Giáo trình Vi sinh đại cương - Đăng Thị Hoàng Oanh

100 trang hapham 3070

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Vi sinh đại cương - Đăng Thị Hoàng Oanh", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

giao_trinh_vi_sinh_dai_cuong_dang_thi_hoang_oanh.pdf

Nội dung text: Giáo trình Vi sinh đại cương - Đăng Thị Hoàng Oanh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN Giáo trình VI SINH ĐẠI CƯƠNG Ts. Đặng Thị Hoàng Oanh 2008
THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG CỦA GIÁO TRÌNH 1. THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ Họ và tên tác giả: Ts. Đặng Thị Hoàng Oanh Sinh năm 1969 Cơ quan công tác: Bộ môn sinh học và bệnh thuỷ sản, Khoa Thuỷ sản Đại học Cần Thơ E-mail: 2. PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG Sinh viên ngành: Nuôi trồng thuỷ sản và bệnh học thuỷ sản Dùng cho các trường Cao đẳng và đại học Từ khoá: vi sinh vật, vi khuẩn, vi-rút, vi nấm, nguyên sinh động vật, Vi khuẩn lam, vi sinh vật nước Yêu cầu kiến thức trước khi học: sinh học cơ bản, sinh hoá 1
MỤC LỤC THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ 1 1. THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ 1 2. PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG 1 MỤC LỤC 2 GIỚI THIỆU 5 Chương 1 MỞ ĐẦU 6 1.1 VI SINH VẬT VÀ VI SINH VẬT HỌC 6 1.2 VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT TRONG TỰ NHIÊN VÀ ĐỐI VỚI ĐỜI SỐNG CON NGƯỜI 7 1.3 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT HỌC 8 Chương 2 VI SINH VẬT NHÂN NGUYÊN 14 2.1 VI KHUẨN THẬT 14 2.1.1 Vi khuẩn 14 2.1.1.1 Kích thước và hình dạng 14 2.1.1.2 Cấu tạo tế bào 16 2.1.2 Xạ khuẩn 23 2.1.3 Vi khuẩn lam 24 2.1.4 Vi khuẩn nguyên thủy 26 2.1.4.1 Mycoplasma 26 2.1.4.2 Ricketxi 27 2.1.4.3 Clamydia 28 2.2 VI KHUẨN CỔ 28 2.2.1 Vi khuẩn sinh khí mêtan 28 2.2.2 Vi khuẩn ưa mặn 28 2.2.3 Vi khuẩn ưa nhiệt 29 Chương 3 VI SINH VẬT NHÂN THẬT 30 3.1 VI NẤM 30 3.1.1 Đặc điểm chung của vi nấm 30 3.1.2 Nấm men 31 3.1.2.1 Hình thái của nấm men 31 3.1.2.2 Sinh sản của nấm men 32 3.1.3 Nấm sợi 33 3.1.3.1 Hình thái và cấu trúc của nấm sợi 33 3.1.3.2 Sinh sản của nấm sợi 35 3.2 MỘT SỐ NGUYÊN SINH ĐỘNG VẬT 36 3.3 TẢO 38 Chương 4 VIRUT 41 4.1 LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VIRUT 41 4.2 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VIRUT 41 4.3 HÌNH THÁI VÀ CẤU TẠO CỦA VIRUT 42 4.3.1 Kích thước và hình dạng của virut 42 4.3.2 Cấu tạo của virut 42 4.3.2.1 Axit nucleic (lõi) 42 4.3.2.2 Vỏ protein (capsit) 43 4.3.2.3 Màng bao 44 2
4.3.3 Cấu tạo của thể thực khuẩn 44 4.3.4 Các dạng cấu trúc đối xứng của virut 44 4.3.4.1 Virut đối xứng xoắn 44 4.3.4.2 Virut đối xứng khối 46 4.3.4.3 Virut đối xứng phức hợp 47 4.4 CÁC HÌNH THỨC SAO CHÉP CỦA VIRUT 48 4.4.1 Sao chép ở virut động và virut thực vật 48 4.4.1.1 Giai đoạn hấp thụ trên bề mặt của tế bào ký chủ 48 4.4.1.2 Giai đoạn xâm nhập vào bên trong tế bào chủ 48 4.4.1.3 Giai đoạn tổng hợp các thành phần của virut 49 4.4.1.4 Giai đoạn lắp ráp 50 4.4.1.5 Giai đoạn phóng thích 50 4.4.2 Sự sao chép của thể thực khuẩn (phage) 51 4.4.2.1 Các giai đoạn của chu trình tan 51 4.4.2.2 Các giai đoạn của chu trình tiềm tan 52 Chương 5 DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT 55 5.1 DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT 55 5.2 NGUỒN THỨC ĂN CABON CỦA VI SINH VẬT 56 5.3 NGUỒN THỨC ĂN NITƠ CỦA VI SINH VẬT 57 5.4 NGUỒN THỨC ĂN KHOÁNG CỦA VI SINH VẬT 58 5.5 NHU CẦU VỀ CHẤT SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT 58 5.6 CƠ CHẾ VẬN CHUYỂN CÁC CHẤT QUA MÀNG TẾ BÀO VI SINH VẬT.60 5.7 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 60 Chương 6 SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT 61 6.1 ĐƯƠNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT 61 6.1.1 Giai đoạn chuẩn bị (pha lag): 62 6.1.2 Giai đoạn tăng trưởng nhảy vọt (pha log): 62 6.1.3 Giai đoạn ổn định (pha ổn định): 62 6.1.4 Giai đoạn chết (pha tử vong): 62 6.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SỰ TĂNG TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT 62 6.2.1 Các phương pháp xác định số lượng tế bào 62 6.2.2 Các phương pháp xác định sinh khối tế bào 63 6.2.2.1 Các phương pháp trực tiếp 63 6.2.2.2 Các phương pháp gián tiếp 64 6.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ BÊN NGÀI LÊN SỰ PHÁT TRIẺN CỦA VI SINH VẬT 64 6.3.1 Cơ chế tác dụng của các yếu tố bên ngoài lên vi khuẩn 64 6.3.1.1 Phá hủy thành tế bào: 64 6.3.1.2 Biến đổi tính thấm của màng tế bào chất: 65 6.3.1.3 Thay đổi đặc tính keo của nguyên sinh chất: 65 6.3.1.4 Kìm hãm hoạt tính: 65 6.3.1.5 Hủy hoại các quá trình tổng hợp: 65 6.3.2 Các yếu tố vật lí 65 6.3.2.1 Độ ẩm 65 6.3.2.2 Nhiệt độ 65 6.3.2.3 Áp lực và áp suất thẩm thấu 67 6.3.2.4 Âm thanh 67 3
6.3.2.5 Sức căng bề mặt 67 6.3.2.6 Các tia bức xạ 67 6.3.3 Các yếu tố hoá học 68 6.3.3.1 Ảnh hưởng của pH môi trường: 68 6.3.3.2 Oxi 69 6.3.3.3 các chất diệt khuẩn (sát trùng) 69 6.3.4 Các yếu tố sinh học 70 Chương 7 DI TRUYỀN CỦA VI SINH VẬT 71 7.1 CÁC ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ DI TRUYỀN CỦA VI SINH VẬT 71 7.2 DI TRUYỀN Ở VIRUT 72 7.3 DI TRUYỀN Ở VI KHUẨN 73 7.3.1 Hiện tượng biến nạp 73 7.3.2 Hiện tượng tải nạp 75 7.3.2.1 Tải nạp không đặc hiệu 75 7.3.2.2 Tải nạp đặc hiệu 75 7.3.3 Hiện tượng tiếp hợp 76 7.4 DI TRUYỀN Ở VI SINH VẬT NHÂN THẬT 78 7.5 ĐỘT BIẾN VÀ SỰ PHÁT SINH ĐỘT BIẾN 79 Chương 8 SINH CẢNH VÀ VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT NƯỚC 81 8.1 SINH CẢNH VÀ SỰ PHÂN BỐ CỦA VI SINH VẬT NƯỚC 81 8.1.1 Sinh cảnh của vi sinh vật nước 81 8.1.2 Sự phân bố của vi sinh vật trong thuỷ vực 82 8.2 VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT TRONG CÁC VÙNG NƯỚC 83 8.2.1 Tham gia phân giải chất hữu cơ trong thủy vực 83 8.2.2 Tham gia các vòng tuần hoàn vật chất trong thuỷ vực 84 8.2.2.1 Vòng tuần hoàn cac bon 84 8.2.2.2 Vòng tuần hoàn oxy 86 8.2.2.3 Vòng tuần hoàn nitơ 86 8.2.2.4 Vòng tuần hoàn lưu huỳnh 87 8.2.3 Vai trò của vi sinh vật trong chuỗi dinh dưỡng của thuỷ vực 88 8.2.4 Tham gia vào sự lắng cặn 89 8.2.5 Vi sinh vật và sự làm bẩn nước 90 8.2.6 Vi sinh vật là các tác nhân gây bệnh trong nước 91 8.2.7 Vi sinh vật và sự tự làm sạch các nguồn nước 91 Chương 9 MẦM BỆNH VI SINH VẬT VÀ CƠ CHẾ BẢO VỆ CỦA VẬT CHỦ 93 9.1 MẦM BỆNH VI SINH VẬT 93 9.1.1 Mầm bệnh vi khuẩn 93 9.1.2 Mầm bệnh nấm 94 9.1.3 Mầm bệnh virut 95 9.2 MIỄN DỊCH HỌC 96 9.2.1 Các loại miễn dịch 96 9.2.1.1 Miễn dịch tự nhiên (bẩm sinh) 96 9.2.1.2 Miễn dịch thu được 96 9.2.2 Các cơ chế miễn dịch trong cơ thể sinh vật 97 9.2.2.1 Miễn dịch do các tế bào đặc biệt 97 9.2.2.2 Kháng nguyên, kháng thể và các phản ứng huyết thanh 98 4
GIỚI THIỆU Vi sinh đại cương là môn học cơ sở cung cấp những kiến thức cơ bản cho sinh viên chuyên ngành nuôi trồng thủy sản và môi trường. Là cơ sở để sinh viên tiếp thu kiến thức các môn học chuyên ngành như bệnh học thủy sản, dinh dưỡng, quản lý môi trường và động thái ao nuôi thủy sản. Để học tốt môn vi sinh đại cương, sinh viên cần phải có kiến thức cơ bản về di truyền, sinh học và sinh hóa học đại cương. Phần lý thuyết của giáo trình được biên soạn tập trung vào hai phần chính là phần vi sinh vật học đại cương và vi sinh vật nước. Nội dung môn học bao gồm những kiến thức về lịch sử quá trình phát sinh và phát triển của ngành vi sinh vật, những thành tựu đã đạt được và những triển vọng của ngành vi sinh vật đối với đời sống và sản xuất. Trọng tâm của môn học đi sâu vào những kiến thức về cấu trúc, chức năng và các hoạt động sống của vi sinh vật. Môn học cũng đề cập đến mối quan hệ giữa vi sinh vật với các yếu tố môi trường và vai trò của vi sinh vật trong môi trường nước. Phần tài liệu tham khão sử dụng để xây dựng giáo trình được trình bày sau mỗi chương. Sinh viên có thể tìm thấy các tài liệu này từ thư viện trung tâm hay thư viện Khoa Thuỷ sản. Phần thực hành vi sinh vật học cung cấp những kiến thức hỗ trợ cho phần lý thuyết và cũng là cơ sở để sinh viên tiếp cận các phương pháp cơ bản trong phân tích và nghiên cứu vi sinh vật dùng trong các chuyên ngành môi trường và nuôi trồng thủy sản. 5
Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 VI SINH VẬT VÀ VI SINH VẬT HỌC Vi sinh vật học là ngành khoa học chuyên nghiên cứu về vi sinh vật bao gồm: (1) cấu tạo và đời sống của vi sinh vật; (2) đa dạng sinh học và sự tiến hoá của vi sinh vật và (3) vai trò của vi sinh vật trong tự nhiên nhất là trong đời sống của động, thực vật và con người. Vi sinh vật là các sinh vật có kích thước rất nhỏ muốn thấy rõ được chúng người ta phải sử dụng tới kính hiển vi. Vi sinh vật thường đo bằng micromet (µm) hoặc bằng nanomet (nm). Các vi sinh vật thường là đơn bào hoặc đa bào nhưng có cấu trúc đơn giản và rất kém phân hoá. Khác với các tế bào động vật và thực vật, các tế bào vi sinh vật có khả năng sống, phát triển và sinh sản một cách độc lập trong tự nhiên (hình 1). Hình 1. Cơ thể sinh vật như cây (a) và súc vật (b) có cấu tạo từ nhiều tế bào. Vi sinh vật là những sinh vật đơn bào (c & d). Trong hệ thống phân loại tổng quát, vi sinh vật được chia thành các nhóm là vi sinh vật nhân nguyên thủy (gồm có vi khuẩn, xạ khuẩn, vi khuẩn lam và vi khuẩn nguyên thủy); vi sinh vật nhân thật (gồm có vi nấm, tảo và một số nguyên sinh động vật); và virút (virút là nhóm vi sinh vật đặc biệt chưa có cấu tạo tế bào và là các vi sinh vật có mức độ tiến hoá thấp nhất). 6
Các môn học chuyên sâu thuộc ngành vi sinh vật học được phân chia theo từng nhóm vi sinh vật riêng biệt bao gồm virút học, vi khuẩn học, nấm học, tảo học và ký sinh trùng học. Các chuyên ngành nghiên cứu những tính chất riêng biệt của vi sinh vật bao gồm tế bào học, phân loại học, sinh lý học, sinh hóa học, di truyền học vi sinh vật, v.v. Vi sinh vật học có chuyên ngành ứng dụng ở rất nhiều lảnh vực như vi sinh học y học, vi sinh học công nghiệp, vi sinh học thực phẩm, vi sinh học thú y, bệnh lý thực vật, vi sinh học đất, vi sinh học nước, vi sinh học không khí, v.v. 1.2 VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT TRONG TỰ NHIÊN VÀ ĐỐI VỚI ĐỜI SỐNG CON NGƯỜI Vi sinh vật phân bố ở khắp mọi nơi trên trái đất và rất đa dạng về chủng loài. Tuy nhỏ bé nhất trong sinh giới nhưng năng lực hấp thu và chuyển hóa của vi sinh vật vượt xa các sinh vật bậc cao và chúng có tốc độ tăng trưởng và sinh sôi nảy nở cực kì lớn. Trong quá trình tiến hóa lâu dài vi sinh vật đã tạo cho mình những cơ chế điều hòa trao đổi chất để thích ứng được với những điều kiện sống rất bất lợi. Năng lực thích ứng của vi sinh vật vượt rất xa so với động vật và thực vật. Vi sinh vật rất dễ phát sinh biến dị bởi vì thường là đơn bào, đơn bội, sinh sản nhanh, số lượng nhiều, tiếp xúc trực tiếp với môi trường sống. Do vậy mà vi sinh vật có vai trò quan trọng trong thiên nhiên cũng như trong hoạt động sống của con người. Trong nông nghiệp, vi sinh vật sống trong đất và trong nước tham gia tích cực vào quá trình phân giải các xác hữu cơ thành CO2 và các hợp chất vô cơ dùng làm thức ăn cho cây trồng và các sinh vật khác. Các vi sinh vật cố định nitơ thực hiện việc biến khí nitơ trong không khí thành hợp chất nitơ cung cấp cho cây cối. Vi sinh vật còn có khả năng phân giải các hợp chất khó tan chứa P, chứa K, chứa S và tạo ra các vòng tuần hoàn trong tự nhiên. Vi sinh vật tham gia tích cực trong quá trình hình thành chất mùn. Vi sinh vật là nguồn thức ăn tự nhiên quan trọng trong các thủy vực, là thành phần chủ yếu của các chế phẩm sinh học dùng cho việc quản lý môi trường nuôi thuỷ sản. Một số nhóm vi khuẩn có tác dụng rất lớn trong các hệ thống lọc sinh học. Trong công nghệ thực phẩm, vi sinh vật là lực lượng sản xuất trực tiếp của công nghiệp lên men. Vi sinh vật sinh ra rất nhiều sản phẩm trao đổi chất khác nhau trong số đó có nhiều sản phẩm đa được sản xuất lớn ở qui mô công nghiệp như men bánh mì, rượu etilic, riboflavin, vitamin B2, penixilin, streptomixin, oxitetraxilin Trong các nguồn năng lượng mà con người có thể khai thác mạnh mẽ trong tương lai có năng lượng thu từ khối lượng chất sống của vi sinh vật. Vi sinh vật là động lực để vận hành các bể sinh khí sinh học. Vi sinh vật có vai trò quan trọng trong việc phân giải các phế thải nông nghiệp, phế thải đô thị, phế thải công nghiệp chúng đóng vai trò hết sức quan trọng trong việc bảo vệ môi trường. Tuy nhiên, có không ít các vi sinh vật gây bệnh cho người, gia súc, gia cầm, tôm cá và cây trồng. Một số vi sinh vật gây ô nhiễm môi trường. Một số khác hư hao hoặc biến chất lương thực, thực phẩm, nguyên liệu, vật liệu, hàng hóa hay sản sinh các độc tố. 7
