Tài liệu Công nghệ Sinh học Động vật

Nội dung text: Tài liệu Công nghệ Sinh học Động vật

1. M U I. KHÁI NI M Công ngh Sinh h c (CNSH) (Biotechnology) òi h i s t p h p c a trí tu , k thu t d a trên n n t ng c ơ b n c a khoa h c s s ng. ó là k t qu c a vi c ng d ng nh ng nguyên lý khoa hc và công ngh ch t o, s n xu t nguyên v t li u b ng nh ng tác nhân sinh h c, nh m t o ra hàng hóa và d ch v ph c v con ng ưi. Công ngh Sinh h c trên ng i và ng v t (CNSH N& V) là nh ng k thu t CNSH ti n hành ho c ng d ng trên i t ưng ng i và ng v t. n ưc ta, CNSH trên ng ưi ch ưa th c s phát tri n thành m t l nh v c c l p, nên th ưng ưc g i chung là Công ngh Sinh h c ng vt (CNSH V). CNSH V có l ch s ti m tàng lâu dài, các ki n th c và s ng d ng s ơ khai ã di n ra cách ây 8.000 n m khu v c Tây B c Á, khi con ng ưi l n u tiên bi t s n b t các loài ng v t hoang d i v nuôi l y th t, lông, s a và sau ó thu n hóa chúng làm ph ươ ng ti n v n chuy n. Cách ây nhi u th p niên, con ng ưi ã có nhi u c i ti n m nh m trong ch n nuôi ng vt, bi t ch n l c nh ng cá th kh e m nh, tiêm ch ng phòng ng a b nh, th c hi n nhi u k thu t khác t ng c ưng kh n ng sinh s n c a chúng. Tuy nhiên, CNSH V hi n i (d a trên thành t u t bào h c và di truy n h c) ch th t s b t u vào nh ng n m 60 c a th k XX và bùng n trong hai th p k g n ây. II. N N T NG KHOA HC VÀ K THU T II.1. GENOMICS VÀ B GEN NG I II.1.1. Genomics Genomics là l nh v c nghiên c u v thành ph n, t ch c, ch c n ng và ti n hóa c a thông tin di truy n ch a trong b gen. Ba l nh v c chính c a genomics: h gen c u trúc (structure genomics), h gen ch c n ng (functional genomics), h gen so sánh (comparative genomics). Genomics ưc xem là tâm im ca sinh h c, b i m i k t qu t nghiên c u genomics ã, và ang óng góp tích c c vào các l nh vc ng d ng nh ư ch m sóc s c kh e con ng ưi, nông nghi p, lâm nghi p và nhi u l nh v c khác. S phát tri n nhanh chóng c a genomics có s tr giúp c a các ngành khoa h c k thu t khác, ch ng h n các thi t b gi i trình t Ngoài ra, s “ ua nhau” gi i mã b gen các sinh v t t nh ng nm 1990 v i nhi u quy mô, nhi u m c khi n công vi c này tr nên sôi ng. n nay, có trên dưi 100 loài ưc gi i mã b gen. II.1.2. B gen ng i Ý t ưng gi i trình t c b gen ng ưi ưc ưa ra t các cu c h p ưc t ch c vào nh ng nm 1984-1986 b i C ơ quan N ng l ưng M (U.S. Department of Energy). Ch ươ ng trình ưc khai tr ươ ng khi C ơ quan N ng l ưng và Vi n s c kh e M k t h p. Vào cùng th i im này, vi c gi i trình b gen ng ưi c ng ưc b t u Pháp, Anh và Nh t b n. V i xu h ưng này, vi c thành l p T ch c B gen Ng ưi (Human Genome Organisation_HUGO) vào mùa xuân n m 1988, ã kéo theo m t s qu c gia khác cùng tham gia ch ươ ng trình và có óng góp vào k ho ch này, c bi t là c và Trung Qu c. 1
2. Tháng 6-1988, cu c h p quan tr ng v vi c gi i trình t và l p b n b gen (Genome Mapping và Sequencing Meeting) u tiên ưc t ch c t i Cold Spring Harbor ã ch ng ki n n lc c a k ho ch gi i trình t b gen ng ưi c a Celera Genomics (nhóm th hai gi i trình t b gen ng ưi do Craig Venter ch trì). Cu c h p ưc xem nh ư là m t im nh n ban u cho HGP. Nh s phát tri n, h p tác qu c t , nh ti n b c a genomics, c ng nh ư k thu t máy tính, b n phác th o hành ng (working draft) b gen ng ưi ã ưc hoàn thành vào 26/6/2000. Tháng 2/2001, các phân tích c a bn phác th o hành ng ưc công b . D án b gen ng ưi hoàn thành và tuyên b k t thúc vào ngày 14/4/2003, s m h ơn 2 n m Hi ngh khoa h c c a NIH k ni m 50 n m chu i xo n kép DNA . Tháng 5-2006, trình t c a NST ng ưi cu i cùng ưc công b trên t p chí Nature. Mc dù h u h t các bài báo u cho r ng b gen ng ưi ã hoàn thành, th t ra n n m 2006, nó v n còn ch ưa hoàn t t và s m t nhi u n m n a m i có th hoàn thành tr n v n, b i các vùng trung tâm c a m i NST (nh ư centromere) luôn bao g m các trình t DNA l p l i cao, r t khó có th gi i trình t chúng v i k thu t hi n nay. * ng d ng và tri n v ng c a vi c nghiên c u b gen ng i Các k thu t và công ngh m i, các ti n ưc t o ra t HGP, và nh ng nghiên c u genomics khác, ang có nhi u tác ng mnh lên kh p các ngành c a khoa h c s s ng. Mt s ng d ng hi n t i và ti m n ng c a vi c nghiên c u b gen: - Thu c phân t (Molecular medicine). - Các ngu n n ng l ưng và các ng d ng môi tr ưng. - ánh giá r i ro. - Sinh kh o c , nhân lo i h c, ti n hóa và s di c ư ng ưi. - DNA pháp y (DNA forensic). - Nông nghi p, sinh s n v t nuôi và ch bi n sinh h c. II.2. PROTEOMICS II.2.1. Khái ni m Proteomics là khoa h c nghiên c u proteome. Proteome là toàn b các protein ưc bi u hi n b i c genome. Vì m t s gen mã hóa cho nhi u protein khác nhau, nên kích th ưc c a proteome th ưng l n h ơn so v i s l ưng gen. Th nh tho ng khái ni m này còn s d ng nh m mô t toàn b protein ưc bi u hi n m t t bào, hay m t mô c bi t nào ó. II.2.2. Các công c ca proteomics Công c u tiên c a proteomics là d li u. Các d li u protein, EST và trình t b gen ưc thu th p t o ra m c l c các protein ưc bi u hi n trong sinh v t. Ch ng h n, d a vào các phân tích t t c trình t mã hóa c a Drosophila, ng ưi ta th y có n 110 gen Drosophila mã hóa cho các domain gi ng EGF, và 87 gen mã hóa cho các protein v i các domain xúc tác tyrosine kinase. Theo ó, khi ti n hành proteomics loài này, c n có m t b n li t kê các protein ã bi t, n u nghiên c u g p ph i các thông tin gi i h n, hay các d li u t ph ươ ng pháp kh i ph không rõ ràng, ng ưi ta có th xác nh thành ph n protein t s trùng kh p v i d li u ã có s n này. 2
3. Công c th hai là kh i ph (Mass spectrometry_MS). Các thi t b MS có nhi u thay i trong th p niên qua, c bi t là nh y. MS có th th c hi n ba ki u phân tích r t c n thi t cho proteomics. Th nh t là, MS cung c p s o l ưng chính xác kh i l ưng phân t c a m t protein nguyên v n nh ư 100 kDa hay h ơn. Do ó, phân tích MS có th là cách t t nh t xác nh kh i lưng phân t (h ơn c ph ươ ng pháp in di protein trên gel polyacrylamide). MS c ng cung c p s o kh i l ưng chính xác các peptide t quá trình protolytic. D li u t các peptide này ưc tìm ki m tr c ti p, nh m xác nh chính xác protein m c tiêu. Cu i cùng, phân tích MS c ng cung c p các trình t c a peptide t quá trình th y gi i. Các d li u t MS s cung c p chi n l ưc rõ ràng (và mnh nh t) trong vi c xác nh protein. Công c th ba là các ph n thu gom , k t h p các d li u MS v i các trình t protein c bi t có s n trong c ơ s d li u. Các ph n m m này s l y các d li u MS không ưc gi i thích rõ ràng và k t h p nó v i nh ng trình t c ơ s d li u protein, hay EST và trình t b gen v i các thu t toán c bi t. Khía c nh m nh nht c a nh ng công c này, là chúng cho phép t ng hóa ưc m t l ưng l n các d li u MS, cho các k t h p trình t protein khác nhau. Công c c n thi t th t là k thu t phân tách protein . S phân tách các protein có hai m c ích trong proteomics. Th nh t, chúng làm ơ n gi n các h n h p protein thành các protein ơ n l hay các nhóm nh . Th hai, b i chúng cho phép phát hi n các khác bi t trong các m c protein so sánh gi a hai m u, nên k thu t phân tách, nh m phân tích protein s cho phép ng ưi ti n hành xác nh ưc các protein c bi t. Thông th ưng, ph ươ ng pháp in di protein hai chi u (2D-SDS- PAGE) ưc s d ng trong proteomics. M t s k thu t khác c ng ưc s d ng là 1D-SDS- PAGE, hay s c ký l ng hi u n ng cao (high-performance liquid chromatograph_HPLC), các k thu t ch y in di mao qu n (Capillary electrophoresis_CE), s c ký ái l c II.2.3. Các ng d ng c a proteomics K thu t proteomics th t s có tác ng l n v i b n ng d ng chính. Khai thác (Mining): xác nh các protein có trong m t mu t c ơ s d li u gen. Ghi nh n s bi u hi n c bi t (Protein-expression profiling): xác nh các protein trong mt m u c bi t, c ng nh ư ch c n ng c a m t tr ng thái c bi t c a t bào hay c ơ th (tr ng thái bi t hóa, tr ng thái phát tri n, tr ng thái b nh ), hay ch c n ng c a s ti p xúc v i thu c, các kích thích hóa lý. Lp các s ơ m ng l i protein (Protein-network mapping): xác nh ph ươ ng th c các protein t ươ ng tác v i nhau trong các h th ng s ng. Lp b n các bi n i protein (Mapping of protein modification): xác nh ph ươ ng th c và v trí các protein b bi n i. II.3. CYTOMICS Cytomics là nghiên c u các quá trình sinh hóa, nh m k t h p các c ơ ch m c th p h ơn vào các quá trình m c t bào và cu i cùng là c ơ th . Cytomics giúp hi u và tái thi t l p các quá trình chuy n hóa (genome, proteome, metabolome), mô ph ng t bào và các c ơ th nh . Phân tích các quá trình chuy n hóa n i bào, metabolome, giúp hi u ưc m ng l ưi protein, và s hi n di n các gen im l ng (silent gene). 3
4. II.4. CÔNG NGH NANO VÀ MICRO Công ngh nano liên quan n kh n ng s p x p các phân t và các nguyên t thành các c u trúc phân t . Nó có tác ng chính lên máy tính, các v t li u và s s n xu t các công c , thi t b , kh n ng can thi p vào các c p iu tr b nh. Các k thu t thi t k máy micro ang phát tri n nhanh chóng và có nhi u ng d ng trong các vi dòng (microfluidic), các trong sensor, s i quang h c Các microrobot và nanorobot ho t ng nh ư các robot di ng nh trong d ch c ơ th là công c tuy t v i cho các thao tác t bào. S ra i c a biochip là m t ti n b v ưt b c c a công ngh sinh h c nano, chúng ch a ng m t ph m vi r ng các v n nghiên c u nh ư genomics, proteomics, sinh h c máy tính và dưc h c, c ng nh ư m t s ho t ng khác. Nh ng ti n b trong l nh v c này t o ra nh ng ph ươ ng pháp m i, g r i cho nh ng quá trình sinh hóa x y ra trong t bào, v i m c ích là tìm hi u và ch a tr các c n b nh cho ng ưi. Các biochip ưc xem là các phòng thí nghi m thu nh , b i l trên nó có th ti n hành hàng tr m n hàng ngàn ph n ng sinh hóa. Biochip giúp các nhà nghiên c u có th sàng l c nhanh m t l ưng l n các ch t sinh h c v i nhi u m c ích khác nhau, t ch n oán bnh n phát hi n các tác nhân nguy h i sinh h c. II.5. K THU T T BÀO NG V T IN VITRO Vi c các t bào ng v t có th nuôi c y, duy trì và t ng sinh trong các chai, l ngày càng d dàng h ơn trong phòng thí nghi m, ã m ra h ưng m i quan tr ng trong nghiên c u CNSH N& V- ó là công ngh t bào ng v t. Các dòng t bào c ng ưc thi t l p, ây là mô hình in vitro lý t ưng cho các nghiên c u nói chung. Nuôi c y các t bào ng v t l ưng l n là n n t ng c a s n xu t vaccine virus và nhi u s n ph m công ngh sinh h c khác. Các ch t sinh h c ưc s n xu t b ng k thu t DNA tái t h p trong nuôi c y t bào ng v t nh ư enzyme, hormone, các kháng th ơn dòng, interleukin hay các nhân t kháng ung th ư. M c dù nhi u protein ơn gi n h ơn có th ưc s n xu t vi khu n, nh ưng nhi u d ưc ch t c n s glycosyl hóa, iu này h u nh ư phi ưc ti n hành trong t bào ng v t. Thu nh n, nuôi c y và bi t hóa t bào là m t thành công m i trong l nh v c nuôi c y t bào ng v t. Tuy m i phát tri n, nh ưng các t bào g c (stem cell) ã h a h n nhi u ng d ng to l n trong y sinh h c. 4
