Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy lông gia súc - Lông gia cầm từ các lò mổ gia súc ở ba huyện Tam Bình, Long Hồ và Vũng Liêm tỉnh Vinh Long

Nội dung text: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy lông gia súc - Lông gia cầm từ các lò mổ gia súc ở ba huyện Tam Bình, Long Hồ và Vũng Liêm tỉnh Vinh Long

1. Tap̣ chı́ Khoa hoc̣ Trườ ng Đaị hoc̣ Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦ Y LÔNG GIA SÚ C - LÔNG GIA CẦ M TỪ CÁ C LÒ MỔ GIA SÚ C Ở BA HUYÊṆ TAM BÌNH, LONG HỒ VÀ VŨNG LIÊM TỈNH VINH̃ LONG Quách Thi ̣Thanh Tâm1 và Bùi Thi ̣Minh Diêụ 2 1Trường Cao đẳng Cộng đồng Vĩnh Long 2Viêṇ Nghiên cứ u & Phá t triển Công nghê ̣Sinh hoc,̣ Trường Đại học Cần Thơ ABSTRACT Thông tin chung: Ngày nhận: 08/05/2015 Every year, there are thousands of tons of livestock and poultry hair waste that have Ngày chấp nhận: 21/12/2015 not been processed in Vietnam. The keratin is the main structural component of animal hair quite hard to decompose in nature. The aim of this study was to isolate Title: and screen keratin degrading bacteria from waste samples collected from animal Isolation and selection of slaughter-house. These samples were serially diluted and plated on pig-hair- animal fur and feather containing medium for isolating and screening of efficient hair-degrading bacteria. degrading bacteria from The forty seven isolates showed their animal-hair-degrading ability with most of them presented white color colonies were selected. All isolates got keratinase with animal slaughter-house in o Vinh Long azokeratin substrate reaction at 50 C for 15 minutes. Strain Kr42 had the highest keratinase activity with 114.3 U/ml. The isolates designated as Kr11, and Kr45 revealed significant differences among differentials with the highest rates as 37.66% Từ khóa: and 29.41%, respectively in animal-hair-degrading ability. In feather-containing Azokeratin, Bacillus flexus, medium, Kr45 was the best with 72.79% of degrading rates. Bergey’s method and the Bacillus megaterium, keratin modern method of 16S rRNA gene sequences indicated that the isolate Kr11 was closely related to Bacillus flexus and the isolate Kr45 was closely correlated to Keywords: Bacillus megaterium. Azokeratin, Bacillus flexus, Bacillus megaterium, keratin TÓM TẮT Hàng năm, tại Việt Nam có hàng ngàn tấn lông gia súc, lông gia cầm thải ra môi trường mà chưa được xử lý. Keratin là thành phần cấu tạo chính của lông gia súc, gia cầm và là hợp chất rất khó bị phân hủy trong tự nhiên. Vì vậy, nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy mạnh các loại cơ chất chứa keratin này từ mẫu đất, mâũ lông và nước thải thu ở lò giết mổ gia sú c thuộc tı̉nh Vınh̃ Long. Các mẫu vật được pha loãng và nuôi cấy trên môi trường chứa bột lông heo như nguồn carbon và nitơ duy nhất để phân lập vi khuẩn. Kết quả phân lập được 47 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông heo với đa số các dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng đục. Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều cho hoạt tính keratinase với cơ chất azokeratin ở 50C sau 15 phút phản ứng. Dòng Kr42 có hoạt độ keratinase cao nhất là 114,3U/ml và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng vi khuẩn còn lại. Bên cạnh đó, dòng Kr11 và Kr45 cho kết quả phân hủy lông heo tốt nhất và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại với tỷ lệ phân hủy lần lượt là 37,66% và 29,41%. Dò ng Kr45 có khả năng phân hủy lông gia cầm tốt nhất vớ i tỷ lê ̣ 72,79%. Kết hơp̣ giữa phương phá p đinḥ danh của Bergey (John et al, 1994) và phương phá p đinḥ danh hiêṇ đaị dưạ và o trình tự của đoạn gen 16S rRNA đã cho kết luâṇ dòng vi khuẩn Kr11 có quan hê ̣ gần với loà i Bacillus flexus và dò ng vi khuẩn Kr45 có tương quan gần vớ i loà i Bacillus megaterium. 1
