có thể được oxy hoá hoàn toàn thành CO2. 2.2 Các vitamin hoà tan trong chất béo 2.2.1 Retinol (vitamin A) Vitamin A là tên thường gọi cho rượu retinol, aldehyd retinal và retinic acid, chúng là những isoprenoide có đặc tính lipid. Chúng tồn tại ở các dạng đồng phân cis và trans khác nhau. Sinh tổng hợp và biến đổi Tiền chất để tổng hợp vitamin là provitamin β-carotene, sự tổng hợp chúng xảy ra trong thực vật. Động vật có thể tách carotene thành retinal, bằng một phản ứng dioxygenase (xảy ra ở trong ruột) và sử dụng nó như là vitamin. Vitamin A được hấp thụ vào cùng với chất béo và được tích luỹ ở dạng retinylpalmitat trong gan sau khi khử và ester hoá. Để vận chuyển đến những cơ quan khác nhau ester được thuỷ phân và retinol được đưa vào máu, ở đó nó được tiếp nhận bằng một protein kết hợp đặc hiệu với retinol. Sự biến đổi giữa retinol, retinal và retinic acid được thực hiện bằng những phản ứng phụ thuộc NADP+. Carotene được đưa vào cùng với thức ăn của người có nguồn gốc trước hết là từ thực vật, trong khi retinol có nguồn gốc động vật (dầu gan cá thu). Nhu cầu hàng ngày đối với người lớn là khoảng 1 mg retinol hoặc 6 mg β-carotene. Thiếu vitamin rất phổ biến ở nhóm dân số suy dinh dưỡng, dẫn đến chứng quáng gà, ức chế sự phát triển của xương và sự phân hoá mô biểu bì, hạn chế sự phát triển và chức năng sinh sản. Chức năng hoá sinh Retinic acid là một chất điều hoà sao chép. Sau khi đi qua màng tế bào phân tử này kết hợp với chất nhận đặc hiệu: all-trans-retinic acid với RAR-receptor, 9-cis retinic acid với RXR-receptor. Sau đó phức hệ retinic acid -RAR-RXR kết hợp với yếu tố hormone được tạo ra từ DNA ở trong nhân. Thuộc những gen được điều khiển theo cách này là gen mã hoá cho protein kết hợp với retinol, enzyme PEP-carboxylase và apolipoprotein 13
A1. Retinic acid cũng tham gia vào sự điều khiển sự phát sinh phôi và phát sinh hình thái (ở liều lượng nhỏ vitamin A trong thời gian có thai là nguyên nhân gây quái thai), phát triển, phân hoá và khả năng sinh sản. Sự biến đổi từ 11-cis thành all-cis-retinal nhờ ánh sáng là cơ sở cho quá trình nhìn ở động vật. Trong vitamin nhóm A có 2 dạng quan trọng là vitamin A1 và A2. Vitamin A2 khác với A1 ở chỗ trong vòng có thêm một nối đôi giữa C3 và C4. Dưới tác dụng của enzyme retinoldehydrogenase nhóm alcol của vitamin A dễ dàng bị oxy hoá đến aldehyd (all-cis-retinal, vẫn có hoạt tính vitamin A). Liên kết đôi giữa C11 và C12 của retinal có thể chuyển thành dạng cis (11-cis-retinal), 11-cis-retinal kết hợp với protein opxin tạo nên sắc tố của mắt là rodopxin. Đây là protein nhận ánh sáng (photoreceptor protein) có trong tế bào hình que của màng lưới mắt người và động vật có vú. Tế bào này hoạt động trong ánh sáng yếu, thích nghi với bóng tối. Khi có ánh sáng, nhóm thêm của rodopxin chuyển từ dạng cis sang dạng trans nên mất khả năng kết hợp với opxin. Ngược lại trong tối sẽ tái tạo lại dạng 11-cis-retinal và rodopxin được tổng hợp trở lại, làm tăng độ nhạy cảm của mắt trong ánh sáng yếu. Halobacterium sử dụng sự biến đổi từ all-trans thành 13-cis-retinal nhờ ánh sáng làm động lực cho những bơm proton của chúng. Retinylphosphate tham gia vào quá trình sinh tổng hợp các glycosaminoglycane ở trong các tế bào biểu bì, ở đây nó có chức năng tương tự như dolicholphosphate. Bằng cách này nó tham gia gián tiếp vào sự toàn ven của màng tế bào và ty thể, ổn định biểu bì của da và của màng nhầy và giảm những rối loạn về phát triển. 14
2.2.2 Calciferol (vitamin D) Ở động vật bậc cao những sản phẩm hydroxyl của vitamin D đóng một vai trò trung tâm trong trao đổi calcium. Thực tế khái niệm “vitamin D” là gồm một nhóm các chất họ hàng, khác nhau về nguồn gốc. Nếu nói chặt chẽ thì chúng không phải là vitamin, vì da có thể tổng hợp một trong chúng (D3) từ một steroid (7- Dehydrocholesterin, provitamin D) khi có ánh sáng tử ngoại. 15
Sinh tổng hợp và sự biến đổi Các vitamin D khác nhau được tạo nên từ Δ5,7-steroid (sản phẩm trung gian để tổng hợp zoo-, phyto- và mycosteroid) bằng việc mở vòng B nhờ ánh sáng. Chúng chỉ khác nhau ở các mạch bên. Hai vitamin D đầu tiên sau đây là quan trọng nhất: - Vitamin D2 (ergocalciferol): tạo nên từ ergosterin, chất này tồn tại ở trong thực vật và nấm. - Vitamin D3 (cholecalciferol): tạo nên từ 7-dehydrocholesterin, chất này có trong động vật bậc cao. - Vitamin D4: xuất hiện từ 22-dihydroergosterin, có trong thực vật và nấm - Vitamin D5: tạo nên từ 7-dehydrositosterin, có trong thực vật. Tổng hợp nội sinh Trong phản ứng đầu tiên khi chiếu ánh sáng tử ngoại dẫn đến sự đồng phân hoá đồng thời với việc mở vòng B của cấu trúc sterin, làm xuất hiện provitamin D. Độ dài bước sóng thích hợp nhất cho quang phản ứng là 295 nm. Chiếu sáng với bước sóng lớn hơn sẽ tạo lumisterin, với bước sóng ngắn hơn tạo tachysterin. Ở ánh sáng mạnh hơn xuất hiện suprasterin I và II. Vitamin D được tạo nên do một sự đồng phân hoá phụ thuộc vào nhiệt độ. Vitamin D đi vào máu và gắn với protein đặc hiệu (DBP: vitamin D-bindende-protein). Đưa vào cùng với thức ăn: Mặc dù sự chiếu sáng có thể cung cấp đầy đủ lượng vitamin D, việc bổ sung thêm vẫn là điều cần thiết (ở người lớn 5 μg/ngày, trẻ em 10 μg/ngày). Sau khi hấp thụ (được hỗ trợ bởi acid mật) vitamin D được gắn với chylomikronen hoặc DBP và được vận chuyển đến gan. Ở trong gan xảy ra sự hydroxyl hoá ở C25 bằng một enzyme phụ thuộc vào cytochrome P-450. Chất này được chuyển đến thận, ở đây xuất hiện hợp chất có hoạt tính sinh học 1α 25-Dihydroxycalciferin (calcitriol. DHCC) do sự hydroxyl hoá tiếp theo ở C1. Một bước hydroxyl hoá luân phiên tạo nên 24 (R).25dihydroxycalciferin. Những phản ứng hydroxyl hoá có thể thấy ở giá noãn (nhau thai), đại thực bào 16
Sự phân giải thực hiện bằng sự hydroxyl hoá và/hoặc oxy hoá của nhóm hydroxyl thành nhóm carboxyl. Những hợp chất này phân cực mạnh hơn, thể hiện hoạt tính sinh học thấp, nó được thải ra qua phân hoặc nước tiểu. Chức năng sinh hoá Ở động vật có vú vitamin D (thực tế là 1α 25-Dihydroxycalciferol) điều khiển sự trao đổi calcium và phosphate. Nó hoạt hoá trực tiếp sự hấp thu (tái hấp thụ) Ca++ và phosphate ở ruột và thận và cùng tham gia cấu tạo với PTH và calcitonin ở trong xương. Mặt khác nó giải phóng Ca++ từ xương cho sự điều chỉnh tạm thời mức Ca++ trong máu. Hiệu quả sao chép được tạo điều kiện bởi vitamin D-receptor. Ở đây vitamin có vai trò như một hormon. Ở trong ruột, dạ dày và xương nó kích thích sự sao chép của các gen mã hoá cho các protein gắn với calcium (CaBP, calbindin, osteocalcin ). Những protein này tham gia vào sự tiếp nhận calcium và khoáng hoá xương. Lĩnh vực y học: Những bệnh gắn liền với mức vitamin D không bình thường: Còi xương: (Khoáng hoá xương thấp, phần lớn ở trẻ em) sinh ra do sự hấp thụ Ca++ giảm khi thiếu vitamin D, thỉnh thoảng cũng do tổng hợp không đủ calcitriol từ calciferol. 17