5. CH Ơ NG 1 NUÔI C Y MÔ – T BÀO NG V T I. GI I THI U I.1. L C S PHÁT TRI N K thu t nuôi c y mô – t bào ng v t là k thu t nuôi c y in vitro các t bào, mô và c ơ quan c a ng v t nh m duy trì và/hay t ng sinh các t bào, mô, c ơ quan ó m t cách c l p, tách kh i nh ng bi n i c a h th ng in vivo iu ki n bình th ưng ho c stress. K thu t này u tiên ưc th c hi n v i các m u mô, và t c t ng sinh c a chúng r t ch m. Vi c nuôi c y mô và t bào ng v t ã ưc ti n hành h ơn 100 n m nay, thông qua nh ng nghiên c u u tiên nh m tìm hi u m t s v n trong l nh v c sinh h c phát tri n. Ch ng h n Ross Harrison (1907) ã thành công trong vi c nuôi t bào th n kinh b ng d ch huy t ch tr ưng thành. Alexis Carrel c ng ã nuôi phôi gà trong môi tr ưng b sung các ch t dinh d ưng và gi ưc tim phôi gà ho t ng n tháng th ba (1912). Nm 1955, Harry Eagle’s kh ng nh d ch chi t mô ph c t p, d ch huy t và nh ng ch t ang dùng nuôi t bào có th ưc thay b i “ mt h n h p các amino acid, vitamin, các co-factor, carbohydrate và mu i, b sung v i m t l ng nh protein huy t thanh ”, iu này ã m ra m t th i k m i trong nuôi c y t bào ng v t in vitro . Sau ó, hàng lo t các k thu t nh m khai thác, bi n i và ng d ng các t bào ng v t nuôi c y in vitro ưc ti n hành nh ư t o các t bào bi n i di truy n, nghiên c u s chuy n hóa và sinh lý t bào, thu nh n và t o dòng in vitro các dòng t bào bình th ưng (t bào sinh d ưng, sinh dc), và b t th ưng (t bào ung th ư) c a ng ưi, c ng nh ư c a nhi u ng v t khác. T m t th c t là nh ng kh i u c a ng ưi có th t o nên dòng t bào liên t c (nh ư dòng t bào Hela ưc Gey và cs thi t l p n m 1952), nuôi c y mô c a ng ưi ã ưc u t ư nghiên c u. Sau ó, vào n m 1961 Hayflick và Moorhead kh o c u v các t bào bình th ưng có i s ng xác nh. Các dòng t bào u tiên ã ưc thi t l p thành công, chúng duy trì ít nh t m t ph n c im, ch c n ng ban u nh ư các t bào tuy n th ưng th n, t bào tuy n yên, t bào th n kinh, t bào c ơ S phát tri n c a k thu t nuôi c y mô ngày càng tinh vi, hi n i do nhu c u b c thi t c a hai h ưng nghiên c u chính: t o vaccine kháng virus và nghiên c u v ung th ư. Hi n nay, các nhà nghiên c u ang ti n t i s d ng d ng t bào lai (hybridoma) gi a t bào ng v t và t bào ung th ư, nh ư là m t h th ng s n xu t các protein tái t h p, ví d kháng th ơn dòng, vaccine, interferon G n ây, nuôi c y t bào g c (stem cell) tr thành m i nh n m i trong công ngh t bào, v i nhi u hy v ng ng d ng y sinh. I.2. S Ơ L C V T BÀO NG V T Các t bào ng v t có vú là t bào eukaryote, chúng ưc liên k t v i nhau b i các nguyên li u gian bào t o thành mô. Mô ng v t th ưng ưc phân chia theo b n nhóm: bi u mô (epithelium), mô liên k t (connective tissue), mô c ơ (muscle) và mô th n kinh (nerve). Trong nuôi cy t bào ng v t, ng ưi ta phân bi t hai nhóm: các t bào d ch huy n phù và các t bào dính bám. 5
6. - Các t bào d ch huy n phù: là nh ng t bào không bám dính khi sinh tr ưng trong môi tr ưng nuôi c y in vitro , ví d các t bào máu và t bào lympho; nh ng t bào này không òi h i b mt sinh tr ưng. - Các t bào dính bám: Hu h t các t bào ng v t bình th ưng là các t bào dính bám, vì th chúng c n có b m t g n vào và sinh tr ưng (th y tinh, plastic), ưc s d ng ph bi n trong các ng d ng là các t bào bi u mô và nguyên bào s i (fibroblast). Ng ưi ta th ưng s d ng a petri ho c các chai tr c l n nuôi c y các t bào dính bám. Các giá th là polymer b t bi n (spongy), th g m (ceramic), các s i r ng, microcapsule ho c các th mang có kích th ưc hi n vi (microcarrier) c ng ưc s d ng r ng rãi t ng t l di n tích/th tích trong nuôi c y. Có m t m i quan h quan tr ng gi a hình d ng t bào và tính ch t bám dính c a chúng. Nu t bào bám dính vào b m t nuôi c y, chúng s có hình dài, tr i r ng trên m t áy h p nuôi, ng ưc l i, n u không bám dính, t bào s có hình kh i c u u. * c im c a các t bào ng v t - T bào ng v t không có vách, nh ưng kích th ưc khá l n (kho ng 10 µm), nên tính b n cơ h c y u. Do ó, t bào ng v t trong nuôi c y in vitro rt d v b i các l c tác ng khi khu y tr n tách t bào, thao tác Vì v y, khi thao tác v i t bào ng v t, c n c g ng thao tác nh nhàng và trong th i gian ng n nh t. - T bào ng v t có tng tr ng và phân chia ch m, nên hi u su t s n sinh các ch t có ho t tính sinh h c r t th p, ch m. Do ó, s n xu t các ch t có ho t tính t t bào ng v t, c n ph i có th i gian dài và kh i l ưng t bào l n. - t bào ng v t, có c ơ ch kìm hãm ng c (negative feed-back), có ngh a là s gia t ng nng c a m t ch t nào ó trong môi tr ưng s d n n c ch t bào t ng h p và ti t ch t ó ra môi tr ưng. iu này có th gây t n th ươ ng t bào, th m chí còn có th làm ch t hàng lo t. Vì v y, khi nuôi c y mô – t bào ng v t, sau m i kho ng th i gian nuôi c y nh t nh, c n thi t ph i thay mi môi tr ưng nuôi. - Tr t bào máu và m t s giai on c a t bào sinh d c, h u h t các mô và t bào ng v t cn bám vào giá có th s ng và phân chia. Thông th ưng t bào t ng tr ưng t t khi g n vào b m t r n. T bào s ng ng phân chia khi ã hình thành l p ơn liên t c trên b m t c a d ng c nuôi. Tuy v y, m t s dòng t bào nh ư t bào ung th ư, ho c dòng t bào liên t c t mô bình th ưng, sau khi ưc thu n hóa, có th sinh tr ưng và phân chia trong tr ng thái l ơ l ng mà không c n bám vào n n. - Các t bào ng v t có th thay i ki u gen và ki u hình , thông qua quá trình dung h p hai t bào có nhân khác nhau t o thành t bào lai (hybridoma) ho c quá trình bi n n p. VD: ch ng t bào bình th ưng có th c m ng thành t bào có các tính ch t c a t bào ung th ư, thông qua quá trình bi n n p ưc th c hi n b i m t virus c m ng ung th ư ho c b ng hóa ch t. - Các dòng t bào ng v t có th c b o qu n l nh sâu trong nit ơ l ng (-197 oC) su t nhi u n m. Khi ưc gi i ông và ho t hóa, t bào ph c h i kh n ng t ng tr ưng và phân chia nh ư ban u. Ngoài các c tính trên, t bào ng v t còn có các c im khác nh ư kém thích nghi v i môi tr ưng, nh y c m v i ion kim lo i, và a s t bào ng v t c n huy t thanh, hormone tng tr ưng và phân chia. T t c nh ng c im trên c n ưc l ưu ý trong quá trình nuôi c y in vitro . 6
7. I.3. U IM VÀ H N CH CA NUÔI C Y MÔ – T BÀO NG V T * Ưu im - H th ng t bào ng vt là các “nhà máy t bào” thích h p cho vi c s n xu t các phân t ph c t p và các kháng th dùng làm thu c phòng b nh, iu tr ho c ch n oán: nh ư các enzyme, hormone, vaccine, kháng th ơn dòng, thu c tr sâu sinh h c, interferon và interleukin, các t bào nguyên v n th nghi m ch t c hóa h c - Các t bào ng v t có quá trình bi n i h u d ch mã chính xác (post translational modifications) i v i các s n ph m protein sinh-dưc (biopharmaceutical protein) nh ư phân gi i protein, liên k t ti u ơn v (subunit), ho c nhi u ph n ng k t h p khác nh ư glycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành các c u n i disulfide ho c phoshorylation các gc amino acid. Nh ng s a i này r t quan tr ng nh h ưng n ho t tính sinh h c c a s n ph m. Ví d quá trình glycosylation có th giúp b o v protein ch ng l i s phân gi i chúng, duy trì kh nng n nh c u trúc và bi n i kháng nguyên. - Sn xu t các viral vector dùng trong li u pháp gen nh m ch a tr nhi u b nh nh ư ung th ư, HIV, viêm kh p, các b nh tim m ch và x ơ hóa u nang. - Sn xu t các t bào ng v t dùng nh ư m t c ơ ch t in vitro trong nghiên c u c ch t hc và d ưc h c. - Phát tri n công ngh mô ho c phát sinh c ơ quan s n xu t các c ơ quan thay th nhân t o- sinh h c hay các d ng c tr giúp, nh ư: da nhân t o ch a b ng, mô gan ch a viêm gan, o Langerhans ch a ti u ưng * H n ch Mc dù ti m n ng ng d ng c a nuôi c y t bào ng v t là r t l n, nh ưng vi c nuôi c y mt s l ưng l n t bào ng v t th ưng g p các khó kh n sau: - T bào ng v t có kích th ưc l n h ơn và c u trúc ph c t p h ơn t bào vi sinh v t. - Tc sinh tr ưng c a t bào ng v t r t ch m so v i t bào vi sinh v t. Vì th , s n lưng c a chúng khá th p và vi c duy trì iu ki n nuôi c y vô trùng trong m t th i gian dài th ưng g p nhi u khó kh n h ơn. - Các t bào ng v t ưc bao b c b i màng huy t t ươ ng, m ng h ơn nhi u so v i thành t bào dày ch c th ưng th y vi sinh v t ho c t bào th c v t, và k t qu là chúng r t d b v . - Nhu c u dinh d ưng ca t bào ng v t ch ưa ưc xác nh m t cách y , và môi tr ưng nuôi c y th ưng òi h i b sung huy t thanh máu r t t ti n. - T bào ng v t là m t ph n c a mô ã ưc t ch c (phân hóa) h ơn là m t c ơ th ơn vào riêng bi t nh ư vi sinh v t. - Hu ht các t bào ng v t ch sinh tr ưng khi ưc g n trên m t b m t. I.4. M T S KHÁI NI M DÒNG T BÀO - Dòng t bào (cell line) : là thu t ng dùng ch m t qu n th t bào gi ng h t nhau b t ngu n t m t t bào ban u. - Dòng t bào liên t c (continued cell line; established cell line) : là dòng t bào nuôi c y trong iu ki n in vitro qua nhi u th h , và có th duy trì kh n ng phân bào trong m t th i gian rt dài, có khi là v nh vi n mà không thay i c tính. Ví d : CHO (chinese hamster ovary: t bào 7