1.3 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT HỌC Từ cổ xưa, mặc dù chưa nhận thức được sự tồn tại của vi sinh vật, con người đã có kinh nghiệm trong việc lợi dụng các vi sinh vật có ích và phòng tránh các vi sinh vật có hại trong đời sống và sản xuất như nấu rựu, muối dưa, ủ phân. Ngay từ trước Công nguyên đã có những tài liệu đề cập đến bản chất sống của các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm. Dần dần con người nhận ra sự có mặt của những sinh vật rất nhỏ không thể nhìn thấy bằng mắt thường, nhưng cho đến năm 1664 điều này mới được xác định khi Robert Hooke (1635- 1703) lần đầu tiên mô tả các tế bào nấm mốc được quan sát dưới kính hiển vi (hình 2). (a) (b) Hình 2. (a) Kính hiển vi do R. Hook sử dụng mô tả các tế bào nấm mốc; (b) Tế bào nấm mốc mọc trên bề mặt da thuộc. Người đầu tiên nhìn thấy và mô tả chi tiết hình thái nhiều loại vi sinh vật là Anton van Leeuwenhoek (1632-1723) người Hà Lan. Ông là người đầu tiên chế tạo ra những kính hiển vi thô sơ trong đó có những cái có thể phóng đại từ 270-300 lần và Ông đã lần lượt quan sát mọi thứ chung quanh mình và đã nhìn thấy vi khuẩn và ký sing trùng. Tất cả các quan sát và miêu tả của ông đã được xuất bản vào năm 1684 (hình 3). b c Hình 3. (a) Kính hiển vi của Leeuwenhoek; (b) Hình vẽ vi khuẩn xuất bản năm a 1864; (c) Tiêu bản máu của người chụp dưới kính hiển vi của Leeuwenhoek. Những quan sát của Leeuwenhoek được nhiều người khác tiếp tục khẳng định. Tuy nhiên vào thời kỳ này quá trình tìm hiểu về vi sinh vật và tầm quan trọng của chúng trong tự nhiên tiến triển rất chậm. Chỉ tới đầu thế kỹ thứ 19 cùng với sự ra đời của những chiếc kính hiển vi quang học hoàn chỉnh, nghiên cứu về vi sinh vật mới có những bước phát triển rỏ rệt. 8
Người khai sinh ra ngành vi sinh vật học thực nghiệm là nhà khoa học người pháp Louis Pasteur (1822-1895). Ông đã chứng minh vi sinh vật không phải tự sinh ra (ngẫu sinh) bằng các thí nghiệm nổi tiếng với các bình cầu cổ cong (hình 4). Hình 4. Thí nghiệm của Louis Partuer chứng minh vi sinh vật không phải tự sinh ra. Ông nhận giải thưởng đặc biệt của Viện Hàn Lâm Khoa học Pháp (1862) về việc phủ nhận học thuyết tự sinh và chứng minh sự có mặt của vi sinh vật trong không khí. Các biện pháp vô trùng trong vi sinh vật học đặc biệt là trong y học và công nghệ thực phẩm đã được phát triển trên cơ sở các thí nghiệm của Ông. Pastuer đã có rất nhiều cống hiến cho vi sinh vật học, nông nghiệp và y học. Nổi bậc nhất là việc việc phát triển vacxin phòng bệnh than, vacxin ngừa bệnh chó dại. Ông là người đầu tiên chứng minh cơ sở khoa học của việc chế tạo vacxin. Tiếp theo Pastuer, nhà bác học Đức Robert Koch (1843-1910) là người có công lớn trong việc phát triển các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật. Ông là người đầu tiên nuôi vi khuẩn bệnh than bên ngoài cơ thể sinh vật và chứng minh vi sinh vật là tác nhân gây bệnh. 9
R. Koch quan sát thấy vi khuẩn gây bệnh than Bacillus anthracis (hình 5) luôn có trong máu của bò bị bệnh. Ông lấy một ít máu tiêm vào chuột khoẻ thì thấy chuột cũng bị bệnh than và chết. Ống lại lấy máu từ con chuột bị bệnh tiêm vào con chuột khoẻ khác. Sau vài lần lập lại như vậy Ông đã có thể tái phân lập được vi khuẩn gây bệnh mà Ông lấy từ con chuột chết vì bệnh than. R. Koch là người đầu tiên chứng minh rằng mỗi loại vi khuẩn gây nên một loại bệnh đặc thù. Hình 5. Ảnh chụp Bacillus anthracis của Robert Koch. Năm 1884, R. Koch đưa ra 4 nguyên tắc về tác nhân gây bệnh (hình 6) mà cho đến ngày nay vẫn còn được áp dụng là nguyên tắc chuẩn để chứng minh khả năng gây bệnh đặc trưng của một loài vi sinh vật nào đó. Các nguyên tắc đó là: 1. Tác nhân gây bệnh phải luôn được tìm thấy trên sinh vật bị nhiễm bệnh nhưng không có ở sinh vật khỏe 2. Tác nhân gây bệnh phải được nuôi trong điều kiện thực nghiệm bên ngoài cơ thể sinh vật 3. Tác nhân gây bệnh phải có khả năng gây bệnh khi gây nhiễm vào con vật mẫn cảm 4. Tác nhân gây bệnh phải được xác định từ kết quả tái phân lập. Các nguyên tắc này là cơ sở khoa học cho việc phòng và trị các bệnh truyền nhiễm có ý nghĩa quan trọng về mặt lâm sàng nhất là trong y học và thú y. 10
Hình 6. Nguyên tắc về tác nhân gây bệnh của R. Koch. Năm 1882, R. Koch công bố công trình khám phá ra vi trùng gây bệnh lao (hình 7e) và đặt tên vi trùng này là Mycobacterium tuberculosis. Ngoài ra, ông còn tìm ra phương pháp phân lập thuần khiết vi sinh vật trên các môi trường đặc (hình 7 a-d) và đã phát hiện ra phương pháp nhuộm màu vi sinh vật. Ông được nhận giải Nobel y học vào năm 1905. Học trò của R. Koch là Juliyes Richard Petri (1832-1921) đã phát kiến ra loại hộp lồng làm bằng thuỷ tinh còn gọi là đĩa petri. Nhà khoa học Hà Lan Martinus Bijerinck (1851–1931) là người tìm ra phương pháp nuôi tăng sinh bằng môi trường chọn lọc và là người đầu tiên phân lập nhiều loài vi sinh vật trong đất và nước trong đó có vi khuẩn cố định đạm hiếu khí Azotobacter (1901), vi khuẩn nốt sần Rhizobium (1888), vi khuẩn lên men butilic, vi khuẩn phân giải pectin và nhiều nhóm vi khuẩn khác. Nhà khoa học Pháp gốc Nga Sergei Winogradsky (1856– 1953) là người đầu tiên phát hiện ra vi khuẩn sắt (1880), vi khuẩn lưu huỳnh (1887), vi khuẩn nitrat hoá (1890). 11
(e) Hình 7. (a-d) mẻ cấy thuần; (e) vi trùng lao Nhà sinh lí thực vật Nga D. Ivanovskii (1864–1920) và M. Bijerinck là những người đầu tiên chứng minh có sự tồn tại của vi sinh vật nhỏ hơn vi khuẩn, qua được lọc bằng sứ xốp. Năm 1892 ông chứng minh các sinh vật siêu hiển này gây ra bệnh khảm ở thuốc lá. Các vi sinh vật nhỏ bé này được gọi là virut. Người đầu tiên phát hiện ra chất kháng sinh là bác sĩ người Anh Alexander Fleminh (1881– 1955). Năm 1928, Ông tách được chủng nấm sinh chất khánh sinh penixilin, mở ra một kỉ nguyên mới cho khả năng đẩy lùi nhanh chóng các bệnh nhiễm khuẩn. Hàng loạt các chất khánh sinh quan trọng khác liên tiếp được phát hiện và được ứng ứng dụng vào các năm tiếp theo. 12
Năm 1897, Eduerd Buchner (1860–1917) lần đầu tiên chứng minh được vai trò của enzim trong quá trình lên men rượu. Ông đã nghiền nát tế bào nấm men bằng cát thạch anh và lấy chất dịch vô bào chiết rút từ men đưa vào một dung dịch chứa 37% đường, sau nữa giờ đã bắt đầu thấy sản sinh CO2 và rượu etylic. Khoa học về enzim hình thành và phát triển nhờ vào hành loạt các thành công tiếp theo. Tính đến năm 1984 người ta đã biết đến 2477 loại Enzim khác nhau và enzim đã có mặt trong rất nhiều hoạt động sản xuất và đời sống của con người. Công nghệ enzym đã trở thành một trong các mủi nhọc của công nghệ sinh học. Các nhà vi sinh vật còn tạo ra bước ngoặc của di truyền học như chứng minh quá trình biến nạp gen được thực hiện thông qua ADN và vai trò của axitnucleic trong việc chuyển giao thông tin di truyền ở virút. Hiểu biết về cấu trúc, chức năng vá các qui luật vận động của vật liệu di truyền đã giúp các nhà khoa học có thể tạo ra các cơ thể hoàn toàn mới lạ một cách chủ động nhờ mang gen tái tổ hợp. Các chủng vi sinh vật được tạo ra nhờ thao tác di truyền có mặt trong đời sống con người ở nhiều lĩnh vực khác nhau như lương thực, thực phẩm, thuốc men và bảo vệ môi trường. Tài liệu tham khảo: 1. Madigan, M.T., Martinko, J.M. and Parker, J., 2002. Biology of Microorganisms. Tenth edition, Prenhall. 2. Phạm Văn Kim, 2001. Giáo trình vi sinh đại cương. Khoa Nông nghiệp, Đại học Cần thơ. 3. Nguyễn Lân Dũng, 2000. Vi Sinh Vật học. Nhà xuất bản giáo dục. 4. y: A brief history of microbiology. 13
Chương 2 VI SINH VẬT NHÂN NGUYÊN Vi sinh vật nhân nguyên là nhóm vi sinh vật không có màng nhân được chia làm hai nhóm chính là nhóm vi khuẩn thật và nhóm vi khuẩn cổ. 2.1 VI KHUẨN THẬT Bao gồm những nhóm chủ yếu là vi khuẩn, xạ khuẩn, vi khuẩn lam và nhóm vi khuẩn nguyên thủy Mycoplatma, Ricketxi và Clamydia. 2.1.1 Vi khuẩn 2.1.1.1 Kích thước và hình dạng Đường kính của vi khuẩn dao động từ 0,2-2,0 μm, chiều dài cơ thể khoảng 2,0-8,0 μm. Vi khuẩn có ba hình dạng chủ yếu là hình cầu, hình que và hình xoắn. (a) (b) (c) (d) (e) 14
Hình 8. (a) Các dạng cầu khuẩn, (b) Cầu khuẩn Enterococcus faecium, (c) liên cầu khuẩn Streptococcus, (d) Song cầu khuẩn Diplococcus, (e) tứ cầu khuẩn, (f) tụ cầu khuẩn Staphylococcus. (f) Ở vi khuẩn hình cầu (cầu khuẩn) tùy theo phương hướng của mặt phẳng phân cắt và cách liên kết mà ta có song cầu khuẩn, liên cầu khuẩn, tứ cầu khuẩn hay tụ cầu khuẩn (hình 8). Vi khuẩn hình que (trực khuẩn) cũng có dạng đơn, dạng đôi hay dạng chuỗi (hình 9). Ở vi khuẩn hình xoắn (còn gọi là xoắn khuẩn) có các dạng hình dấu phẩy (phẩy khuẩn), hình xoắn thưa (xoắn khuẩn), hình xoắn khít (xoắn thể) (hình 10). Ngoài ra còn các hình dạng khác như hình khối vuông, khối tam giác, vi khuẩn dạng sợi. b c a Hình 9. (a) Các dạng trực khuẩn, (b) trực khuẩn E. coli, (c) trực khuẩn dạng chuỗi. b a 15
Hình 10. (a) Các dạng xoắn khuẩn, (b) phẩy khuẩn Vibrio cholera, (c) xoắn khuẩn Spirillum (d) xoắn thể Spirochete. c d 2.1.1.2 Cấu tạo tế bào Về mặt cấu trúc, tế bào vi sinh vật nhân nguyên chia thành ba phần (hình 11). Phần vỏ bao gồm bao nhày, thành tế bào và màng tế bào chất. Phần tế bào chất bao gồm hệ gen của tế bào, ribosom và các thành phần khác. Phần gắn vào mặt ngoài tế bào có tiên mao và khuẩn mao. Hình 11. Sơ đồ cấu trúc của tế bào vi sinh vật nhân nguyên. 2.1.1.2.1 Tiên mao Tiên mao (roi) là những sợi lông dài mọc ở mặt ngoài của vi khuẩn có tác dụng giúp cho chúng di chuyển trong môi trường lỏng. Đường kính của tiên mao thường là khoảng 20nm nên không thể quan sát dưới kính hiển vi thường. 16
Vi khuẩn có thể có hoặc không có tiên mao, số lượng và vị trí gắn của tiên mao trên tế bào vi khuẩn có giá trị trong phân loại và định tên vi khuẩn. Các vị trí của tiên mao có thể là (hình 12b): - không có tiên mao: vi khuẩn vô mao - roi mọc ở cực: (1) mọc ở một cực (một roi hoặc chùm roi); (2) mọc ở hai cực (một roi hoặc chùm roi) - mọc khắp xung quanh bề mặt tế bào - mọc từ giữa tế bào a b Hình 12. (a) Cấu tạo tiên mao vi khuẩn; (b) Các vị trí khác nhau của tiên mao trên tế bào vi khuẩn. Tiên mao của vi khuẩn (hình 12a) có các phần chủ yếu là: (1) thể gốc xuất phát từ lớp ngoại nguyên sinh chất, phía bên trong màng nguyên sinh chất, gồm một trụ nhỏ gắn với 4 đĩa tròn có dạng vòng kí hiệu là L, P S và M; (2) bao bọc bên ngoài tiên mao ở phần phía ngoài lớp LPS là một bao hình móc và (3) các sợi tiên mao. Tiên mao hoạt động theo cách quay như kiểu vặn nút chai. Nhờ các phản ứng hoá học mà các vòng của thể gốc có thể làm quay tiên mao. Bao hình móc giữ cho sợi tiên mao quay đều đặn quanh một trục dọc. Khả năng di động của vi khuẩn là một trong những chỉ tiêu cơ bản dùng trong định danh và chẩn đoán vi khuẩn. Các phương pháp dùng để quan sát khả năng di động của vi khuẩn bao gồm: (1) nhuộm tiên mao để quan sát vị trí và số lượng tiên mao; (2) quan sát khả năng di động trên môi trường đặc và (3) quan sát trực tiếp vi khuẩn sống trên tiêu bản tươi. Tốc độ và kiểu di động của vi khuẩn khác nhau tuỳ theo loài và vị trí của tiên mao. Tuy nhiên kiểu di động của vi khuẩn trong môi trường lỏng còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác. Có khi hoàn toàn là ngẫu nhiên nhưng có trường hợp là để tìm đến hay tránh khỏi một yếu tố nào đó. Ví dụ như vi khuẩn tìm đến nguồn thức ăn, chổ có ánh sáng, tránh chổ 17
có axít hoặc có hoá chất độc hại. Điều này cho thấy vi khuẩn có tiên mao có nhiều lợi thế về mặt sinh thái để tồn tại hơn là vi khuẩn không có tiên mao. 2.1.1.2.2 Khuẩn mao Khuẩn mao là những sợi lông rất ngắn (7-9nm), rỗng giữa (đường kính 2-2.5nm), số lượng rất nhiều (250-300 sợi/tế bào), bản chất protein mọc trên bế mặt tế bào vi khuẩn (hình 13). Vi khuẩn G- thường có khuẩn mao, tuy nhiên một số vi khuẩn G+ và vi khuẩn cổ cũng có khuẩn mao. Khuẩn mao có chức năng giúp cho vi khuẩn báo giữ vào bề mặt cơ chất. Khuẩn mao còn giúp cho tế bào tăng bề mặt hấp thu chất dinh dưỡng. Hình 13. Khuẩn mao của vi khuẩn Mỗi vi khuẩn còn có 1-4 khuẩn mao giới tính có công dụng làm cầu nối để chuyển những đoạn ADN từ tế bào này sang tế bào khác. Khuẩn mao giới tính còn là thụ thể để cho các thể thực khuẩn. 2.1.1.2.3 Bộ phận bao che tế bào Bao che bên ngoài tế bào vi khuẩn có hai lớp màng chính, từ ngoài vào trong lần lượt là thành tế bào và màng nguyên sinh chất. Một số lớn vi khuẩn còn có một lớp dịch nhày bao bọc bên ngoài thành tế bào. 18