Bệnh loãng xương: xuất hiện khi tổng hợp calcitriol bị rối loạn, do thận không hoạt động hoặc mức ostrogen thấp vì nó kích thích bước hydroxyl hoá. 2.2.3 Tocopherol (vitamin E) Tocopherol (tocos = con cháu, pherol = sinh ra) khá phổ biến ở cây xanh, rau xà lách, hạt ngũ cốc, dầu thực vật, gan bò, lòng đỏ trứng. Nhóm tocopherol gồm 8 hợp chất, bao gồm vòng 8 - chromanol và một chuỗi bên isoprenoide Sản phẩm cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp là α-tocopherol (5,7,8-trimethyltocopherol), thể hiện hoạt tính sinh học cao nhất. Ở thực vật và động vật tocopherol bảo vệ lipid trước sự thiệt hại do oxy hoá. Các tocopherol phân biệt với nhau bằng số lượng và vị trí của nhóm methyl ở vòng và các liên kết đôi trong chuỗi bên. Tất cả chúng đều ưa lipid. Tocopherol được tổng hợp ở dạng đồng nhất chỉ ở thực vật, trước hết trong lục lạp của lá. Nó có ở động vật và thực vật trước hết ở màng tế bào (ví dụ màng ty thể, hồng huyết cầu, và lạp thể). Lượng bổ sung hằng ngày đối với người lớn là 8-12 mg. Cần lượng lớn hơn khi thực phẩm có chứa nhiều acid béo chưa no. Hiếm khi thấy thiếu vitamin này, ngoại trừ ở trường hợp đẻ non và rối loạn ở hấp thu lipid. Tuy nhiên trong chăn nuôi ở chế độ dinh dưỡng không đầy đủ gây ra sự thoái hoá các cơ quan và vô sinh. Chức năng hoá sinh của tocopherol trước hết là bảo vệ lipid ở màng trước phản ứng peroxid-hoá (đặc biệt acid béo có nhiều liên kết chưa no). Nó làm giảm tác hại do LDL bị oxy hoá, dẫn đến bệnh sưng khớp xương. Tocopherol là nội ether của các hydroquinon. Chúng tác dụng là những chất nhận gốc, ở đây chúng chuyển sang trạng thái tocopheroxy (semiquinon). Đây chỉ là một gốc phản ứng yếu với thời gian bán huỷ là nhiều giờ, nó làm gãy các phản ứng chuỗi. Phản ứng tạo nên là thuận nghịch, rất có thể ascorbate thực hiện sự khử trở lại thành tocopherol. Ở đây nó bị oxy hoá bề mặt giữa lipid và nước thành monodehydroascorbate. Giữa hai vitamin này có sự đồng tác dụng. β-carotene cũng được coi là chất khử cho tocopherol. Ngược lại semiquinon được oxy hoá tiếp tục thành quinon, chất này dẫn đến một sự mở vòng thuận nghịch. 18
2.2.4 Phylloquinon và menoquinon (vitamin K) Phylloquinon là một thành phần của hệ thống quang hoá của thực vật quang hợp. Menoquinon đóng một vai trò trong hô hấp yếm khí của vi khuẩn. Ở động vật hai hợp chất (vitamin K1 cũng như vitamin K2) là cofactor ở sự γ cacboxyl hoá của glutamat. Đó là monomethyl- naphtochinon với một chuỗi bên isoprenoid. Phyllochinon và menachinon phân biệt nhau chỉ số lượng liên kết đôi và chiều dài của chuỗi bên. Lượng tiếp nhận hằng ngày cần thiết ở người lớn 70-140 μg. Lượng này được đáp ứng bằng thức ăn và sản phẩm của vi khuẩn đường ruột. Trước khi được thải phần lớn chỉ các chuỗi bên được làm ngắn bằng oxy hoá. Chức năng hoá sinh Ở động vật chúng là cofactor tạo nên γ-cacboxylglutamate trong protein xảy ra ở endoplamatische reticulum thô nhờ enzyme carboxylase. Protein tạo nên được phân giải. Quá trình biến đổi sau đó là cần thiết cho khả năng kết hợp Ca++ và cho sự cố định protein bằng các cầu Ca++ ở màng phospholipid (ví dụ ở quá trình đông máu). Ở quá trình biến đổi protein này vitamin-K-hydroquinon tách ra một proton của glutamate, tiếp theo nó được carboxyl hoá. Đồng thời xuất hiện một vitamin K-quinon-2,3-epoxid (những chi tiết vẫn còn chưa biết). Epoxid được khử bằng quinon-epoxid-reductase gắn với dithiol thành quinon và sau đó thành hydroquinon. Dẫn xuất của cumarine có thể kìm hãm bước reductase, ví dụ dicumarol và warfarin có tác dụng là chất kháng đông. 19
CHƯƠNG 3 ENZYME VÀ SỰ XÚC TÁC SINH HỌC Để sống và phát triển, cơ thể sinh vật phải thường xuyên trao đổi chất và trao đổi năng lượng với môi trường bên ngoài. Các quá trình này tiến hành được là nhờ các phản ứng hóa sinh xẩy ra trong cơ thể theo quy luật có tổ chức và có liên quan chặt chẽ với nhau. Đặc điểm chung của các phản ứng này là có thể xảy ra một cách đặc hiệu, dễ dàng với vận tốc lớn ở ngay trong điều kiện môi trường sinh lý và nhiệt độ của cơ thể. Sở dĩ các phản ứng tiến hành trong cơ thể có những đặc điểm trên chính là nhờ các chất xúc tác đặc biệt có khả năng làm tăng vận tốc phản ứng lên gấp bội, đó là các chất xúc tác sinh học. Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa sinh xảy ra trong cơ thể sinh vật. Enzyme tồn tại trong tất cả các tế bào sống của động vật, thực vật, vi sinh vật. Các phản ứng do enzyme xúc tác có thể xảy ra ở ngay trong cơ thể sống hoặc ở ngoài cơ thể. Hiện nay đã tách được rất nhiều enzyme khác nhau từ nguồn động vật, thực vật, đặc biệt là từ vi sinh vật, trong đó có nhiều loại đã được thu nhận với độ thuần khiết cao. Xúc tác enzyme có nhiều ưu điểm hơn hẳn xúc tác thông thường như cường lực xúc tác lớn, tính đặc hiệu cao, không độc, có thể tác dụng trong điều kiện nhẹ nhàng, đơn giản. Hơn nữa có thể sản xuất enzyme từ các nguyên liệu giá rẻ nhưng đem lại hiệu quả kinh tế cao, nhờ vậy việc ứng dụng enzyme rộng rãi trong các ngành công nghiệp nhẹ, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y học và nghiên cứu khoa học đã nhanh chóng có những bước tiến dài và ngày càng có nhiều triển vọng tốt đẹp. I – KHÁI NIỆM VỀ SỰ XÚC TÁC NÓI CHUNG Tốc độ phản ứng hóa học được xác định bởi giá trị năng lượng hoạt hóa tức là năng lượng các chất tham gia phản ứng phải đạt được trên mức năng lượng bình thường của chúng để cắt đứt các liên kết cần thiết và hình thành các liên kết mới. Năng lượng hoạt hóa các phản ứng nào đó càng lớn thì tốc độ phản ứng càng chậm và ngược lại. Việc đưa một số chất nào đó vào trong hệ thống vốn có tác dụng làm tăng tốc độ phản ứng hóa học được gọi là sự xúc tác. Trong quá trình xúc tác, các chất xúc tác đã làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng hóa học. Năng lượng cần để xảy ra sự va chạm có hiệu lực dẫn đến phản ứng hóa học được gọi là năng lượng hoạt hóa. 37
Trong quá trình xúc tác, các chất xúc tác chỉ tham gia vào các phản ứng trung gian sau đó chúng lại được phục hồi nhanh chóng, chất xúc tác không đóng vai trò như những chất tham gia phản ứng. Tốc độ các phản ứng thuận nghịch cũng được các chất xúc tác làm tăng theo cả hai chiều. Điều đó nói lên rằng: chất xúc tác không quyết định chiều đi của phản ứng, chúng chỉ thúc đẩy cho phản ứng đạt đến cân bằng một cách nhanh chóng. Ảnh hưởng của chất xúc tác là làm giảm năng lượng hoạt hóa. Trong đồ thị sau: A là chất phản ứng, B là sản phẩm của phản ứng. Phản ứng không được xúc tác Năng lượng Năng lượng hoạt hóa Phản ứng được hoạt hóa có do enzyme xúc tác enzyme xúc tác ự A ng t ượ B ng l ă N 6G1 6G2 Æ Æ Chiều phản ứng II – ENZYME LÀ CHẤT XÚC TÁC SINH HỌC Những luận cứ sau đây đã chứng minh bản chất xúc tác của enzyme: a) Cũng như các chất xúc tác nói chung, enzyme làm tăng nhanh tốc độ phản ứng. Enzyme không quyết định chiều hướng của phản ứng. b) Enzyme không đóng vai trò là chất tham gia phản ứng trong phương trình phản ứng. Trong quá trình xúc tác, lượng enzyme không thay đổi. c) Cũng như mọi chất xúc tác khác, enzyme làm giảm năng lượng hoạt hóa cần thiết của các phản ứng hóa học. Nói cách khác năng lượng hoạt hóa phản ứng được giảm đi nhiều khi có sự xúc tác của enzyme. 38
III - BẢN CHẤT HÓA HỌC CỦA ENZYME 3.1. Enzyme là những chất xúc tác có bản chất protein. Trong sự phát triển của hóa sinh học, bước nhảy vọt đã đạt được khi người ta thực hiện thành công việc tách rút các chất xúc tác sinh học ra khỏi tế bào và nghiên cứu tính chất của chúng, lúc đó người ta nhận biết rằng enzyme có bản chất protein. Năm 1926, Sumner là người đầu tiên thu được urease ở dạng kết tinh. Cho đến nay đã có khoảng hơn 150 enzyme được rút ra ở dạng tinh khiết. Trong số các enzyme đó, một số đã được biết trọn vẹn về cấu trúc bậc I như ribonuclease, trypsin, chymotrypsin, Ngày nay người ta xác nhận rằng, các enzyme chính là nhóm protein quan trọng. Chúng được hình thành trong tế bào như các protein đơn giản (enzyme một thành phần) hoặc như các protein phức tạp (enzyme hai thành phần). Trong số các enzyme thì đa số là enzyme hai thành phần. Dạng hoạt động của enzyme hai thành phần bao gồm phần protein và phần không có bản chất protein gọi là nhóm prostetic (nhóm ngoại, nhóm ghép, ) Enzyme một thành phần là các protein đơn giản thực hiện chức năng xúc tác. Ví dụ: Ribonuclease A và một số enzyme thủy phân protein và một số enzyme khác. 3.2. Các nhóm ghép, các coenzyme Bên cạnh phần protein thì enzyme hai thành phần còn chứa phần không có bản chất protein. Người ta gọi phần không phải protein cần thiết bắt buộc đối với hoạt động của enzyme là nhóm ghép (nhóm ngoại, nhóm thêm, yếu tố phụ, ) và phần protein vốn liên kết với nhóm đó là apoenzyme, phức hợp của hai thành phần trên là holoenzyme (enzyme hai thành phần). Trong trường hợp nhóm ghép là những chất hữu cơ có trọng lượng phân tử bé được liên kết với phần protein thì nhóm ghép được gọi là coenzyme. Theo cách đó thì: Apoenzyme + Coenzyme Holoenzyme Nếu đứng riêng rẽ thì cả coenzyme cũng như apoenzyme đều không có khả năng xúc tác. Chỉ có lúc nào 2 phần này kết hợp với nhau thì hoạt tính xúc tác của enzyme mới thể hiện. Bản chất hóa học của coenzyme rất khác nhau: - Một số loại này chính là các vitamin. Sự liên quan về chức năng giữa các vitamin và các coenzyme được giới thiệu ở bảng sau: 39