8. bu ng tr ng chu t Trung qu c), Schneider-2 (t bào phôi ru i gi m), COS1 (t bào th n kh xanh Châu Phi), Hela (t bào ung th ư c t cung ng ưi), Vero (t bào th n kh xanh Châu Phi) - Dòng t bào t m th i (temporary cell line) : là dòng t bào ch s ng trong iu ki n nuôi cy m t th i gian gi i h n. ây th ưng là các dòng t bào th ưng (không ph i ung th ư). - T bào s ơ c p (primary cell) : là các t bào ưc nuôi c y trong iu ki n in vitro l n u tiên (nuôi c y s ơ c p) sau khi ưc tách ra t khi mô. - T bào th c p (secondary cell) : là các t bào ã qua vài l n c y truy n (nuôi c y th c p) sau khi ưc tách t kh i mô. I.5. CÁC C P NUÔI C Y MÔ VÀ T BÀO NG V T Nhìn chung, trong phòng thí nghi m th ưng có ba c p chính: nuôi c y c ơ quan, nuôi c y mô phát tri n s ơ c p và nuôi c y t bào. I.5.1. Nuôi c y t bào T bào trong iu ki n in vitro có nh ng im khác bi t so v i in vivo . Th nh t là t bào nuôi c y in vitro không có c tính t ươ ng tác t bào chuyên bi t (t ươ ng tác a chi u) nh ư mô c a t bào in vivo . Th hai là môi tr ưng in vitro thi u vài thành ph n liên quan n s iu hòa in vivo , do ó chuy n hóa c a t bào in vitro n nh và d ki m soát h ơn trong in vivo , nh ưng có th không th c s i di n cho mô. Tuy nhiên, dù th nào i n a thì nuôi c y mô – t bào ng v t c ng ã th hi n nhi u kh nng c bi t trong nghiên c u và ng d ng, nó ã và ang là công c r t h u ích. Có nhi u hình th c nuôi c y khác nhau tùy c tính t bào, hay tùy thu c vào ph ươ ng pháp: nuôi c y s ơ cp (Primary culture), nuôi c y th c p (Secondary culture), nuôi c y huy n phù (Suspension culture) và nuôi c y l p ơn (Monolayer culture). Nuôi c y s ơ c p: là nuôi c y các t bào sau khi ưc tách ra t cách m nh mô và tr ưc l n cy chuy n u tiên. Nuôi c y s ơ c p th ưng ưc s d ng khai thác các t bào ban u trong nh ng m nh mô, nh m t o ra các dòng t bào m i. Trong nuôi c y s ơ c p, các t bào ban u th ưng là m t h n h p các dòng khác nhau, ho c ch a m t ki u t bào tr i nh t, trong ó có nhng t bào quan tâm và nh ng t bào khác (t bào nhi m). Có th lo i b các t bào nhi m b ng c ơ h c, hay enzyme khi tách mô, hay b ng cách duy trì các iu ki n ch n l c d ươ ng tính cho s s ng sót c a m t ki u t bào quan tâm c n thu nh n. Quy trình nuôi cy s ơ c p: thu nh n các m nh sinh ph m, các m nh mô s ng
   x lý s ơ b , lo i b vi khu n, n m và các thành ph n không mong mu n khác
   tách t o huy n phù t bào ơ n
   ư a vào môi tr ưng nuôi c y. Nuôi c y th c p ưc ti n hành sau khi t bào ưc t o dòng t nuôi s ơ c p. Nhi u dòng t bào ã ưc thi t l p và th ươ ng m i hóa. Ph n l n các dòng này ưc thu nh n t kh i u (ví d t bào Hela, RD ) hay t các t bào b bi n i in vitro. Tuy nhiên, các dòng t bào này ưc nuôi c y trong các phòng thí nghi m khác nhau nên có th d n n s phát sinh các c tính m i khác nhau và khác v i các t bào s ơ khai ban u. Các t bào nuôi c y th c p là i t ưng chính cho nghiên c u và ng d ng c a công ngh t bào ng v t. Quy trình nuôi c y th c p: gi i ông ( i v i các t bào ưc b o qu n l nh)
   ư a vào môi tr ưng thích nuôi c y thích h p 8
9. Nuôi c y huy n phù th ưng ưc ti n hành v i các t bào thu nh n t máu (b ch c u ). Có th coi ây là ph ươ ng pháp nuôi c y trong không gian ba chi u v i k thu t nhân sinh kh i bng fermenter, thông qua h th ng bioreactor, nh m thu nh n l ưng l n các t bào mong mu n. Nuôi c y l p ơn ưc ng d ng v i nh ng dòng t bào khác thu nh n t các mô r n (ph i, th n, c ơ, x ươ ng, m ) c n nuôi phát tri n thành l p ơn. Các dòng t bào bám dính có th ưc phân lo i nh ư t bào n i mô: BAE-1; t bào bi u mô: Hela; mô th n kinh: SH-SY5y hay fibroblast: MRC-5. Thông th ưng, hình d ng in vitro ca các t bào s ng nói trên luôn ph n ánh ngu n g c ca mô. Ngoài ra, m t s dòng t bào khi nuôi s bi u hi n tr ng thái bán bám dính (semi-adheret) nh ư B95-8. Khi ó, trong d ng c nuôi s xu t hi n h n h p hai qu n th t bào: các t bào bám và các t bào huy n phù. * Nh ng thu n l i c a nuôi c y t bào - Có th phát tri n m t dòng t bào qua nhi u th h . - Có th nuôi c y quy mô l n. * Nh ng b t l i c a nuôi c y t bào - T bào b m t i m t s c tính ã bi t hóa trong mô. I.5.2. Nuôi c y mô Nuôi c y mô phát tri n s ơ c p ưc ti n hành b ng cách t các m nh mô lên trên b m t rn b ng nh a, hay th y tinh bao ph b i các ch t dinh d ưng d ng l ng. Trong iu ki n thích hp, các m nh mô s bám vào b m t r n, các t bào ph n rìa c a m nh mô s t ng sinh làm n i rng m nh mô. K thu t này cung c p mô hình th nghi m thu n l i h ơn so v i các th nghi m in vivo , c bi t khi ti n hành các nghiên c u v c t . Nuôi c y mô phát tri n s ơ c p còn dùng thu nh n các qu n th t bào. * Nh ng thu n l i c a nuôi c y mô - Các y u t lý hóa c a môi tr ưng (pH, nhi t , áp su t th m th u, O 2, CO 2) ưc ki m soát t t. Các y u t b sung có thành ph n không xác nh c ng ang d n ưc hi u rõ và ưc thay th b i nh ng thành ph n xác nh. - Mu mô không ng nh t nh ưng sau vài th h nuôi c y in vitro , nh ng dòng t bào này tr nên ng nh t h ơn hay ít nh t là cùng d ng. - Nh ng t bào nuôi c y có th ti p xúc tr c ti p v i m t ch t n ng th p và xác nh, và ch t này có th xâm nh p tr c ti p vào t bào. - So v i nuôi c y c ơ quan thì trong nuôi c y mô, m t s ch c n ng bình th ưng c a mô v n ưc duy trì và có th nuôi c y trên quy mô l n (nh ưng khó ti n hành). * Nh ng khó kh n c a nuôi c y mô - T ch c ban u c a mô b m t. - K thu t nuôi c y c n ưc th c hi n iu ki n vô trùng tuy t i. T bào ng v t òi hi ưc cung c p m t môi tr ưng ph c h p, gi ng huy t t ươ ng máu hay d ch l ng k các t bào. Do ó, òi h i ng ưi th c hi n ph i có k n ng thành th o và hi u bi t t t v l nh v c này. - Tiêu hao nhi u công s c và ti n b c nh ưng ch thu ưc m t l ưng nh . Giá thành vi c nuôi c y cao, do ó ch nên s d ng khi c n thi t. 9
10. - Sau m t th i gian phân chia liên t c, có th t o thành các t bào v i b NST a b i không hoàn ch nh. Ngay c v i nuôi c y trong th i gian ng n, m c dù các t bào có th n nh v m t di truy n, nh ưng s không ng nh t v t c t ng tr ưng c a t ng t bào có th t o ra s thay i t th h này sang th h khác. I.5.3. Nuôi c y c ơ quan K thu t nuôi c y c ơ quan ưc phát tri n t các ph ươ ng pháp nuôi c y mô nh m ph c v nghiên c u, ây có th là mô hình ch c n ng trong nhi u th nghi m. ó là k thu t nuôi c y in vitro nh ng m nh c a m t c ơ quan hay c c ơ quan, duy trì c u trúc c a mô và h ưng nó phát tri n bình th ưng. Môi tr ưng nuôi c y c ơ quan có th d ng môi tr ưng r n hay môi tr ưng l ng. Vi c nuôi c y c ơ quan thu nh n t phôi thai d dàng h ơn các c ơ quan t c ơ th tr ưng thành, b i nhu c u O 2 ca nh ng mô tr ưng thành l n h ơn nhi u. Vì v y, nuôi ưc các c ơ quan t c ơ th tr ưng thành ph i s d ng môi tr ưng v i các thi t b c bi t. Nh ng thu n l i c a nuôi c y c ơ quan: - Ch c n ng sinh lý bình th ưng c a c ơ quan ưc duy trì. - T bào gi tr ng thái bi t hóa hoàn toàn. Nh ng b t l i c a nuôi c y c ơ quan: - Không th nuôi c y quy mô l n. - Cơ quan nuôi c y phát tri n ch m. - Th ưng xuyên ph i c y chuy n sang môi tr ưng m i cho m i thí nghi m. II. IU KI N LÝ – HÓA TRONG K THU T NUÔI CY MÔ – T BÀO NG VT II.1. Nhi t T bào c a các loài ng v t khác nhau có nhi t nuôi c y thích h p khác nhau. VD: t bào c a ng v t có vú và c a ng ưi phát tri n t t 37 ± 10C, nhi t t bào c a các loài chim phát tri n t t 38,5 0C, còn t bào c a các loài côn trùng phát tri n t t nhi t 25 ± 20C. M t s dòng t bào phát tri n nhi t th p h ơn thân nhi t bình th ưng c a c ơ th , VD: t bào bi u mô, t bào tinh trùng Trong nuôi c y in vitro , t bào ng v t không ch u ưc nhi t cao h ơn 2 0C so v i nhi t phát tri n thích h p c a chúng, nh ưng t bào l i có kh n ng ch u ng ưc nhi t th p h ơn nhi t phát tri n t i ưu c a chúng mà r t ít nh h ưng n s phát tri n c a chúng sau này. duy trì nhi t nuôi c y, th ưng ph i s d ng t m (incubator). Nhìn chung, các t m duy trì nhi t b ng cách làm m và tu n hoàn khí nóng áp ng v i nh ng thay i nhi t và s tr l i nhi t nhanh chóng sau khi m hay óng c a t . i v i các t m có b sung n ưc khay bên d ưi s duy trì m cao. II.2. pH pH không ch quan tr ng trong vi c duy trì s cân b ng ion thích h p mà còn duy trì ch c nng t i ưu c a các enzyme n i bào, c ng nh ư s g n k t c a các hormone và nhân t t ng tr ưng lên các receptor b m t. S bi n i pH có th làm thay i chuy n hóa t bào, d n t i s c m ng 10
11. sn xu t protein shock nhi t, m t quá trình d n n s ch t t bào (apoptosis). Do v y, ki m soát pH là c n thi t t i ưu hóa iu ki n nuôi c y. pH t i ưu cho s phát tri n c a t bào nuôi c y khác nhau tùy theo loài và tùy theo dòng t bào. H u h t các t bào s ng trong môi tr ưng có ng ưng pH 6,5 – 7,8 nên môi tr ưng nuôi c y th ưng ưc iu ch nh pH 7,0 – 7,4 (trung bình là 7,2). M t s dòng t bào thích h p v i pH cao hơn (VD: t bào fibroblast ng ưi thích h p v i pH 7,4 – 7,7) hay th p h ơn (VD: t bào côn trùng phát tri n t t pH 6,2 ±0,1). Môi tr ưng có pH n nh ít thay i có th giúp t bào s ng t t h ơn. Hu h t các môi tr ưng th ươ ng m i ch a phenol red nh ư là m t ch t ch th pH. Môi tr ưng chuy n màu vàng cho bi t pH gi m (acid) và màu h ng n u pH t ng (ki m). II.3. Áp su t th m th u Áp su t th m th u c a môi tr ưng ưc xác nh b i chính công th c môi tr ưng. Mu i và glucose là hai tác nhân chính hình thành nên áp su t th m th u, m c dù các amino acid c ng quan tr ng. Thay i áp su t th m th u c a t bào h u nh ư luôn tác ng lên s t ng tr ưng và ch c nng t bào. N u t bào n m trong môi tr ưng có áp su t không thích h p, chúng s bi n d ng: t bào co l i trong môi tr ưng có áp su t th m th u quá cao, còn trong môi tr ưng có áp su t quá th p, chúng s c ng ph ng lên. ki m tra áp su t th m th u c a môi tr ưng, th ưng s d ng Osmom k (Osmometer). Các môi tr ưng th ươ ng m i ưc thi t k áp su t th m th u là 300 mOsm (t bào phát tri n trong kho ng 290 - 310 mOsm). Có th iu ch nh áp su t th m th u b ng cách thêm NaCl, c 0,0292 g/lít NaCl s làm t ng 1 mOsm (s d ng 5M NaCl v i 1ml/lít s làm t ng áp su t th m th u lên 10 mM). Chú ý là trong môi tr ưng còn có các thành ph n ưng, ion, các amino acid chúng c ng óng góp vào s t o áp su t th m th u. II.4. Các lo i khí Ba lo i khí c n quan tâm: CO 2, O 2 và N 2. T l c a chúng ưc ph i tr n thích h p theo các ch ươ ng trình thi t k s n c a t nuôi, nh ó các phân áp khí ưc t o ra thích ng v i c im sinh lý c a t bào và mô s ng. O2 có vai trò quan tr ng trong sinh tr ưng, t ng sinh và bi t hóa t bào. Tuy nhiên, nhu c u v O 2 ca t bào nuôi c y th p h ơn nhu c u O 2 ca mô s ng. Áp su t O 2 trong t nuôi c y t bào th ưng th p h ơn áp su t O 2 trong không khí. Trong quá trình nuôi c y t nh, các phân t oxy trong không khí luôn có xu h ưng khu ch tán vào môi tr ưng nuôi, qua l p môi tr ưng dày ch ng vài milimet. Do v y, n u s d ng quá nhi u môi tr ưng trong m t th tích h p s kìm hãm s khu ch tán oxy. N ng O 2 ph bi n dùng trong t nuôi t bào th ưng t 16 – 20%. Tác ng c a CO 2 lên nuôi c y t bào khó ưc xác nh m t cách chính xác, b i nó liên - quan n hàm l ưng CO 2 hòa tan, pH, n ng HCO 3 . Áp su t CO 2 trong không khí có th iu hòa tr c ti p n ng CO 2 hòa tan, v i s tham gia c a y u t nhi t . Chính s bi n i thu n - ngh ch CO 2 thành HCO 3 có th s làm thay i pH c a môi tr ưng nuôi, do v y, n ng CO 2 trong t nuôi có tính quy t nh n pH c a môi tr ưng nuôi c y. iu này ưc hi u là, có th dùng n ng CO 2 n nh pH c a môi tr ưng nuôi. Tùy vào m i lo i t bào ch n n ng CO 2 tươ ng ng. 11