2.1.1.2.4 Bao nhày Hầu hết vi khuẩn đều có một lớp vật chất dạng keo bên ngoài thành tế bào được gọi là bao nhày (hình 14). Phần lớn thành phần hoá học của bao nhày là nước (98%) và polisaccarit, ngoài ra còn có polipeptit và protein. Bao nhày thường có chiều dày lớn hơn 0.2μ nên có thể nhìn thấy dưới kính hiển vi thường Hình 14. Bao nhày của cầu khuẩn khi nhuộm bằng mực tàu. Nếu chiều dày nhỏ nhuộm với mực tàu. hơn 0.2μ thì được gọi là bao nhày mỏng phải quan sát bằng kính hiển vi điện tử mới thấy được. Bao nhày có công dụng bảo vệ vi khuẩn tránh bị thương tổn khi khô hạn, tránh khỏi hiện tượng thực bào của bạch cầu và là nơi tích lũy chất dinh dưỡng của vi khuẩn. 2.1.1.2.5 Thành tế bào Thành tế bào vi khuẩn có chiều dày khác nhau tùy theo loài dao động từ 10-18nm. Thành tế bào có chiếm trọng lượng từ 10-20% trọng lượng khô của vi khuẩn. Cấu tạo hoá học của thành tế bào bao gồm hai chất dị cao phân tử là polisacarit và peptidoglycan. Thành tế bào có độ rắn chắc nhất định để duy trì hình dạng của tế bào, cần thiết cho quá trình phân cắt bình thường của tế bào và bảo vệ tế bào đối với một số điều kiện bất lợi như giúp tế bào đề kháng với các lực tác động bên ngoài. Vi khuẩn có thể chịu được áp suất thẩm thấu từ 10-25 atm. Thành tế bào cho phép các chất dinh dưỡng đi qua nhưng lại có thể ngăn cản sự xâm nhập của một số chất có hại đối với tế bào như thuốc nhuộm, một số chất kháng sinh, muối mật, muối kim loại nặng, một số enzim phân giải. Thành tế bào của vi khuẩn có liên quan mật thiết đến tính tính gây bệnh cũng như tính mẩn cảm với thể thực khuẩn và cũng là nơi quan trọng nhất tương tác với các chất kháng sinh. Thành phần cấu tạo của thành tế bào của vi khuẩn rất phức tạp và cũng rất riêng biệt so với các sinh vật khác. Nhờ phương pháp nhuộm Gram do nhà do nhà vi khuẩn học Đan Mạch Hans Chistian Gram (1853-1938) phát minh ra từ năm 1884, vi khuẩn được phân biệt thành hai nhóm lớn là vi khuẩn Gram dương (G+) và vi khuẩn Gram âm (G-) (hình 15). Hình 15. Sơ đồ cấu tạo thành tế bào của vi khuẩn 19
Thành tế bào của vi khuẩn G+ cấu tạo bởi lớp peptidoglycan dày bao bên ngoài màng tế bào chất. Axit teicoic là một thành phần đặc trưng của tế bào vi khuẩn G+. Trong khi vi khuẩn G- lại không có axit teicoic. Do tích điện âm Axit teicoic giúp cho việc vận chuyển các ion dương vào, ra tế bào và giúp tế bào dự trữ photphat. Ngoài ra axit teicoic còn liên quan đến kháng nguyên bề mặt và tính gây bệnh của một số vi khuẩn G+. Chúng còn gọi là thụ thể hấp phụ đặc biệt đối với một số thể thực khuẩn. Hình 16. Sơ đồ cấu tạo lớp màng ngoài, thành tế bào và màng tế bào chất của vi khuẩn G- Vi khuẩn G- có thành tế bào với cấu trúc khá phức tạp. Trong cùng là một lớp PG mỏng. Cách một lớp không gian chu chất là lớp màng ngoài. Màng ngoài có cất trúc gần giống với màng tế bào chất nhưng photpholipit hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn lớp ngoài là lipopolisaccarit (LPS). LPS dầy khoảng 8-10nm có chứa lipit A là nội độc tố của vi khuẩn. Lớp LPS ở vi khuẩn G- còn có chứa kháng nguyên O quyết định nhiều đặc tính huyết thanh của các vi khuẩn có chứa LPS và là vị trí gắn (thụ thể) của thể thực khuẩn. Đặc biệt, màng ngoài của một số vi khuẩn G- còn có một số loại protein bao gồm protein cơ chất, protein màng ngoài và lipoprotein. Các protein ở vi khuẩn G- đã được chứng minh là có khả năng chống lại sự tấn công của các vi khuẩn khác (hình 16). Ở vi khuẩn G- và G+ đều có lớp không gian chu chất nằm ở giữa thành tế bào và lớp màng tế bào chất. Ngoài ra, ở giữa lớp màng ngoài và lớp PG mỏng ở thành tế bào chất của cả vi khuẩn G- cũng có một lớp không gian chu chất. Trong lớp này có nhiều thành phần như proteinaza, nucleaza, protein vận chuyển qua màng, protein thụ thể làm chổ bám của thể thực khuẩn). Thành tế bào vi khuẩn G+ có thể bị phá hủy hoàn toàn để trở thành thể nguyên sinh khi chịu tác động của lizozim (có trong lòng trắng trứng, nước mắt, nước muối, đuôi của thể thực khuẩn. Thành phần tế bào vi khuẩn G- có sức đề kháng lớn hơn với lizozim do đó bị phá hủy ít hơn. 2.1.1.2.6 Màng tế bào chất Màng tế bào chất có chiều dầy khoảng 5-10nm và chiếm khoảng 10-15% trọng lượng tế bào. Màng nguyên sinh chất có cấu tạo bởi 2 lớp photpholipit (PL), chiếm khoảng 30-40 % khối lượng màng và các protein nằm phía trong, phía ngoài hay xuyên qua màng chiếm 60-70 % khối lượng màng (hình 17). Mỗi phân tử PL chứa một đầu tích điện phân cực (đầu photphat) và một đuôi không tích điện, không phân cực (đầu hidrocacbon). Đầu phân cực tan trong nước nằm phía trong. Đầu photphat còn gọi là đầu háo nước, đầu 20
hidrocacbon còn gọi là đầu kị nước. Các PL trong màng làm màng hóa lỏng và cho phép các protein di động tự do. Sự hóa lỏng động học này là cần thiết cho các chức năng của màng. Cách sắp sếp của PL và protein như vậy gọi là mô hình khảm lỏng. Hình 17. Sơ đồ cấu tạo màng tế bào chất của vi khuẩn Màng nguyên sinh chất có các chức năng sau: - Khống chế sự vận chuyển trao đổi ra, vào tế bào của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất. - Duy trì một áp suất thẩm thấu bình thường bên trong tế bào. - Là nơi sinh tổng hợp của các thành phần tế bào (peptidoglycan, LPS, axit teicoic) và các polime của vỏ nhầy. - Là nơi tiến hành các quá trình photphoryl oxi hóa và photphoryl quang hợp. - Là nơi tổng hợp nhiều loại enzim như β-galactozidaza, các enzim liên quang đến tổng hợp thành tế bào, vỏ nhầy, các protein của chuỗi hô hấp. - Cung cấp năng lượng cho sự vận động của tiêm mao 2.1.1.2.7 Tế bào chất Tế bào chất là thành phần chủ yếu của tế bào vi khuẩn. Thành phần hoá học chủ yếu của tế bào chất là lipoprotein. Trong tế bào chất có chứa ribosome, mesosome, không bào các hạt chất dự trữ, các hạt sắc tố và thể nhân của vi khuẩn. Tế bào chất có ba nhiệm vụ chính: - Tạo ra các phân tử ban đầu hoặc các chất liệu kiến trúc cần thiết cho quá trình tổng hợp của tế bào - Cung cấp năng lượng cho tế bào và - Chứa đựng các chất bài tiết của tế bào. 21
2.1.1.2.8 Thể nhân Thể nhân là cơ sở vật chất chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn. Thể nhân của vi sinh vật nhân nguyên chưa có màng nhân nên còn được gọi là nhân sơ hay nhân nguyên thuỷ. Thể nhân có hình dạng bất định và là một nhiễm sắc thể duy nhất có cấu tạo bởi một sợi ADN xoắn kép. Hình 18. Thể nhân của vi khuẩn Ngoài ra, đa số vi khuẩn còn có chứa ADN kép dạng vòng kín nằm ngoài nhiễm sắc thể được gọi là plasmid (hình 18). Plasmid thường chứa từ 2-30 gen và có khả năng sao chép độc lập. 2.1.1.2.9 Nha bào Nha bào là bộ phân lưu tồn đặc biệt, được hình thành ở những giai đoạn phát triển nhất định của một số loài vi khuẩn G+ phần lớn là vi khuẩn hình que. Hai nhóm vi khuẩn chủ yếu có khả năng hình thành nha bào là nhóm vi khuẩn hiếu khí Bacillus có trong đất và nhóm vi khuẩn kị khí Clostridium có trong đất, chất mùn và trong ruột của động vật. Ngoài ra một số cầu khuẩn, phẩy khuẩn và xoắn khuẩn cũng có khả năng sinh nha bào. Nha bào không thấm nước và thường được phân biệt dựa trên vị trí của chúng trong tế bào vi khuẩn trước khi chúng được phóng thích ra ngoài. Các vị trí này có thể nằm ở giữa, hoặc ở một phía của tế bào (hình 19). Ngoài ra người ta còn căn cứ vào sự trương to của tế bào mẹ lúc chứa các nha bào. Hình19. Nha bào ở vi khuẩn bacillus. 22
Cấu tạo của nha bào gồm nhiều lớp màng bao bọc. Ngoài cùng là lớp màng ngoài, kế đến là vỏ của nha bào có nhiều lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan. Tiếp theo là lớp màng trong và trong cùng là lớp tế bào chất chỉ chứa hệ gen và một số ít ribosom và enzym (hình 20). Nha bào không có nhiệm vụ sinh sản mà có khả năng đề kháng được với những điều kiện môi trường khắc nghiệt như nhiệt độ cao, tính axit cao, bức xạ, hóa chất và các chất tẩy trùng. Nha bào có thể tồn tại rất lâu trong trong điều kiện bất lợi và sẽ trở về trạng thái sinh vật bình thường khi điều kiện thích hợp. Một số vi khuẩn hình thành nha bào là tác nhân gây bệnh ở động vật do chúng sản sinh độc tố. Điển hình là vi khuẩn Bacillus anthracis (hình 20) gây bệnh than ở bò và bệnh có thể lây sang người. Vi khuẩn Clostridium botulinum có khả năng gây ngộ độc thực phẩm. Vi khuẩn Clostridium tetani gây bệnh uốn ván. Hình 20. Cấu trúc của nha bào dưới kính hiển vi điện tử 2.1.2 Xạ khuẩn Xạ khuẩn là nhóm lớn vi khuẩn G+, hiếu khí, sống hoại sinh và có cấu tạo dạng sợi phân nhánh. Xạ khuẩn phân bố rất rộng rãi trong đất, tham gia vào quá trình chuyển hoá tự nhiên của nhiều hợp chất trong đất. Xạ khuẩn có thể sinh ra nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng, đặc biệt là chất kháng sinh. Khoảng 80% thuốc kháng sinh đã biết có đến 80% từ xạ khuẩn. Trong đó quan trọng nhất là kháng sinh thuộc nhóm tetracyclines, macrolides và aminoglycosides. Xạ khuẩn còn có khả năng sinh ra các enzim, một số vitamin thuộc nhóm B và axit hữa cơ. Hai nhóm xạ khuẩn quan trọng là tác nhân gây bệnh ở người là Mycobacterium tuberculosis gây bệnh lao và Corynebacterium diphtheriae gây bệnh bạch hầu. Một số xạ khuẩn thuộc nhóm Mycobacteria và Corynebacteria sống cộng sinh ở động vật. Trước đây xạ khuẩn được xếp chung nhóm với nấm do chúng có hình thức phát triển dạng sợi phân nhánh (hình 21). Ngày nay xạ khẩn được xếp vào nhóm vi khuẩn thật do chúng có nhiều đặc điểm giống với vi khuẩn và khác với nấm như sau: (1) có giai đoạn đa bào và đơn bào; (2) kích thước rất nhỏ; (3) thể nhân là nhân nguyên thủy; (4) vách tế bào không chứa celluloze hoặc kitin; (5) không có giới tính và (6) sống hoại sinh hoặc ký sinh. 23
Hình 21. Các hình thức phát triển hệ sợi ở xạ khuẩn. 2.1.3 Vi khuẩn lam Là nhóm vi sinh vật nhân nguyên thuộc vi khuẩn thật có cấu tạo gần gũi với cấu tạo của vi khuẩn G-. Trước đây vi khuẩn lam được gọi là tảo lam hay tảo lam lục. Vi khuẩn lam khác biệt rất lớn với tảo ở những đặc điểm: vi khuẩn lam không có lục lạp, không có nhân thực, có riboxom 70S, thành tế bào có chứa peptidoglican. Vi khuẩn lam có khả năng tự dưỡng quang năng nhờ chứa sắc tố quang hợp là chất diệp lục a, caroten β và các sắc tố phụ. Bộ phận thực hiện quá trình quang hợp trong tế bào vi khuẩn lam được gọi là tilacoit. Vi khuẩn lam phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Đại bộ phận vi khuẩn lam sống trong nước ngọt và tạo thành thực vật phù du của các thủy vực. Một số phân bố trong những vùng nước mặn giàu chất hữu cơ hoặc trong nước lợ. Một số sống cộng sinh. Nhiều vi khuẩn lam có khả năng cố định nitơ và có sức đề kháng cao với các điều kiện bất lợi cho nên có thể gặp vi khuẩn lam trên các bề mặt tảng đá hoặc trong vùng sa mạc, trong các suối nước nóng có nhiệt độ cao tới 87°C trong các vùng biển có nồng độ muối tới 0,7%. Một số vi khuẩn lam sống trong ao hồ thường phát triển mạnh vào mùa hè tạo ra hiện tượng “nước nở hoa”. Khi đó nước có màu xanh xỉn và có mùi vị khó chịu, làm giảm hiện tượng oxi trong nước, làm đối động vật phù du, gây hại cho cá, nhiều khi ảnh hưởng tới nguồn nước cung cấp cho các đô thị, các khu công nghiệp (hình 22). Hình 22. Hiện tượng nước nở hoa ở các ao hồ khi vi khuẩn lam phát triển quá mức Một số vi khuẩn lam vì có giá trị dinh dưỡng cao, có chứa một số hoạt chất có giá trị y học, lại có tốc độ phát triển nhanh, khó nhiễm tạp khuẩn vì thích hợp được với các điều kiện môi trường khá đặc biệt (ví dụ Spirulina thích hợp với pH rất cao) cho nên đã được sản xuất với qui mô công nghiệp để thu nhận sinh khối. Việc nuôi Spirulina từ nước thải của các bể sinh học có thể phát triển rộng lớn ở các vùng nông thôn để vừa góp phần cải thiện điều kiện môi trường sống vừa tạo ra nguồn thức ăn bổ sung cho chăn nuôi hoặc cho nghề nuôi cá tôm. 24
Vi khuẩn lam có hình dạng và kích thước rất khác nhau. Chúng có thể là đơn bào hoặc ở dạng sợi đa bào. Theo hệ thống phân loại của Bergey (1994) thì vi khuẩn lam được xếp vào 5 bộ khác nhau khá rõ rệt về hình thái (hình 23): 1. Bộ Stigonematales (gồm các chi Chlorogloeopsis, Fischerella, Stifonema, Geitleria): đa bào, dạng sợi phân nhánh thực hay phân nhánh lưỡng phân thường có dị tản, nghĩa là có sự phân hóa ngang và thẳng. 2. Bộ Chrococcales (gồm các chi Chamaesiphon, Gloeobacter, Gloeothece): đơn bào hoặc sống thành tập đoàn, sinh sản theo lối chia đôi tế bào. 3. Bộ Pleurocapsales (gồm các chi Dermocarpa, Xenococcus, Dermocarpella, Myxosarcina, Chroococidiopsis): đơn bào phân cắt nhiều lần, có thể tạo thành dạng sợi, thường có dạng tản. 4. Bộ Oscillatoriales (gồm các chi Spirulina, Arthrospira, Oscillatoria, Lyngbya, Pseudanabaena, Starria, Crinalium, microcoleus): đa bào, dạng sợi, không có tế bào dị hình. 5. Bộ Nostocales (gồm các chi Anabaena, Aphanizomenon, Nodularia, Cylindrospermum, Nostoc, Sytonema, Calothrix): đa bào, dạng sợi, có các tế bào dị hình tham gia vào hoạt động cố định nitơ. Gloeocapsa sp. Gloeobacter sp. Pleurocapsa sp. Oscillatoria sp. 25
Lyngbya aestuarii Spirulina subsalsa Anabaena scheremetievi Aphanizomenon flos-aquae Nostoc sp Fischerella Synechococcus Calothrix sp. Hình 23. Một số loài vi khuẩn lam phổ biến 2.1.4 Vi khuẩn nguyên thủy 2.1.4.1 Mycoplasma Mycoplasma là vi sinh vật nguyên thủy không có thành tế bào. Tế bào Mycoplasma được bao bọc bởi một màng đơn có ba lớp, bắt màu G- (hình 24). Kích thước ngang của Mycoplasma khoảng 0.2 - 0.3μm và là sinh vật nhỏ nhất trong sinh giới có đời sống dinh dưỡng độc lập. Khuẩn lạc trên môi trường của micoplasma rất nhỏ (0.1-1,0 mm). Chúng sinh sản theo phương thức cắt đôi. Có thể sinh trưởng trên các môi trường nuôi cấy nhân tạo giàu chất dinh dưỡng. Có thể phát triển cả trong điều kiện hiếu khí lẫn kị khí. Mycoplasma chịu ức chế bởi các chất kháng sinh ngăn cản quá trình sinh tổng hợp protein như: eritromixin, tetraxilin, lincomixin, gentamixin, kanamixin và rất mẫn cảm với các chất kháng sinh nistatin, amphoterixin, candixidin. 26