2. Tap̣ chı́ Khoa hoc̣ Trườ ng Đaị hoc̣ Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 2.2 Phương phá p Lông gia súc và lông gia cầm có thành phần 2.2.1 Phân lập vi khuẩn có khả năng phân chính là keratin rất khó phân hủy và chiếm tỉ lệ khá giải keratin trên môi trường bột lông heo: lớn trong nguồn rác thải từ các lò giết mổ trở thành Đất đươc̣ đào sâu khoảng 20 cm ở ngay cơ sở một nguồn ô nhiễm nghiêm trọng (Gupta và giết mổ gia súc để thu khoảng 10 g mẫu đất. Mâũ Ramnani, 2006). Đã có nhiều phương pháp được lông đươc̣ thu khoảng 10 g mâũ lông đang phân áp dụng để xử lý các lông này như chôn, đốt bỏ huỷ trong đất ở ngay cơ sở giết mổ gia súc. Mẫu hoặc làm thức ăn gia súc (Tapia và Contiero, nước đươc̣ tiến hành thu tại nơi trực tiếp thải nguồn 2008). Tuy nhiên, chi phí cho phương pháp đốt nước ra (nơi nước tĩnh, đọng lại) và thu khoảng 50 hoặc chôn khá cao và còn gây ô nhiễm cho môi ml nước. Các mẫu được cho vào túi nilon sạch, loại trường đất, nước và không khí; còn việc sử dụng dùng một lần, ghi nhãn đem về phòng thí nghiệm bột lông xay nhuyễn làm thức ăn gia súc thì cho tỉ giữ ở nơi mát đến khi tiến hành phân lập. lệ tiêu hóa rất thấp (Joshi et al., 2007). Các nghiên cứu trong nước về vi sinh vật có khả năng phân Chuẩn bị cơ chất chứa keratin, đối vớ i bột lông giải keratin đã đạt được những thành công nhưng heo: lông heo được thu tại các lò giết mổ tại tỉnh số lượng nghiên cứu còn ít và đều tập trung ở phía Vĩnh long, rử a sạch tạp chất, sấy khô, loại bỏ da và Bắc-vùng khí hậu khá khác biệt với Đồng bằng các tạp chất còn lại, sau đó cắt nhuyễn khoảng 1,5 sông Cử u Long. Do đó, việc phân lập và tuyển mm; đối vớ i bột lông gia cầm: lông gà và lông vịt chọn vi khuẩn có khả năng phân huỷ lông gia súc được thu tại các lò giết mổ gia cầm tại tỉnh Vĩnh và lông gia cầm từ các lò giết mổ gia súc ở tı̉nh Long, rử a sạch loại bỏ tạp chất, sấy khô, xay Vınh̃ Long là nghiên cứu cần thiết nhằm tìm kiếm nhuyễn, trộn với tỷ lệ 1: 1. các dòng vi khuẩn phân huỷ lông gia súc, lông gia Cân 1 g mẫu đối với đất, lông hoặc hút 10 ml cầm mạnh để phục vụ cho sản xuất chế phẩm sinh đối với mẫu nước cho vào bình tam giác 250 ml học giúp chế biến nguồn chất thải này thành phân chứa 99 ml (90 ml đối với mẫu nước) môi trường hữu cơ sinh hoc̣ hoăc̣ sản phẩm bổ sung protein với lỏng có bổ sung bột lông heo ủ ở 30C trên máy lắc độ hấp thu cao làm thức ăn cho cá, gia súc, gia (120 vòng/phút) trong vòng 24 giờ nhằm tăng sinh cầm; đồng thời giúp giảm thiểu ô nhiễm môi khối các vi khuẩn trong mẫu. Thu lấy dịch chứa vi trường từ ngành chăn nuôi. Ngoài ra, tương lai còn khuẩn, bỏ phần cặn lắng. có thể phát triển để sản xuất keratinase với nhiều ứng dụng cho các ngành công nghiệp nhẹ khác. Dịch môi trường được pha loãng từ nồng độ 100 đến nồng độ 10-10, trải lên môi trường khoáng có Trong nghiên cưu nay, các mẫu đất, nước và ́ ̀ bổ sung bột lông, ủ ở 30C trong vòng 2 ngày. Các lông hoai mục được thu thập tại các lò giết mổ gia khuẩn lạc mọc to, rõ rệt sẽ được chọn để cấy súc ở 3 huyêṇ Tam Bı̀nh, Long Hồ và Vũng Liêm, chuyển trên môi trường bột lông heo cho đến khi tỉnh Vĩnh Long. Các dòng vi khuẩn có khả năng ròng. Các mẫu ròng sau đó được trữ trong ống môi phân giải keratin được phân lập trên môi trường trường thạch nghiêng có cùng thành phần ở 4C. bột lông và được chọn lọc dựa