12. III. MÔI TR NG NUÔI C Y T BÀO NG V T Thành ph n môi tr ưng nuôi c y t bào ng v t ph c t p h ơn r t nhi u so v i môi tr ưng nuôi c y vi sinh hay t bào th c v t, th ưng ch a các thành ph n không xác nh. Do thành ph n ph c t p, khó n nh nên ng ưi ta quan tâm d n n nghiên c u, t o các môi tr ưng t ng h p có th ch ng b o qu n, s d ng, iu ch nh và n nh thành ph n trong nh ng l n nuôi c y khác nhau. Môi tr ưng nuôi c y ch a ph n l n là n ưc. N u ngu n n ưc không n nh có th t o nên s khác bi t quan tr ng trong ch t l ưng s d ng. iu này c bi t quan tr ng i v i các môi tr ưng không có huy t thanh, vì các h p ch t h u c ơ và kim lo i hi n di n trong n ưc c t vô trùng kh ion có th gây c nghiêm tr ng i v i m t s ki u t bào. III.1. Vai trò c a môi tr ng Môi tr ưng nuôi c y cung c p các ch t dinh d ưng c n thi t cho s phát tri n c a t bào in vitro . Các ch t dinh d ưng thi t y u giúp t bào phân chia nh ư amiono acid, acid béo, ưng, các ion, các vitamine, cofactor và các phân t c n thi t duy trì môi tr ưng hóa h c cho t bào. M t s thành ph n có th gi nhi u vai trò h ơn, VD: sodium bicarbonat duy trì pH thích h p và t o áp su t th m th u cho môi tr ưng. III.2. Thành ph n c a môi tr ng a. Mu i vô c ơ Các mu i vô c ơ trong môi tr ưng gi vai trò quan tr ng i v i s phát tri n t bào in vitro , nh ư: cân b ng áp su t th m th u, duy trì c ơ ch v n chuy n ch t qua màng, giúp iu hòa in th màng, bám g n t bào, ho t ng nh ư các cofactor b. H m H m có vai trò iu hòa pH c a môi tr ưng nuôi c y. H u h t các môi tr ưng s d ng h m bicarbonate v i CO 2 là thành ph n chính. Ngoài ra, còn có h th ng m phosphat và các m hu c ơ ph c t p khác. C ng có th s d ng h m h u c ơ hay huy t thanh trong môi tr ưng c ơ bn. Khi s d ng bicarbonate làm h th ng m chính trong môi tr ưng thì s t ươ ng tác c a CO 2 thu nh n t các t bào (hay t không khí) v i n ưc, s d n n s iu ch nh pH môi tr ưng theo cân b ng c a ph ươ ng trình: + - H2O + CO 2 = H 2CO 3 = H + HCO 3 S d ng h m bicarbonate/CO 2 cn duy trì không khí v i 5–10% CO 2 trong t . Bicarbonate, CO 2 r, không c i v i t bào nên ưc dùng ph bi n. H m h u c ơ ưc s d ng nhi u nh t là HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2- ethane sulfonic acid). Các h m h u c ơ không nh y c m v i CO 2, chúng cung c p m t h th ng tt các t bào chuy n hóa m nh (s n xu t nhi u CO 2) có th n nh pH. Mt s dung d ch m nh ư Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethane] th ưng s d ng trong sinh hóa có th gây c i v i t bào in vitro . c. Carbohydrate ưng trong môi tr ưng là ngu n cung c p C và n ng l ưng cho s phát tri n t bào in vitro . Các ưng chính ưc s d ng là glucose và galactose, m t s môi tr ưng còn s d ng 12
13. maltose hay fructose. N ng ưng khác nhau gi a các môi tr ưng c ơ b n t 1g/l– 4,5g/l. Môi tr ưng ch a n ng ưng cao s giúp phát tri n nhi u ki u t bào. d. Vitamine Vitamine là c ơ ch t cho nhi u cofactor, chúng có nhi u trong thành ph n huy t thanh. Tuy nhiên, nhi u lo i môi tr ưng c n ưc b sung vitamine thích h p b i chúng r t quan tr ng trong nuôi c y t bào. c bi t vitamine nhóm B c n thi t cho s phát tri n t bào, và i v i m t s t bào, vitamine B12 là thi t y u. M t s môi tr ưng có nhi u vitamine A và E. Thông th ưng vitamine ưc s d ng trong môi tr ưng là riboflavin, thiamine và biotin. e. Các protein và peptide Các thành ph n này gi vai trò quan tr ng trong nuôi c y h u h t các t bào, c bi t khi nuôi c y v i môi tr ưng không huy t thanh. M t s protein, peptide r t c n thi t nh ư albumin, transferring, fibronectin và fetuin th ưng có s n trong huy t thanh. f. Acid béo và lipid Gi ng v i protein và peptide, các ch t này r t c n thi t trong môi tr ưng nuôi không huy t thanh và cho m t s t bào c bi t. Chúng hi n di n trong huy t thanh v i các d ng nh ư cholesterol và steroid. g. Y u t vi l ng Bao g m k m, ng, selenium và các tricarboxylic acid trung gian, trong ó selenium là ch t giúp tách các g c oxy t do. Ngoài ra, tùy vào m c ích nghiên c u có th ưa vào môi tr ưng m t s vi l ưng c n thi t khác. h. Huy t thanh Trong h u h t các lo i môi tr ưng nuôi c y t bào ng v t u có m t huy t thanh b i nó có nh ng vai trò quan tr ng nh ư sau: - Cung c p ch t dinh d ưng quan tr ng cho t bào nh ư các amino acid thi t y u, ti n ch t ca nucleic acid, các nguyên t vi l ưng - Cung c p các nhân t t ng tr ưng, kích thích cho t bào t ng tr ưng và phân chia. - Kích thích s ph c h i các t n th ươ ng c a t bào khi c y chuy n, và các protein trong huy t thanh làm b t ho t trypsin, tránh các enzym gây t n th ươ ng t bào. - Ci thi n tính tan c a các ch t dinh d ưng. - Ch ng oxy hóa: huy t thanh kháng oxy hóa m nh, và c ch c tính c a oxy. - Ci thi n tính dính c a t bào lên b m t bình nuôi nh các y u t làm t ng dính c a t bào lên giá . Huy t thanh r t c n cho vi c nuôi c y t bào ng v t. Tuy nhiên, bên c nh nh ng tác ng tt nêu trên, huy t thanh c ng có nh ng tác ng không t t: - Nuôi c y t bào v i môi tr ưng b sung huy t thanh chi phí cao, nh t là huy t thanh bò (FBS)
    làm t ng giá thành lên áng k (huy t thanh chi m 90% giá thành c a môi tr ưng nuôi cy). - Huy t thanh d b nhi m virus, mycoplasm và khó n nh ch t l ưng c a nh ng lô môi tr ưng khác nhau. 13
14. - Huy t thanh còn ch a nh ng thành ph n gây c ch s phân bào và c m ng s phân hóa (VD: TGF - có tác d ng c ch s phân chia c a t bào th ưng bì khí qu n, làm t bào bi n thành hình có góc c nh; TGF- còn có tác d ng kìm hãm s phân chia c a dòng t bào bi u bì ng ưi và chu t), (do ó khi nuôi c y, c n ch n lo i huy t thanh phù h p không ch a y u t c ch i v i dòng t bào nuôi c y). - Mt s t bào nuôi c y không (ho c kém) phát tri n trong huy t thanh, chúng thích ng vi các môi tr ưng c c b chuyên bi t, có tính ch t khác bi t rõ r t v i huy t thanh. - Nhi u ch t trong huy t thanh (vitamin C, các lipoprotein ) th ưng không n nh khi ông l nh hay b o qu n lâu. Môi tr ưng b sung huy t thanh s có n ng hormone hay các nhân t t ng tr ưng không thích h p v i s phát tri n c a m t s t bào. - Huy t thanh không pha loãng s c v i nhi u lo i t bào (c ng có m t s lo i t bào có kh n ng ch u ng ưc n ng huy t thanh cao h ơn các t bào khác, VD: các t bào n i mô thành m ch vì chúng phát tri n trong môi tr ưng t ươ ng t huy t thanh nh ưng không hoàn toàn gi ng huy t thanh) - Khi m t n ng hormone thích h p, huy t thanh c ng có th ch a c ơ ch t c ch s phát tri n, bi t hóa hay ch c n ng. Huy t thanh c ng kích thích s bi t hóa c a các t bào vào tr ng thái không nguyên phân, làm chúng không th duy trì dòng t bào b t t . Vì v y, nhi u nhà nghiên c u h ưng n xây d ng các môi tr ưng t ng h p không dùng huy t thanh (nh ư M-199) hay dùng v i l ưng th p (CMRL 1066, NTCT 109). phát tri n t bào trong môi tr ưng không huy t thanh, c1o nhi u cách ti p c n, t t c các chi n l ưc này u nh m kt h p s thay i liên t c v i vi c làm giàu các thành ph n dinh d ưng trong môi tr ưng nuôi: - To s thích nghi c a các t bào v i môi tr ưng không huy t thanh và không b sung hormone nào. - S d ng huy t thanh ã ưc làm gi m (hay loi b hoàn toàn) các l p hormone không cn thi t. - B sung th ưng xuyên vào môi tr ưng không huy t thanh các nhân t t ng tr ưng, bám dính và các nhân t phù h p khác. III.3. Ch n l c môi tr ng thích h p Nu m t dòng t bào m i ưc mang vào phòng thí nghi m, c n xác nh môi tr ưng thích hp phát tri n. Các thông tin này có th ưc ưa ra b i nhà cung c p. C ng có th t tìm ưc thông tin thông qua vi c sàng l c, th nghi m v i nhi u loài môi tr ưng khác nhau trong cùng iu ki n nuôi xác nh môi tr ưng thích h p cho nuôi c y nh ng t bào phát tri n s ơ c p u tiên, nh ng dòng t bào còn thi u thông tin ho c mu n tìm môi tr ưng m i thay th cho m t dòng t bào nào ó. Hi n nay, tr nh ng dòng t bào ã thi t l p ưc thu n hóa v i môi tr ưng tng h p hoàn toàn, a s các dòng t bào còn l i ưc nuôi c y trong môi tr ưng t ng h p có b sung 5–10% huy t thanh (có dòng t bào c n b sung 20% huy t thanh). ưc s d ng ph bi n là huy t thanh bê, c ng có m t s lo i t bào òi h i b sung huy t thanh bào thai bò trong môi tr ưng nuôi c y. Ngoài huy t thanh, m t s nh ng d ch chi t sinh h c ph c t p (s a, d ch chi t phôi, huy t t ươ ng ), các nhân t t ng tr ưng, hormone c ng th ưng ưc b sung vào môi tr ưng. 14
15. III.4. K thu t pha môi tr ng - Thành ph n môi tr ưng: khác nhau tùy vào lo i s d ng. Khi pha môi tr ưng c n ph i m b o cung c p y các thành ph n theo úng công th c. - iu ki n nuôi c y: thông th ưng các t bào ng v t phát tri n t t nh t nhi t m o kho ng 36-39 C. c bi t khi nuôi c y t bào ng v t, iu ki n v m và n ng CO 2 trong không khí r t quan tr ng. Trong các t nuôi c y t bào ng v t th ưng t m t khay n ưc t o m cao trong không khí, tránh b c h ơi n ưc t môi tr ưng nuôi, d n n thay i áp su t th m th u c a môi tr ưng. N ng CO 2 trong t nuôi th ưng 5%, c bi t có khi n 95%. - S vô trùng: ây là y u t c c k quan tr ng và ưc l ưu ý c bi t trong nuôi c y t bào ng v t. Virus và các vi sinh v t ngo i nhi m là nh ng nguy c ơ l n, có th làm ch t t bào nuôi cy. Tùy theo tính ch t hóa h c c a các thành ph n môi tr ưng ch n cách kh trùng thích h p, có th là h p ưt ho c l c vô trùng b ng milipore. IV. K THU T NUÔI C Y T BÀO IV.1. NUÔI C Y S Ơ C P Quy trình nuôi s ơ c p gm: THU NH N M U MÔ Ct nh (Ch n l c m u mô quan tâm, c t b ph n mô ch t) Ct nh Tách t bào b ng Tách t bào b ng (M nh nh nuôi) cơ h c ( nghi n, ép) enzyme ( ) Nuôi m u Trypsin l nh Trypsin m Collagenase mô s ơ c p Ly tâm NUÔI SƠ CP Tái huy n phù Thu nh n t bào mi Cy chuy n Nuôi m nh DÒNG T BÀO mô th c p Hình 1.1. Sơ nuôi c y s ơ c p 15
16. + B ưc 1: thu nh n mô (t ươ i hay ông l nh) có ch a t bào s ng. + Bưc 2: ph u tích và/ hay tách r i t bào, xác nh n ng . + Bưc 3: nuôi c y. IV.1.1. Thu nh n m u và x lý s ơ b Mu thu nh n có th bao g m b t k mô nào c a c ơ th . T i n ơi thu nh n, m u c n ưc làm s ch (r a và sát trùng b ng c n) r i ưa vào b o qu n trong dung d ch DPBS r i chuy n nhanh v phòng thí nghi m. Tùy lo i m u mô c ng nh ư th i gian c n thi t ưa v phòng thí nghi m, có k ho ch v n chuy n chúng trong iu ki n nhi t m (37 0C), nhi t l nh hay ông l nh t m th i. X lý s ơ b m u mô: r a nhi u l n b ng dung d ch DPBS có b sung kháng sinh, kháng nm