Một số Mycoplasma có đời sống hoại sinh, thường gặp trong đất, trong nước bẩn, trong phân ủ. Chúng có thể làm nhiễm bẩn các dung dịch dùng để nuôi cấy tổ chức động vật. Mycoplasma pneumoniae là tác nhân gây bệnh viêm màng phổi. Hình 24. Tế bào mycoplasma chụp dưới kính hiển vi điện tử. 2.1.4.2 Ricketxi Ricketxi là vi sinh vật nhân nguyên thủy G- chỉ có thể tồn tại trong tế bào các sinh vật nhân thật. Chúng khác với Mycoplatma ở chổ đã có thành tế bào và không thể sống độc lập trong các môi trường nhân tạo. Tế bào Ricketxi có kích thước thay đổi (0,25 x 1,0 μm; 0,6-1,2 μm; 0,8-2,0 μm) và có hình thái biến hóa (hình que, hình cầu, song cầu, sợi ). Chúng sinh sản bằng phương thức cắt thành hai phần đền nhau. Ricketxi mẫn cảm với các chất kháng sinh như penixilin, tetraxilin, chloramphenicol. Chúng có các chu trình trao đổi năng lượng không hoàn chỉnh và mẫn cảm với nhiệt độ. Chết ở nhiệt độ từ 56°C trở lên sau 30 phút. Ricketxi thường sống ký sinh trên côn trùng và lan truyền bệnh sang người qua các vết thương do côn trùng đốt. Ở người Rickettsia prowalzekii là tác nhân gây bệnh sốt phát ban nguy hiểm. (a) (b) Hình 25. (a) tế bào bị nhiễm Bartonella bacilliformis, (b) tế bào bi nhiễm Ehrlichia canis. 27
2.1.4.3 Clamydia Clamydia là một loại vi khuẩn nguyên thủy G- rất bé nhỏ, có hệ thống enzim không hoàn chỉnh, thiếu các enzim tham gia vào quá trình trao đổi sinh năng lượng, do đó bắt buộc phải ký sinh trong tế bào các sinh vật nhân thật. Sinh sản bằng cách phân cắt thành hai phần bằng nhau. Rất mẫn cảm với các chất kháng sinh và sunphamit. Clamydia mắt hột gây bệnh mắt hột ở người và chuột nhắt có tên là Clamydia trachomatis (hình 26). Hình 26. Thể vùi Clamydia trachomatis bên trong tế bào 2.2 VI KHUẨN CỔ Vi khuẩn cổ là nhóm vi khuẩn lâu đời nhất trong nhóm vi sinh vật nhân nguyên. Chúng có những sai khác rỏ rệt về cấu tạo thành tế bào và đặc tính sinh hóa so với nhóm vi khuẩn thật. Vi khuẩn cổ sống trong các điều kiện môi trường rất đặc biệt mà các sinh vật bình thường không thể chịu đựng được (hình 27). 2.2.1 Vi khuẩn sinh khí mêtan Vi khuẩn sinh metan là vi khuẩn kị khí bắt buộc. Vi khuẩn sinh mêtan thường thấy trong nền đáy các thuỷ vực nước ngọt và lợ mặn, trong đường ruột của động vật và trong các nguồn chất thải động vật. Vi khuẩn mêtan có khả năng sử dụng H2 làm nguồn năng lượng và CO2 làm nguồn cacbon để thực hiện quá trình trao đổi chất. Sản phẩm của quá trình trao đổi chất là khí metan được tích tụ trong môi trường. Vi khuẩn sinh khí mêtan có nhiều tiềm năng được sử dụng để tạo năng lượng sinh học từ chất thải nông nghiệp. 2.2.2 Vi khuẩn ưa mặn Vi khuẩn ưa mặn là nhóm vi khuẩn có thể phát triển ở 4-5M NaCl (khoảng 25%) và ở độ mặn thấp hơn 3M NaCl thì chúng không phát triển được. Thành tế bào, ribosom và các enzim của nhóm vi khuẩn này đều được cân bằng bởi ion Na+. 28
2.2.3 Vi khuẩn ưa nhiệt Vi khuẩn ưa nhiệt là nhóm vi khuẩn đòi hỏi nhiệt độ rất cao (từ 80-105°C) để phát triển. Các enzim và các mang chất ở nhóm vi khuẩn này đều được cân bằng ở nhiệt độ cao. Hầu hết vi khuẩn thuộc nhóm này còn đòi hỏi nguyên tố lưu huỳnh để phát triển. Cho nên nhóm vi khuẩn ưa nhiệt thường xuất hiện ở những nơi có nhiệt độ cao và giàu lưu huỳnh như miệng núi lửa, các thuỷ vực nước nóng hoặc ở đáy các đại dương. Vi khuẩn Sulfolobus acidocaldarius là vi khuẩn ưa nhiệt đầu tiên do Thomas D. Brock, thuộc đại học Wisconsin USA phát hiện năm 1970 cùng với vi khuẩn ưa nhiệt Thermus aquaticus. Các khám phá này đã khởi động các nghiên cứu về lảnh vực sinh học các sinh vật ưa nhiệt. Enzime taq polymerase sử dụng trong các phản ứng trùng hợp (PCR) để khuếch đại ADN được lấy từ vi khuẩn ưa nhiệt Thermus aquaticus có nhiệt độ phát triển thích hợp là 70°C. (a) (b) (c) Hình 27. (a) Vi khuẩn sinh mêtan Methanococcus jannischii, (b) Vi khuẩn ưa mặn Halobacterium salinarium, (c) Vi khuẩn chịu nhiệt Sulfolobus acidocaldarius (bên trái: ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử (X85,000) vi khuẩn có dạng cầu không đều. Bên phải: ảnh chụp dưới kính hiển vi huỳnh quang cho thấy vi khuẩn bám vào các tinh thể lưu huỳnh. Tài liệu tham khảo: 1. Kenneth Todar, 2003. Major groups of prokaryotes. Department of Bacteriology. University of Wisconsin-Madison. 2. Kenneth Todar, 2003. Structure and function of procaryotic cells. Department of Bacteriology. University of Wisconsin-Madison. 3. Gary E. K., 2002. Microbiology learning object 1: Introduction to microbiology, the prokaryotic cell (bacteria) and the eukaryotic cell. 4. Madigan, M.T., Martinko, J.M. and Parker, J., 2002. Biology of Microorganisms. Tenth edition, Prenhall. 5. Phạm Văn Kim, 2001. Giáo trình vi sinh đại cương. Khoa Nông nghiệp, Đại học Cần thơ. 6. Nguyễn Lân Dũng, 2000. Vi Sinh Vật học. Nhà xuất bản giáo dục. 29
Chương 3 VI SINH VẬT NHÂN THẬT Vi sinh vật nhân thật bao gồm các vi sinh vật có nhân rỏ rệt. Các nhóm vi sinh vật có nhân thật bao gồm vi nấm, vi tảo và một số nguyên sinh động vật. 3.1 VI NẤM 3.1.1 Đặc điểm chung của vi nấm Vi nấm là các tế bào sinh vật nhân thật, phân bố rất rộng rải trong đất, nước và cả trong không khí. Vi nấm sống hoại sinh và ký sinh trên các sinh vật khác nên cũng là tác nhân gây bệnh cho người và động vật. Trong số khoảng 100,000 loài nấm đã được biết đến có khoảng 100 loài có khả năng gây bệnh. Một số loài vi nấm làm hư hỏng thực phẩm hoặc tiết ra độc tố. Trong đất vi nấm có vai trò quan trọng trong việc phân hủy các chất hữu cơ thành các chất dinh dưỡng cho thực vật. Cấu trúc nên lớp mùn màu mở của đất, tham gia vào sực chuyển hoá các chất vô cơ trong đất. Một số loài nấm có khả năng lên men thực phẩm như men rựu (Saccharomyces cerevisiae), một số có khả năng sinh chất kháng sinh (Penicillium sp), enzim, các axit hữu cơ và nhiều chất khác. Vi nấm gồm có nấm men và các nấm sợi không sinh thể quả lớn (còn gọi là mũ nấm), có các đặc điểm chung sau: - Cơ thể của nấm là một tản, có bộ máy dinh dưỡng chưa phân hóa thành cơ quan riêng biệt. Tản của nấm có thể là đơn bào hoặc đa bào. Đa số có dạng sợi gọi là sợi nấm hay khuẩn ti, có hoặc không có vách ngăn, đường kính trung bình 5-10 μm, có khi 25 μm hoặc 1–2 μm. Có sợi nấm trong suốt không màu, có sợi có màu. Đa số sợi nấm phân nhánh nhiều lần nhưng cũng có sợi nấm không phân nhánh. - Từ một bào tử hay một đoạn sợi nấm gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển ra cả ba chiều thành một khối sợi nấm (hệ sợi nấm hay khuẩn ti thể). Trên khuẩn ti thể người ta chia ra làm hai loại khuẩn ti là khuẩn ti dinh dưỡng là khuẩn ti cắm sâu vào môi trường và khuẩn ti khí sinh là khuẩn ti phát triển tự do trong không khí. - Để thích nghi với các điều kiện sống khác nhau, hệ sợi nấm có thể biến hoá thành nhiều dạng khác nhau như: rễ giả, sợi hút, sợi áp, sợi bò hay thân bò, vòng nấm hay mạng nấm. Từ khuẩn ti khí sinh có thể mọc ra những sợi sinh sản vô tính hoặc hữu tính sau đây: đầu bào tử trần, nang bào tử kín, đảm, túi giá, cụm giá, đĩa giá, bó giá, hạch nấm, thể đệm, quả túi. - Các vách ngang ở sợi nấm có vách ngăn đều có lỗ thông. Chất nguyên sinh và nhân tế bào có thể đi qua các lỗ thông này. Trừ các tế bào nấm men đơn bào, các sợi nấm chưa có cấu tạo tế bào điển hình như các tế bào vi sinh vật nhân thật. Mỗi tế bào trong sợi nấm chưa có hoạt động trao đổi chất độc lập vì chưa có giới hạn rỏ rệt. - Nấm có rất nhiều đặc điểm chung với các sinh vật có nhân thật, nhất là về cấu tạo của nhân. Nấm khác hẳn về nhiều mặt với các vi sinh vật thuộc nhóm nhân nguyên. 30
- Nấm có những đặc điểm riêng biệt về mặt hóa học tế bào. Không có cấu trúc thống nhất giữa các nhóm về thành phần của thành tế bào giữa các nhóm nấm. Chất dự trữ của nấm không phải là tinh bật như ở thực vật mà là glycogen như ở động vật. Nấm thành tế bào vững chắc cấu tạo bởi celluloz hoặc chitin. Một số nấm như nấm nhày không có thành tế bào mà chỉ có màng nguyên sinh chất nên chúng thường có hình dạng vô định. - Nấm không chứa trong tế bào các sắc tố quang hợp vì vậy không có khả năng quang hợp, không có khả năng sống tự dưỡng. Nấm chỉ có đời sống hoại sinh, kí sinh hoặc cộng sinh. - Sinh sản bằng bào tử vô tính và bào tử hữu tính. - Nấm không có một chu trình phát triển chung. Có 5 kiểu chu trình phát triển là: (1) chu trình lưỡng bội; (2) chu trình hai thế hệ; (3) chu trình đơn bội; (4) chu trình đơn bội - song nhân và (5) chu trình vô tính. 3.1.2 Nấm men Là nhóm nấm có vị trí phân loại không thống nhất nhưng có các đặc điểm chung sau: (i) có tồn tại trạng thái đơn bào; (ii) đa số sinh sôi nảy nở theo lối nảy chồi cũng có khi có hình thức phân cắt tế bào; (iii) nhiều loài nấm men có khả năng lên men đường; (iv) thích nghi với môi trường có chứa đường cao, có tính axít cao; (v) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, môi trường có đường, pH thấp. 3.1.2.1 Hình thái của nấm men Nấm men là nấm đơn bào, có nhân thật, thường có hình bầu dục, tuy nhiên tùy loài mà tế bào nấm men có thể có hình cầu, hình trứng, hình elip Kích thước tế bào nấm men lớn gấp 10 lần vi khuẩn, đường kính khoảng từ 1-5µm và dài khoảng 5-30µm (hình 28). Các loài nấm men có khuẩn ti hoặc khuẩn ti giả. Thành tế bào dày khoảng 25nm, cấu tạo bởi glucan hoặc kitin, khoảng 10% protein (một phần là các enzim) và một lượng nhỏ lipit. Màng tế bào chất cấu tạo chủ yếu là protein (50% khối lượng khô), còn lại là lipit (40%) và một ít polisaccarit. Nhân của tế bào nấm men được bao bọc bởi một màng nhân như ở các sinh vật có nhân thật khác. Màng nhân có cấu trúc hai lớp và có rất nhiều lỗ thủng. Ti thể của nấm men cũng giống như các nấm sợi và các sinh vật có nhân khác. Các tế bào nấm men khi già sẽ xuất hiện không bào chứa các enzim thủy phân, poliphotphat, lipoit, ion kim loại Chúng là những vi sinh vật kị khí bắt buộc. (a) (b) Hình 28. (a) nấm men Saccharomyces cerevisiae (b) ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử tế bào Candida albicans (PM = màng tế bào chất; M = ty thể; N = nhân; V = không bào; CW = thành tế bào). 31
3.1.2.2 Sinh sản của nấm men 3.1.2.2.1 Sinh sản vô tính 3.1.2.2.1.1 Nảy chồi Nảy chồi là hình thức sinh sản vô tính phổ biến nhất gặp ỏ hầu hết nấm men. Ở điều kiện thuận lợi nấm men sinh sôi nảy nở rất nhanh. Khi một chồi xuất hiện các enzim thủy phân sẽ làm phân giải phần polisacarit của thành tế bàolàm cho chồi chui ra khỏi tế bào mẹ. Vật chất mới được tổng hợp sẽ được huy động đến chồi và làm chồi phình to dần lên khi đó sẽ xuất hiện vách ngăn giữa chồi và tế bào mẹ (hình 29). Thành phần của vách ngăn cũng tương tự như thành tế bào. Sau đó chồi tách khỏi tế bào mẹ. (a) (b) Hình 29. Sự nảy chồi (a) ở nấm men Candida albicans; (b) ở Blastomyces dermatitidis 3.1.2.2.1.2 Phân cắt Lối phân cắt ở các tế bào nấm men cũng tương tự như ở vi khuẩn. Tế bào dài ra, ở giữa mọc ra vách ngăn chia tế bào ra thành hai phần tương đương nhau mỗi tế bào con có một nhân. Hình thức sinh sản này thường gặp ở nấm men Schizosaccharomyces. 3.1.2.2.1.3 Bằng bào tử Bào tử áo như ở nấm men Candida albicans (hình 30) là bào tử đặc biệt hình thành từ một hoặc vài tế bào trên sợi nấm, thường mọc ở đỉnh của các khuẩn ti giả. Bào tử áo có vách dày nên có khả năng chịu đựng được điều kiện môi trường khắc nghiệt và sẽ nảy mầm cho ra sợi nấm mới khi gặp điều kiện thuận lợi. Hình 30. Khuẩn ti giả (pseudohypha), bào tử chồi (blastospores), và bào tử áo (chlamydospore) ở Candida albicans 32
3.1.2.2.2 Sinh sản hữu tính Sinh sản hữu tính ở nấm men thường ít xảy ra so với sinh sản vô tính, tuy nhiên nhờ có sinh sản hữu tính mà các hiện tượng tái tổ hợp các đặc điểm di truyền xảy ra. Ở nấm men có hình thức sinh sản hữu tính bằng bào tử nang. Bào tử nang được hình thành do sự tiếp nối của hai tế bào khác giới, chổ tiếp nối sẽ tạo một lỗ thông và qua đó nguyên sinh chất có thể đi qua để tiến hành phối chất và nhân cùng đi qua để tiến hành phối nhân. Hình 31: Bào tử nang ở nấm Ascomycota Qua phân bào giảm nhiễm sẽ tạo thành các tế bào con (hình 31). 3.1.3 Nấm sợi Là tất cả các nấm không phải là nấm men và không sinh mũ nấm. Tuy nhiên ở tất cảc các giai đoạn chưa sinh mũ nấm thì khuẩn ti thể (hệ sợi nấm) của nấm lớn vẫn được coi là nấm sợi. Nấm sợi còn được gọi là nấm mốc mọc trên thực phẩm, chiếu, quần áo, giày dép, sách vở. Nhiều nấm sợi ký sinh trên người, động vật và thực vật gây ra các bệnh nguy hiểm. Một số nấm mốc có khả năng sinh ra độc tố. Nấm sợi phân bố rộng rãi trong tự nhiên và tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ và hình thành chất mùn. Rất nhiều loại nấm sợi đã được sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp enzim, công nghiệp dược phẩm, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố sinh trưởng thực vật, làm chỉ thị xác định độ phì nhiêu và định lượng các chất hoạt động sinh học, sản xuất sinh khối phục vụ chăn nuôi và dinh dưỡng cho con người, xử lý ô nhiễm môi trường. 3.1.3.1 Hình thái và cấu trúc của nấm sợi Nấm sợi cấu trúc tương tự cấu trúc của tế bào nấm men (hình 33a). Ở một số loài nấm, khuẩn ti không có vách ngăn bên trong và có nhiều nhân. Khuẩn ti ở các loài nấm có vách ngăn có thể chứa một, hai nhân hoặc nhiều nhân. Bên ngoài có thành tế bào thường cấu tạo bởi chitin hoặc cellulozơ hoặc cả hai. Tế bào chất có nhân phân hóa. Màng nhân có cấu tạo hai lớp, trên màng có nhiều lỗ nhỏ. 33