Coenzyme Chức năng Vitamin tương ứng NAD, NADP - Chuyển H+ và e- PP + - FAD. FMN - Chuyển H và e B2B Coenzyme A - Vận chuyển gốc acyl Pantotenic - Phân giải háo khí và tổng hợp acid(B3) acid béo Thiaminpyro(P) - Khử carboxyl hóa Thiamine(B1) - Chuyển nhóm aldehyd Pyridoxal(P) - Chuyển amine hóa Pyridoxine(B6) - Khử carboxyl hóa - Các ion kim loại có vai trò cần thiết bắt buộc cho sự hoạt động của enzyme. Các ion (cation) có chức năng giống với các coenzyme. Người ta gọi các ion kim loại đó là các coenzyme đơn giản. Các enzyme cần ion kim loại cho việc thực hiện chức năng của mình được gọi là metalloenzyme. Chức năng của các ion kim loại nói chung phần nhiều là chúng tạo ra các phức hợp kiểu chelate giữa một nhóm nhất định nào đó của cơ chất và enzyme. Trước tiên các cation tạo phức “ion kim loại – cơ chất”, sau đó phức hợp này mới phản ứng với enzyme. Các ion Ca, Cu, Mg, Mn, Mo, Zn, đều là những ion tham gia trong sự hoạt động của các enzyme. 3.3. Tính đặc hiệu của enzyme Khả năng xúc tác với tính đặc hiệu cao là một trong những đặc tính cơ bản và quan trọng nhất của enzyme. Tính đặc hiệu của enzyme thể hiện ở chỗ: enzyme chỉ xúc tác cho một trong vô số những chuyển hóa có thể có được đối với các chất. Có hai loại đặc hiệu cơ bản đó là đặc hiệu phản ứng và đặc hiệu cơ chất. * Tính đặc hiệu phản ứng: được thể hiện ở chỗ enzyme chỉ có khả năng lựa chọn một dạng phản ứng trong số các phản ứng và xúc tác cho phản ứng đó. Điều đó thấy rõ trong ví dụ sau đây: 40
R1 – C – COOH + NH3 H2O oxidase O Cetoacid(1) 2H R1 – CH – COOH decarboxylase R1 – CH2 + CO2 NH2 NH2 Amine Aminoacid(1) Transaminase R2 – CH – COOH NH2 Aminoacid(2) R2 – C – COOH R1 – C – COOH O O Cetoacid(2) Cetoacid(1) Dưới tác dụng của oxidase, aminoacid bị khử amine hóa bằng cách oxy hóa để tạo ra cetoacid và NH3. Với sự có mặt của oxidase, một phản ứng khác khử carboxyl hóa lại không thể xảy ra. Việc xúc tác này đòi hỏi phải có enzyme khác, đó là decarboxylase. Cũng như vậy, phản ứng chuyển amine hóa đòi hỏi phải có transaminase. * Tính đặc hiệu cơ chất: Enzyme có thể lựa chọn đối với các chất tham gia phản ứng. Không phải mọi cơ chất có khả năng phản ứng đều được enzyme “tiếp nhận” như nhau. Mỗi enzyme chỉ chuyên xúc tác cho một hoặc một vài cơ chất nhất định và mức độ đặc hiệu của nó tùy thuộc vào từng loại enzyme. Có 3 mức độ đặc hiệu cơ chất chủ yếu: a) Đặc hiệu tương đối: Enzyme chỉ có thể tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định mà không phụ thuộc vào các nhóm hóa học nằm ở hai bên liên kết. Ví dụ các esterase có thể tác dụng lên hàng loạt các ester của phosphoric acid. 41
b) Đặc hiệu nhóm: biểu hiện là enzyme chỉ có thể tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định và một trong hai nhóm nằm ở hai bên liên kết cũng phải có cấu tạo nhất định. Ví dụ carboxylpeptidase có khả năng phân hủy liên kết peptide gần nhóm –COOH tự do, nghĩa là liên kết peptide ở cuối mạch polypeptide, CH – CONH – CH – COOH CH – COOH + H2N – CH – COOH R1 R2 R1 R2 c) Đặc hiệu tuyệt đối: Enzyme chỉ tác dụng lên một kiểu liên kết nhất định và các nhóm hóa học ở hai bên liên kết cũng phải xác định. Ví dụ: Enzyme trypsine thủy phân các liên kết peptide giữa lysine hoặc arginine với bất cứ aminoacid nào. Sản phẩm là những đoạn peptide có lysine hoặc arginine chứa nhóm COOH tự do ở phía tận cùng của peptide. O O C – NH – CH – C Lysine hay R Arginine Vị trí thủy phân của trypsine - Enzyme Trombine còn có tính đặc hiệu cao hơn trypsine: nó chỉ thủy phân liên kết peptide ở phía carboxyl của gốc arginine nào có gốc glycine đứng liền kề sau nó: O O C – NH – CH – C Arginine Glycine Vị trí thủy phân của trombine * Ngoài các tính đặc hiệu trên nhiều enzyme còn biểu hiện rất cao về tính đặc hiệu hóa học lập thể (Đặc hiệu quang học): Enzyme chỉ tác dụng lên những dạng đồng phân lập thể nào đó của các chất hữu cơ. Ví dụ: Enzyme L-lactatdehydrogenase chỉ tác dụng lên L-lactic acid mà không tác dụng lên D-Lactic acid. Muốn tác dụng lên D-Lactic acid phải có enzyme D-lactatdehydrogenase. 42
IV – CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI HOẠT TÍNH XÚC TÁC CỦA ENZYME 4.1. Nhiệt độ Trong phạm vi lý học, tốc độ của phản ứng tăng lên cùng với sự tăng của nhiệt độ. Nhưng khi vượt quá phạm vi nào đó, các phản ứng được enzyme xúc tác bị ảnh hưởng do sự biến tính của phân tử protein-enzyme. Kết quả này phụ thuộc vào nhiệt độ tối thích của enzyme, là nhiệt độ mà tại đó tốc độ phản ứng enzyme đạt cực đại. Mỗi enzyme có nhiệt độ tối thích khác nhau. Sự khác nhau này tùy thuộc vào nguồn gốc của các enzyme, tùy theo từng điều kiện hoặc từng sự khác nhau về tính nhạy cảm với nhiệt độ của phân tử protein-enzyme. Đa số enzyme mất hoạt tính xúc tác ở nhiệt độ cao(>80oC), trừ papain, myokinase có thể tồn tại ở 100oC. Hoạt tính Nhiệt độ tối thích 20 30 40 50 60 70 80 toC 4.2. Ảnh hưởng của pH Mỗi enzyme đều có trị số pH tối thích nào đó đối với hoạt tính của chúng. Ở ngoài phạm vi của trị số này hoạt tính của enzyme đều bị giảm thấp. Trị số pH tối thích của một số enzyme như sau: Enzyme pH tối thích Pepsine 1,5 – 2,5 Amylase(mạch nha) 4,6 – 5,0 Amylase(nước bọt) 6,8 – 7,2 Trypsine 7,8 – 9,5 Arginase 9,8 Catalase 6,8 – 7,0 Peroxidase 6,0 43
Những nguyên nhân sau đây có thể dẫn tới sự phụ thuộc vào pH của enzyme: a) Nếu trong số các nhóm bên tham gia trực tiếp trong sự hoạt động của enzyme chứa nhóm có khả năng phân ly. b) pH đã ảnh hưởng tới các nhóm phân ly khác của protein-enzyme vốn có tác dụng trong việc duy trì cấu hình có hoạt tính của enzyme. c) Sự thay đổi pH của môi trường có thể ảnh hưởng tới các nhóm phân ly của cơ chất hay của coenzyme vốn được kết hợp với enzyme. 4.3. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất kìm hãm enzyme Những chất nào có khả năng làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme thì được gọi là chất hoạt hóa enzyme. Các chất đó thường là các ion kim loại như: K+, Na+, Mg+2, Ca+2, Co+2, Zn+2, Mn+2, Ví dụ: Mg+2 làm tăng hoạt tính phosphatase Ca+2 làm tăng hoạt tính lypase. Sự hoạt động của các enzyme đều có thể bị kìm hãm bởi các tác động gây biến tính protein. Người ta phân biệt các hình thức kìm hãm enzyme và phân biệt các chất kìm hãm enzyme như sau: a) Chất kìm hãm chung: các chất này kìm hãm hoạt tính xúc tác của tất cả các enzyme. Các chất này là các muối kim loại nặng;chất tannin. b) Chất kìm hãm riêng: có tác dụng kìm hãm một hay một nhóm enzyme có cấu tạo gần giống nhau. Ví dụ: các chất chứa nhóm – CN kìm hãm enzyme hô hấp. 4.4. Nồng độ cơ chất và nồng độ enzyme Khi môi trường có đầy đủ cơ chất thì tốc độ phản ứng tỷ lệ thuận với lượng enzyme. Khi nồng độ cơ chất thấp, không đủ để lôi kéo tất cả lượng enzyme vào phản ứng thì tốc độ phản ứng tăng tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất.Tốc độ phản ứng đạt tối đa khi tất cả enzyme đều kết hợp vào cơ chất. V – CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENZYME Khi đặt vấn đề nghiên cứu về cơ chế xúc tác của enzyme người ta xuất phát từ giả thiết cho rằng trong các phản ứng được enzyme xúc tác, phức tạm thời “Enzyme – Cơ chất” được tạo thành. Quá trình này gồm 3 giai đoạn: E + S ES ES* E + P 1 2 3 44