vào hoạt tính (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010) keratinase, khả năng phân hủy lông gia cầm và lông heo. Các dòng vi khuẩn tuyển chọn được định 2.2.2 Đánh giá khả năng phân hủy bột lông danh dựa vào đặc điểm hình thái, đặc tính sinh hóa heo của các dòng vi khuẩn: và trình tự đoạn gen 16S rDNA. Đối với mỗi dòng vi khuẩn, chuẩn bị một bình 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP thủy tinh 75 ml chứa 25 ml môi trường bột lông heo với thành phần như môi trường phân lập và 2.1 Vật liệu được khử trùng ở 121C trong 10 phút. Lần lượt Tiến hành lấy mâũ ở 7 lò giết mổ gia súc taị ba chủng vào mỗi bình thủy tinh 1,15 ml dịch nuôi vi huyện Tam Bı̀nh, Long Hồ và Vũng Liêm tỉnh khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được, ủ ở Vĩnh Long, Mỗi lò giết mổ gia súc thu 1 mâũ nướ c, 30C trên máy lắc (120 vòng/phút). Một bình thủy 1 mâũ lông và 1 mâũ đất. tinh với cùng thể tích môi trường nhưng không Cơ chất chứa keratin: bột lông heo, bột lông chủng vi khuẩn mà thay bằng 1,15 ml nước cất vô gia cầm. trùng được sử dụng làm mẫu đối chứng. Sau 7 2
3. Tap̣ chı́ Khoa hoc̣ Trườ ng Đaị hoc̣ Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 ngày nuôi lắc, tiến hành lọc và rửa môi trường qua pH 7,5. Azokeratin được rửa một lần nữa với nước vải lọc đã được khử trùng và cân khối lượng trước và làm khô qua đêm trong chân không ở 500C. đó, cân lượng bột lông còn lại sau khi đã lọc và sấy Trữ lạnh azokeratin (4-100C) để sử dụng trong khô ở 60C đến khối lượng không đổi để tính khối thời gian dài. (Areeb et al., 2012) lượng bột lông đã bị phân hủy trong quá trình nuôi cấy. (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010) Đo hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn trên cơ chất Azo-keratin Khả năng phân hủy bột lông heo của vi khuẩn được tính theo công thức sau: (Nguyễn Huy Hoàng Cho 5 mg azokeratin vào ống nghiêṃ et al., 2010) eppendorf 1,5 ml cùng với 0,8 ml dung dịch đệm potassium phosphate 50 mM, pH = 7,5. Đảo đều A (%) = (m - m ) x 100 / m BĐ C BĐ hỗn hợp trên cho đến khi azokeratin tan hoàn toàn. Trong đó: A (%) là tỉ lệ bột lông heo bị phân Thêm 0,2 ml dịch keratinase thô vào dung dịch hủy bởi vi khuẩn; azokeratin, trộn và ủ lắc trong 15 phút ở 50oC. Kết mBĐ: là khối lượng bột lông ban đầu; thúc phản ứng bằng cách thêm vào ống nghiêṃ eppendorf 0,2 ml acid trichloroacetic 10%. Hỗn mC : là khối lượng bột lông còn lại sau khi bị phân hủy. hợp được lọc và phân tích bằng cách đo ở bước sóng 450 nm với máy hấp thụ quang phổ Thermo 2.2.3 Đánh giá khả năng phân hủy bột lông Spectronic genesys 10 UV. Mẫu đối chứng được gia cầm của các dòng vi khuẩn chuẩn bị bằng cách thêm 0,2 ml acid trichloroacetic Thí nghiệm khảo sát khả năng phân hủy bột 10% trước khi cho dịch keratinase thô. Đơn vị hoạt lông gia cầm của các dòng vi khuẩn phân lập được động của keratinase được xác định là số lần tăng độ tiến hành tương tự như khảo sát khả năng phân hủy hấp thụ ở bước sóng 450 nm sau 15 phút phản ứng bột lông heo, nhưng với cơ chất là bột lông gia so với 0,01. (Areeb et al., 2012) cầm. 2.2.5 Đinḥ danh các dòng vi khuẩn được 2.2.4 Đánh giá hoạt tính keratinase của các tuyển chọn dòng vi khuẩn Một dòng vi khuẩn thể hiện khả năng phân hủy Tạo Azo-keratin bột lông gia súc và một dòng vi khuẩn phân hủy bột lông gia cầm mạnh nhất được tuyển chọn và Phương pháp này được thực hiện tương tự như được giải trình tự đoạn gen 16S rRNA, đối chiếu các bước trong quy trình tạo azoalbumin: với dữ liệu trên GenBank bằng công cu ̣ BLAST để Bột lông gia cầm được nghiền thật