(a) Hình 33. (a) Cấu trúc khuẩn ti của nấm sợi; (b) Sinh sản vô tính ở nấm sợi 34
3.1.3.2 Sinh sản của nấm sợi a. Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng hình thức vô tính (hình 33a) bằng các hình thức sau: 1. Bào tử đính (bào tử cành): được sinh ra trên một sợi nấm gọi là đài/ cành (hình 34). (a) (b) Hình 34. Bào tử đính (conidiospores) (a) ở nấm Penicillium, (b) ở Aspergillus 2. Bào tử kín: bào tử được chứa trong túi (hay bọc) sinh ra trên một sợi nấm (hình 35). Hình 35. Các bào tử kín của nấm Rhizopus nằm trong túi bào tử 35
3. Bào tử đốt: bào tử được hình thành do sự phân đốt ở khuẩn ti dinh dưỡng (hình 36). Hình 36: Bào tử đốt ở nấm Coccidioides immitis b. Nấm sợi cũng có hình thức sinh sản hữu tính nhưng không phổ biến. Thường gặp nhất là hình thức sinh sản bằng bào tử tiếp hợp (hình 37). (a) (b) Hình 37. (a) Nấm Rhizopus, (b) Bào tử tiếp hợp ở nấm Rhizopus 3.2 MỘT SỐ NGUYÊN SINH ĐỘNG VẬT Nguyên sinh động vật là các vi sinh vật đơn bào, nhân thật, sống đáy và dinh dưỡng dị dưỡng. Thức ăn của chúng là các sinh vật đơn bào khác, vi khuẩn và mùn bả hữu cơ. Tế bào của nguyên sinh động vật thường không có vách tế bào, nên phần lớn nguyên sinh động vật không có hình dạng và kích thước nhất định. Tuy nhiên chúng thường có một lớp vỏ mỏng bao quanh tế bào. Một số nguyên sinh động vật sống cộng sinh. Một số sống ký sinh và có khả năng gây bệnh ở người và động vật. Hầu hết chúng có lông tơ, roi hoặc chân giả dùng để di chuyển. Nguyên sinh động vật được phân thành 5 nhóm dựa theo cách di chuyển và bắt mồi của chúng. 36
1. Sarcodina/Rhizopoda Gồm các nguyên sinh động vật di chuyển và bắt mồi bằng cách tạo ra các giả túc. Điển hình của nhóm này các amoeba (hình 38). Chúng dinh dưỡng bằng cách thực bào và phân bố rộng rãi trong đất và trong nước. Hình 38. Amoeba proteus 2. Ciliophora Gồm các nguyên sinh động vật di chuyển và bắt mồi bằng các lông tơ (hình 39). Các loài tiêu biểu của nhóm này là Paramecium. Chúng phân bố chủ yếu trong nước ngọt. Hình 39. Paramecium (250X) 3. Sporozoa/Apicomplexa Sporozoa còn được gọi là Apicomplexa là nhóm nguyên sinh động vật có các cơ quan tử nằm ở phấn đầu của tế bào có tác dụng giúp cho các sporozoan phá vở mô và tế bào ký chủ (hình 40). Tất cả các sporozoan là ký sinh trùng. Được biết đến nhiều nhất là các loài Plasmodium gây bệnh sốt rét ở người. Ở giai đoạn chưa trưởng thành sporozoan di chuyển bằng giả túc. Các giao tử đực di chuyển bằng roi. Hình 40. Opalina (1200X) 37
4. Zoomastigophora Là nhóm nguyên sinh động vật di chuyển bằng roi, có thể sống công sinh, ký sinh hay sống tự do. Hai loài phổ biến của nhóm này là Trichonympha sống cộng sinh trong ruột mối giúp chúng tiêu hóa các mẫu gỗ, và Trypanosoma có trong máu người mắc bệnh sốt ngủ châu phi. Chúng là những vi sinh vật dị dưỡng bắt mồi bằng hình thức thực bào (hình 41). Hình 41. Trypanosoma gambiense 5. Actinopoda Actinopoda là nhóm nguyên sinh động vật có roi trục (chân giả sợi trục) mọc trên bề mặt tế bào (hình 42). Các chân giả này được các Actinopoda sử dụng để bắt mồi và để trôi nổi. Chúng được chia làm hai nhóm là heliozoans và radiozoans. Nhóm heliozoans thường phân bố trong nước ngọt và có các roi trục cứng. Nhóm radiozoans thường phân bố ở nước mặn và có vỏ giống thuỷ tinh. Cả hai nhóm đều là thành phần của phiêu sinh vật. Hình 42. Raphidiophrys pallida 3.3 TẢO Tảo là các vi sinh vật nhân thật có khả năng quang hợp bao gồm các loài tảo nước ngọt và tảo nước mặn. Tảo là nguồn thực phầm quan trọng. Chlorophyll a có ở tất các các loài tảo cùng với những sắc tố khác. Các sắc tố này qui định màu sắc của loài tảo đó. Tảo lục Tảo lục là tảo đơn bào do có chứa diệp lục tố (hình 43). Một số tảo lục đa bào có kích thước lớn. Chúng sống trong biển và trong nước ngọt. Một số sống trong đất ẩm, sống cộng sinh với nguyên sinh động vật, động vật không xương sống hoặc với nấm. 38
Hình 43. Oedogonium macrandous (100x) Tảo hồng Tảo hồng là tảo đa bào bên cạnh diệp lục tố còn có sắc tố đỏ phycoerythrin. Hầu hết các loài tảo hồng phân bố ở môi trường biển ấm. Một số ở nước ngọt và ở trong đất. Có một vài loài tảo hồng sống ở độ sâu 260m dưới đáy biển. (a) (b) Hình 44. (a) Tảo hồng Nemalion (250X); (b) Tảo hồng Batrachospermum Tảo nâu Tảo nâu là tảo đa bào, ngoài diệp lục tố còn có thêm sắc tố nâu fucoxanthin. Fucoxanthin che án màu của diệp lục tố có trong chúng. Chúng thường phân bố ở ven bờ biển ôn đới. Đa số các loài rong biển thuộc ngành tảo nâu. Hình 45. Tảo nâu Pylaiella (1000X) Tảo vàng nâu Tảo vàng nâu là tảo nước ngọt có màu vàng nâu do có sắc tố vàng, cam, nâu, carotenoid và xanthophyl. Hầu hết tảo vàng nâu có hai roi. Thường có mặt trong thành phần phiêu sinh vật nước ngọt. Chúng có thể tồn tại rất lâu trong các hồ nước lạnh hoặc khô hạn nhờ vào sự hình thành bào xác. Hình 46. Tảo vàng nâu Synura 1100X 39
Tảo hai roi (Dinoflagellata) Là nhóm tảo di chuyển bằng cách xoay tròn cơ thể bằng 2 roi. Hai roi của chúng thường mọc vuông góc với nhau. Hầu hết các dinoflagellata có cấu tạo đơn bào. Một số sống thành tập đoàn. Chúng là thành phần của phiêu sinh vật có hình thức dinh dưỡng dị dưỡng và có khả năng quang hợp. Hiện tượng triều đỏ xảy ra là do khi mật độ tảo tăng quá cao trong một thời gian ngắn. Các loài sinh vật có vỏ sử dụng dinoflagellates làm thức ăn sẽ tích tụ độc tố và sẽ gây ngộ độc cho các sinh vật sử dụng chúng làm thức ăn kể cả con người. (a) (b) Hình 47. Tảo hai roi (a) Peridinium; (b) Ceratium Tảo silic (Diatom) Diatom là các tảo đơn bào thuộc nghành tảo silic. Vách tế bào của chứa silic nên trông giống thủy tinh. Trên tế bào diatom có rất nhiều lỗ nhỏ giúp cho việc di chuyển và trao đổi khí của chúng. Diatom phân bố ở nước ngọt và nước biển. Hình 48. Một số diatom (250x ) Tài liệu tham khảo: 1. Madigan, M.T., Martinko, J.M. and Parker, J., 2002. Biology of Microorganisms. Tenth edition, Prenhall. 2. Gary E. K., 2002. Microbiology learning object 2: Fungi, protozoa, viruses, and the innate immune system. 3. Phạm Văn Kim, 2001. Giáo trình vi sinh đại cương. Khoa Nông nghiệp, Đại học Cần thơ. 4. Nguyễn Lân Dũng, 2000. Vi Sinh Vật học. Nhà xuất bản giáo dục. 40
Chương 4 VIRUT 4.1 LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VIRUT Từ xa xưa mặc dù chưa biết virut là nguyên nhân gây nên các bệnh hiểm nghèo con người đã có những nghiên cứu về tác nhân gây bệnh và tìm biện pháp để phòng bệnh. Những bằng chứng đầu tiên về bệnh bại liệt đã được tìm thấy ở Ai cập khoảng 3750 năm trước công nguyên. Bệnh đậu mùa xuất hiện ở Trung Quốc khoảng 1000 trước công nguyên. Mãi cho đến những năm 1880 khi Louis Pastuer và Robert Koch chứng minh vi sinh vật là tác nhân gây bệnh truyền nhiễm, con người dần dần khám phá ra những bí ẩn của các bệnh hiểm nghèo xảy ra trước đó. Sau đó Pastuer đã có rất nhiều nghiên cứu về tác nhân gây bệnh dại và gọi đó là virut (tiếng Latin có nghĩa là độc) nhưng ông không tách biệt vi khuẩn với các tác nhân gây bệnh khác. Vào năm 1892, một nhà sinh lí học thực vật người Nga tên là D.Ivanovskii, đã chứng minh mầm bệnh khảm ở thuốc lá sau khi được lọc qua các nến lọc vi khuẩn có kích thước nhỏ nhất vẫn có khả năng lây nhiễm trên các cây thuốc lá khác. Ông cho rằng đó là "độc tố vi khuẩn" hoặc "vi khuẩn cực tiểu". Đến năm 1898 nhà vi sinh học Hà Lan M.Beijerinck (1851-1931) cũng nghiên cứu một cách độc lập mầm bệnh của bệnh khảm thuốc lá và ông cũng thu được kết quả giống như Ivanovskii. Cùng năm đó F. Loeffler và P. Frosch phát hiện ra virut gây bệnh lở mồm long móng ở bò. Cho đến năm 1909, Landsteiner và Popper chứng minh bệnh bại liệt ở người là do virut gây nên, đây cũng là bệnh virut đầu tiên ở người được biết đến. Nhiều nhà khoa học khác tiếp tục phát hiện ra các virut khác gây ra bệnh sốt vàng ở người (1902), bệnh dại ở gà (1908), bệnh u ở niêm dịch thỏ, bệnh X ở khoai tây Năm 1915 nhà khoa học Anh F. Twort (1877-1950) và năm 1917 nhà khoa học pháp F. d' herelle phát hiện ra virut ở vi khuẩn đã đặt tên cho loại virut này thể thực khuẩn. Virut học phát triển rất nhanh kể từ khi kính hiển vi điện tử ra đời năm 1939. Năm 1940 lần đầu tiên nhà khoa học người Đức Kausche và cộng sự chụp được hình dạng của virut gây bệnh khảm trên cây thuốc lá (TMV) dưới kính hiển vi điện tử. Các nhà khoa học đã chứng minh vật chất di truyền ở thể thực khuẩn là ADN, mở đầu cho giai đoạn nghiên cứu sinh học phân tử ở virut (1952). Nhờ các thành tựu mới mẻ nhất trong nghiên cứu kĩ thuật di truyền ở virut mà con người đã làm ra được nhiều loại vaccin phòng bệnh virut hiểm nghèo ở người và gia súc, gia cầm. 4.2 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VIRUT Virut thường được gọi là hạt virut vì chúng chưa có cấu tạo tế bào. Virut chứa những yếu tố di truyền là ADN hay ARN nằm trong một vỏ bọc protein và có thể có các hợp chất khác bao quanh bên ngoài vỏ. Ở trạng thái này virut còn được gọi là virion. Trong tế bào, virion được nhân lên dựa vào sự hiệp trợ của hệ thống trao đổi chất của vật chủ mà sao chép axit nucleic, tổng hợp các thành phần như protein, lipoprotein, photpholipit. Khi hệ gen của virut có mặt trong tế bào chủ và được nhân lên gọi là quá trình nhiễm virut. 41
Trong điều kiện ngoại bào ngoài chúng có thể tồn tại lâu dài ở trạng thái đại phân tử hóa học không sống và có hoạt tính truyền nhiễm. Theo nhà virut học A. Lwoff (1966) thì virut khác biệt với các sinh vật khác chủ yếu ở chổ chúng chỉ có một loại axit nulceic, hoặc là ADN hoặc là ARN, có thể tiến hành tái tạo axit nucleic nhưng không thể sinh trưởng, không phân cắt thành hai phần đều nhau, không có các enzim tham gia vào trao đổi năng lượng, không có riboxom của mình. Vật chủ của virut bao gồm động vật, thực vật và vi khuẩn. Vi vậy virut cũng được phân loại theo vật chủ của tế bào mà chúng ký sinh là virut động vật, virut thực vật và virut vi khuẩn. Nhiều virut động vật có thể nuôi cấy được trong mô hoặc tế bào. Nuôi cấy tế bào là rất cần thiết cho việc nghiên cứu virut. Đối với virut vi khuẩn người ta dùng các vi khuẩn chuẩn thuần khiết để nuôi cấy chúng trên môi trường lỏng hoặc môi trường thạch. Khi tế bào bị nhiễm virut có thể quan sát thấy dưới kính hiển vi quang học một đám lớn các hạt virut tập hợp lại với nhau tạo ra các thể bao hàm. Các vết làm tan vi khuẩn trên bản thạch đĩa gọi là vết thực khuẩn mắt thường cũng nhìn thấy được. Đó cũng là một tập hợp rất lớn các virut. Thể bao hàm có hình thái và kích thước không giống nhau. Đa số nằm trong tế bào chất của vật chủ nhưng cũng có một số ít nằm trong nhân tế bào. Có lúc thể bao hàm vừa tồn tại trong tế bào chất vừa tồn tại trong nhân. 4.3 HÌNH THÁI VÀ CẤU TẠO CỦA VIRUT 4.3.1 Kích thước và hình dạng của virut Virut có kích thước rất nhỏ dao động từ 5-300nm (1nm=10-9m), nên không không thể quan sát thấy virut qua kính hiển vi quang học. Muốn quan sát hình thái và đo kích thước virut phải sử dụng kính hiển vi điện tử và các kĩ thuật phụ trợ. Virut có bốn hình dạng chủ yếu là hình khối, hình khối cầu, hình que và hình tinh trùng (hay hình nòng nọc) (hình 49). 4.3.2 Cấu tạo của virut Thành phần chủ yếu của virut bao gồm axit nuleic được bao bọc bởi vỏ protein và ở một số virut còn có một số phân tử các. 4.3.2.1 Axit nucleic (lõi) Axit nucleic là cơ sở lưu trữ, tái tạo mọi thông tin di truyền, vì vậy là thành phần quan trọng của mọi virut. Virut có nhiều loại hình axit nucleic và là cơ sở phân tử để phân loại virut. Các loại hình axit nucleic của virut được phân biệt dựa trên mấy điểm chủ yếu sau đây: (i) AND hay ARN, (ii) Chuỗi đơn hay chuỗi xoắn kép, (iii) Dạng sợi, dạng vòng kín hay dạng vòng hở và (iv) Hệ gen là một, hai hay nhiều thành phần. 42
Hình 49. Các hình dạng chủ yếu của virut 4.3.2.2 Vỏ protein (capsit) Capsit mang các thành phần kháng nguyên và có tác dụng bảo vệ lõi axit nucleic. Capsit cấu tạo bởi các đơn vị phụ gọi là hạt capsit hay capsome. Các capsome có thể do một chuỗi polypeptit tạo thành hoặc có thể tạo thành từ các đơn phân monomer protein đồng nhất, mà mỗi đơn phân này cấu tạo từ nhiều chuỗi polypeptit. Lõi và vỏ virut hợp lại tạo thành một nucleocapsit, đó là kết cấu cơ bản của mọi virut (hình 50). Hình 50. So sánh virut có màng bao và virut không có màng bao 43