    ct b các ph n mô ch t, ph n th a
    ct m nh nh ra thành t ng m nh 2-3 mm 2
    nuôi mu mô s ơ c p ho c tách r i các t bào. VI.1.2. Tách r i các t bào Mô là t p h p các t bào ưc t ch c tinh vi và c tr ưng, chúng liên k t thành m t kh i th ng nh t, thông qua các c u n i gian bào. Tách các t bào ra kh i mô c n phá b nh ng c u n i liên bào này, nh ưng không gây t n th ươ ng áng k cho t bào. Có hai bi n pháp chính tách r i các t bào: a. Tách b ng c ơ h c - Ct nhuy n mô : Dùng kéo c t nhuy n m nh mô, huy n phù trong dung d ch PBS (-), lng và thu d ch trong (huy n phù thu nh n các t bào ơ n). Ph ươ ng pháp này cho kh n ng s ng ca t bào cao nh ưng s l ưng t bào ơ n thu nh n ít nên th ưng ưc áp d ng cho nh ng m u mô có kích th ưc l n và không khan hi m. Trên th c t , vi c c t nhuy n mô th ưng dùng làm t ng kh n ng ti p xúc c a mô v i enzyme trong k thu t tách b ng enzyme ưc ti n hành sau ó. - Ép nhuy n mô s d ng hai phi n lame: th ưng ưc s d ng tách t bào nh ng mô có liên k t y u (nh ư mô lách). Ngoài ra còn có th s d ng các pittong c a syringe ép mô trong a petri nh m tách r i các t bào. - Ép b ng màng l c t bào (Cell strainer): t m u mô lên trên màng l c (có ưng kính l 70 – 100 µm), s d ng pittong c a syringe chà sát m nh m nh mô, khi ó, nh ng t bào s va ch m vào l ưi l c và tách r i. Nh ng t bào ơ n (có ưng kính nh h ơn l l c) s l t qua l l c. b. Tách b ng enzyme Cu n i gian bào có b n ch t là protein (các t bào liên k t v i nhau và v i ECM), do v y các protease s d ng tách t bào là nh ng enzyme thu phân protein nh ư: trypsin, collagenase, elastase, pronase, dispase hay nh ng t h p khác. Vi c s d ng enzyme có th riêng l , hay k t h p tùy thu c vào m c ích. Trypsin ct liên k t gi a nhóm carboxyl (-COOH) c a lysin ho c arginin và g c amin (- NH 2) c a axid amin b t kì ng li n k v i nó trong polypeptid, ngo i tr liên k t gi a lysin và arginin. X lý trypsin d n n s cu n tròn t bào. Khi các t bào co l i, các liên k t tr nên l ng lo và t bào d dàng ưc tách ra b i tác ng c ơ h c. Trypsin ho t ng trong môi tr ưng pH 6 – 9, t i ưu pH 8 – 9, r t b n v ng trong môi tr ưng acid y u. 16
17. Canxi ưc xem nh ư ch t b o v cho trypsin, ho t tính xúc tác c a trypsin b gi m 50% khi vng m t Ca 2+ vì trypsin tr nên tr ơ. M t s kim lo i nh ư coban, mangan có kh n ng ho t hóa trypsin. Ho t tính c a trypsin s b kìm hãm b i huy t thanh bò có thai ho c DFP (di-isopropyl fluoro phosphate). Nng trypsin th ưng dùng tách t bào là 0,01–0,5% (th ưng là 0,25%), ôi khi là 1%. Có th s d ng quy trình trypsin m (37 0C) hay trypsin l nh (4 0C). Trypsin không tác ng c hi u cho lo i protein, vì v y có th phân c t các protein màng và gây v t bào khi dùng n ng cao, ho c cho tác ng trong th i gian dài. C n trung hòa trypsin b ng huy t thanh ngay sau khi thu uc t bào ơ n. Collagenase là enzyme th y phân các liên k t peptid d ng poly-L prolin c tr ưng cho vùng xo n c a collagen. Collagenase thu nh n t ng v t h u nh thì c t chu i collagen t i nh ng im riêng bi t, còn thu nh n t vi khu n thì c t t i nhi u v trí d c trên chu i collagen. a s các collagenase ho t ng pH trung tính ho c h ơi ki m (pH 7- 8), nhi t thích hp d ưi 40 0C, và gi m ho t tính nhi t trên 45 0C. Có 4 lo i collagenase: - Collagenase lo i I: ch a m t l ưng trung bình nh ng ho t ch t (collagenase, caseinase, clostripain, trypsin ho t ng). Chúng th ưng ưc dùng cho vi c tách t bào da, gan, ph i, m và nh ng t bào mô th ưng th n. - Collagenase lo i II: ch a h p ch t clostripain nhi u h ơn, ưc s d ng tách t bào t tim, x ươ ng, c ơ và s n. - Collagenase lo i III: có ho t tính phân gi i protein th p. - Collagenase lo i IV: có ho t tính trypsin th p, th ưng dùng phân tách t bào t y. Collagenase và dispase phân c t không hoàn toàn các c u n i nên ít làm h ư h i t bào. Ng ưi ta còn s d ng hyaluronidase k t h p v i collagenase phân h y các ch t d ch n i bào, DNase ưc s d ng phân h y các DNA thoát ra t các t bào b ly gi i. Chymotrypsin có tính c hi u kém h ơn trypsin, nó phân gi i các liên k t peptide t o thành bi nhóm carboxyl c a acid amin th ơm (nh ư tyrosin, phenylalanin, tryptophan, methionin và leucin) v i m t nhóm amin c a m t acid amin khác. Chymotrypsin có pH thích h p t 8 – 9, và b c ch b i DFB (di-isopropyl fluoro phosphate) Papain th y phân protein thành các polypeptid và các acid amin. Papain ch u ưc nhi t tươ ng i cao (d ng khô không b bi n tính 100 0C trong 3 gi ), ho t ng pH t 4,5 – 8,5 (tùy vào c ơ ch t l a ch n pH thích h p nh t cho m i ph n ng). Papain b kìm hãm b i các ch t oxy hóa nh ư oxy, ozone, hydroperoxyte, iod acetamid, th y ngân chlobenzoate, cystin và các h p ch t disulfur khác. Elastase th y phân m t s l ưng l n protein n n. Elastase là enzyme duy nh t có kh n ng th y phân elastin, m t ch t n n không b tác ng b i trypsin, chymotrypsin hay pepsin. Elastase th ưng ưc s d ng có k t h p v i các enzyme khác nh ư collagenase, trypsin và chymotrypsin. Elastase là enzyme ưc ch n tách t bào t phôi. c. Tách t bào b ng các ph ơ ng pháp khác + Ph ơ ng pháp ly tâm theo gradient t tr ng: ưc s d ng phân tách tinh trùng hay các t bào ơ n nhân trong máu. Môi tr ưng ly tâm th ưng s d ng là Percoll, Ficoll 17
18. VD: Quy trình Ficoll dùng phân tách t bào máu ơ n nhân: - Pha loãng máu (có ch t ch ng ông) 2 l n v i dung d ch m PBS - t 35 ml máu pha loãng lên 15ml Ficoll, ly tâm t c 400g trong 20 phút 24 0C - Thu d ch n i, huy n phù trong cùng m t l ưng dung d ch m - Ly tâm l n n a t c 500g trong 20 phút 24 0C - Thu c n, huy n phù trong cùng m t l ưng dung d ch m - Bo qu n d ch huy n phù t bào 2 – 80C + Ph ơ ng pháp tách t bào d a vào marker b m t (là nh ng receptor b m t c a t bào) : ưc s d ng ánh d u và phân l p t bào g c. Nh ng t bào g c hi m hoi ưc ch n t hàng tri u t bào khác. D ch t bào ưc ính m t phân t hu nh quang vào receptor, d ưi tác d ng c a lc y, d ch (có t bào) s i qua m t u kim r t nh , sao cho m i l n ch có m t t bào. u ra ca kim là m t ngu n ánh sáng, th ưng là tia laser và sau ó là m t in tr ưng. Nh ng t bào phát hu nh quang s mang in tích âm, còn nh ng t bào không phát hu nh quang mang in tích dươ ng. S tích in khác nhau nh ư v y cho phép thu nh n t bào c n. Mc dù m i lo i mô có nh ng yêu c u v iu ki n tách khác nhau, nh ưng cho dù là mô nào, khi tách t bào nuôi c y u c n l ưu ý m t s im sau: - Các mô m , mô ch t, mô t p ph i ưc lo i b ra trong quá trình tách. - Mô nên ưc c t nhuy n b ng d ng c nh n, bén tránh h ư h i t bào. - Enzyme s d ng trong quá trình tách t bào, tr ưc ó ph i ưc tách ra kh i dung d ch (b ng ly tâm), hay ph i b b t ho t (b ng huy t thanh). - Nng t bào thu nh n cho nuôi c y s ơ c p ph i m b o, ng th i luôn cao h ơn n ng t bào nuôi c y sau ó. - Hi ph c t bào b ng cách nuôi trong môi tr ưng dinh dưng cao hay b sung huy t thanh vi n ng cao. - Phân tách t bào t mô non hay phôi nhanh h ơn, hi u qu cao h ơn, t bào thu ưc nhi u hơn, s ng và t ng sinh m nh h ơn so v i các mô ã tr ưng thành. IV.1.3 Nuôi c y thu nh n t bào a. Nuôi t bào s ơ c p Ly tâm d ch tách t bào
    lo i b d ch n i, thu c n
    huy n phù t bào
    ư a d ch huy n phù t bào vào bình nuôi c y (bình Roux), b sung môi tr ưng
    37,5 0C trong t nuôi, sau 24 gi thay môi tr ưng m i và ti p t c . Sau l n nuôi c y s ơ s c p thu ưc các t bào s ơ c p. Thành ph n t bào s ơ c p r t ph c tp, bao g m nhi u lo i t bào khác nhau cùng hi n di n trong bình nuôi. có dòng t bào thu n nh t, c n th c hi n b ưc ti p là ch n dòng. b. Nuôi c y phát tri n m nh mô s ơ c p i v i tr ưng h p l ưng m u mô quá ít, c n nuôi c y nguyên m nh mô thu nh n t bào, tránh m t m u khi tách mô: t các m nh mô trong a nuôi, s d ng cùng môi tr ưng v i môi tr ưng nuôi t bào t mô ó. 18
19. Các m nh mô th ưng n i, hay l ơ l ng trong môi tr ưng nuôi c y, th ưng b ch t nhanh n u không bám vào b m t nuôi. Có th b sung ít môi tr ưng t ng s bám dính c a m nh mô vào b m t d ng c nuôi ho c c nh m u mô b ng huy t t ươ ng/ huy t thanh. Khi các t bào ã phát tri n và lan r ng ra t các rìa c a m nh mô, ti n hành tách b m u mô và thu ưc t bào. c. C y chuy n Cy chuy n r t c n cung c p ch t dinh d ưng và không gian cho các dòng t bào phát tri n liên t c. T n s và t l pha loãng, hay n ng t bào trong c y chuy n ph thu c vào các c tính c a m i dòng. N u dòng ưc c y chuy n quá th ưng xuyên hay n ng t bào quá th p, chúng có th b m t. Cy chuy n bao g m các thao tác sau: - Tách b môi tr ưng nuôi c y c . - Ra b m t giá th nuôi (có t bào bám). - Tách các t bào bám kh i b m t d ng c nuôi. - Pha loãng các t bào b ng môi tr ưng m i. Cy chuy n các t bào bám dính: - Tách b môi tr ưng kh i h p nuôi. N u các t bào bám ch t, có th b môi tr ưng. N u nhi u t bào n i hay bám y u, nên l c nh và r a, sau ó làm l ng s bám dính các t bào b ng dung d ch trypsin. - Ra d ng c nuôi v i PBS. - B sung dung d ch trypsin. - trong t m 37 0C ch ng 2 – 3 phút (tùy ki u t bào và ki u nuôi)
    xem d ưi kính hi n vi: n u các t bào có hình tròn có ngh a là chúng ã tách ra kh i b m t giá th nuôi. - Huy n phù v i môi tr ưng có b sung huy t thanh, và r a t bào b ng cách ly tâm 800 vòng/phút trong 5 – 10 phút
    tái huy n phù b ng môi tr ưng nuôi (b ưc này có th b n u t l pha loãng cao trong môi tr ưng có ch a huy t thanh) Cy chuy n các t bào huy n phù: Nuôi c y các t bào trong các flask hay các spinner có th ưc duy trì b ng vi c pha loãng mt l ưng t ươ ng ươ ng c a huy n phù t bào b ng môi tr ưng t ươ i: - Gi flask ng th ng, dùng pipette huy n phù vài l n tách r i các c m t bào. - Tách l y m t l ưng huy n phù m ho c pha loãng vào bình nuôi m i
    ly tâm
    thu cn, lo i b d ch n i
    tái huy n phù c n vón vào môi tr ưng t ươ i
    ly m t th tích t ươ ng ươ ng lưng t bào mong mu n vào các bình nuôi và ti n hành nuôi. IV.2. T O DÒNG T BÀO Vi c t o dòng m b o t t c các t bào con cháu u xu t phát t m t t bào ơ n và có cùng m t c tính di truy n. Ý ngh a c a vi c t o dòng là ng n c n nh ng thay i nhanh, và không oán tr ưc trong ki u hình nuôi c y. H ơn n a vi c t o dòng cho phép sàng l c s l ưng l n các dòng c ng nh ư ch n l c các dòng t bào v i c tính mong mu n. Nói chung vi c t o dòng cho phép ch n l c m t ch ng t bào v i các c tính t i ưu cho nghiên c u. 19