Ở giai đoạn 1 phản ứng xảy ra tương đối nhanh cơ chất (S) được liên kết với enzyme (E) nhờ các liên kết yếu. Lúc này sự liên kết không gian giữa các phân tử cơ chất và enzyme chưa đủ hiệu quả đối với sự xúc tác của enzyme. Ở giai đoạn tiếp theo xảy ra sự biến đổi của cơ chất (S) có liên quan tới việc phá vỡ hay hình thành các liên kết cộng hóa trị. Ở giai đoạn này, cơ chất được hoạt hóa (một hoặc vài phức chất ES chuyển tiếp được hoạt hóa). Ở đây, cấu trúc bậc 3 của enzyme luôn biến đổi tạo khả năng tiếp xúc giữa các nhóm hoạt động của enzyme với cơ chất đang biến đổi. Enzyme đã làm biến đổi phần tử cơ chất làm cho các liên kết bên trong phân tử trở nên “lỏng lẻo” hơn, do đó chỉ cần một lượng năng lượng nhỏ cũng đủ làm cho cơ chất biến thành các sản phẩm (P) khác nhau. Người ta đã chứng minh rằng trong khi hình thành phức chất ES có 2 quá trình đồng thời xảy ra nhanh chóng đó là: a) Sự thay đổi mật độ điện tử gây nên sự phân cực hóa các liên kết. b) Sự biến dạng về mặt hóa học của các liên kết “kéo căng” trong phân tử cơ chất. Cả hai yếu tố này (sự biến hình và sự phân cực hóa các liên kết đồng hóa trị) đều làm tăng thế năng nhiệt động học của các liên kết này, nghĩa là xúc tiến việc vượt qua “hàng rào” năng lượng hoạt hóa của quá trình chuyển tiếp phức “Enzyme-Cơ chất”. VI - ĐỘNG HỌC CỦA PHẢN ỨNG ENZYME 6.1. Động học của phản ứng enzyme trong trường hợp không có chất kìm hãm. 6.1.1. Ở giai đoạn: E + S Æ ES K +1 E + S ES K-1 K+1: hằng số vận tốc của phản ứng thuận. K-1: hằng số vận tốc của phản ứng nghịch. Gọi V1 là tốc độ phản ứng thuận. V-1 là tốc độ phản ứng nghịch. [E]: nồng độ enzyme. [S]: nồng độ cơ chất. Ta có: V1 = K+1([E]. [S]) V-1 = K-1[ES] (1) 45
Khi phản ứng đạt đến cân bằng (enzyme phản ứng hết với cơ chất) thì V1 = V-1 nghĩa là: K+1([E]. [S]) = K-1[ES] K [ES]⋅[ ] từ đó ta có: −1 = K+1 []ES Nếu gọi Ks là hằng số cân bằng các phản ứng bậc I, ta có: [][]E.S K−1 Ks = Æ Ks = (2) []ES K+1 * Nếu Ks có giá trị lớn thì K-1 sẽ lớn và K+1 sẽ nhỏ. Từ đó ta thấy phức hợp ES dễ phân giải thành các chất S và E. Phản ứng enzyme tiến hành chậm. * Nếu Ks có giá trị nhỏ thì tốc độ tạo ES sẽ nhanh đồng thời phản ứng enzyme cũng tiến hành nhanh. Vậy nếu Ks càng nhỏ thì nồng độ ES càng cao. [ES]⋅[ ] Ở giai đoạn 1 ta đã tính được: K = s []ES Hay viết dưới dạng khác là: [E] [S] = Ks[ES] (3) Nếu gọi [Eo] là nồng độ chung của enzyme trước khi bắt đầu tham gia phản ứng. [E]: nồng độ enzyme ở dạng tự do (không tạo phức hợp) [ES]: nồng độ của phức hệ ES. thì nồng độ enzyme không tạo phức hợp (ở dạng tự do) là: [E] = [Eo] - [ES] (4) Thay vào phương trình (3), ta có: ([Eo] - [ES]). [S] = Ks. [ES] Triển khai: [Eo] [S] - [ES] [S] = Ks. [ES] hay là: Ks [ES] + [ES] [S] = [Eo] [S] hay là: [ES](Ks + [S]) = [Eo] [S] Từ đó [S] [ES] [S] [ES] = [Eo] Æ = (5) KSs + [] []Eo KSs + [] Như vậy nồng độ [ES] càng lớn thì tốc độ phản ứng enzyme càng lớn (Vì Ks lúc đó sẽ nhỏ).Tốc độ sẽ đạt tới tối đa khi nồng độ phức hệ [ES] bằng nồng độ enzyme ban đầu [Eo] ([ES] = [Eo]) nghĩa là khi tất cả enzyme đều được kết hợp với cơ chất thì phản ứng enzyme là tối đa. 46
V [ES] Từ đó có thể lập thành tỉ lệ: = Vmax []Eo V: tốc độ phản ứng enzyme (ở giai đoạn đầu) Vmax: tốc độ tối đa. [ES] [S] Từ phương trình (5) ta đã có: = [Eo ] KSs + [] V []S Vậy = Vmax KSs + [] [S] Từ đó: V = Vmax KSs + [] Đây là phương trình Michaelis và Menten (1913) dùng để tính tốc độ phản ứng enzyme từ E + S Æ ES. 1 Nếu Ks = [S] thì V = Vmax 2 6.1.2. Ở giai đoạn: ES* Æ E + P Khi đó ta có tốc độ tạo ES là: V+1 = K+1([E] [S]) Tốc độ phân li ES theo phản ứng nghịch V-1 = K-1[ES] Tính tốc độ phân giải phức hệ ES để tạo E + P, hằng số tốc độ này bằng K+2 K+1 K+2 E + S ES E + P K-1 K-2 Khi nồng độ cơ chất [S] cao hơn nhiều so với nồng độ [E] thì sẽ đạt nhanh chóng trạng thái cân bằng giữa sự hình thành ES và sự phân giải phức hệ ES đó. Như vậy ở giai đoạn này ta có: K-1[ES] + K+2[ES] = K+1[E] [S] Tốc độ phân giải T ốc độ phân giải Tố c độ tạo phức hệ ES phức hệ ES Æ E + S ph ức hệ ES Æ E + P Hay là: (K-1 + K+2). [ES] = K+1 [E] [S] (6) Từ phương trình (4): [E] = [Eo] - [ES] Thay vào phương trình (6), ta có: 47
(K-1 + K+2). [ES] = K+1 ([Eo] - [ES]). [S] từ đó: KK+ ([]E− [ ES]) .[ S] [E][ S]− [ ES][ S ] −1 + 2 = o = o K +1 []ES []ES KK−1+ + 2 [Eo ][ S]− [ ES][ S] Đặt = Km Æ Km = K +1 []ES Km được gọi là hằng số Michaelis (đo bằng mol/lit) (tính theo khi mà sự tạo [ES] và phân li [ES] bằng nhau) Km[ES] = [Eo] [S] - [ES] [S] Km[ES] + [ES] [S] = [Eo] [S] [ES](Km + [S]) = [Eo] [S] [E.S][ ] [ES] = o (7) KSm +[] Mặt khác tốc độ phản ứng tính theo sự hình thành sản phẩm P từ [ES] bằng: V = K+2[ES] V từ đó: [ES] = K+2 V [E.S][ ] Thay vào (7) ta có: = o K+2 KSm +[] K.E.S[][ ] Vậy V = +2 o (8) KSm + [] Phương trình này cho phép tính được sự phụ thuộc tốc độ phản ứng vào nồng độ của enzyme và cơ chất. V đạt cực đại khi [ES] = [Eo] nghĩa là khi E được kết hợp hoàn toàn với S. V [ES] [][]ES = từ phương trình 7 ta có: ES = 0 Vmax [E0] KSm + [] 48
V 1 [ES][ ] [S] Vậy = . 0 = Vmax []E 0 KSm + [] KSm +[] Từ đó: []S Đây là phương trình V = Vmax . Michaelis và Menten dùng để KS+ m [] tính tốc độ phản ứng từ ES* Æ E + P 1 * Vậy V = .Vmax thì Km = [S] 2 Lúc đó hằng số Michaelis được đo bằng mol/lít So sánh giá trị Km và Ks ta thấy: KK−1+ + 2 Km = K +1 K−1 mà Ks = K+1 K+2 Vậy Km = Ks + K+1 Khi K+2 = K+1 thì Km = Ks + 1 [S] Từ phương trình (8) V = Vmax. có thể viết dưới dạng KSm +[] phương trình: V V = max K m +1 []S Theo phương trình này thì khi [S] tăng thì tốc độ phản ứng tăng. Nhưng khi nồng độ cơ chất [S] tăng đến một mức độ nào đó thì đạt tới giá trị tốc độ cực đại:V = Vmax. Sau đó thì V không tăng theo nồng độ cơ chất [S] vì V đã luôn luôn =Vmax. Đó là phương trình biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng với nồng độ cơ chất. Có thể biểu diễn bằng dạng hiperbol: Tốc độ Vmax C Vmax B 2 A 0 Km [S] 49
Có thể giải thích của đường biểu diễn dạng hiperbol như sau: Trong phản ứng có enzyme xúc tác số phân tử cơ chất lớn hơn số phân tử enzyme rất nhiều (S>E). Cơ chất chỉ được chuyển hoá khi tạo thành phức hệ enzyme. Do đó tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ phức hệ [ES]. Nồng độ [ES] ở 3 điểm A, B, C không giống nhau. Ở điểm A và B còn vài phân tử enzyme chưa kết hợp với cơ chất, do đó nếu tăng hay giảm nồng độ cơ chất [S] sẽ làm tăng hay giảm sự va chạm giữa E và S nghĩa là làm tăng hay giảm nồng độ [ES] và sẽ ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng và tốc độ là hàm số của nồng độ cơ chất [S]. Tới điểm C tất cả phân tử enzyme đã kết hợp với S nên khi tăng nồng độ cơ chất có thể làm tăng dần sự va chạm giữa E và S nhưng không làm tăng tốc độ phản ứng. Vì không còn enzyme tự do để có thể gắn thêm vào cơ chất và tốc độ đạt được đã là cực đại. Ở điểm B đúng 1 số phân tử enzyme đã kết hợp với cơ chất, 2 1 tốc độ ở đó = Vmax và nồng độ cơ chất tương ứng với điểm B bằng 2 hằng số Km. Từ phương trình Michaelis Menten [S] V = Vmax . KSm + [] 1 Nếu V = Vmax thì Km = [S]. Như vậy nghĩa là hằng số 2 Michaelis bằng nồng độ của cơ chất khi mà tốc độ phản ứng bằng 1 Vmax. 2 * Phương trình Michaelis cũng có thể viết dưới dạng khác theo đề nghị của Lineweaver và Burk (1934) bằng cách lấy số nghịch đảo: KS+[ ] K 1 1 1 = m Æ 1 = m . + V V.Smax [] V Vmax []S Vmax 50
Phương trình có dạng y = ax + b và đường biểu diễn có dạng đường thẳng như sau: 1 V 1 V max 1 1 − K m []S Qua đồ thị có thể xác định được Vmax và Km. 6.2. Động học của các phản ứng enzyme trong trường hợp có chất kìm hãm Trong trường hợp có chất kìm hãm cạnh tranh hay không cạnh tranh thì giá trị V của phản ứng sẽ bao gồm cả hằng số Ki (Ki là hằng số phân li của phức hợp enzyme-chất kìm hãm EI hay còn gọi là hằng số kìm hãm). Hằng số Ki được tính nhờ phương trình sau: Ki+1 E + I EI Ki-1 K i −1 [EI]⋅[ ] Ki = = K i +1 []EI * Các chất kìm hãm cạnh tranh: là các chất thường có cấu tạo gần giống với cơ chất. Các chất kìm hãm cạnh tranh có tính đặc hiệu rất cao, nghĩa là chỉ kìm hãm một enzyme riêng biệt. Ví dụ: Malonic acid là chất kìm hãm cạnh tranh của enzyme succinat-dehydrogenasa vì nó có cấu tạo gần giống succinic acid. CH2 – COOH CH2 – COOH COOH CH2 – COOH Malonic acid Succinic acid 51