4.3.2.3 Màng bao Một số virut bên ngoài capsit còn có một màng bao (hình 50) cấu tạo bởi photpholipit hay glycoprotein. Màng bao thường là màng nhân, màng tế bào chất hoặc là màng của các không bào của vật chủ bị virut cải tạo thành và mang tính kháng nguyên đặc trưng cho virut (hình 51). Hình 51. Sự hình thành màng bao của virut 4.3.3 Cấu tạo của thể thực khuẩn Thể thực khuẩn là virus ở vi khuẩn. Cấu trúc của thể thực khuẩn thường phức tạp hơn cấu trúc của virut. Thể thực khuẩn thường có cấu trúc hình nòng nọc hay hình tinh trùng ví dụ như thể thực khuẩn T4 cấu tạo bởi ba bộ phận: đầu, cổ và đuôi. Phần đầu bao gồm capsit và axit nucleic như ở virut không có màng bao. Đầu nối với đuôi qua cổ. Đuôi gồm có bao đuôi, ống đuôi, đĩa gốc, 6 mấu ghim và 6 sợi đuôi. Bao đuôi và ống đuôi cấu tạo bởi các capsome. Đĩa gốc cũng tương tự như đĩa cổ, trên đó mọc ra 6 sợi đuôi và 6 mấu ghim. Sợi đuôi cấu tạo bởi các phân tử protein (hình 56a). 4.3.4 Các dạng cấu trúc đối xứng của virut Nucleocapsit của virut luôn có cấu trúc đối xứng do sự sắp xếp của các protein cấu trúc. Virut thường có cấu trúc đối xứng xoắn, đối xứng khối và là đối xứng phức hợp. Mỗi loại đối xứng lại phân thành loại có màng bao và loại không có màng bao. 4.3.4.1 Virut đối xứng xoắn Điển hình như virut khảm thuốc lá (TMV) có hình que thẳng, dài 300nm. TMV có vỏ protein là capsit chứa 2130 capsome. Mỗi capsome cấu tạo bởi 158 gốc axit amin, khối lượng phân tử là 17500. Các capsome có đối xứng xoắn bao quanh và bám vào sợi ARN xoắn trôn ốc. Hình 52. (a). Virut đối xứng xoắn (b) Virut khảm thuốc lá 44
(a) (b) (c) Hình 53.(a) Virut đối xứng khối; (b) Ảnh Adenovirus qua kính hiển vi điện tử (c) Cấu trúc Adenovirus (a) (b) (c) (d) (e) Hình 54. (a) Virut đối xứng xoắn có màng bao, (b) Virut đối xứng khối có màng bao, (c) Ảnh chụp Coronavirus qua kính hiển vi điện tử, (d) Ảnh chụp phức hợp Herpes virut qua kính hiển vi điện tử, (e) Ảnh chụp HIV qua kính hiển vi điện tử 45
TMV chứa 95% protein và 5% chuỗi đơn ARN. Có cả thảy 130 vòng xoắn. Mỗi vòng xoắn dài 2,3nm, trên đó có trung bình 16,33 capsome. Sợi đơn ARN có chứa 6390 đơn vị nucleotic, khối lượng phân tử là 2*106. Cứ 3 nucleotic thì kết hợp với 1 protein, mỗi vòng có 49 nucleotic (hình 52). 4.3.4.2 Virut đối xứng khối Điển hình như Adenovirus có hình cầu cấu trúc 20 mặt, gần giống hình cầu, không có màng bao, đường kính khoảng 70-80nm. Adenovirus có tất cả 12 góc, 20 mặt, 30 cạnh. Capsit cấu tạo bởi 252 capsome, trong đó có 12 thể ngủ lân có khối lượng phân tử 70.000, phân bố ở 12 góc và 240 thể lục lân có khối lượng phân tử 120.000, phân bố đều ở trên 20 mặt. Thể ngủ lân cấu tạo bởi 5 monomer protein, còn có thể lục lân cấu tạo bởi 6 protomer. Ở mỗi thể ngủ lân có một sợi protein mọc thẳng ra đầu có hình cầu (như hình đinh ghim), những sợi này được gọi là sợi ADN xoắn kép. Tất cả mọi Adenovirus đều có 6.500 đôi nucleotic (hình 53). Ngoài đối xứng 20 mặt một số virut còn có đối xứng 4 mặt và đối xứng 8 mặt. Virut đối xứng xoắn và virut đối xứng khối có khi có màng bao (hình 54). Trên thực tế kích thước hình thái của virut rất đa dạng, tùy theo loại axitnuleic của virut và vật chủ của virut (hình 55) (a) (b) Hình 55. (a) Hình thái virut ARN ở động vật; (b) Hình thái virut ADN ở động vật 46
4.3.4.3 Virut đối xứng phức hợp Điển hình như thể thực khuẩn T4 của vi khuẩn E. coli. Thể thực khuẩn T4 cấu tạo bởi ba bộ phận: đầu, cổ và đuôi. Đầu có cấu trúc 20 mặt còn đuôi lại có cấu trúc đối xứng xoắn. Chính vì vậy mà người ta gọi là đối xứng phức hợp (hình 56). 1. Phần đầu dài 95nm, rộng 65nm, dưới kính hiển vi điện tử có thể thấy rõ 20 mặt. Capsit có cấu tạo bởi 8 loại protein, lượng chứa protein chiếm tới 76-81% trong thể thực khuẩn. Có cả thảy 212 capsome, mỗi capsome có đường kính là 8nm. Bên trong đầu có sợi ADN xoắn kép. 2. Phần cổ nối phần đầu với phần đuôi. Đó là một đĩa hình lục giác tạo thành, đường kính 37,5nm, có 6 tua cổ (cảnh tu) mọc ra từ cổ. 3. Phần đuôi gồm có bao đuôi, ống đuôi, đĩa gốc, 6 mấu ghim và 6 sợi đuôi: (a) (b) (c) Hình 56. (a) Cấu tạo thể thực khuẩn, (b) Thực khuẩn T4 của vi khuẩn E.coli, (c) Các dạng hình thái của thể thực khuẩn 47
- Bao đuôi dài 95nm, có 24 vòng xoắn cấu tạo bởi 144 capsome (mỗi capsome có khối lượng phân tử là 55.000) cấu tạo nên. Ống đuôi dài 95nm, đường kính 8nm, ở giữa có lổ thủng đường kính 2,5-3,5nm. Đây là con đường để dẫn ADN trong đầu của thể thực khuẩn xâm nhiễm vào tế bào vật chủ. - Ống đuôi cũng cấu tạo bởi 24 vòng xoắn, tương ứng với 24 vòng xoắn trên bao đuôi. - Đĩa gốc cũng tương tự như đĩa cổ, đó là một đĩa hình lục giác, rỗng ở giữa. Đường kính đĩa gốc là 30,5nm, trên đó mọc ra 6 sợi đuôi và 6 mấu ghim. - Mấu ghim dài 20 nm có chức năng hấp phụ. Sợi đuôi dài 140nm có thể gấp lại ở chính giữa, đường kính 2nm. - Sợi đuôi cấu tạo bởi 2 loại phân tử protein khá lớn và 4 loại phân tử protein khá nhỏ. Nó có tác dụng hấp thụ chuyên hóa vào vùng mẫn cảm của bề mặt tế bào vật chủ. Sau khi sợi đuôi hấp thụ đĩa gốc sẽ bị kích thích, dẫn đến việc co rút bao đuôi và làm cho ống đuôi đâm vào tế bào chủ. 4.4 CÁC HÌNH THỨC SAO CHÉP CỦA VIRUT 4.4.1 Sao chép ở virut động và virut thực vật Ở virut động vật và virut thực vật, hình thức sao chép có những khác nhau theo từng loại virut, nhưng nhìn chung quá trình sao chép diễn ra qua các giai đoạn như sau: 4.4.1.1 Giai đoạn hấp thụ trên bề mặt của tế bào ký chủ Sự hấp thu của virut lên bề mặt của tế bào chủ thường xảy ra một cách thụ động, do ngẫu nhiên hay do một tác nhân lan truyền nào đó chứ không phải do virut chủ động. Để virut có thể được hấp thu, trên bề mặt tế bào của ký chủ phải có các thụ thể phù hợp với loại virut đó và tế bào chủ còn phải có khả năng hỗ trợ cho quá trình sao chép của virut sau đó. 4.4.1.2 Giai đoạn xâm nhập vào bên trong tế bào chủ Virut có màng bao xâm nhập vào tế bào chủ bằng một trong hai cách: (1) Màng bao của virut kết kết hợp với màng bao của tế bào chủ tại vị trí của thụ thể và axit nuleic được giải phóng vào trong tế bào chất của tế bào chủ (hình 57a); (2) Virut xâm nhập bằng sự thực ẩm bào nhờ màng tế bào chất của tế bào chủ (hình 57b). Màng bao của virut sau đó được cởi bỏ nhờ các enzim và axit nuleic được giải phóng vào trong tế bào chất của tế bào chủ (a) 48
(b) (c) (d) Hình 57. (a&b) Sự xâm nhập của virut không có màng bao; (c&d) Sự xâm nhập của virut có màng bao Virut không có màng bao cũng xâm nhập vào tế bào chủ bằng một trong hai cách: (1) Capsit của virut kết hợp với màng tế bào chất của tế bào chủ để đưa axit nuleic của virut vào trong tế bào chất của tế bào chủ (hình 57c); (2) Virut xâm nhập bằng sự thực ẩm bào nhờ màng tế bào chất của tế bào chủ. Sau đó nhờ các enzim, axit nuleic được giải phóng vào trong tế bào chất của tế bào chủ (hình 57d). 4.4.1.3 Giai đoạn tổng hợp các thành phần của virut Quá trình tổng hợp các thành phần của virut được tiến hành nhờ vào hệ thống chuyển hoá trong tế bào chất của tế bào chủ từ các ribosomes, các ARN vận chuyển, các dưỡng chất, năng lượng và các enzim. Hệ gen của virut sẽ được phiên mã thành ARN thông tin (hình 58) và sẽ được ribosom của tế bào chủ giả mã thành protein và enzim của virut. Trong giai đoạn đầu của quá trình sao chép hệ gen của virut được nhân lên hàng ngàn lần. Ở giai đoạn sau, các thành phần cấu trúc của virut như protien lõi và protein vỏ và các enzim của virut được tổng hợp. Cũng trong giai đoạn này, các protein và glycoprotein của virut (trường hợp virut có màng bao) sẽ liên kết vào màng tế bào chất của tế bào chủ. 49
Hình 58. Sự phiên mã của axitnucleic của virut thành ARN thông tin; mạch (+) ARN được dịch mã thành protein. mạch (+) và (-) là các mạch bổ sung 4.4.1.4 Giai đoạn lắp ráp Ở giai đoạn này các phần của virut lắp ráp lại với nhau tạo thành nucleocapsit (hình 59). Ở virut có màng bao, các capsit bao lấy các axit nucleic rồi sau đó các nuclecapsit tiến đến gần màng tế bào chất của tế bào chủ để các protein và glycoprotein của virut ở dạng kết hợp với màng nguyên sinh chất của tế bào chủ bao lấy chúng hình thành virut có màng bao hoàn chỉnh. Ở virut không có màng bao, các capsit bao lấy các axit nucleic rồi sau đó các nuclecapsit tiến đến gần màng tế bào chất của tế bào chủ để thoát ra ngoài. (a) (b) Hình 59. (a) Sự lắp ráp ở virut có màng bao, (b) Sự lắp ráp ở virut không có màng bao. 4.4.1.5 Giai đoạn phóng thích Virut có thể được phóng thích theo một trong ba cách: (1) tế bào chủ sẽ bị vở và virut thoát ra ngoài. Trường hợp này thường gặp ở virut không có màng bao (hình 60a), (2) virut tạo màng bao từ màng tế bào chất, màng nhân hoặc các màng khác của tế bào chủ theo phương thức nảy chồi (hình 60b), (3) Virut có màng bao thoát ra ngoài bằng sự vận chuyển kết hợp với màng nguyên sinh chất của tế bào chủ (hình 60c). Một số virut sau khi lắp ráp có thể chui từ tế bào này sang tế bào khác mà không cần có sự phóng thích chúng ra ngoài môi trường. Hiện tượng này xảy ra nhờ vào sự tiếp cân giữa các tế bào bị nhiễm và tế bào không bị nhiễm virut. 50
(a) (b) (c) Hình 60. (a) Tế bào bị vở và virut thoát ra ngoài, (b) Virut được phóng thích theo phương thức nảy chồi, (c) Virut được phóng thích nhờ sự vận chuyển của màng nguyên sinh chất của tế bào chủ. 4.4.2 Sự sao chép của thể thực khuẩn (phage) Các virut của vi khuẩn cũng có quá trình sinh sản trải qua các giai đoạn giồng như ở virut động và thực vật. Các nghiên cứu phage ký sinh ở tế bào vi khuẩn E. coli cho thấy chúng có 2 cơ chế sinh sản là: (1) chu trình tan và (2) chu trình tiềm tan. Ở chu trình tan các thể thực khuẩn làm chết tế bào chủ nên gọi là độc. Ở chu trình tiềm tan các virut có thể sinh sản mà không làm chết tế bào chủ nên được gọi là ôn hòa. 4.4.2.1 Các giai đoạn của chu trình tan 1. Giai đoạn hấp thụ của phage lên bề mặt tế bào vi khuẩn: mỗi loại phage chì có thể hấp thu lên bề mặt của một vài dòng của một loài vi khuẩn nhất định ((hình 61a). Sự hấp thụ của phage phụ thuộc vào các thụ thể trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Các thể thực khuẩn khác nhau có các vị trí khác nhau về điểm hấp thu. Ví dụ thể thực khuẩn T3, T4, T7 của vi khuẩn E.colli có điểm hấp thu là lipopolisaccarit. Thể thực khuẩn T2 và T6 lại có điểm hấp thu là lipoprotein. Việc hấp thu chịu ảnh hưởng bởi nhiều nhân tố nội ngoại cảnh như số lượng thể thực khuẩn, các ion dương, các nhân tố bổ trợ như triptophan có thể xúc tiến sự hấp thu của thể thực khuẩn T4, pH môi trường trung tính có lợi cho sự hấp thu, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển cũng là thích hợp cho sự hấp thu. 2. Giai đoạn xâm nhập: sau khi hấp thụ, đĩa gốc và sợi đuôi sẽ nhận được một sự kích thích, làm cho các capsome của bao đuôi sẽ có những vận động phức tạp. Chúng co lại chỉ còn một nữa chiều dài và đâm ống đuôi vào qua thành tế bào và màng tế bào chất. Trong quá trình này các men lizozim ở đầu ống đuôi có tác dụng làm hòa tan peptidoglican ở một bộ phận của thành tế bào. Phage không xâm nhập vào trong tế bào mà chỉ tiêm ADN của chúng vào tế bào chất của tế bào vi khuẩn (hình 61b). 51
3. Giai đoạn tổng hợp các thành phần của phage: đầu tiên phage cung cấp thông tin di truyền cho tế bào vi khuẩn và bắt tế bào này tổng hợp các enzim và các thành phần của phage dựa trên hệ thống trao đổi chất của tế bào vật chủ (hình 61c). 4. Giai đoạn lắp ráp: sau khi đã được tổng hợp xong, các thành phần của phage sẽ lắp ráp lại thành các thể thực khuẩn hoàn chỉnh, đó là các thể thực khuẩn thế hệ “con” có kích thước như nhau (hình 61d). 5. Giai đoạn phóng thích: Sau khi được lắp ráp xong, phage tiết ra men lizozim làm vở vách tế bào vi khuẩn và phage được phóng thích ra ngoài (hình 61e). Mỗi tế bào vi khuẩn bị nhiễm phage có thể phóng thích từ 50- 200 phage. a b c d e Hình 61. (a) Phage hấp thu vào bề mặt thành tế bào vi khuẩn tại vị trí của thụ thể, (b) phage tiêm axit nucleic vào tế bào chất của tế bào vi khuẩn, (c) sự sao chép các thành phần của phage, (d) sự lắp ráp các thành phần của phage tạo nên phage con, (e) quá trình làm tan tế bào và phóng thích phage. 4.4.2.2 Các giai đoạn của chu trình tiềm tan Chu trình bắt đầu khi phage gắn vào bề mặt tế bào vi khuẩn và tiêm ADN vào tế bào chất chúng hoặc có thể tham gia vào chu trình tan hoặc gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào vi khuẩn để bước vào chu trình tiềm tan (hình 62). Có trường hợp ADN của phage không gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ mà sao chép độc lập giống như plasmid. Các giai đoạn của chu trình như sau: 52