mịn, cho 1 g xác định mức độ tương đồng về trình tự của đoạn vào bình tam giác 100 ml; Cho vào 20 ml nước đã gen này với các dòng vi khuẩn đã được công bố. khử ion, dùng khuấy từ trộn đều hỗn hợp; Cho tiếp Qui trình được thực hiện như sau: ly trích DNA vào hỗn hợp 2 ml NaHCO3 10% (w/v), khuấy đều. của vi khuẩn; kiểm tra độ tinh sạch của DNA đã trích được bằng phương pháp đo quang phổ hấp Dùng ống nghiệm 10 ml, cho vào 174 mg thụ OD (Optical density); thực hiện phản ứng PCR sulfanilic acid hòa tan trong 5 ml NaOH 0.2 N. với cặp mồi phổ biến (8F – 1391R) dùng để Tiếp tục cho 69 mg NaNO2 hòa tan vào dung dịch. khuếch đại đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn Thêm vào 0,4 ml HCl 5N. Lắc đều trong 2 phút, (Baker et al., 2003) có trình tự như sau: sau đó trung hòa bởi 0,4 ml NaOH 5N. Mồi xuôi 8F: Cho tất cả phần dung dịch trong ống nghiệm 10 ml vào bình tam giác 100 ml có bột lông gia cầm 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ đã chuẩn bị ở trên, trộn đều trong 10 phút. Lọc hỗn Mồi ngược 1391R: hợp phản ứng bằng giấy lọc Whatman – số 1, phần 5′-GACGGGCGGTGWGTRCA -3′ azokeratin không tan được rửa hoàn toàn với nước khử ion. Azokeratin sẽ được hòa lơ lửng trong Kiểm tra kích thước sản phẩm PCR bằng nước, được lắc đều ở 50 0C trong 2 giờ và được lọc phương pháp điện di trên gel agarose 1,5% có lại lần nữa. Chu kỳ rửa được lặp lại cho đến khi pH nhuộm Ethidium bromide ở hiệu điện thế 80V của dịch rửa 6,0 – 7,0 và sự hấp thụ quang phổ của trong 50 phút, với thang chuẩn DNA 100 bp dung dịch ở bước sóng 450 nm nhỏ hơn 0,01. Cuối (Fermentas, USA). Sản phẩm từ phản ứng PCR cùng, chu trình rửa được lặp lại ít nhất hai lần sử được giải trình tự tại phòng thí nghiệm Sinh học dụng dung dịch đệm potassium phosphate 50 mM Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trườ ng Đại học Cần Thơ. So sánh trình 3
4. Tap̣ chı́ Khoa hoc̣ Trườ ng Đaị hoc̣ Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 tự rRNA thu được với dữ liệu trên GenBank ở trang web ( Dựa vào tỉ lệ tương đồng của trình tự đoạn gen 16S rRNA, kết hợp với các đặc tính hình thái và sinh hóa (theo hệ thống phân loaị Bergey) để xác định loài của hai dòng vi khuẩn được tuyển chọn. 2.2.6 Khảo sát khả năng phân hủy sợi lông gà Kr21 của cá c dòng vi khuẩn phân lập được Chọn những chiếc lông gà cùng loại có khối lượng tương đương (khoảng 10g), sấy khô ở 50oC trong vòng 2 ngày. Cho mỗi chiếc lông vào ống nghiệm chứa 20 ml môi trường gồm NaCl 0,5g/l, KH2PO4 0,4 g/l, K2HPO4 0,3 g/l, NH4Cl 0,5 g/l, sao cho toàn bộ chiếc lông bị ngập trong môi Hınh̀ 1: Hình thái khuẩn lạc của dòng vi khuẩn trường, khử trùng ở 121oC trong 10 phút. Mỗi ống Kr21 nghiệm được chủng vào 4 ml dịch huyền phù vi Bảng 1: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn, ủ ở 120rpm ở mức nhiệt độ 37oC đã khảo khuẩn hiếu khí phân lập được sát. Quan sát và ghi nhận thời gian làm gãy rụng Số lương̣ lông đối với dòng vi khuẩn tuyển choṇ trong 10 Đặc điểm Hình thái % tuần. khuẩn lac̣ 2.2.7 Phân tích kết quả và xử lý thống kê Hồng nhạt 1 2,13 Trắng đục 33 70,21 Mau sắ c Các kết quả trung bình các lần lặp lại và vẽ biểu ̀ Trắng trong 9 19,15 đồ bằng phần mềm Microsoft Excel 2010. Số liêụ Vàng trong 4 8,51 đươc̣ xử lý bằng phần mềm thống kê Minitab Hình dạng Tròn 47 100,00 version 16.2.1 bằng phép thử DUNCAN và LSD ở Nguyên 19 40,43 Kiểu bìa mứ c đô ̣5%. Răng cưa 28 59,57 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Mô 30 63,83 Độ nổi Lài 12 25,53 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Phẳng 5 10,64 Từ 21 mẫu (7 mẫu đất, 7 mẫu