Khi tăng nồng độ cơ chất thì mất kìm hãm cạnh tranh. * Các chất kìm hãm không cạnh tranh: là các chất có tác dụng kìm hãm hoạt động của enzyme bằng cách gắn vào các vị trí khác với các vị trí gắn cơ chất của enzyme. Trong trường hợp này chỉ làm giảm V cực đại của phản ứng chứ không ảnh hưởng gì đến hằng số Km. Ví dụ: Các ion kim loại nặng Ag+2; Hg+; Trichloroacetic acid. 6.2.1.Động học của phản ứng enzyme trong trường hợp có chất kìm hãm cạnh trạnh Việc tính toán Vi sẽ phức tạp hơn vì ta có đồng thời với quá trình gắn E với cơ chất, còn có cả quá trình gắn E vào chất kìm hãm I. K+1 K+2 E + S ES E + P K-1 Ki+1 E + I EI Ki-1 Bằng cách tính toán như trên ta có : V.Si max [ ] V = i ⎛ K ⎞ ⎜ m ⎟ KSm +[] + ⎜ []I. ⎟ ⎝ Ki ⎠ Phương trình này giống phương trình Michaelis nhưng có thêm K m []I. để phản ánh quá trình kìm hãm bởi các chất kìm hãm cạnh tranh. Ki * Cũng có thể tính Vi bằng cách : 1 1 ⎛ K.I[ ]⎞ 1 1 = . ⎜ m ⎟ . + ⎜K m + ⎟ Vi Vimax ⎝ K i ⎠ []S Vimax 52
6.2.2.Động học của phản ứng enzyme trong trường hợp có chất kìm hãm không cạnh tranh: Trong trường hợp này người ta thấy rằng chất kìm hãm không cạnh tranh có thể gắn vào enzyme tự do và cả vào phức hệ ES theo các phản ứng sau: K+1 K+2 E + S ES E + P K-1 Ki+1 E + I EI K i-1 Ki+2 ES + I IES Ki-2 K i+3 EI + S IES K i-3 Cách tính phức tạp hơn: - Giả thiết rằng K+2 rất nhỏ so với K+1 và K-2, và phức hợp IES không tạo thành sản phẩm tương ứng và các hằng số cân bằng có giá trị như nhau (tương ứng với các phản ứng ghi trên), bằng cách tính như trên sẽ có: K.ES+2[ o ][ ] V = i ⎛ []I ⎞ ⎜ ⎟ ()Ks +[] S .⎜ 1 + ⎟ ⎝ Ki ⎠ hoặc tính theo dạng khác: 1 ⎛ [I] ⎞ ⎛ 1 K m 1 ⎞ = ⎜1+ ⎟ ⎜ + . ⎟ Vi ⎝ K i ⎠ ⎝ Vmax Vmax []S ⎠ Khi so sánh tốc độ phản ứng không bị kìm hãm với tốc độ phản ứng có chất kìm hãm không cạnh tranh người ta thu được tỉ lệ sau: 53
V [I] o = 1+ Vi Ki Vo là tốc độ ban đầu của phản ứng enzyme không có chất kìm hãm. K.ES+2[] o [ ] Vo = từ (8) KSs + [] Ở đây Ks thay vào chỗ của Km vì K+2 rất nhỏ so với K-1 nghĩa là Km = Ks. Như vậy có thể thấy rằng: Sự biến đổi tương đối của hoạt tính enzyme có chất kìm hãm không cạnh tranh chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất kìm hãm mà không phụ thuộc vào nồng độ của cơ chất [S]. V * Đối với chất kìm hãm cạnh tranh thì tỉ lệ o có dạng: Vi V KK o = 1 + m i []I từ phương trình này ta thấy sự biến đổi Vi KSm + [] của hoạt tính enzyme khi có chất kìm hãm cạnh tranh phụ thuộc cả vào nồng độ cơ chất và nồng độ chất kìm hãm. Có thể biểu diễn tốc độ phản ứng enzyme trong trường hợp có chất kìm hãm cạnh tranh và không cạnh tranh bằng đồ thị: V V V = V V max imax max Vimax 1 2 1 2 Km Kmi [S] Km = Ki [S] 1 1 2 1 2 V V 1 1 1 = 1 Vmax Vi max Vi max 1 V max 1 1 1 1 1 1 − − − = − K m K mi []S K m K mi []S 1 – có chất kìm hãm. 2 – không có chất kìm hãm. Có chất kìm hãm cạnh tranh Có chất kìm hãm không cạnh tranh 54
Tóm tắt: (Tất cả những phương trình sau đây chỉ dùng cho trường hợp khi 1 cơ chất tham gia vào phản ứng) Không có Có chất kìm hãm Có chất kìm hãm chất kìm hãm cạnh tranh không cạnh tranh Phương 1 = 1 1 trình V = = Vi Vi K 1 1 m . + 1 ⎛ K.I ⎞ ⎛ []I ⎞ m [ ] ⎜ ⎟ . V S V . ⎜K m + ⎟ . 1+ max [] max ⎜ ⎟ ⎜ K ⎟ Vimax ⎝ K i ⎠ ⎝ i ⎠ 1 1 ⎛ 1 K m 1 ⎞ + ⎜ + + ⎟ ⎜ V V []S ⎟ []S Vimax ⎝ i max i max ⎠ Đoạn thẳng trên trục tung 1 1 1 ⎛ []I ⎞ tại điểm . ⎜1+ ⎟ V V V ⎜ ⎟ 1 max max max ⎝ K i ⎠ Vmax Đoạn thẳng cắt trên trục 1 1 1 hoành tại − − − ⎛ I ⎞ Km [] Km 1 Km ⎜ 1+ ⎟ điểm ⎜ K ⎟ []S ⎝ i ⎠ 55
VII . CÁCH GỌI TÊN VÀ PHÂN LOẠI ENZYME Trong thời gian cơ chế tác dụng của enzyme chưa được nêu ra, người ta đã đặt cho một số enzyme những tên riêng biệt như pepsine, trypsine, chymotrypsine, papaine, bromeline, Khi con số các enzyme được biết ngày càng nhiều tên enzyme được gọi theo nguyên tắc sau đây: Tên enzyme = (tên cơ chất mà enzyme xúc tác + loại phản ứng mà enzyme xúc tác + tiếp vị ngữ “ase”). Ví dụ: Ascorbat- Ascorbic acid + ½ O2 Dehydroascorbic acid + H2O oxidase CH 2 – COOH Succinat- CH – COOH + FAD + FAD.H2 CH2 – COOH dehydrogenase CH –COOH Succinic acid Fumaric acid Việc phân loại enzyme là công việc khó khăn vì số enzyme mà cơ chế xúc tác của nó được hiểu biết một cách tường tận không nhiều. Việc phân loại enzyme được dựa theo nguyên tắc là: lấy cơ sở kiểu phản ứng do enzyme xúc tác mà Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế đã đề xuất năm 1964. Năm 1973 hệ thống phân loại này lại tiếp tục được hoàn thiện bởi Ủy ban danh pháp Hóa sinh thuộc Hiệp hội hóa học cơ bản và ứng dụng Quốc tế (IUPAC). Trên cơ sở đó tất cả các enzyme được phân chia 6 nhóm chủ yếu sau: 1. Oxydoreductase 4. Lyase 2. Transferase 5. Isomerase 3. Hydrolase 6. Synthetase (Ligase) Các số thập phân trên bảng phân loại có ý nghĩa như sau: - Số thứ nhất chỉ nhóm chính (Ví dụ nhóm 2: transferase) - Số thứ hai qui định một số đặc tính của phản ứng (Ví dụ: 2.1 cho biết enzyme vận chuyển gốc 1 carbon) - Số tiếp theo cho biết chi tiết hơn (Ví dụ 2.1.1: có nghĩa là enzyme vận chuyển nhóm methyl ) Tuy nhiên cho đến nay các tên gọi truyền thống của enzyme vẫn còn được sử dụng. VIII. CÁC NHÓM ENZYME RIÊNG BIỆT 8.1. Oxydoreductase (các enzyme oxy hóa khử) 56
Các enzyme nhóm này làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng oxy hóa khử. Chúng chuyển vận H+ hay các điện tử và xúc tác cho sự oxy hóa sinh học. Các enzyme này có vai trò to lớn trong quá trình hô hấp và trao đổi năng lượng trong cơ thể. Sơ đồ tổng quát của các phản ứng được xúc tác bởi oxydoreductase như sau: AH2 + B A + BH2 oxydoreductase Trong đó AH2 là cơ chất; B là chất nhận H nào đó, có thể là O2. Trong tế bào oxydoreductase tạo nên các hệ thống (được gọi là chuỗi enzyme oxy hóa khử), trong đó việc vận chuyển các nguyên tử hydro (H+ và e-) qua nhiều giai đoạn, từ cơ chất đến chất nhận cuối cùng là O2. Kết quả là các nguyên tử hydro được vận chuyển đến O2 và sẽ tạo thành H2O. Sơ đồ hệ thống enzyme hô hấp và việc vận chuyển H+ và e- được trình bày tổng quát sau đây: 2H +, 2e- 2H +, 2e- AH 2 NAD NADH 2 FAD FADH 2 + - (NADP) (NADPH 2 ) 2H , 2e Q + 2H QH2 2e- 2cytochrome b 2e- 2cytochrome c 2e- 2cytochrome a H2O -2 - O ½ O2 2e Tùy theo khả năng của oxydoreductase chuyển H2 vừa lấy được từ cơ chất (AH2) đến O2 của không khí, người ta chia oxydoreductase thành hai phân nhóm: - Dehydrogenase háo khí (oxidase) - Dehydrogenase yếm khí. a) Dehydrogenase yếm khí: là những enzyme không có khả năng + - vận chuyển H và e từ cơ chất oxy hóa đến trực tiếp cho O2 của không 57
khí, mà chúng sẽ chuyển H+ và e- đó cho các chất vận chuyển trung gian khác. Nhóm ghép của dehydrogenase yếm khí là dẫn xuất của vitamin PP (B5) đó là NAD và NADP. NH2 O N N + C NH2 (NAD ) N N - - O CH2 – O – (P) – O – (P) – O – CH2 O (+) N H H H H H OH HO H H OH HO H + Nếu là: – O – (P) thì đó là NADP b) Dehydrogenase háo khí: là những enzyme có khả năng vận + - chuyển H và e đến trực tiếp cho O2 của không khí. Chúng cũng là những enzyme hai thành phần. Nhóm ghép của chúng là dẫn xuất của vitamin B2 (Riboflavin) đó là FMN và FAD. O N H 3C NH NH2 H 3C N N O N N CH2 (CH – OH)3 N N FAD CH2 – O – (P) – O – (P) – CH2 O H H FMN H OH HO H 58