Hình 62. Chu trình tiềm tan ở thể thực khuẩn ôn hòa 1. Hấp thụ: phage hấp thụ vào bề mặt tế bào vi khuẩn tại vi trí của thụ thể 2. Xâm nhập: phage tiêm ADN vào trong tế bào chất của vi khuẩn 3. Sao chép giai đoạn sớm: hệ gen của phage được sao chép và các thành phần của phage được tổng hợp 4. Sao chép giai đoạn sau: tiếp tục tổng hợp nên các thành phần của phage 5. Lắp ráp: các thành phần của phage được lắp ráp tạp phage hoàn chỉnh 6. Phóng thích: lysozyme của phage phá vở lớp peptidoglycan làm tan tế bào vi khuẩn Hoặc 7. Phage gắn ADN vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn (hình 63). Phage lúc này được gọi là prophage 8. Khi tế bào vi khuẩn sống và sinh sản, prophage sẽ được sao chép cùng với nhiễm sắc thể của vi khuẩn. 9. Vi khuẩn chứa phage tiềm tan bị một tác động nào đó bị phá huỷ ADN, prophage sẽ tách khỏi nhiễm sắc thể chuyển sang chu trình tan sinh sản ra các phage mới và thoát ra khỏi tế bào (xem hình 64). 53
Số lượng virut nhiễm vào tế bào vi khuẩn và giai đoạn phát triển về sinh của chúng là các yếu tố quyết định cho các phage ôn hoà thực hiện chu trình tan hay tiềm tan. Tỉ lệ prophage tách khỏi nhiễm sắc thể chuyển sang chu trình tan là rất hiếm (phần tỉ). (a) (b) Hình 63. (a) Phage gắn ADN vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn (b) Khi tế bào vi khuẩn sống và sinh sản, prophage sẽ được sao chép cùng với nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Hình 64. (a) Gen của phage tách khỏi nhiễm sắc thể của vi khuẩn, (b) gene của phage sao chép và tổng hợp các thành phần của phage nhờ (c) phage tiếp tục tổng hợp các thành phần và các enzym (d) lắp ráp thành phage hoàn chỉnh (e) phage sử dụng enzym phá làm tan tế bào vi khuẩn và thoát ra ngoài. Tài liệu tham khảo: 1. Phạm Văn Kim, 2001. Giáo trình vi sinh đại cương. Khoa Nông nghiệp, Đại học Cần thơ. 2. Nguyễn Lân Dũng, 2000. Vi Sinh Vật học. Nhà xuất bản giáo dục. 3. Madigan, M.T., Martinko, J.M. and Parker, J., 2002. Biology of Microorganisms. Tenth edition, Prenhall. 4. Gary E. K., 2002. Microbiology learning object 2: Fungi, protozoa, viruses, and the innate immune system. 5. Nguyễn Thị Chính và Ngô Tiến Hiển, 2001. Virut học. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà nội. 6. Alan J. C., 2002. Principles of Molecular Virology. Accademic Press. 7. Phạm Thành Hổ, 2001. Di truyền học. Nhà xuất bản giáo dục 54
Chương 5 DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT 5.1 DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT Quá trình vi sinh vật hấp thụ các chất dinh dưỡng để thỏa mãn mọi nhu cầu sinh trưởng và phát triển của chúng được gọi là quá trình dinh dưỡng. Các chất được vi sinh vật hấp thu từ môi trường xung quanh và được chúng sử dụng làm nguyên liệu để cung cấp cho các quá trình sinh tổng hợp tạo ra các thành phần của tế bào hoặc để cung cấp cho các quá trình trao đổi năng lượng được gọi là chất dinh dưỡng. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, vi sinh vật thường được nuôi cấy trong những môi trường nhân tạo gồm một thành phần các chất thích hợp cho loài vi sinh vật cần nuôi cấy phát triển. Tuy nhiên, không phải mọi thành phần của môi trường nuôi cấy nhân tạo đều là chất dinh dưỡng. Một số chất cần thiết cho vi sinh vật nhưng chỉ làm nhiệm vụ bảo đảm các điều kiện thích hợp về môi trường như pH, về áp xuất thẩm thấu, về cân bằng ion. Nhu cầu về các thành phần dinh dưỡng của vi sinh vật thường là để đáp ứng nhu cầu về các nguyên tố có trong thành phần hóa học của các tế bào (bảng 1). Bảng 1. Thành phần, nguồn gốc và chức năng các nguyên tố chủ yếu trong tế bào vi khuẩn % trọng Nguyên tố Nguồn gốc Chức năng lượng khô Các hợp chất hữu Cacbon 50 Phần tử chủ yếu cấu tạo thành tế bào cơ hoặc CO2 H O, các hợp chất Phần tử chủ yếu cấu tạo nên các chất của tế Oxy 20 2 hữu cơ, CO2 và O2 bào, tham gia quá trình hô hấp NH , NO , các hợp Phần tử chủ yếu cấu tạo nên các amino Nitro 14 3 3 chất hữu cơ, N2 axit, nucleic axit, nucleotit, các coenzim. H O, các hợp chất Phần tử chủ yếu cấu tạo nên các hợp chất Hydro 8 2 hữu cơ, H2 hữu cơ và nước của tế bào. Phần tử chủ yếu cấu tạo nên các nucleic Vô cơ phốt phát Photpho 3 axit, nucleotit, phospholipit, LPS, axit (PO ) 4 teichoic SO , H S, So, hợp 4 2 Phần tử chủ yếu cấu tạo nên cysteine, Lưu huỳnh 1 chất hữu cơ có lưu methionine, glutathione, một số coenzim huỳnh Kali 1 Các muối kali Cation hữu cơ , thành phần phụ của enzim Cation hữu cơ, thành phần phụ cho phản Manhê 0.5 Các muối manhê ứng xúc tác của enzim Cation hữu cơ, thành phần phụ của enzim, Canxi 0.5 Các muối canxi thành phần của các nha bào. Là thành phần của cytochromes và một số Sắt 0.2 Các muối sắt nonheme iron-protein, thành phần phụ cho phản ứng xúc tác của enzim 55
Các vật chất cần thiết cho sự sống của vi sinh vật được chia thành hai nhóm chính là: (1) nước và các muối khoáng, (2) các chất hữu cơ. - Nước chiếm đến 70- 90% khối lượng cơ thể vi sinh vật. Tất cả các phản ứng xảy ra trong tế bào vi sinh vật đều đòi hỏi có sự tồn tại của nước. Muối khoáng chiếm khoảng 2-5% khối lượng khô của tế bào. Trong tự nhiên chúng thường tồn tại dưới dạng các muối sunphat, photphat, cacbonat, clorua và trong tế bào chúng thường tồn tại ở dạng 2+ 2+ + + 2- 2- - - cation (Mg , Ca , K , Na ) hoặc dạng anion (HPO4 , SO4 , HCO3 , Cl ). - Chất hữu cơ trong tế bào vi sinh vật chủ yếu cấu tạo bởi các nguyên tố C, H, O, N, P, S. Riêng 4 nguyên tố C, H, O, N là các nguyên tố chủ chốt để cấu tạo nên protein, axit nucleic, lipit, hodrat cacbon, đã chiếm 90 -97% toàn bộ chất khô của tế bào. Trong tế bào vi khuẩn các hợp chất đại phân tử thường chiếm tới 96% khối lượng khô, các chất đơn phân tử chỉ chiếm có 3,5 % và các ion vô cơ chỉ chiếm 1%. Trong tế bào vi sinh vật ngoài protein, peptit còn có những axit amin ở trạng thái tự do. 5.2 NGUỒN THỨC ĂN CABON CỦA VI SINH VẬT Trong tự nhiên cũng như trong phòng thí nghiệm, vi sinh vật luôn có những nhu cầu nhất định về năng lượng, nguồn cac bon, các chất dinh dưỡng và các chất cần thiết để đảm bảo các điều kiện thích hợp về môi trường. Căn cứ vào nguồn cung cấp cacbon và năng lượng mà người ta chia vi sinh vật thành các nhóm sinh lí sau đây: 1. Vi sinh vật tự dưỡng: là những vi sinh vật có khả năng tự tạo ra chất hữu cơ cho tế bào bằng cách tiết ra các enzim xúc tác tổng hợp C từ CO2. Lối dinh dưỡng của nhóm vi sinh vật này giống như ở cây xanh. 2. Vi sinh vật di dưỡng: là những vi sinh vật không có khả năng tổng hợp chất hữu cơ từ nguyên tử C. Chúng sử dụng C từ các hợp chất hữu cơ có sẵn. Đây là nhóm vi sinh vật chiếm đa số và có lối dinh dưỡng giống như ở động vật. 3. Vi sinh vật quang dưỡng: là những vi sinh vật cần phải lấy năng lượng từ ánh sáng mới sống được. Nhóm vi sinh vật quang dưỡng được chia thành hai nhóm căn cứ vào nguồn C chúng sử dụng. Nhóm quang khoáng dưỡng lấy H từ H2O trong quá trình quang hợp để khử O của CO2. Nhóm quang hữu cơ dưỡng lấy H từ H2S thay vì từ H2O. 4. Vi sinh vật hoá dưỡng: là những vi sinh vật không cần ánh sáng vẫn sống được. Chúng lấy năng lượng từ các phản ứng hoá học xảy ra bên trong tế bào. Nhóm vi sinh vật hoá dưỡng lại được phân biệt thành hai nhóm nhỏ là (1) nhóm vi sinh vật hoá khoáng dưỡng hoá năng vô cơ (vi sinh vật nhóm này lấy năng lượng bằng cách oxyhóa các chất vô cơ) và (2) nhóm vi sinh vật hoá khoáng dưỡng năng hữu cơ (vi sinh vật nhóm này lấy năng lượng từ phản ứng oxy hoá chất hữu cơ). 5. Vi sinh vật hoại sinh: lấy nguồn C từ các chất hữu cơ còn nguyên vẹn ở chung quanh, nước cống rảnh hoặc từ các xác hữu cơ. 6. Vi sinh vật kí sinh: lấy nguồn C là chất hữu cơ trong cơ thể các sinh vật còn sống hoặc từ các tổ chức hoặc dịch thể của một cơ thể sống thường thấy ở các vi sinh vật 56
gây bệnh cho người, động vật và thực vật. Vi sinh vật được gọi là ký sinh bắt buộc khi chúng chỉ có thể sống ký sinh trên một mô còn sống của một sinh vật khác và chúng không thể sống hoại sinh hoặc trên môi trường nuôi cấy nhân tạo. Vi sinh vật được gọi là ký sinh tùy ý thì lại có thể sống ký sinh trong các trường hợp trên. Tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp có thể là chất vô cơ hoặc chất hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ các nguồn thức ăn cacbon của vi sinh vật khác nhau phụ thuộc vào 2 yếu tố: (1) thành phần hóa học và tính chất sinh lí của nguồn thức ăn, (2) đặc điểm sinh lí của từng loại vi sinh vật. Hầu như không có hợp chất cacbon hữu cơ nào mà không bị hoặc nhóm vi sinh vật này hoặc nhóm vi sinh vật khác phân giải. Vi sinh vật có khả năng tiết ra các enzim thủy phân để chuyển hóa những chất hữu cơ không tan được trong nước hoặc có khối lượng phân tử quá lớn thành hợp chất dễ hấp thụ như đường, acid amin, acid béo. 5.3 NGUỒN THỨC ĂN NITƠ CỦA VI SINH VẬT + Nguồn nitơ hấp thụ dễ dàng nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH 4. Hầu hết vi sinh vật đều có khả năng sử dụng muối amon. Muối nitrate là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loài tảo, nấm sợi và cũng thích hợp đối với nhiều loại nấm men và vi khuẩn. Tuy + - nhiên gốc NH4 thường bị hấp thụ nhanh hơn, rồi mới đến NO3 . Một số vi sinh vật có khả năng khả năng chuyển hóa N2 thành NH3 nhờ hoạt động xúc tác của một hệ thống enzim có tên gọi là nitrogenaza. Người ta gọi các sinh vật này là sinh vật cố định nitơ còn quá trình này được gọi là quá trình cố định nitơ. Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong thức ăn hữu cơ nhưng không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử. Chỉ có các polipeptit chứa không quá 5 gốc axit amin mới có thể di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật. Rất nhiều vi sinh vật có khả năng sản sinh proteaza xúc tác việc phân hủy protein thành các hợp chất phân tử thấp có khả năng xâm nhập vào tế bào vi sinh vật. Về axit amin người ta nhận thấy có thể có ba quan hệ khác nhau đối với từng loại vi sinh vật. Có những loại vi sinh vật không cần đòi hỏi phải được cung cấp bất kì loại axit amin + nào. Chúng có khả năng tổng hợp ra toàn bộ các axit amin mà chúng cần thiết từ NH4 và các chất hữu cơ không chứa nitơ. Người ta gọi nhóm vi sinh vật này là nhóm tự dưỡng amin. Có những loại vi sinh vật ngược lại bắt buộc phải được cung cấp một hoặc nhiều axit amin mà chúng cần thiết. Chúng không có khả năng tự tổng hợp ra các axit amin này. Người ta gọi chúng là nhóm dị dưỡng amin. Loại thứ ba là loại các vi sinh vật không có các axit amin trong môi trường vẫn phát triển được, nhưng nếu có mặt một số axit amin nào đó thì sự phát triển của chúng sẽ được tăng cường hơn nhiều. Nhu cầu axit amin của các loại vi sinh vật rất khác nhau ngay cả các loài vi sinh vật rất giống nhau về hình thái và rất gần nhau về vị trí phân loại có thể đòi hỏi rất khác nhau về các axit amin. Các axit amin mà các cơ thể sinh vật đòi hỏi phải được cung cấp gọi là các axit amin không thay thế. Không có các axit amin không thay thế chúng cho tất cả các vi sinh vật. Loại axit amin cần thiết với loài vi sinh vật này có thể là hoàn toàn không cần thiết với loài vi sinh vật khác. 57
Các vi khuẩn gây bệnh, vi khuẩn gây thối, vi khuẩn lactic sống trong sữa thường đòi hỏi phải được cung cấp nhiều axit amin có sẵn. Các loài vi khuẩn sống trong đất thường có khả năng tự tổng hợp tất cả các axit amin cần thiết đối với chúng. Nấm mốc, nấm men và xạ khuẩn cũng thường không đòi hỏi các axit amin có sẵn. Tuy nhiên sự có mặt của các axit amin trong môi trường sẽ làm nâng cao tốc độ phát triển của chúng. 5.4 NGUỒN THỨC ĂN KHOÁNG CỦA VI SINH VẬT Hàm lượng các chất khoáng chứa trong nguyên sinh chất vi sinh vật thường thay đổi tùy loài, tùy giai đoạn phát triển và tùy giai đoạn nuôi cấy. Thành phần khoáng của các tế bào vi sinh vật khác nhau thường là chênh lệch nhau rất nhiều. Nhu cầu khoáng của vi sinh vật cũng khác nhau tùy loài và tùy giai đoạn phát triển. Những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi phải được cung cấp với liều lượng lớn được gọi là nguyên tố đại lượng. Còn những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi với những liều lượng rất nhỏ thì được gọi là các nguyên tố vi lượng. Các nguyên tố khoáng đa lượng của tế bào vi sinh vật bao gồm, P (chiếm tỉ lệ cao nhất khoảng (50% so với tổng số chất khoáng), S, Fe, Mg, Zn. Các nguyên tố khoáng vi lượng bao gồm Ca, Mn, Na, Cl, K. Sự tồn tại một cách dư thừa các nguyên tố khoáng là không cần thiết và có thể dẫn đến những ảnh hưởng xấu. Chẳng hạn việc thừa P có thể làm giảm thấp hiệu suất tích lũy của một số kháng sinh, thừa Fe làm cản trở quá trình tích lũy vitamin B2 hoặc vitamin B12. 5.5 NHU CẦU VỀ CHẤT SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT Chất sinh trưởng là những chất hữu cơ cần thiết đối với hoạt động sống mà một loài vi sinh vật nào đó không tự tổng hợp được ra chúng từ các chất khác. Cùng một chất có thể hoàn toàn không cần thiết đối với loài sinh vật này vì chúng có thể tự tổng hợp được chất đó nhưng lại có tác dụng kích thích sinh trưởng với vi sinh vật khác nếu vi sinh vật đó tự tổng hợp được nhưng nhanh chóng tiêu thụ hết hoặc có thể là rất cần thiết đối với quá trình sinh trưởng của chúng nếu như chúng hoàn toàn không có khả năng tự tổng hợp chất đó. Nhu cầu về chất sinh trưởng ở vi sinh vật cũng giống như là nhu cầu vitamin ở người và động vật. Đặc điểm của môi trường sống một mặt ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp chất sinh trưởng của vi sinh vật, mặt khác ảnh hưởng hưởng đến đặc điểm trao đổi chất của chúng. Chính thông qua những ảnh hưởng này mà môi trường sống của từng loài vi sinh vật đã góp phần quyết định nhu cầu về chất sinh trưởng của chúng. Khi sống lâu dài trong môi trường thiếu chất sinh trưởng, vi sinh vật sẽ dần dần tạo ra khả năng tự tổng hợp các chất sinh trưởng mà chúng cần thiết. Mặt khác, do sống trong các điều kiện môi trường khác nhau, các loại vi sinh vật có thể sẽ có những kiểu trao đổi chất khác nhau cũng có nghĩa là đòi hỏi các hệ thống enzim khác nhau do đó đòi hỏi các chất sinh trưởng khác nhau. Việc một loại vi sinh vật không đòi hỏi một chất sinh trưởng nào đó có thể do hai nguyên nhân: một là vi sinh vật này không tự tổng hợp ra được chất sinh trưởng đó, hai là quá trình trao đổi chất của loại vi sinh vật này không có sự tham gia của loại coenzim chứa chất sinh trưởng đó. 58