nước, 7 mẫu 3.2 Kết quả kiểm tra hoạt tính keratinase lông) thu tại các lò giết mổ gia súc ở huyêṇ Tam bằng cơ chất azokeratin Bı̀nh, Long Hồ, Vũng Liêm của tỉnh Vĩnh Long đã phân lập được 47 dòng vi khuẩn trong điều kiện Sau 2 ngày lắc ủ (đã đồng nhất mật số vi hiếu khí. Tất cả các dòng này đều có khả năng phát khuẩn), enzyme thô được lọc và ly tâm để thực triển trên môi trường khoáng cơ bản có bổ sung bột hiện phản ứng với cơ chất azokeratin. Kết quả tính lông heo như nguồn carbon và nitơ duy nhất, hoạt độ enzyme keratinase của các dòng vi khuẩn chứng tỏ chúng có khả năng sử dụng bột lông heo được thể hiện trong Hình 2. Kết quả cho thấy hầu cho sự phát triển (Daniel et al., 2009). Sau khi như tất cả các dòng vi khuẩn đều cho phản ứng với phân lập ròng, các dòng vi khuẩn được cấy trên cơ chất azokeratin. Trong đó, dòng Kr42 cho hoạt môi trường đặc có cùng thành phần để quan sát tính cao nhất với 114,33U/ml, khác biệt có ý nghĩa hình thái khuẩn lạc. Thời gian trung bình để tế bào thống kê ở mức 5% so với tất cả các dòng vi khuẩn vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường còn lại. Các dòng Kr37, Kr30, Kr24 thuộc nhóm có phân lập là từ 24 – 48 giờ. Đặc điểm về hình thái hoạt độ keratinase thấp nhất, khác biệt có ý nghĩa khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn được mô tả trong thống kê ở mức 5% và thấp hơn khoảng 68 – 114 Bảng 1. lần so với dòng cho hoạt tính cao nhất là Kr42. 4
5. Tap̣ chı́ Khoa hoc̣ Trườ ng Đaị hoc̣ Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 Hoạt đô ̣keratinase (U/ml) Hình 2: Hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn Ghi chú: - Số liệu thống kê trên hình là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. - Các giá trị trung bình có các mẫu tự theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%.(theo phé p thử Duncan) 5
6. Tap̣ chı́ Khoa hoc̣ Trườ ng Đaị hoc̣ Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 Hoạt tính keratinase ở dòng Kr42 cao hơn so keratinase thu đươc̣ có thấp hơn so vớ i nghiên cứ u với hoạt tính keratinase thô trong nghiên cứu của của Savitha et al. (2010), tuy nhiên enzyme từ dòng Mozammel et al. (2005) với các mức 58,1U/ml ở B. licheniformis KI8102 ở nghiên cứu này là dòng Baccilus subtilis MZK-7 và 39U/ml ở dòng keratinase tinh sạch (hoạt tính 500 U/ml). Bacillus licheniformis ATCC 9945, hay 33,9U/ml 3.3 Khả năng phân hủy bột lông heo của ở Bacillus licheniformis MZK-3. Kết quả hoaṭ tı́nh các dòng vi khuẩn phân lập được Hınh̀ 3: Khả năng phân hủy bột lông heo của các dòng vi khuẩn Ghi chú: - ĐC: Mẫu đối chứng, không chủng vi khuẩn. - Số liệu thống kê trên hình là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. - Các giá trị trung bình ở mỗi thanh có các mẫu tự theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5% theo phé p thử Duncan. Kết quả khảo sát (hınh̀ 3) cho thấy các dòng vi lông heo sau 7 ngày nuôi cấy với mật số vi khuẩn khuẩn phân lập được đều có khả năng phân hủy chủng vào lúc đầu là 4 x 1011 (CFU/ml). Dòng 6
7. Tap̣ chı́ Khoa hoc̣ Trườ ng Đaị hoc̣ Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 Kr11 cho kết quả phân hủy bột lông heo cao nhất tích thống kê cũng cho thấy khả năng phân hủy 37,66%, kết quả phân hủy này cao gấp khoảng lông heo của hai dòng này khác biệt có ý nghĩa 34,24 lần so với kết quả phân hủy bôṭ lông heo ở thống kê ở mức 5% theo phép thử Duncan so với mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn; kế đến là mẫu đối chứng và với tất cả các dòng còn lại. dòng Kr45 với tỷ lệ phân hủy bôṭ lông heo là 3.4 Khả năng phân hủy bột lông gia cầm 29,4% cao gấp 26,73 lần so với tỷ lê ̣phân hủy bôṭ của các dòng vi khuẩn phân lập được lông heo ở mẫu đối chứng. Đồng thời, kết quả phân Tỷ lê ̣phân hủ y (%) Hình 4: Khả năng phân hủy bột lông gia cầm của cá c dòng vi khuẩn Ghi chú: - ĐC: Mẫu đối chứng, không chủng vi khuẩn. - Số liệu thống kê trên hình là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. - Các giá trị trung bình có các mẫu tự theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5% theo phé p thử Duncan 7