Các enzyme chứa FMN, FAD thường không oxy hóa trực tiếp cơ chất mà chúng lấy H2 từ NADH2 (hoặc từ NADPH2) rồi chuyển điện tử cho hệ cytochrome. Đa số enzyme chứa FMN khi tác dụng trực tiếp với O2 không khí sẽ tạo thành H2O2. Ví dụ: enzyme glycolatoxidase xúc tác cho phản ứng oxy hóa glycolic acid theo sơ đồ sau: COOH Glycolatoxidase CH2OH FMN H2O2 Glycolic acid O C – H FMNH2 O2 COOH Glyoxilic acid 8.2. Nhóm transferase (các enzyme vận chuyển) Các enzyme nhóm này làm nhiệm vụ vận chuyển các nhóm hóa học từ hợp chất này sang hợp chất khác mà không làm thay đổi hóa trị của các nguyên tố. Sơ đồ tổng quát: Ax + B A + Bx transferase x: là nhóm được vận chuyển. Tùy thuộc vào x mà ta có các tên enzyme vận chuyển khác nhau. Ví dụ: Acyltransferase: x là gốc các acid béo trong đó có gốc acetic acid. Đây là enzyme hai thành phần trong đó nhóm hoạt động là HS-CoA có cấu tạo như sau: NH2 H3C CH3 N N O O SH CH2 – O – (P) – O – (P) – O O NH NH N N H H OH H H 59 OH O – (P)
- Glycozyltransferase: Nếu x là gốc glycozyl. - Aminotransferase: Nếu x là nhóm amin (– NH2 ). - Methyltransferase: Nếu x là nhóm (CH3). - Aldotransferase: Nếu x là nhóm aldehyd. - Cetotransferase: Nếu x là nhóm cetone. - Phosphotransferase: Nếu x là gốc H3PO4. Enzyme này còn có tên là: a) Kinase: Nếu xúc tác cho phản ứng chuyển gốc H3PO4 mà ATP là nhóm hoạt động của enzyme này. Ví dụ: Glycerine + ATP Glycerol(P) + ADP Kinase b) Mutase: là enzyme vận chuyển gốc H3PO4 trong nội tại phân tử của 1 chất. Ví dụ: Enzyme hexoso(P)-mutase xúc tác cho phản ứng sau: 6 6 CH2OH CH2 – O – (P) 5 O 5 O H H H Hexoso(P) - H H H 4 1 4 1 HO OH H O – (P) mutase HO OH H OH 3 2 3 2 H OH H OH Glucoso-1(P) Glucoso-6(P) 8.3. Nhóm hydrolase (các enzyme thủy phân): Các enzyme nhóm này xúc tác cho các phản ứng thủy phân. Sơ đồ tổng quát: R1 – R2 + H2O R1 – H + R2 – OH Hydrolase 60
Dựa vào liên kết giữa R1 và R2 mà ta có tên các enzyme thủy phân khác nhau: - Peptidase: Thủy phân liên kết peptide. - Glycosidase: Thủy phân liên kết glycoside. - Esterase: Thủy phân liên kết ester. - Amidase: Thủy phân amide. R – C – NH2 + H2O R – COOH + NH3 Amidase O Amide Ví dụ: NH2 C = O + H2O CO2 + 2NH3 Urease NH2 Ure H 2N – CH – COOH H2N – CH – COOH NH3 CH2 + H2O CH2 Asparaginase CONH2 COOH Asparagin Aspactic acid 8.4. Nhóm Liase (các enzyme phân cắt) Enzyme nhóm này phân cắt một nhóm nào đó ra khỏi một hợp chất mà không có sự tham gia của H2O. Có trường hợp kết quả của phản ứng là tạo liên kết đôi. Ví dụ: * Decarboxylase: xúc tác cho phản ứng sau: CO2 R – CH – COOH R – CH2 Decarboxylase NH2 NH2 Aminoacid Amine 61
* Aldolase: xúc tác cho phản ứng thuận nghịch sau: 62
Fructosodi(P) Aldehyd(P)glyceric + Phosphodioxiacetone CH2 – O – (P) O C = O C – H CH2 – OH Aldolase (CH – OH) 3 CH – OH + C = O CH2 – O(P) CH2 – O(P) CH2 – O(P) Fructoso 1,6 di(P) Aldehyd(P)glyceric Phosphodioxiacetone * Hydratase (hydroliase): gồm các enzyme xúc tác cho phản ứng loại trừ và kết hợp H2O. CH2 – COOH H2O CH2 - COOH C(OH).COOH C – COOH Aconitat-hydratase CH2 – COOH CH - COOH Citric acid Cis-aconitic acid CH – COOH 2 H2O CH – COOH Aconitat-hydratase CH.OH.COOH Isocitric acid 8.5. Nhóm Isomerase (các enzyme đồng phân hóa): Các enzyme nhóm này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa các chất hữu cơ thành đồng phân của chúng. Ví dụ chuyển hóa giữa dạng cetone và dạng aldehyd. Giữa dạng L và dạng D Ví dụ: Enzyme trioso(P)isomerase xúc tác cho phản ứng sau: O CH2 – OH C – H C = O CH – OH CH2 – O(P) CH2 – O(P) Phosphodioxiacetone Aldehyd(P)glyceric 63
Enzyme alaninracemase xúc tác cho phản ứng biến đổi L-alanine thành D-alanine và ngược lại. COOH COOH Alaninracemase H2N – C – H H – C – NH2 CH3 CH3 L-Alanine D-Alanine 8.6. Nhóm synthetase (các enzyme tổng hợp) Các enzyme nhóm này xúc tác cho các phản ứng tổng hợp các chất hữu cơ. Nhóm này chỉ xúc tác khi có mặt của ATP và các hợp chất cao năng khác. Vì các phản ứng tổng hợp đòi hỏi phải cung cấp nhiều năng lượng. Một số ví dụ sau đây: ATP ADP + H3PO4 * Aspactic acid + NH3 Asparagine – H2O Asparaginsynthetase ATP ADP + H3PO4 * Glutamic acid + NH3 Glutamine – H2O Glutaminsynthetase ATP AMP + H P O 4 2 7 * CH – COOH + HS-CoA CH – C ~ S.CoA 3 3 Acetic acid Acetyl-CoA-Synthetase O Acetyl-CoA 64
o0o 65
CHƯƠNG 4 CARBOHYDRATE VÀ SỰ TRAO ĐỔI CARBOHYDRATE TRONG CƠ THỂ THỰC VẬT 4.1 Cấu tạo, tính chất và vai trò của carbohydrate Carbohydrate là nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinh vật. Nhìn chung hàm lượng carbohydrate ở thực vật cao hơn ở động vật. Ở thực vật carbohydrate tập trung chủ yếu ở thành tế bào, mô nâng đỡ và mô dự trữ. Tuy nhiên hàm lượng carbohydrate thay đổi tuỳ theo loài, giai đoạn sinh trưởng, phát triển. Trong cơ thể người và động vật carbohydrate tập trung chủ yếu trong gan. Thực vật xanh có khả năng sử dụng năng lượng ánh sáng để tổng hợp carbohydrate từ CO2 và H2O. Carbohydrate thực vật là nguồn dinh dưỡng quan trọng của người và động vật. Trong cơ thể sống carbohydrate giữ nhiều vai trò quan trọng như: - Cung cấp năng lượng cho cơ thể, carbohydrate đảm bảo khoảng 60% năng lượng cho các quá trình sống. - Có vai trò cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidglican ) - Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide) - Góp phần bảo đảm tương tác đặc hiệu của tế bào (polysaccharide trên màng tế bào hồng cầu, thành tế bào một số vi sinh vật). Dựa vào cấu tạo, tính chất carbohydrate được chia làm hai nhóm lớn: monosaccharide và polysaccharide. 4.2 Các monosaccharide Monosaccharide là các aldehyd hoặc ketone có chứa một hoặc nhiều nhóm hydroxyl. Số lượng carbon trong phân tử monosaccharide ít nhất là 3, đó là glyceraldehyd và dihydroxyacetone. Chúng có công thức như sau: 56
CH2OH | C = O | CH2OH D-glyceraldehyd Dihydroxyaketone L-glyceraldehyd Glyceraldehyd có chứa 1 cacbon bất đối (C*), có hai đồng phân D và L, còn dihydroxyaketone không chứa carbon bất đối. Số đồng phân lập thể của monosaccharide tính theo công thức X = 2n (n là số C* trong phân tử). Nếu số cacbon trong phân tử monosaccharide là 4, 5, 6 hoặc 7 chúng có tên gọi tương ứng là tetrose, pentose, hexose và heptose. Công thức cấu tạo của một số monosaccharide thường gặp được trình bày ở dưới đây: CHO CHO CH2OH CH2OH | | | | HCOH HCOH C = O C = O | | | | HCOH HCOH HC-OH HO-CH | | | | CH2OH HCOH HCOH HCOH | | | CH2OH CH2OH CH2OH D-Erythrose D-Ribose D-Ribulose D-Xilulose CHO CH2OH CH2OH | | | HCOH C = O C = O | | | HOCH HO-CH HO-CH | | | HCOH HCOH HCOH | | | HCOH HCOH HCOH 57
| | | CH2OH CH2OH HCOH | CH2OH D-Glucose D-Fructose D-Sedoheptulose Khi đánh số thứ tự các nguyên tử carbon trong phân tử monosaccharide, bắt đầu từ carbon của nhóm carbonyl của aldose, hoặc carbon ở đầu gần nhóm carbonyl của các ketose. Căn cứ vào vị trí của H và OH ở carbon bất đối mang số thứ tự lớn nhất (carbon bất đối ở xa nhóm carbonyl) giống với D hoặc L- glyceraldehyd để xếp monosaccharide đó vào dạng D hoặc L. Các monosaccharide có khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực về bên phải (ký hiệu dấu +) hoặc bên trái (ký hiệu dấu -). Trong hoá sinh học đường 6C và 5C có ý nghĩa lớn. Một số đường ví dụ 1,6 fructosediphosphate và đường ribose đã được nêu ở trên. Hexose và pentose có thể tồn tại ở dạng thẳng hoặc vòng. Theo đề nghị của Harworth phân tử đường được viết ở dạng vòng. Ở đây người ta tưởng tượng một mặt phẳng nằm ngang có 6 hoặc 5 góc, ở những góc của nó sắp xếp ở phía trên hoặc phía dưới những chuỗi bên vuông góc với mặt phẳng. Ở dạng vòng xuất hiện một nhóm hydroxyl glycoside, nhóm này có khả năng phản ứng cao, dễ dàng tạo liên kết glycoside và có tính khử. 58
. Nhóm hydroxyl glycoside là đặc trưng của đường khử, nhóm này có thể ở phía dưới hoặc phía trên mặt bằng phân tử. Nếu nó nằm phía dưới thì người ta gọi là dạng α, ví dụ α-glucose, nếu ở phía trên thì được gọi là dạng β. Glucose tồn tại chủ yếu ở dạng 6 cạnh (pyranose), fructose và pentose ở dạng vòng 5 cạnh (furanose). Một liên kết glycoside xuất hiện khi ở một phân tử nguyên tử H được thay thế bằng một gốc đường (glycosyl), ví dụ ở adenine được thay thế bởi 1 ribosyl (gốc đường của ribose). 59