Bảng 2. Một số vitamin cấn thiết cho sự dinh dưỡng của vi sinh vật Vitamin Dạng coenzim Chức năng Tiamin (Anevrin, B1) Tiamin pirophotphat (TPP) Oxi hóa và khử cacboxyl, các ketoaxit, chuyển nhóm aldehit Riboflavin (Lactoflavin, B2) Flavinmononucleoitit Chuyển hidro (FMN), flavin adenindinucleotit (FAD) Axit Pantotenic (B3) CoenzimA Oxi hóa ketoaxit và tham gia vào trao đổi chất của axit béo Niaxin (A. Nicotinic, Nicotin adenindinucleotit Khử hidro và chuyển hidro Nicotinamit, B5) (FAD) và NADP Piridoxin (Piridoxal, Piridoxal photphat Chuyển amin, khử amin, khử Piridoxamin, B6) cacboxyla raxemin hóa axit amin. Biotin (B7, H) Biotin Chuyển CO2 và nhóm cacboxilic Axit Folit (Folaxin, B9, M, Axit tetrahidrofolic Chuyển đơn vị 1 cacbon, chuyển Bc) CO2 các nhóm cacboxilic Axit APAB Axit tetrahidrofolic Chuyển đơn vị 1 cacbon (Paraaminobenzoic, B10) Xianocobalamin Metilxianocobalamit Chuyển nhóm metyl (Cobalamin, B12) Axit lipoic Lipoamit Chuyển nhóm axyl và nguyên tử hidro Axit ascocbic (vitamin C) - Là cofacto trong hidroxyl hóa Ecrocanxiferol (vitamin D2) 1,25- Trao đổi canxi và photpho dihidroxicolecanxiferol (Theo Nguyễn Lân Dũng, 2000) Cùng một loài sinh vật nhưng nếu được nuôi cấy trong các điều kiện khác nhau cũng có thể có những nhu cầu khác nhau về chất sinh trưởng. Chẳng hạn nấm mốc Mucorouxi được chứng minh chỉ cần biotin và tiamin khi phát triển trong điều kiện kị khí. Điều kiện pH và nhiệt độ của môi trường nhiều khi cũng ảnh hưởng rõ rệt đến nhu cầu và chất sinh trưởng của vi sinh vật. Sự có mặt của một số chất dinh dưỡng khác có khi cũng ảnh hưởng đến nhu cầu về chất sinh trưởng của vi sinh vật. Thông thường các chất được coi là chất sinh trưởng đối với một loại nào đó có thể thuộc về một trong các lọai sau: các gốc kiềm purin, pirimidin và các dẫn xuất của chúng, các acid béo và các thành phần của màng tế bào, các vitamin thông thường. Hàm lượng các chất sinh trưởng cần thiết cũng khác nhau giữa các loài vi sinh vật. Vi sinh vật có sự khác nhau rất lớn về nhu cầu vitamin. Vai trò của một số vitamin trong hoạt động sống của vi sinh vật được tóm tắt ở bảng 2. 59
5.6 CƠ CHẾ VẬN CHUYỂN CÁC CHẤT QUA MÀNG TẾ BÀO VI SINH VẬT Tế bào vi sinh vật thường xuyên trao đổi vật chất và năng lượng với môi trường bên ngoài để nhận các chất dinh dưỡng cần thiết từ môi trường và thải ra các sản phẩm trao đổi chất. Tế bào vi sinh vật nhận và thải các chất qua màng tế bào chất một cách chọn lọc tuân theo một trong hai cơ chế: (1) khuếch tán đơn giản hay còn gọi là vận chuyển thụ động và (2) cơ chế vận chuyển không gian đặc biệt. - Theo cơ chế khuếch tán thụ động các phân tử đi từ màng nhờ sự chênh lệch nồng độ trong trường hợp các hợp chất không điện phân hay chênh lệch điện thế (trong trường hợp các ion) ở hai phía của màng. - Đa số các chất hòa tan qua màng do tác dụng của các cơ chế vận chuyển đặc biệt: những phân tử vận chuyển sắp xếp trong màng liên kết với các phân tử chất hoà tan rồi chuyển chúng vào bề mặt bên trong của màng, từ đây các phân tử chất hòa tan được chuyển vào tế bào chất. Sự vận chuyển đặc biệt các chất qua màng có thể cần hoặc không cần năng lượng của tế bào. 5.7 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT Môi trường nuôi cấy vi sinh vật rất đa dạng về hình thức và thành phần tùy theo đặc tính sinh lý và sinh hoá của loài vi sinh vật và mục đích của quá trình nuôi cấy. Hai loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật phổ biến nhất là: 1. Môi trường nuôi cấy tự nhiên: còn được gọi là môi trường thực nghiệm là những môi trường có sẵn trong tự nhiên như sữa, nước trích thịt bò, nước trích các loại rau củ hoặc ngũ cốc chứa đựng nhiều chất hữu cơ và vô cơ tan trong nước có thể đáp ứng được yêu cầu về dưỡng chất của một số lớn vi sinh vật. Môi trường nuôi cấy tự nhiêu có ưu điểm là rẻ tiền nhưng có nhược điểm là không thể biết chính xác thành phần dinh dưỡng. 2. Môi trường nuôi cấy tổng hợp: có các thành phần dinh dưỡng của môi trường được biết rõ và được kiểm soát về hàm lượng và chất lượng. Môi trường này cho phép người nuôi cấy vi sinh vật theo dõi một cách dễ dàng tác động của chất dinh dưỡng đối với vi sinh vật, đặc biệt là những loài vi sinh vật đã được biết rõ. Tuy nhiên môi trường nuôi cấy tổng hợp rất đắt tiền, chỉ sử dụng cho từng loài vi sinh vật thích hợp, chuẩn bị khá phức tạp và tốn nhiều thời gian. Tài liệu tham khảo: 1. Kenneth Todar, 2001. Nutrient and growth of bacteria. Department of Bacteriology. University of Wisconsin-Madison. 2. Phạm Văn Kim, 2001. Giáo trình vi sinh đại cương. Khoa Nông nghiệp, Đại học Cần thơ. 3. Nguyễn Lân Dũng, 2000. Vi Sinh Vật học. Nhà xuất bản giáo dục. 4. Madigan, M.T., Martinko, J.M. and Parker, J., 2002. Biology of Microorganisms. Tenth edition, Prenhall. 60
Chương 6 SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT Ở vi sinh vật, sinh trưởng là sự tăng kích thước và khối lượng tế bào, còn phát triển là sự tăng số lượng tế bào. Trong số các vi sinh vật thì sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn được nghiên cứu sâu rộng. Sinh trưởng và phát triển ở các vi sinh vật khác, chủ yếu là ở vi sinh vật đơn bào, không khác lắm so với ở vi khuẩn, những kiến thức chung về sinh trưởng và phát triển ở vi khuẩn có thể ứng dụng vào các vi sinh vật khác. Điều cần chú ý là khi nói về sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn tức là đề cập đến sinh trưởng và phát triển của một số lượng lớn tế bào của cùng một loại vì việc nghiên cứu ở một tế bào vi khuẩn quá nhỏ là rất khó. Khi xác định số lượng hoặc khối lượng của vi khuẩn ta thường dùng dịch treo đồng đều của các tế bào trong môi trường dịch thể nào đó mà xác định nồng độ vi khuẩn (số tế bào/ml) hoặc mật độ vi khuẩn (mg/ml). Từ kết quả đó các chỉ số này có thể tính bằng hằng số tốc độ phân chia tế bào (thể hiện bằng số lần tăng đôi nồng độ vi khuẩn sau một giờ) và đại lượng ngược lại, tức thời gian thế hệ (thời gian cần cho số lượng tế bào trong một quần thể vi khuẩn tăng gấp đôi). 6.1 ĐƯƠNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT Trong một mẻ nuôi cấy thích hợp vi khuẩn thường tăng trưởng theo 4 giai đoạn chính là giai đoạn chuẩn bị, giai đoạn tăng trưởng nhảy vọt, giai đoạn ổn định và giai đoạn chết (hình 65). Hình 65. Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật 61
6.1.1 Giai đoạn chuẩn bị (pha lag): Từ lúc bắt đầu cấy đến khi vi khuẩn đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại. Ở giai đoạn này vi khuẩn chưa phân chia (chưa gia tăng mật số) nhưng thể tích và khối lượng tế bào tăng lên rõ rệt do quá trình tổng hợp các chất diễn ra mạnh mẽ. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự phát tirển của vi khuẩn trong giai đoạn này. Đáng lưu ý nhất là 3 yếu tố sau đây: - Tuổi giống cấy: tuổi của quần thể giống cấy tức là chúng đang ở giai đoạn sinh trưởng nào. Thực nghiệm chứng minh nếu giống cấy ở pha lag thì pha lag sẽ ngắn. Ngược lại nếu giống cấy ở pha log hay pha tử vong thì pha lag sẽ kéo dài. - Lượng cấy giống : lượng cấy giống nhiều thì pha lag ngắn và ngược lại. - Thành phần môi trường: môi trường có thành phần dinh dưỡng phong phú (thường là có môi trường có cơ chất thiên nhiên) thì cho pha lag ngắn. 6.1.2 Giai đoạn tăng trưởng nhảy vọt (pha log): Vi sinh vật bắt đầu nhân mật số lên theo cấp số nhân. Kích thước của tế bào, thành phần hóa học, hoạt tính sinh lý của vi khuẩn không thay đổi theo thời gian. Tế bào ở trạng thái động học và được gọi như là “những tế bào tiêu chuẩn”. 6.1.3 Giai đoạn ổn định (pha ổn định): Mật số vi sinh vật không tăng thêm mà giữ ở mức ổn định. Trong pha này quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào củ chết đi. Kết quả là tế bào và cả sinh khối không tăng cũng không giảm. Tốc độ sinh trưởng bây giờ phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. 6.1.4 Giai đoạn chết (pha tử vong): Mật số vi sinh vật sống giảm dần. Trong pha này số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa (mặc dù số lượng tế bào sống tổng cộng có thể không giảm). Đôi khi các tế bào bị tự phân nhờ các enzim của tự bản thân. Ở các vi khuẩn sinh bào tử hình thành phức tạp hơn do qua trình hình thành bào tử. 6.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SỰ TĂNG TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT 6.2.1 Các phương pháp xác định số lượng tế bào Trong một quần thể vi khuẩn không phải mọi tế bào đều có khả năng sống. Những vi khuẩn gọi là sống phải tạo thành khuẩn lạc trên hoặc trong môi trường thạch và phát triển trong môi 62
trường dịch thể. Do đó tùy theo mục đích thí nghiệm ta có thể xác định lượng tế bào vi khuẩn tổng cộng bao gồm tế bào sống và chết hoặc chỉ xác định số lượng tế bào sống. 1. Để xác định số lượng tế bào tổng cộng người ta thường dùng phương pháp đếm tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi nhờ các buồng đếm. 2. Có thể dùng những kỹ thuật nhuộm đặc biệt để phân biệt tế bào sống và tế bào chết. Do tế bào sống có màng sinh chất hoạt động, không thấm thuốc nhuộm nên hai loại tế bào bắt màu không giống nhau. Chẳng hạn đỏ congo chỉ nhuộm màu tế bào chết, còn tế bào sống không ăn màu. 3. Trong trường hợp xác định số tế bào sống người ta thường đếm số khuẩn lạc tạo thành bởi các vi khuẩn sống trong điều kiện sinh trưởng thuận lợi. Dịch treo vi khuẩn được pha loãng vào một thể tích nhất định được tán lên môi trường thạch trong đĩa petri. Sau khi nuôi cấy người ta đếm số khuẩn lạc mọc. Do mỗi tế bào sống sẽ tạo thành một khuẩn lạc, nên khi đếm số khuẩn lạc ta được số tế bào sống. Tuy nhiên điều này không đúng với các vi khuẩn mọc thành chuỗi, thành đôi hay thành đám hoặc đối với dịch treo vi khuẩn không đồng nhất. Với một số loài vi khuẩn khó phát triển trên môi trường thạch thì kiểm tra số lượng vi khuẩn bằng phương pháp pha loãng liên tục, sau đó cấy từ mỗi độ pha loãng 1ml vào từng ống đựng môi trường chỉ thị. Có thể cấy vào 5 ống và lấy số liệu ở 3 độ pha loãng cuối có phản ứng dương tính rồi tra bảng để tìm ra số lượng gần đúng mật độ vi khuẩn. Phương pháp này được gọi là phương pháp đếm số lượng có khả năng nhất (MPN). Ngoài ra, còn có thể lọc chất dịch qua màng lọc vi khuẩn rồi đặt màng lọc lên đĩa petri chứa môi trường thạch để kiểm tra số khuẩn lạc mọc và suy ra mật độ vi sinh vật trong chất dịch. 6.2.2 Các phương pháp xác định sinh khối tế bào Việc chọn phương pháp để xác định sinh khối vi khuẩn tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu. Chẳng hạn, muốn đánh giá sản lượng tế bào thì ta cần sinh khối tươi hoặc khô sau khi đã ly tâm tế bào. Muốn xác định cường độ trao đổi chất hay hoạt tính men, người ta tính hàm lượng protein hay nitơ. Trong thực tế có thể sử dụng các phương pháp trực tiếp hay gián tiếp: 6.2.2.1 Các phương pháp trực tiếp - Xác định sinh khối tươi hoặc sinh khối khô (phương pháp này kém chính xác) - Xác định hàm lượng nitơ tổng số theo phương pháp micro- kjehdal và phương pháp xác định NH3 hay hàm lượng cacbon tổng số theo phương pháp của Van Slike- Folch (các phương pháp này cho độ chính xác cao). - Xác định hàm lượng protein của vi khuẩn bằng phương pháp Biure cải tiến hoặc phương pháp so màu. Các phương pháp vi lượng dựa vào việc đo số lượng các thành phần đặc trưng của protein như tirozin, triptophan (theo phương pháp của Lowry hoặc Folin-Ciocalteu). Xác định hàm lượng protein trong sinh khối là phương pháp thích 63