8. Tap̣ chı́ Khoa hoc̣ Trườ ng Đaị hoc̣ Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 phân hủy lông heo ở các dòng vi khuẩn cũng có thể Hình 4 thể hiêṇ khả năng phân hủy lông gia là do sự khác biệt về cấu trúc keratin giữa lông gia cầm của 47 dòng vi khuẩn phân lâp̣ đươc.̣ Kết quả súc ( -keratin) và lông gia cầm (-keratin) cũng khảo sát sau 7 ngày nuôi cấy cho thấy rằng cả 47 như hàm lượng sulfur (cầu nối disulfide) trong hai dòng vi khuẩn đều có khả năng phân hủy lông gia loại cơ chất này (Akhtar và Edwards, 1997). cầm. Dòng vi khuẩn Kr45 có khả năng phân hủy lông gia cầm mạnh nhất với tỷ lệ là 72,79%. và 3.5 Khả năng phân hủ y sợi lông gà nguyên khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với của 47 dòng vi khuẩn trong ống nghiệm mẫu đối chứng và với các dòng còn lại. Kết quả theo dõi sự làm rụng lông con trên sợi Kết quả thu đươc̣ thể hiêṇ khả năng phân hủy lông gà nguyên của 47 dòng vi khuẩn sau 10 ngày lông gia cầm cao hơn hẳn so với khả năng phân nuôi lắc cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn đều có hủy lông gia súc hầu như ở tất cả các dòng vi khả năng làm gãy rụng lông con trên sợi lông gà khuẩn tương ứng (Hình 3 và Hı̀nh 4), mặc dù nguyên. Trong đó, dòng Kr45 và dòng Kr11 bắt chúng được phân lập từ các lò giết mổ gia súc. đầu làm rụng lông con từ ngày thứ ba sau khi Điều này cho thấy khả năng phân hủy cơ chất chứa chủng và làm rụng toàn bộ lông con sau 10 ngày keratin không chỉ phụ thuộc vào dòng vi khuẩn và (chỉ còn lại lông ống) và làm tan ra ̃ toàn bộ sợi hoạt độ enzyme keratinase do chúng tạo ra, mà còn lông gà sau 10 tuần (Hình 5 và Hınh̀ 6). Các dòng phụ thuộc vào cấu trúc của keratin, chứ không bị còn lại cũng cho thấy khả năng làm rụng lông con ảnh hưởng nhiều từ nguồn phân lập. Sự khác biệt từ ngày thứ tư nhưng chưa đến 50% số lông con về khả năng phân hủy lông gia cầm và khả năng sau 10 ngày chủng. Kr45 ĐC Kr11 ĐC Hình 5: Sơị lông gà đã phân hủ y sau 10 tuần Hình 6: Sơị lông gà đã phân hủ y sau 10 tuần đươc̣ chủ ng dòng Kr45 so vớ i đố i chứ ng đươc̣ chủ ng dòng Kr11 so vớ i đố i chứ ng Ghi chú : ĐC- đối chứ ng : không chủng vi khuẩn 3.6 Kết quả định danh các dòng vi khuẩn bằng cách kết hơp̣ phương pháp truyền thống theo được tuyển chọn hê ̣ thống phân loaị Bergey và phương pháp hiêṇ đaị dựa vào trınh̀ tư ̣ gen 16S rRNA. Dòng vi khuẩn Kr11(đươc̣ phân lâp̣ từ mâũ đất ở lò giết mổ bò ở huyêṇ Tam Bı̀nh) phân huỷ lông Đăc̣ điểm sinh hoá của hai dòng vi khuẩn tuyển gia súc manḥ nhất và Kr45 (đươc̣ phân lâp̣ từ mâũ choṇ đươc̣ khảo sát để đinḥ danh theo phương pháp lông ở lò giết mổ bò ở huyêṇ Tam Bı̀nh) phân hủy truyền thống với hê ̣thống phân loaị Bergey. lông gia cầm manḥ nhất đươc̣ choṇ để đinḥ danh 8