Hình 4.1 Tổng hợp hexosephosphate từ triosephosphate Trong trường hợp này nguyên tử N nối với 2 thành phần, vì vậy người ta gọi N-glycoside. Tương tự như vậy S-glycoside và O-glycoside cũng được tạo nên. Trong trường hợp thứ nhất nguyên tử H của một nhóm SH, 60
trong trường hợp thứ hai nguyên tử H của một nhóm OH được thay thế bởi một gốc glycosyl. Tính chất chung của các monosaccharide Các monosaccharide là những chất không màu, phần lớn có vị ngọt. Chúng hoà tan tốt trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ không phân cực, tan trong dung dịch ethanol 80%. Tính chất lý học đặc trưng của monosaccharide là tính hoạt quang của chúng, nghĩa là có khả năng làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực sang phải hoặc sang trái. Có thể đo được góc quay này bằng máy phân cực kế. Hoá tính quan trọng của monosaccharide là những tính chất của nhóm chức aldehyd hoặc ketone, điển hình là tính khử. a) Tuỳ điều kiện oxy hoá monosaccharide bị oxy hoá thành các acid khác nhau - Khi oxy hoá nhẹ bằng dung dịch clo, brom, iod trong môi trường kiềm, hoặc dung dịch kiềm của các ion kim loại, nhóm chức aldehyd của monosaccharide bị oxy hoá. Ion kim loại bị khử thành dạng có hoá trị thấp hơn hoặc đến kim loại tự do (vi dụ Cu2+ →Cu+1, Ag+ →Ag0). CHO COOH | | HCOH HCOH | | HOCH Oxy hoá nhẹ HOCH | | HCOH HCOH | | HCOH HCOH | | CH2OH CH2OH D-glucose D-gluconic acid - Khi chất oxy hoá là HNO3 đặc, cả hai nhóm aldehyd và alcohol bậc 1 của monosaccharide đều bị oxy hoá tạo thành acid chứa 2 nhóm carboxyl gọi là saccharic acid: 61
CHO COOH | | HCOH HCOH | | HOCH HNO3 HOCH | | HCOH HCOH | | HCOH HCOH | | CH2OH COOH D-glucose saccharic acid b) Dưới tác dụng của các chất khử nhóm carbonyl của monosaccharide bị khử tạo thành các polyol tương ứng Để tiến hành phản ứng khử có thể dùng dòng khí hydro có chất xúc tác là kim loại (hỗn hợp Hg và Na). Ví dụ khi bị khử fructose tạo thành 2 polyol đồng phân là sorbitol và mannitol. Sorbitol cũng là sản phẩm của phản ứng khử glucose. CHO CH2OH | | HCOH HCOH | | HOCH HOCH | | HCOH HCOH | | HCOH HCOH | | CH2OH COOH D-glucose D-sorbitol Trong cơ thể sinh vật, glucose có thể bị khử tạo thành polyol vòng gọi là inosite, ví dụ mezoinosite là yếu tố sinh trưởng của các mô thực vật nuôi cấy. Estephosphoric của nó (fitin) là nguồn dự trữ phospho trong hạt. 62
c) Phản ứng tạo este thường xảy ra với nhóm alcohol bậc 1, OH glycosite của monosaccharide. Các este phosphat của monosaccharide là những sản phẩm trung gian quan trọng nhất của nhiều quá trình trao đổi chất trong cơ thể sinh vật. d) Phản ứng của nhóm OH glycosite tạo thành các hợp chất glycoside Nhóm OH glycoside có thể phản ứng với rượu tạo thành este tương ứng gọi là glycosite. Tuỳ theo vị trí của nhóm OH này mà α- hoặc β- glycoside được tạo thành. Trong phân tử glycoside, phần không phải carbonhydrate được gọi là aglicon. Có thể phân biệt các kiểu liên kết glycosite khác nhau: - Liên kết O-glycoside: (G-C-O-A) gốc aglicon (A) kết hợp với carbonhydrate (G) qua O. Liên kết O-glycoside là dạng liên kết của đi-, tri-, oligo- và polysaccharide. - Liên kết S-glycoside: (G-C-S-A) gốc aglicon (A) kết hợp với carbonhydrate (G) qua S - Liên kết N-glycoside: (G-C-N-A) gốc aglicon (A) kết hợp với gluxit (G) qua N - Liên kết C-glycoside: (G-C-C-A) gốc aglicon (A) kết hợp với carbonhydrate (G) qua C Liên kết glycoside không bền với acid, tương đối bền với kiềm. Dưới tác dụng của acid hoặc các enzyme tương ứng, glycoside bị thuỷ phân tạo thành monosaccharide và aglicon. 4.3 Các polysaccharide Polysaccharide do nhiều gốc monosaccharide kết hợp với nhau, có khối lượng phân tử lớn, do đó polysaccharide không có tính khử. Các monosaccharide có thể thuộc một loại hay nhiều loại khác nhau. Các liên kết glycoside trong phân tử polysaccharide có thể là α- hoặc β-glycoside. Tên polysaccharide dựa theo tên của monosaccharide cấu tạo nên nó 63
nhưng đổi đuôi “ose” thành đuôi “an”. Ví dụ D-glucane, D-fructane, D- galactane. Sau đây chỉ đề cập chi tiết hơn một số polysaccharide phổ biến và quan trọng. Tinh bột là polysaccharide dự trữ thực vật phổ biến nhất, là một hỗn hợp của amylose và amylopectin, trong đó amylopectin chiếm khoảng 80%. Amylose là một chuỗi không phân nhánh gồm nhiều gốc glucose. Có khoảng 200-300 gốc glucose kết hợp với nhau theo kiểu α-glycoside. Liên kết luôn luôn nằm giữa C1 và C4. Ngược lại amylopectin là chuỗi phân nhánh. Sự phân nhánh là do liên kết glycoside giữa C1 và C6. Amylopectin được tạo thành từ amylose. Gốc amylose (khoảng 40 gốc glucose) được gắn kết với một chuỗi amylose khác bằng liên kết α -1-6-glycoside. Người ta cho rằng chuỗi amylose dài và cả những chuỗi amylopectin ngắn hơn có cấu tạo xoắn. Cơ quan dự trữ tinh bột là vô sắc lạp (amyloplast), tương tự như lục lạp và phát triển từ tiền lục lạp. Cơ quan chứa tế bào dự trữ (hạt ngũ cốc, củ khoai tây) gồm các vô sắc lạp xếp sít nhau. Tinh bột được tích luỹ trong vô sắc lạp và lục lạp ở dạng hạt tinh bột và tạo nên vị trí tinh bột tập trung. Cấu trúc này đối với từng loại thực vật là khác nhau như ở hình 4.2. Người ta có thể nhận dạng hạt tinh bột có nguồn gốc từ các loài thực vật khác nhau. Ở những vị trí tinh bột tập trung 64
thể hiện sự kết hợp của các hạt tinh bột dày hơn hoặc thưa hơn. Sự kết hợp dày hơn thể hiện vào ban ngày, thưa hơn vào ban đêm. Tinh bột có nhiều trong các loại quả và củ khác nhau, như trong hạt ngũ cốc (60-70 %) trong củ khoai tây (15-20%). Hình 4.2 Cấu trúc của các hạt tinh bột khác nhau Trong lục lạp tinh bột chỉ được tích luỹ tạm thời và thực ra chỉ khi hoạt động quang hợp mạnh, vào ban ngày. Ban đêm những hạt tinh bột được phân giải thành các monosacaride, đặc biệt là các triose và được đi ra khỏi lục lạp. Glycogen là một chuỗi mạch nhánh, đại phân tử được tạo nên từ nhiều gốc glucose. Glycogen (tinh bột của gan) là carbohydrate dự trữ của động vật bậc cao. Nó tồn tại chủ yếu ở trong gan và trong mô cơ. Nồng độ glycogen ở trong gan cao hơn ở trong mô cơ, tuy nhiên vì trọng lượng của mô cơ lớn hơn trọng lượng của gan nên mô cơ có nồng độ glycogen tổng số cao hơn ở gan. Glycogen nằm trong tế bào chất ở dạng hạt nhỏ, có đường kính 10-40 nm. Sự tổng hợp glycogen thực hiện từ UDP-glucose. 65
Nó là chất cho gốc glycosyl đối với enzyme tổng hợp glycogensynthetase. Glycogen ở trong gan chịu trách nhiệm điều khiển nồng độ đường trong máu. Nồng độ đường trong máu nằm giữa 4,5-7mM. Khi cung cấp đường qua thức ăn thì glucose trong máu được tổng hợp thành glycogen, khi cần glucose, ví dụ hoạt động của cơ thì glucose được giải phóng từ glycogen. Cellulose là một thành phần quan trọng của thành tế bào thực vật. Ở thành tế bào sơ cấp nó chiếm khoảng 30%, ở tế bào già thành phần này còn cao hơn. Cellulose là một glucan, một polysaccharide, được tạo nên từ các gốc glycosyl. Liên kết nằm giữa C1 và C4 và tương tự liên kết trong cellobiose. Ở liên kết β-glycoside nhóm OH ở C1 nằm ở phía trên, trong khi nhóm OH ở C4 nằm ở phía dưới (công thức Harworth). Như vậy những nhóm OH của hai gốc đính ở 2 phía đối diện nhau, người ta cho rằng mặt bằng của phân tử tự quay 1800. Sau đó phân tử cellulose có một hình dạng, mà nguyên tử C6 lúc nằm ở phía trên và lúc thì ở phía dưới của phân tử. 66