20. Tái t o dòng (recloning) là công vi c thi t l p l i các c tính v n có c a dòng, m t khi chúng b bi n i (b i các dòng t bào ã thi t l p có th t o ra m t s bi n i nào ó v i các c tính phù h p h ơn, trong môi tr ưng nuôi nào ó). Nu mu n thay i các c tính t bào thông qua t bi n hay chuy n nhi m, thì vi c t o dòng không c n thi t. Do ó, có th t o các bi n i quan tr ng trong các ki u hình c bi t, sau mt vài th h c y chuy n. Trong môi tr ưng nuôi c y, m t t bào riêng r s nguyên phân t o nhi u t bào con. Các t bào này qu n t t i v trí ca t bào m ban u, hình thành nên m t t p oàn (colony). Nh ư v y, các t bào c a m t t p oàn s có cùng c tính ki u gen và ki u hình, hay nói cách khác, chúng cùng m t dòng. IV.2.1. K thu t ch n dòng t bào Ph ươ ng pháp ti n hành: - Dùng dung d ch trypsin tách r i các t bào t a nuôi c y, t o huy n phù t bào. - Cy t bào vào a nuôi có môi tr ưng m i v i m t th p ( các t bào cách xa nhau trong a nuôi). Nuôi t bào cho n khi chúng phát tri n các colony riêng r . - Ch n m t colony t bào c n t o dòng, cô l p b ng m t m t ng kim lo i n ng có kích th ưc phù h p. Hút b môi tr ưng trong ng và tách các t bào t colony này b ng trypsin, c y sang a môi tr ưng m i. Nu c n thi t có th th c hi n b ưc ch n dòng này vài l n n a cho n khi m b o thu ưc dòng t bào t m t t bào u tiên. Cy chuy n t bào - b môi tr ưng c . - Cho PBS vào bình Roux (-), l c nh r a s ch t bào ch t và huy t thanh, b PBS (-), lp l i 2 l n. - Cho trypsin-EDTA cho vào bình Roux. - Lc nh bình Roux. - b trypsin, v nh bình Roux t bào tách kh i vách bình Roux. - Cho 2ml E’MEM vào bình Roux, tráng u lên b m t bình Roux có t bào. - Hút vào m i bình Roux m i 5ml môi tr ưng E’MEM. - Dùng pipette hút s c môi tr ưng và phun u vào b m t bình Roux có t bào t o huy n phù. - Hút d ch huy n phù cho vào bình Roux m i, l c nh , 37,5 0C trong t nuôi. - Sau 24 gi , b môi tr ưng c , cho môi tr ưng m i vào lo i b trypsin và các t bào ch t. Mt bình Roux ch a y t bào có th c y chuy n sang 3 ho c 4 bình Roux m i. 20
21. IV.2.2. Các ph ơ ng pháp t o dòng a. Ph ơ ng pháp ng syringe: giúp thu nh n các t p oàn t bào quan tâm ưc nuôi c y trên môi tr ưng th ch. Cách ti n hành: - Tách các t bào b ng trypsin. - Tái huy n phù trong môi tr ưng phát tri n. - m m t th tích t bào. - Huy n phù t bào. - Thêm môi tr ưng vào d ch huy n phù, hút–nh b ng pipette vài l n tách các t bào riêng r . - trong t m và quan sát b t u vào ngày th 5. - Khi t p oàn phát tri n ch ng 50 – 100 t bào, có th “nh t ra” các t p oàn ch n l c, c n ch c ch n r ng các t p oàn ch n l c xa kh i các “hàng xóm c ” c a nó vòng nh n t o dòng s ch ch a m t t p oàn duy nh t. - Hút b môi tr ưng và r a v i PBS. - Trét m t d ưi m t ng syringe (b ng thép không g ) m t l p m silicone ã h p kh trùng. Dùng k p syringe vào a, n xu ng ch c ch n nó ưc g n t t. M i syringe không nên ch a hai t p oàn. - Ti p t c n khi có 5 – 10 t p òan/ a ưc ch n và bao ph u. - Cho trypsin vào syringe, n khi các t bào tr nên tròn và n i lên khi ki m tra d ưi kính hi n vi. - Pha loãng trypsin v i môi tr ưng phát tri n và c n th n hút o nh khi ki m tra d ưi kính hi n vi. - Thêm môi tr ưng t ng tr ưng vào gi ng. - Lp y các gi ng v i n ưc c t vô trùng hay PBS. - 37 0C và ki m tra s phát tri n hàng ngày. b. Ph ơ ng pháp pha loãng t i h n các n ng pha loãng r t th p, trong m t th tích dung d ch nh t nh có th ch ch a mt t bào duy nh t. Các t bào ơ n này ưc nuôi c y trong các vi gi ng, hình thành m t t p oàn. Dòng t bào quan tâm ưc ch n tr c ti p t nh ng t p oàn này. Ph ươ ng pháp này có th ưc s d ng v i các t bào huy n phù hay t bào bám. Ti n hành: - X lý các a nuôi b ng trypsin thu ưc d ch huy n phù t bào ơ n. Quan sát, ki m tra dưi kính hi n vi. - Ra các t bào hai l n b ng cách ly tâm t c th p. 21
22. - iu ch nh sao cho thu ưc n ng 10 – 100 t bào/ml trong môi tr ưng phát tri n hòan ch nh. - Cho môi tr ưng vào các gi ng nuôi c a a 96 gi ng, n ng s dng ph thu c vào hi u qu tr i c a các t bào s d ng. t i a c ơ h i có các t bào ơ n/gi ng, ch ng m t n a s gi ng có th s không có t bào nào. - T 12 – 14 gi ki m tra các dòng sau khi tr i, ánh d u các a có t bào ơ n. N u có gi ng có t hai t bào tr lên ph i b gi ng ó. - Các dòng có th ưc tr c ti p sàng l c t các gi ng nuôi c a a. - Khi m t dòng ưc ch n, chúng ưc nh t ra và nuôi vào a 24 gi ng, 35mm và cu i cùng là 100mm. Có th s d ng cùng lo i môi tr ưng l n nuôi u tiên. c. Ph ơ ng pháp dùng môi tr ng không huy t thanh To dòng trong môi tr ưng không huy t thanh t ươ ng t v i ph ươ ng pháp t o dòng nêu trên, ngo i tr c n ph i trung hòa trypsin v i STI và r a b ng cách ly tâm. V. CÁC H TH NG NUÔI C Y T BÀO NG V T V.1 H TH NG NUÔI C Y T BÀO TRUY N TH NG (NUÔI C Y T BÀO 2D) Nuôi c y t bào truy n th ng là ph ươ ng pháp nuôi c y trên a Petri 2D, a nhi u gi ng 2D hay b m t lam kính 2D. Tuy nhiên, c u trúc môi tr ưng bình th ưng c a m t t bào trong c ơ th sng là 3D g m m t m ng l ưi ph c t p các vi s i khuôn ngo i bào v i các vi l ; trong ó các t bào ưc các t bào khác bao quanh, v i các ligand ngo i bào, bao g m nhi u lo i colagen, laminin và các protein n n khác, không ch cho phép liên k t t bào – t bào, t bào – màng c ơ b n mà còn dn oxy, hormone, d ưng ch t vào và lo i b các s n ph m th i. Vì v y, ph ươ ng pháp nuôi c y truy n th ng th hi n m t s h n ch , ó là: - Không th thi t l p m t gradient 3D “ úng” trong nuôi c y 2D – iu này có nh h ưng nh t nh n s bi t hóa sinh h c, quy t nh s ph n c a t bào, s phát tri n c ơ quan, truy n tín hi u, truy n thông tin th n kinh và vô s các quá trình sinh h c khác. - T bào ưc phân l p tr c ti p t c ơ th th ưng xuyên thay i s chuy n hóa và các ki u bi u hi n gen hi ưc nuôi c y 2D vì s thích ng c a các t bào v i a petri 2D òi h i s iu ch nh áng k c a qu n th t bào ang s ng không ch thay i oxy, d ưng ch t và các t ươ ng tác ECM mà còn lo i b ch t th i. - Các t bào t ng tr ưng trong môi tr ưng 2D có th thay i áng k kh n ng x n xu t các protein ECM c a riêng chúng và th ưng xuyên ch u nh ng bi n i v hình thái (VD: gia t ng s tr i r ng). - Các t bào nuôi c y in vitro thi u các tác nhân tín hi u và hormone ch y u (nh ư bình th ưng, chúng ưc cung c p y trong c ơ th t h tu n hoàn). V.2 H TH NG NUÔI C Y T BÀO 3D K thu t nuôi c y t bào 3D ưc ng d ng nh m phát tri n các mô và c ơ quan thay th . Trong k thu t này, ng ưi ta ưa t bào và các nhân t t ng tr ưng vào trong các scaffold t ng h p (ho t ng nh ư ECM t m th i) giúp các t bào t ch c thành các mô khác nhau (da, s n, gan, th n kinh, m ch ) hay th m chí là c c ơ quan. Scaffold là m t khuôn ngo i bào nhân t o có c u trúc l x p, giúp iu ti t t bào, h ưng dn t ng tr ưng và tái t o mô ba chi u. Sau khi ưc ưa vào scaffold, các t bào s bám, sau ó 22
23. sao chép, bi t hóa và t ch c thành mô kh e m nh bình th ưng, cùng v i vi c ti t ra các thành ph n n n ng ai bào c n t o mô. Vì v y, vi c ch n l a scaffold là c t y u t o ra các mô và c ơ quan có hình d ng và kích th ưc mong mu n. Oxy và d ưng ch t ưc cung c p t môi tr ưng lng nuôi c y t bào. Các t bào b t u t ng sinh và di c ư vào các l c a scaffold. Các polymer t ng h p (nh ư PGA, PLA, PLGA, PCL) và các polymer t nhiên (alginate, agarose, gel collagen, polyglycosaminoglican ) xut hi n trong nh ng th p k g n ây ưc l a ch n ph bi n ch t o scaffold vì s h p d n, linh ho t ng d ng cho s t ng tr ưng c a ph n ln các mô. Ph ương pháp này c ng t n t i m t s h n ch : - S phân h y các polymer t ng h p (c trong iu ki n in vitro và in vivo ), gi i phóng các sn ph m ph có tính acid, khi n vi môi tr ưng scaffold không lí t ưng cho s t ng tr ưng mô. - Các polymer t nhiên có th gây áp ng mi n d ch, do ó c n làm gi m tính kháng nguyên c a chúng b ng cách khâu m ch, ho c x lí pepsin lo i nh ng vùng telopeptid. - Các ph ươ ng pháp ch t o scaffold không th ki m soát chính xác kích th ưc và hình d ng l, c ng nh ư s phân b không gian c a các l và c u trúc các kênh bên trong scaffold. Dung môi còn d ư ng l i trong scaffold c ng là v n quan tr ng c n gi i quy t vì nguy c ơ c t và gây ung th ư cao. - Các t bào không th phân b ng nh t trong kh p scaffold – hu h t các t bào không th di c ư vào bên trong sâu h ơn 500 µm. kh c ph c tình tr ng này, nên c y thêm t bào vào scaffold trong su t quá trình thi t k ki m soát t t h ơn s phân b t bào. Tuy nhiên, iu này không th th c hi n ưc v i h u h t các quy trình thi t k scaffold vì có liên quan n các hóa ch t c và nhi t, làm t n th ươ ng các t bào s ng. - Các t bào l p y các l và b t u ti t ECM c a riêng chúng, l p t bào trên cùng tiêu th ph n l n oxy và d ưng ch t, làm h n ch s khu ch tán c a các thành ph n này, do ó làm gi m s t bào tiên phong di c ư sâu vào bên trong scaffold. Cu i cùng, s di c ư c a t bào b d ng li do thi u oxy và d ưng ch t cung c p. - Ngay c khi t bào ã phân b kh p scaffold quy mô l n, v n c n cung c p m ch máu nuôi d ưng các t bào sâu bên trong scafflod. Các mô m ch xung quanh có th t ng tr ưng vào trong m t scaffold c y ghép, nh ưng ph i m t th i gian cho quá trình phát tri n m ch này, các t bào sâu bên trong có th ch t khi m ch phát tri n t i n ơi. V.3. NUÔI C Y T BÀO NG V T TRONG BÌNH KHU Y Hu h t vi c nuôi c y mô ti n hành trên quy mô nh , cung c p m t l ưng ít t bào ti n hành các thí nghi m. Vi c nuôi t bào ng v t v i quy mô l n ưc b t u th nghi m t u nh ng n m 1950 b ng cách dùng Jar Fermentor. Khi nuôi c y t bào ng v t quy mô l n, c n chú ý m t s c im không có l i cho nuôi c y quy mô l n sau: - T bào ng v t khá l n, kho ng 10 µm. Tính b n c ơ h c i v i s khu y y u. - Th i gian t ng sinh g p ôi ch m, kho ng 1 ngày. Nh y c m vi ion kim lo i. - Kém kh n ng thích ng v i môi tr ưng. C n huy t thanh và hormone. - a s t bào ng v t c n s ng và phân chia trên m t giá . Khi t ng l ưng t bào nuôi c y, c n ph i iu ch nh hàng lo t các thông s và thi t b c n thi t. Ch ng h n, m t s v n c n l ưu ý nh ư ch t dinh d ưng, s trao i khí ( c bi t là oxy) và 23