9. Tap̣ chı́ Khoa hoc̣ Trườ ng Đaị hoc̣ Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 Bảng 2: Kết quả khảo sá t đăc̣ diểm của hai dòng vi khuẩn hiếu khı́ đươc̣ tuyển choṇ Dòng Khả năng Hình dạng Bào tử Catalase Gram Kıch thươc vi khuẩn (m) STT ́ ́ vi khuẩn di động tế bào Chiều dài Chiều rông̣ 1 Kr11 Có Que Có + + 3,2 1,0 2 Kr45 Có Que Có + + 4,1 1,5 thường xuyên). Như vây,̣ trong 35 nhóm vi khuẩn theo hê ̣ thống phân loaị Bergey (John et al., 1994), có 3 Vı̀ hai dòng VK đươc̣ tuyển choṇ là nhóm vi nhóm cho kết quả phù hơp̣ nhất là nhóm 18 khuẩn gram dương có bào tử (Bảng 2), nên chúng (nhóm vi khuẩn gram dương hınh̀ cầu hoăc̣ hı̀nh thuôc̣ nhóm 18. Dựa vào đặc tính của các nhóm vi que hı̀nh thành bào tử ); nhóm 19 (nhóm vi khuẩn khuẩn hình que, có khả năng chuyển đông̣ ở Bảng gram dương hı̀nh que không hı̀nh thành bào tử , 3 (trı́ch từ John et al., 1994) có thể nhâṇ ra 2 dòng thường xuyên) và nhóm 20 (nhóm vi khuẩn gram VK này không thuôc̣ nhóm Sporesarcina và nhóm dương hı̀nh que không hı̀nh thành bào tử , không Sulfidobacillus. Bảng 3: Phân biêṭ cá c đăc̣ tı́nh khá c nhau giữa cá c nhóm vi khuẩn có bào tử Đăc̣ tı́nh Amphibacillus Bacillus Clostridium Desulfotomaculum Oscillospira Sprohalobacter Sporolactobacillus Sporesarcina Sulfidobacillus Syntrophospora Hı̀nh que + + + + + + + - + + Khả năng chuyển đông̣ + + + + + + + + - ND Catalase - + - - ND - - + ND ND Ghi chú : + : dò ng dương tı́nh ; - : dò ng âm tı́nh ; ND: không xá c đinḥ Thưc̣ hiêṇ thử nghiêṃ catalase vớ i hai dòng vi trı̀nh tư ̣ gen 16S rRNA: DNA của chúng đươc̣ ly khuẩn đươc̣ tuyển choṇ đều cho kết quả dương tı́nh trı́ch và đoạn gen 16S rRNA được khuyếch đaị bằng ky thuâṭ PCR sư dung̣ căp̣ mồi 8F va 1391R. vớ i H2O2 và nhóm Bacillus đươc̣ xem là nhóm phù ̃ ̉ ̀ hơp̣ nhất về các đăc̣ tı́nh sinh hoá của hai dòng vi khuẩn Kr11 và Kr45. Kết quả khảo sát đăc̣ điểm của 2 dòng vi khuẩn ở Bảng 2 càng cho thấy rõ nhóm Bacillus là nhóm vi khuẩn phù hơp̣ nhất về các đăc̣ tı́nh sinh hoá của hai dòng vi khuẩn Kr11 và Kr45. Trı̀nh tư ̣ đoạn gen 16S rDNA của hai dòng vi khuẩn trên được xác định bằng phương pháp Sinh học Phân tử. DNA của chúng đươc̣ ly trı́ch và đoạn gen 16S rRNA được khuyếch đaị bằng kỹ thuâṭ Hınh̀ 7: Boṭ khı́ sinh ra khi khảo sá t hoaṭ tı́nh PCR sử dung̣ căp̣ mồi 8F và 1391R. catalase củ a dòng vi khuẩn Kr11 và Kr45 Kết hơp̣ vớ i phương pháp nhâṇ diêṇ dưạ vào 9
10. Tap̣ chı́ Khoa hoc̣ Trườ ng Đaị hoc̣ Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 1400bp Giếng 1: Thang chuẩn 1kp Giếng 2: mẫu Kr11 Giếng 3: mẫu Kr45 Giếng 4: Đối chứng âm Hình 8: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose củ a hai dòng vi khuẩn đươc̣ tuyển choṇ (Ngà y 12/12/2014) Bảng 4: Kết quả mối tương quan di truyền các dòng vi khuẩn phân giải keratin phân lập với các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI) Các dòng vi khuẩn phân lập Đại diện loài có quan hệ gần gũi Mã số Tỉ lệ tương đồng (%) Kr11 Bacillus flexus RB85 KJ623600 96 Kr45 Bacillus megaterium strain AIMST 3 HQ670528 97 lông ga nguyên hoan toan sau 10 tuần có tiềm năng Kết hơp̣ giưa phương phap đinḥ danh truyền ̀ ̀ ̀ ̃ ́ đưa vào thử nghiệm ứng dụng phân hủy lông gia thống Bergey va phương phap đinḥ danh hiêṇ đaị ̀ ́ cầm ở điều kiện môi trường tự nhiên để làm thức dưạ vao trình tự đoạn gen 16S rDNA của hai dòng ̀ ăn chăn nuôi. vi khuẩn được tuyển chọn với trình tự của các dòng vi khuẩn khác ở GenBank cho thấy chúng đều LỜI CẢM TẠ thuộc chi Bacillus, dong Kr11 co quan hê ̣ gần gui ̀ ́ ̃ Tác giả xin chân thành cảm ơn Viện Nghiên vơi Bacillus flexus RB85, dong Kr45 tương quan ́ ̀ cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường gần vơi dong Bacillus megaterium AIMST 3. ́ ̀ Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thực hiện Như vậy, hai dòng vi khuẩn được tuyển chọn từ nghiên cứu. nghiên cứu này đều thuộc chi Bacillus. Kết quả này TÀI LIỆU THAM KHẢO phù hợp với kết luận của Ghosh