Có khoảng 36 chuỗi cellulose riêng biệt kết hợp với nhau thành 1 vi sợi, ở đây các chuỗi liên kết với nhau bằng liên kết hydro. Các vi sợi này có những vùng kết tinh và ở dạng này enzyme khó có thể tác động. Những vi sợi kết hợp lại thành sợi, và bó sợi, như ở bông vải là dạng sợi tinh khiết. Chất cho glucosyl là UDP-glucose. Enzyme, cellulose synthetase, có ở gian bào. 4.4. Hoá sinh quang hợp 4.4.1 Pha sáng trong quang hợp Trong thế giới sinh vật thì quang hợp là một quá trình cơ bản. Thông qua quang hợp mà năng lượng của ánh sáng mặt trời chiếu xuống được biến thành năng lượng hoá học. Hầu hết sinh vật của hành tinh chúng ta sống trực tiếp hoặc gián tiếp nhờ năng lượng ánh sáng mặt trời. Như vậy năng lượng được tích luỹ là ở dạng năng lượng hoá học. Phản ứng tổng quát của quá trình quang hợp thường được biểu diễn bằng phương trình sau, mặc dù nó thể hiện không hoàn toàn đầy đủ. 6CO2 + 6H2O + Năng lượng → C6H12O6 + 6O2 Chính xác là ở quá trình quang hợp nhờ năng lượng ánh sáng mặt trời mà đường được tạo thành và quang hợp ở thực vật đã gắn liền với việc giải phóng oxy. Quá trình quang hợp được chia làm hai giai đoạn: - Phản ứng sáng - Sự đồng hoá CO2 Giai đoạn thứ nhất là quá trình chuyển năng lượng ánh sáng thành năng lượng hoá học. Giai đoạn thứ hai là tạo ra dạng năng lượng hoá học bền vững và dễ dự trữ hơn. 67
Hình 4.3 Cấu trúc của diệp lục a và của farnesol. Farnesol là gốc kỵ nước của một số tế bào vi khuẩn Ánh sáng cần cho quá trình quang hợp được tiếp nhận bởi hai nhóm sắc tố: chlorophyll và carotenoid. Ở một số sinh vật bậc thấp hơn còn có phycobillin. Cấu trúc cơ bản của diệp lục là vòng porphyrin, được tạo nên từ 4 vòng pyrrol riêng lẽ (hình 4.3). Ở trung tâm của vòng có một nguyên tử Mg liên kết với các nguyên tử nitơ bởi hai liên kết đồng hoá trị và hai liên kết phối trí. Nguyên tử Mg có thể được tách ra khi có tác động của axit loãng. Phân tử diệp lục không chứa Mg được gọi là pheophytin cũng có một vai trò quan trọng trong phản ứng sáng quang hợp. Chuỗi bên của phân tử diệp lục có tính kỵ nước và nhờ vậy mà toàn bộ phân tử có đặc tính kỵ nước. Người ta biết những loại chlorophyll khác nhau: chlorophyll a, chlorophyll b và chlorophyll vi khuẩn. Sự khác nhau của những loại này là do sự khác nhau của các chuỗi bên. Ở chlorophyll b có nhóm aldehyde, như hình 4.3, được thay thế bằng nhóm methyl ở chlorophyll a. Điều thú vị hơn là chuỗi bên dài kỵ nước được tạo nên từ các dẫn xuất isopren. Ở chlorophyll a và b chuỗi bên là một phytol (rượu) liên kết ester với một chuỗi bên của vòng porphyrine. Ở một số vi khuẩn chlorophyll chứa một farnesol (alkohol) được liên kết ester với chuỗi bên của vòng. Điều có ý nghĩa đặc biệt hơn là những liên kết đôi liên hợp trong vòng porphyrine. Chúng có khả năng hấp thu ánh sáng và vì vậy những liên đôi này là yếu tố quan trọng của chlorophyll. Những liên kết liên hợp 68
của carotenoide cũng hấp thu ánh sáng. Các chất thuộc nhóm carotenoide có màu vàng đến màu đỏ da cam, thấy rõ ở lá cây vào mùa thu, lúc này diệp lục bị phân huỷ nên không còn che phủ sắc tố carotenoid. Để hiểu hơn về quá trình quang hợp chúng ta phải đề cập đến cơ quan mà trong đó quang hợp xảy ra, đó là lục lạp. Lục lạp có hình tròn đến hình bầu dục, có đường kính khoảng 10 μm. Nó được bao quanh bởi màng trong và màng ngoài, những màng này có ý nghĩa đối với việc đi vào và đi ra của các chất. Màng trong của lục lạp được tạo nên từ hệ thống màng kéo dãn, ở một số vị trí có dạng xếp chồng lên nhau. Hình 4.4 Sơ đồ biểu diễn một lục lạp Những màng này xuất hiện dưới kính hiển vi điện tử như những túi dẹt. Vì vậy người ta gọi chúng là thylacoid. Màng thylacoid bao quanh một không gian bên trong gọi là cơ chất của lạp thể và tạo nên sự ngăn cách giữa bên trong thylacoid với môi trường ngoài. Sự phân cách giữa bên trong thylacoid với stroma là cần thiết cho phản ứng sáng của quang hợp. Ở một số vị trí có nhiều thylacoid xếp lên nhau thành chồng rất dày. Chúng xuất hiện dưới kính hiển vi như những hạt (grana), vì vậy người ta gọi chúng là grana-thylacoid. Chúng được nối kết với những thylacoid riêng lẽ như màng kép xuyên qua cơ chất lục lạp. Chúng được gọi là stroma-thylacoid (hình 4.4). 69
Màng thylacoid là nơi mà ánh sáng được tiếp nhận bởi các sắc tố đã mô tả ở trên và nhờ các hệ thống oxy hoá khử khác nhau mà năng lượng ánh sáng mặt trời được biến đổi thành năng lượng hoá học và thẩm thấu. Quá trình này phức tạp và chưa được giải thích chi tiết. Màng thylacoid chứa ba cấu thành siêu phân tử, chúng chiếm toàn bộ bề rộng của màng và là thành phần quan trọng của chuỗi vận chuyển điện tử trong quang hợp. Ba phức hệ đó là hệ thống quang hoá I, hệ thống quang hoá II và phức hệ cytochrome b/f (hình 4.5). Hình 4.5 Các phức hệ vận chuyển quan trọng nhất của màng thylacoid: Hệ thống quang hoá II (HTQHII), phức hệ cytochrome b/f, hệ thống quang hoá I (HTQHI) Hệ thống quang hoá là vị trí chứa các sắc tố hấp thụ ánh sáng (những anten). Hệ thống quang hoá I chứa ít nhất là 13 loại protein khác nhau, khoảng 200 phân tử diệp lục, một số lượng carotenoid chưa biết và ba phức hệ Fe-S. Những polypeptide kết hợp và định hướng các phân tử chlorophyll và carotenoid. Hệ thống quang hoá II chứa ít nhất 11 phân tử polypeptide khác nhau, khoảng 200 phân tử diệp lục a và 100 phân tử diệp lục b, hai phân tử pheophytin, quinon, 4 Mn cũng như Ca và chlorid. Cả hai hệ thống tiếp nhận ánh sáng và chuyển hoá chúng trong sự vận chuyển điện tử. Hệ thống quang hoá II còn có nhiệm vụ là tách điện tử ra từ H2O, như vậy là oxy hoá H2O. Sự oxy hoá này là quá trình phức tạp, gồm 4 bước (mỗi bước 1e- được vận chuyển và ở đây có sự tham gia của Mn với sự thay đổi hoá trị. - + 2H2O → 4e + 4H + O2. 70
Quá trình tách nước trong quang hợp được gọi là quang phân ly nước, nó giải phóng ra O2 và đặc trưng cho quang hợp ở sinh vật nhân chuẩn. Hệ thống quang hoá I và II không chỉ chứa sắc tố tiếp nhận ánh sáng mà mỗi hệ thống còn chứa một phân tử diệp lục hoàn toàn đặc biệt thể hiện ở vị trí của nó, phân tử diệp lục này khi tiếp nhận ánh sáng có khả năng bắn ra 1 điện tử. Quá trình này như là sự khởi đầu cho sự vận chuyển điện tử trong quang hợp. Phân tử diệp lục đặc biệt của hệ thống quang hoá I hấp thu cực đại ánh sáng có bước sóng 700 nm. Vì vậy gọi là P700 (Pigment 700) và phân tử diệp lục đặc biệt của hệ thống quang hoá II hấp thu cực đại ở 682 nm. Để bắn ra 1 điện tử thì phân tử diệp lục cần năng lượng. Năng lượng được hấp thụ ở dạng năng lượng ánh sáng từ những sắc tố khác (chlorophyll và carotenoid) của mỗi hệ thống quang hoá và được chuyển đến P682 cũng như P700 qua sự cộng hưởng điện tử. Bằng cách này hai hệ thống quang hoá tạo ra một sự vận chuyển điện tử khi có ánh sáng, sự vận chuyển điện tử này đi từ H2O như là nguồn điện tử, qua hệ thống quang hoá II, plastochinon, phức hệ cytochrom b/f, plastocianin đến hệ thống quang hoá I và cuối cùng đến NADP+ và nó được khử thành NADPH. NADP+ + H+ + 2e- → NADPH Trong chuỗi khử này hệ thống quang hoá II và hệ thống quang hoá I khởi động kế tiếp nhau. Plastoquinone cũng như phức hệ cytochrome b/f và plastocyanin có chức năng vận chuyển e- giữa hai hệ thống quang hoá này vì chúng định vị ở những vị trí khác nhau. Sự vận chuyển e- đã làm cho năng lượng ánh sáng được biến đổi thành năng lượng hoá học, ở dạng khử NADPH (1 mol NADPH = 220 kJ). Thành viên vận chuyển điện tử cơ bản ở trong chuỗi vận chuyển là phức cytochrome b/f, cũng là protein có heme là nhóm prostetic, và vận chuyển điện tử là do sự thay đổi hoá trị của Fe. Bên cạnh phức cytochrome b/f là plastoquinon, một protein chứa Cu (protein màu xanh) vận chuyển điện tử giữa phức cytochrome b/f và hệ thống quang hoá I. Sự vận chuyển này có thể là do sự thay đổi hoá trị của Cu. Hệ thống plastoquinon-plastoquinol vận chuyển H từ hệ thống quang hoá II đến phức cytochrome b/f. Khoảng cách vận chuyển ở đây lớn hơn. Nó khuếch tán trong “vùng đuôi” của lớp màng kép lipid. Thành phần màng chứa nhiều acid béo chưa no thì sự khuếch tán của plastoquinone dễ dàng hơn. Sau đây là phân tử plastoquinone và sự khử nó thành plastoquinol (plastohydroquinone). Đặc tính kỵ nước của phân tử là do các nhóm CH3 71