24. vi c lo i b các c t do chuy n hóa t o ra (ammonia, lactic acid ). t i ưu hóa quá trình, th tích nuôi ch ng 1 lít là t t nh t. Nuôi c y t bào ng v t trong bình khu y là b ưc t ng quy mô u tiên trong vi c nuôi c y t bào huy n phù t nhiên, hay t bào sau khi ưc thu n hóa, ho c g n t bào v i các vi v t mang. T bào ưc nuôi c y huy n phù trong m t bình nuôi, có b ph n cánh khu y ho t ng nh t tr ưng c a nam châm. Ngoài ra bình nuôi c y này còn có hai nhánh hai bên, thu n l i cho vi c thêm t bào, thay môi tr ưng, hay cung c p khí O 2, ho c không khí giàu CO 2. V.4. NUÔI C Y T BÀO QUY MÔ PILOT VÀ S N XU T Vi c l a ch n h th ng và hình th c nuôi c y ph thu c vào t c phát tri n và c im to s n ph m c a các dòng t bào. * H th ng nuôi c y: th ưng s d ng là hollor-fibre (s i r ng) và ceramic matrix modules (các ơ n v ch t n n ceramic), bioreacter khu y và fermentors. T bào có th ưc nuôi c y trong h th ng nuôi c y không ng nh t hay ng nh t: - H th ng nuôi c y không ng nh t: t bào ưc c nh trong phòng t ng sinh. H u h t các h th ng có phòng t ng sinh v i các hollow fibre, hay ch t n n ceramic x p. - H th ng nuôi c y ng nh t: t bào ưc nuôi trong bioreacter v i khu y c ơ h c, hay s c khí gi chúng tr ng thái huy n phù. * Hình th c nuôi c y gm: batch (theo m ), fed-batch (theo m có cung c p thêm t bào), chemostat (nuôi c y liên t c) và perfusion (ch y tràn). Batch và fed-batch ưc dùng ph bi n nh t. Hình th c chemostat và perfusion thì òi h i thao tác, hóa ch t nhi u h ơn vì nó cho phép t o MAbs liên t c. T t c các ph ươ ng pháp nói trên u có th áp d ng ưc v i h th ng nuôi c y ng nh t và không ng nh t, tr chemostat. VI. M T S K THU T LIÊN QUAN VI.1. K THU T VÔ TRÙNG K thu t vô trùng ưc thi t l p di t (l p hàng rào vô trùng) m t ph r ng các vi sinh v t (ng v t nguyên sinh, n m, vi khu n, mycoplasma, virus ). Tùy theo t ng i t ưng vi sinh v t, c bi t là kh n ng kháng c a chúng, có ph ươ ng pháp kh trùng t hi u qu t i a. Các ph ươ ng pháp kh trùng th ưng ưc dùng là: - S d ng autoclave t o n ưc nhi t 121 0C (d ng h ơi n ưc d ưi iu ki n áp su t). - Chi u x : chi u tia UV (Ultraviolet light), tia Gamma (Gamma ray) - Vô trùng b ng hóa ch t: alcohol (lo i 70%), khí formaldehyde - Vô trùng b ng l c: s d ng các b l c vi khu n và n m, b l c virus, máy l c HEPA (High efficiency particulate air). VI.2. QUAN SÁT T BÀO - Quan sát tr c ti p b ng m t, trên các a nuôi nh n bi t s thay i c a các y u t môi tr ưng nuôi: pH (d a vào màu s c c a môi tr ưng nh b sung ch t ch th màu pH), n ng CO 2 (do t nuôi báo), c c a môi tr ưng (gây nên b i vi sinh v t nhi m ho c các m nh v c a t bào ch t). - Quan sát d ưi kính hi n vi ánh giá v hình d ng, s l ưng t bào. 24
25. VI.3. KI M SOÁT NHI M Các vi sinh v t nhi m th ưng ưc nh n bi t khá d dàng vì thông qua nh ng quan sát b ng mt ho c quan sát d ưi kính hi n vi. Nh ng a nuôi có acid b t th ưng hay có v c hay có các qu c u, các dây c n ưc quan sát d ưi kính hi n vi phát hi n k p th i tác nhân nhi m. Nu sau khi ki m tra kh ng nh m u b nhi m, c n cách li các a nuôi ó và kh trùng, ng th i sát trùng kính hi n vi, v trí t a nuôi, tay và các d ng c khác. S nhi m virus th ưng r t khó và t n kém phát hi n. Và khó phát hi n nh t là ki u nhi m dòng t bào này v i m t dòng t bào khác (g i là s nhi m chéo – cross contaminated cell lines)– chúng có th x y ra nhi u n m mà không ưc phát hi n. Ng n ng a nhi m là iu c n thi t, òi h i s c n b ng gi a vi c duy trì môi tr ưng vô trùng trong phòng nuôi c y và thi t b , th i gian và chi phí liên quan. Cách t t nh t lo i b s nhi m trong nuôi c y là b i các a, v t d ng ã nhi m. Th m chí, khi c n thi t s n sàng h y b c các m u thí nghi m. VI.4. ÔNG L NH K thu t ông l nh nh m gi t bào trong nit ơ l ng nhi u n m v i kh n ng s ng sót cao là thu n l i c a các nghiên c u in vitro . Ngân hàng t bào ông l nh s cung c p th ưng kì các dòng t bào chu n, chúng ưc gi i ông và sau ó nuôi c y th c p. Khi thi t l p dòng t bào, chúng có th ưc b o qu n ông l nh sau 3 – 5 l n c y chuy n. i v i các t bào ng ưi bình th ưng, th i gian s ng in vitro có gi i h n, do v y, ông l nh là cách duy nh t s d ng dòng t bào này trongnhi u thí nghi m khác nhau. Vn t ra là khi các t bào qua ông l nh và gi i ông, n u h u h t b ch t, qu n th t bào không th ưc ông l nh tr l i như quy trình ã ti n hành. Quá trình 6ong l nh và gi i ông có th thay i ki u nhân t bào, c bi t là các t bào chu t. Do ó, ông l nh v n có th t o ra d hp trong t bào i v i m t s tr ưng h p. Nu các t bào ưc gi trong nit ơ l ng, ph i c n th n b i ây là c ơ h i nhi m, nh t là nhi m chéo, ho c s lan r ng các tác nhân nhi m nh ư mycoplasma. Cu i cùng, ng ưi ta nh n th y rng các t bào l ưu tr l i (-180 0C) th ưng gi m s c s ng. VII. NG D NG C A K THU T NUÔI C Y T BÀO NG V T - Nuôi c y t bào ng v t làm mô hình th nghi m và ch n oán b nh. - Sn xu t các h p ch t sinh h c nh ư interferon, vaccine virus, các protein (các nhân t ông máu và ho t hóa plasminogene ), enzyme (Rtase ) - To ngu n mô – t bào ng v t làm v t li u c y ghép: ghép t bào t y t ng t o ra insulin ca heo vào ng ưi, ghép t bào th n kinh t thai giúp ph c h i ch c n ng não hay ch c n ng v n ng, t o m ch máu t nuôi c y t bào ng m ch ch c a bò S phát tri n xa h ơn c a k thu t này trong y h c là vi c t o ngu n t bào – mô th c hi n ghép t thân: l y t bào/mô t c ơ th bnh nhân nuôi c y in vitro , cho bi t hóa thu ưc t bào/mô ghép l i cho chính b nh nhân ó, ph c h i các mô t n th ươ ng. Tri n v ng l n nh t trong l nh v c này là s d ng các t bào g c phôi thai. - Sn xu t các virus di t côn trùng b ng cách nuôi c y các t bào côn trùng và cho nhi m virus, sau ó thu ch ph m. 25
26. CH Ơ NG 2 CÔNG NGH H TR SINH S N I. GI I THI U Khái ni m: H tr sinh s n là m t quy trình nh m t o ra cá th m i v i nhi u k thu t h tr phù h p cho t ng giai on trong ti n trình sinh s n. Công ngh này không ch là m t li u pháp iu tr vô sinh/hi m mu n ng ưi mà còn là ph ươ ng ti n h u ích, n n t ng ti n hành các nghiên c u khác ng ưi và ng v t nh ư chuy n gen, ch n oán s m, b o t n ng v t, nhân b n, thu t bào g c. Nm 1763, Jacobi ã th c hi n các k thu t th tinh nhân t o cho chó và cá. N m 1780, bác s thú ý ng ưi Italia, Spallanzani, ã nghiên c u tinh d ch và nh n th y r ng khi tinh dch nhi t th p, tinh trùng s ng lâu h ơn. Cui th k 19, nhi u tài li u trình bày ph ươ ng pháp th tinh nhân t o cho chó, ng a và bò mt cách khá chi ti t. Tuy nhiên, ph m vi các nghiên c u nói trên còn h p, do s h n ch các ki n th c sinh h c th i by gi . Th tinh nhân t o cho gia súc ưc nghiên c u có h th ng t u th k XX. Nm 1959, con th u tiên ưc ra i t ph ươ ng pháp th tinh trong ng nghi m. Th tinh trong ng nghi m trên ng ưi ưc Petrucci c p n n m 1961 nh ưng b Tòa thánh Vatican ph n i k ch li t. N m 1962, công trình này ưc ti p t c b i Edward và Steptoe. Vào n m 1971, Steptoe ã b t u th c hi n hút 149 tr ng (t nhi u ph n hi n t ng) qua ni soi b ng và nuôi ưc 112 t bào n giai on phôi nang, tuy nhiên không th ti n hành c y truy n. Có m t tr ưng h p báo cáo c y thành công, phôi có hi n t ưng làm t , nh ưng r t ti c, thai li n m ngoài t cung. Nm 1972, con chu t u tiên ra i t phôi ông l nh. N m 1973, n l ưt con bê u tiên ra i c ng b ng phôi ông l nh. Ngày 25 tháng 7 n m 1978, l n u tiên trong l ch s phát tri n c a nhân lo i, mt bé gái (Louise Brown) ra i b ng công ngh th tinh trong ng nghi m t i m t b nh vi n Anh. N m 1982, bé gái th hai (Amadine) ra i b ng công ngh này Pháp. Trong nh ng n m 80 c a th k XX, k thu t th tinh trong ng nghi m phát tri n m nh. Singapore ưc ghi nh n là n ơi th c hi n thành công th tinh trong ng nghi m u tiên Châu Á vào n m 1983 b i nhóm nghiên c u c a SC Ng và cs. Nm 1984, m t phôi ông l nh ưc rã ông c y vào t cung, phát tri n và cho ra i bé trai u tiên, t tên là Zoe. N m 1993, trong khi nghiên c u m t ca lâm sàng B , Gianpiero D. Palermo ã ư a ra k thu t b ơm tinh trùng vào bào t ươ ng tr ng (ICSI). Nm 2005, phác m i trong k thu t tr tr ng ã c i thi n áng k t l th tinh. Nhi u em bé u tiên t c tr ng và tinh trùng ông l nh ra i thành công t i Ý. Ni dung c a các k thu t h tr sinh s n, v c ơ b n có th ưc x p thành các nhóm sau: - K thu t thu nh n giao t . - K thu t h tr th tinh. - Nuôi phôi. 26
27. - K thu t chuy n phôi (c y truy n). Và m t s k thu t liên quan khác. II. K THU T CHU N B GIAO T II.1. CHU N B TR NG II.1.1. Cho tr ng (oocyte donation) ng ưi, ng ưi cho tr ng ưc kích thích bu ng tr ng b ng các hormone gây chín r ng nhi u tr ng ho c ưc ch t hút qua siêu âm u dò âm o. Ng ưi cho tr ng th ưng không quá 35 tu i, có s c kh e t t, tâm sinh lý và quan h xã h i bình th ưng và nh t thi t ph i tr i qua các ki m tra y h c, n i ti t và s n khoa nghiêm ng t. N u ng ưi cho tr ng ã t ng có ít nh t là m t con bình th ưng thì càng t t. ng v t, thu nh n ngu n tr ng (và tinh trùng) c a nh ng gi ng khác nhau cùng loài, nh m th tinh trong ng nghi m ưc xem là m t ph ươ ng pháp lai t o hi u qu . Cho các giao t vt nuôi không mang ý ngh a h tr sinh s n mà ơ n thu n ch là tính ch t c i thi n gi ng, ph c v ch n nuôi hay b o t n loài. Nh ng n m g n ây, k thu t cho noãn t ươ ng ( ooplasmic donation – ch l y d ch bào t ươ ng hay d ch túi m m thay vì thu nh n t bào tr ng) và chuy n túi m m ưc ti n hành nh ư là m t ph ươ ng th c nh m ci thi n hi u qu c a h tr sinh s n. ây, khi tiêm m t l ưng nh noãn tươ ng c a t bào tr ng bình th ưng vào tr ng nh n thì có th s giúp h i ph c l i nh ng c tính mà tr ng nh n khi m khuy t. Ty th (t n t i trong noãn t ươ ng, gi ch c n ng hô h p) là thành ph n c ơ b n có nh h ưng quan tr ng t i ho t ng sinh lý bình th ưng c a tr ng. Tuy nhiên, s tn t i c a noãn t ươ ng ngo i lai trong t bào ch (d ty th ) có th gây ra nh ng i kháng v i b gen c a b và m n m trong nhân. S không t ươ ng thích gi a ty th và b gen có th s gây ra nh ng khi m khuy t trong s bi u hi n c a gen và s phát tri n, th m chí chúng có th ưc di truy n và bi u hi n nhi u th h ti p theo. II.1.2. Gây r ng tr ng nhi u (superovulation) Gây r ng tr ng nhi u (còn gi là gây siêu bào noãn ) là ph ươ ng pháp kích thích s chín và rng tr ng hàng lo t b ng các hormone nh m thu ưc nhi u tr ng chín m t lúc. iu này có th nh m hai m c ích: thu ngu n tr ng và cho th tinh t nhiên thu nh n ngu n phôi (trong ng dn trng) sau ó. Nhi u thí nghi m cho th y nhóm hormone gonadotropin (PMSG_Pregnant mare’s serum gonatropin) (huy t thanh ng a ch a) có tác d ng gây chín tr ng nhanh, gi ng nh ư FSH. T ươ ng t , hCG (human chorionic gonatropin) c ng tác ng gây r ng tr ng nh ư LH (Luteinizing hormone). Do v y, gây r ng tr ng nhi u, có th s d ng PMSG và FSH ( ưc tách chi t t tuy n yên c a cu, ho c heo) k t h p chung v i hormone hCG. FSH kích thích phát tri n m t lo t các nang noãn, iu này thích h p cho vi c th tinh in vitro . Trong m t s tr ưng h p, ch c n t o ra m t vài hay mt nang noãn phát tri n gi ng t nhiên. Li u dùng c a các hormone nói trên tùy thu c vào t ng loài, tu i và tr ng l ưng con v t; cng nh ư ph thu c vào lo i thu c, th i gian tiêm. m t s loài nh ư chu t, hi u qu kích thích rng tr ng còn ph thu c vào chu k sáng t i. 27