et al. (2007) là phần lớn các dòng vi khuẩn có hoạt tính phân hủy Akhtar W. and H.G.M. Edwards, 1997. keratin cao phân lập được đều thuộc chi Bacillus. Fourier-transform Raman spectroscopy of Dòng Bacillus megaterium F7-1 đã được Geun - mammalian and avian keratotic Tea Park và Hong – Joo Son nghiên cứu và cho biopolymers. Spectrochim Acta. 53: 81-90. thấy khả năng phân hủy đến 26% lượng bột lông gà Barker G.C., J.J.Smith and D.A. Cowan, 2003. sau 24 giờ chủng ở 30°C. Review and reanalysis of domain specific 4 KẾ T LUÂṆ VÀ ĐỀ XUẤ T 16S primers. Journal of Microbiological Method. 55: 541-555. Từ chất thải lò giết mổ gia suc đã phân lập ́ Daniel J.D., Ana P.F.C. and Brandelli A, 2009. được vi khuẩn có khả năng phân hủy lông gia súc Keratinolytic potential of a novel Bacillus sp. (lông heo) và lông gia cầm. Khả năng phân hủy cơ P45 isolated from the Amazon basin fish chất chứa keratin không chỉ phụ thuộc vào hoạt Piaractus mesopotamicus. International tính keratinase mà còn phụ thuộc vào các yếu tố Biodeterioration & Biodegradation. 63: 358–363. khác (có thể là tế bào vi khuẩn và kiểu cấu trúc keratin, Edward et al., 2001). Trong thı́ nghiêm,̣ hai Edward H.Burtt, Jr. and Jann M.Ichida, 2001. dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông heo Bacteria useful for degrading keratin. manḥ (Bacillus flexus Kr11) và lông gia cầm mạnh United States Patent. (Bacillus megaterium Kr45) đều thuộc chi Bacillus, Ghosh A., Maity B., Chakrabarti K. and kỳ vọng ứng dụng để xử lí rác thải chứa keratin. Chattopadhyay D, 2007. Bacterial diversity Dòng vi khuẩn Kr45 liên quan gần với loài of east Calcutta wet land area: Possible Bacillus megaterium với khả năng phân hủy cong̣ identification of potential bacterial 10
11. Tap̣ chı́ Khoa hoc̣ Trườ ng Đaị hoc̣ Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 population for different biotechnological degradation, International Journal of uses. Microbial Ecology. 54: 452-459. Engineering in Life Sciences, Volume 10, Gupta, R. and P. Ramnani, 2006. Microbial Issue 4, pages 361–367. keratinases and their prospective John G. Holt, Peter H.S. and Nobel R.K., 1994. applications: an overview. Appl Microbiol Bergey's Manual of Determinative Biotechnol, 70:21–33. Bacteriology, ninth edition. Lippincott Mohammad, S. H., K. A. Abul, S. M. Abu Williams and Wilkins, United States, 9-754 pp. Sayem, M. Golam and H.Mozammel, 2007. Joshi S.G., Tejashwini M.M., Revati N., Production and Partial characterization of Sridevi R. and Roma D.,2007. Isolation, feather-degrading keratinolytic serine identification and characterazation of a protease from Bacillus licheniformis MZK- feather degrading bacterium. International 3. J.Biological Sciences, 7 (4):599-606. Journal of Poultry Science. 6(9): 689-693. Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Hiền, Park Geun.Tea and Hong-Joo Son, 2009. Nguyễn Thị Quỳnh Mai và Nguyễn Ngọc Keratinolyticactivity of Bacillus Dũng. 2010. Phân lập chủng vi khuẩn có megaterium F7-1, a feather- khả năng phân giải lông vũ tạo nguồn thức degradingmesophilicbacterium. ăn cho nuôi trồng thủy sản. Toàn văn Hội Microbiological Research, 164: 478-485. nghị thủy sản 2010. Tapia D.M.T. and J.Contiero, 2008. Production Savitha S. Desai, Swati Hegde, Preeti Inamdar, and partial characterization of keratinase Nagaraj Sake and M. S. Aravind, 2010. produced by a microorganism isolated from Isolation of keratinase from bacterial poultry processing plant wastewater. African isolates of poultry soil for waste Journal of Biotechnology. 7(3): 296-300. 11