28. Bng 2.1. Quy trình gây siêu bài noãn m t s v t nuôi (E. Hafez, 1987) ng v t Ngày c a chu Hormone phát tri n tr ng Hormone r ng k ng d c tr ng hCG (IU) FSH (mg) PMSG (IU) Bò 15-16 1500-3000 20-50 1500-2000 Dê 16-17 1000-2000 12-20 1000-1500 Cu 12-14 1000-2000 12-20 1000-1500 Heo 15-16 750-1500 10-20 500-1000 Tác ng b t l i nh t c a vi c kích thích bu ng tr ng b ng hormone là có th xu t hi n hi ch ng quá m n c a bu ng tr ng (Ovarian hiperstimlation syndrome – OHSS) và tr ưng h p ch a a thai. V m t lâm sàng, h i ch ng này n u nh , hay trung bình không quan tr ng, nh ưng bi u hi n n ng có th e d a tính m ng. Tuy nguyên nhân ch ưa rõ ràng, nh ưng h i ch ng có m t s bi u hi n: - Nh : t ng hàm l ưng estrogen, bu ng tr ng to lên ch a các nang nh . - Trung bình: ngoài các bi u hi n trên còn xu t hi n tiêu ch y, nôn ói. - Nng: kích th ưc nang l n làm bu ng tr ng to, th m quanh mao m ch t ng làm thoát dch gây tích n ưc c tr ưng trong b ng và tràn d ch màng ph i, gây khó th . II.1.3. Thu nh n tr ng Có th thu nh n tr ng ng v t b ng nhi u cách: - Thu tr ng t ng d n tr ng sau khi r ng: ph u thu t l ng d n tr ng, s d ng ng thông b ơm dung d ch PBS g i r a lòng ng vài l n, tìm tr ng trong dung d ch r a và phân lo i. Ph ươ ng pháp này th ưng s d ng cho ng v t thí nghi m vì thu ưc tr ng có t l chín cao. Tuy nhiên, vi c xác nh th i im tr ng chín và r ng khó kh n, do v y, ch ng th ưng ph i gây rng tr ng nhi u b ng kích d c t . - Thu tr ng t nang tr ng c a bu ng tr ng: b ng k thu t n i soi – siêu âm, s d ng m t kim dài xuyên qua thành âm o, tìm nang tr ng chín ch c hút cho phép thu nh n t bào tr ng. Ph ươ ng pháp này cho phép khai thác tr ng nhi u l n, hi n ưc s d ng r ng rãi ng ưi và các gia súc l n, nh ưng ng v t quý hi m. Ngoài ra, c ng có th ti n hành n i soi qua thành b ng, c ng nh ư gi i ph u l bu ng tr ng gi ng nh ư cách thu tr ng ng d n tr ng. - Thu tr ng t nang tr ng c a bu ng tr ng nh ng ng v t ã b gi t m . Trong ph ươ ng pháp này, bu ng tr ng ph i ưc thu ngay sau khi m , càng s m càng t t, sau ó ti n hành kh trùng, b o qu n trong môi tr ưng thích h p và chuy n nhanh v phòng thí nghi m. Vi c thu nh n tr ng t bu ng tr ng liên quan t i m t s th pháp k thu t khác: - Ph ơ ng pháp ch c-hút (follicle puncturing): s d ng kim tiêm 18 G và syringe 5 ml ch c vào nang tr ng r i hút tr ng. - Ph ơ ng pháp r ch-múc (follicle dissection): dùng dao ph u thu t r ch nang tr ng múc dch có ch a tr ng. - Ph ơ ng pháp c t nghi n bu ng tr ng (ovary slicing): bu ng tr ng ưc c t nh b ng kéo và l c l y t bào tr ng. 28
29. các ph ươ ng pháp nêu trên, h u h t tr ng thu nh n ưc còn non, vì v y, chúng c n ph i ưc nuôi chín, m c dù các tr ng nuôi chín in vitro th ưng có hi u qu th tinh không cao. ng ưi, sau khi kích thích gây r ng có th thu nh n tr ng b ng m t trong ba ph ươ ng pháp (tùy tr ng thái b nh nhân, iu ki n b nh vi n): soi b ng (laparoscopic), siêu âm c c b bu ng tr ng (ultrasound) và g i r a nang tr ng (follicular flushing). II.1.4. Quan sát và phân lo i tr ng S d ng kính hi n vi soi n i v i phóng i x6-12 ki m tra d ch và x25-50 quan sát t bào tr ng. Tr ng ch ưa tr ưng thành s t i và khó quan sát, nh ưng v i tr ng tr ưng thành, c ng khó nh n ra chúng vì l p t bào cumulus s làm tr ng tr nên m nh t. Tr ng th ưng ưc quan sát v i ch t l ưng khác nhau thông qua s hi n di n c a l p t bào cumulus. N u phát hi n m t ph c h p tr ng/cumulus (oocyte/cumulus –OCC) thì vi c ánh giá tr ng thái c a tr ng th ưng d a vào th tích, 6 m c và s hi n di n v s l ưng, hình thái ca toàn b kh i OCC. N u phát hi n tr ng có m t th c c có th cho r ng tr ng ang giai on metaphase II (MII). Hi n có hai k thu t ánh giá s tr ưng thành c a tr ng t ph c h p OCC. - K thu t ánh giá gián ti p thông qua các tr ng còn g n kh i cumulus
    cách ánh giá này ơ n gi n nh ưng thi u chính xác. - K thu t ánh giá tr c ti p: có hai cách: + Làm d t ph c h p OCC b ng cách gây xung ng m nh a nuôi d ưi kính hi n vi r i ánh giá tr ng d a vào s hi n di m c a túi m m hay th c c th nh t: n u quan sát th y túi m m (vùng ch a nhân), tr ng ưc cho là ang giai on túi m m (GV); n u túi nhân không còn hi n di n trong tr ng, tr ng ưc cho là tr ng thái v túi m m (GVBD); khi th c c th nh t hi n di n, tr ng ã hoàn thành l n gi m phân u tiên và ang ngh metaphase – tr ng ang tr ng thái MII. + Phân tách kh i cumulus b ng enzym, r a tr ng và ánh giá gi ng nh ư khi tr ng còn l p cumulus. Thu n l i c a k thu t này là tr ng ưc ánh giá c n th n h ơn, và th ưng s d ng trong ICSI. Lp t bào cumulus Th c c Kho ng không quanh bào t ơ ng Vùng nhân Màng t bào Bào t ơ ng Zona pellucida Hình 2.1. Tr ng tr ng thành (ph c h p OCC)
30. II.1.5. Nuôi tr ng tr ng thành (in vitro maturation – IVM) Mt tr ng ưc coi là chín khi ã tr ưng thành c v nhân và t bào ch t. Ch nh ng tr ng chín m i s n sàng cho vi c th tinh. Các tr ng ưc l y tr c ti p t vi c ch c hút nang th ưng ch ưa tr ưng thành, do ó, sau khi thu nh n, tr ng ph i ưc nuôi chín (tr ưng thành) trong môi tr ưng có m HEPES, huy t thanh và heparin. u tiên, tr ng sau khi thu nh n ưc r a b ng môi tr ưng thu nh n ( ã ưc làm m 37 0C), sau ó r a b ng môi tr ưng nuôi chín và ư a vào các gi t môi tr ưng nuôi nuôi chín. Môi tr ưng nuôi chín tr ng khác nhau gi a các loài, ng th i khác nhau v m c ích s dng và ôi khi tùy thu c vào các phòng thí nghi m, g m hai lo i: môi tr ưng ơn gi n và môi tr ưng ph c t p. Môi tr ưng IVM th ưng ưc b sung hormone (FSH, LH/hCG, estradiol, prolactin ) nh m tác ng tr c ti p lên quá trình tr ưng thành c a tr ng, c i thi n s phát tri n c a ph6oi giai on tr ưc làm t . Nhân t t ng tr ưng c ng ưc b sung g m IGF (vai trò g ng insulin–like growth factor), EGF (nhân t t ng tr ưng bi u mô–epidermal growth factor) và TGF-L. Chúng tác ng lên s phân bào, kích thích t ng h p RNA và protein Có nhi u y u t nh h ưng n IVM, ch ng h n n ưc s d ng, th m th u, nhi t và khí, sáng c a môi tr ưng, d ng c nuôi c y Nhi t thích h p cho IVM tr ng bò và trâu là 0 38–39 C, n ng khí thích h p là 5%CO 2, 5%O 2 và 90% N 2. II.2. CHU N B TINH TRÙNG II.2.1. Thu nh n tinh d ch ng v t, tinh trùng s d ng trong th tinh in vitro có th ưc khai thác t tinh hoàn, phó tinh hoàn thông qua con ưng phóng tinh hay thu nh n t ph u thu t tr c ti p. Mt s ph ươ ng pháp th ưng dùng ly tinh t ng v t: - S d ng dòng in nh kích thích. - Dùng tay xoa tuy n sinh d c qua tr c tràng. - Dùng âm o gi . - Dùng tay. Trong ó ph bi n nh t là dùng âm o gi và dùng tay. ng ưi, trong tr ưng h p tinh trùng bình th ưng, vi c thu nh n ưc ti n hành b ng cách dùng tay kích thích phóng tinh. II.2.2. ánh giá tinh d ch và tinh trùng o th tích tinh d ch thu ưc b ng syringe hay các pipette chia v ch, sau ó s d ng phòng m h ng c u (haemocytometer) ánh giá m t tinh trùng, di ng c a tinh trùng c ng nh ư các ki u di ng c a tinh trùng. Qua ó, l a ch n ph ươ ng pháp thích h p chu n b m u cho các k thu t h tr . Thao tác d ưi kính hi n vi phóng i x20. Khi m c n l ưu ý: (1) s hi n di n c a các mnh v t bào và nh ng t bào khác ngoài các t bào tinh trùng (t bào h ng c u, b ch c u), (2) s ng ưng k t c a các t bào tinh trùng và ki u ng ưng k t. Hu h t m u tinh bình th ưng u có kh n ng th tinh. Không s d ng các m u ch a lưng tinh trùng b t th ưng (hình d ng) cao b i ti m n ng th tinh c a chúng kém. 30
31. Ngoài ra, nh ng h ư h ng trên NST c a tinh trùng c ng có th ưc phát hi n b ng ph ươ ng pháp nhu m chromomycin (CMA3) và nhu m aniline blue (AAB) Bình th ng (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) Hình 2.2. M t s d ng tinh trùng b t th ng ng i (1: Quá to, 2: Quá nh , 3: Nhi u u, 4: Nhi u uôi, 5: D d ng, 6: uôi g y, 7: Thân dài) II.2.3. Chu n b tinh trùng cho k thu t th tinh Các ph ươ ng pháp h tr th tinh, quy trình chu n b tinh trùng c ơ b n gi ng nhau, tr tr ưng h p th tinh vi thao tác. Tinh trùng ưc thu nh n b ng cách nào i n a c ng không có kh n ng xâm nh p vào t bào tr ng n u không ưc ho t hóa. Trong s giao ph i t nhiên, tinh trùng ưc ho t hóa trong ng sinh d c c a con cái. Trong s giao ph i t nhiên, tinh d ch có ch c n ng trung hòa và b o v tinh trùng kh i môi tr ưng acid c a âm o, ng th i có m t ph n ch c n ng n nh và nuôi d ưng tinh trùng. Tuy nhiên, tinh d ch c ng có th nh h ưng x u n tinh trùng sau khi phóng tinh vào âm nh ư làm gi m sc s ng, gi m di ng và th m chí làm gi m kh n ng th tinh c a tinh trùng. Do ó, vi c tách tinh trùng kh i tinh d ch s d ng vào m c ích iu tr là c n thi t. S l a ch n ph ươ ng pháp chu n b tinh trùng (trong th c t có th ph i k t h p gi a nhi u ph ươ ng pháp v i nhau) ph thu c vào s ánh giá v s l ưng t bào tinh trùng di ng, t l gi a s l ưng tinh trùng di ng so v i không di ng, th tích tinh d ch, s hi n di n c a các kháng th , s ng ưng k t hay m nh v . * Thu nh n tinh trùng 37 –39 0C 30– 60 phút Tinh trùng Tinh trùng ch t/ b t ng di ng t t Hình 2.3. K thu t Swim up
32. Ph ơ ng pháp swim up chu n: th ưng ưc dùng v i các m u tinh trùng có s l ưng cao (10 6 tinh trùng di ng/ml) v i kh n ng di ng ti n t t. Nguyên t c c a ph ươ ng pháp này là nh ng tinh trùng di ng t t s t b ơi lên trên, thoát kh i l p tinh d ch phía d ưi. Ly tâm v i gradient nng không liên t c: ưc s d ng cho các m u có m t s bi u hi n v di ng th p, kh n ng di ng ti n kém, l ưng m nh v và (hay) s l ưng t bào khác còn nhi u, có ch a n ng cao các kháng th kháng tinh trùng Tinh d ch Tinh d ch Percoll 45% Ly tâm Tinh trùng Percoll 90% bt ng Tinh trùng di ng Hình 2.4. K thu t ly tâm v i thang n ng Percoll Ph ơ ng pháp l ng hay t trên paraffin l ng: th ưng ưc s d ng v i m u có s l ưng tinh trùng th p và di ng kém. Ph ươ ng pháp này giúp tách các m nh v t bào hi u qu nh ưng li t n th i gian chu n b (vài gi ). Huy n phù tinh trùng t o gi t tròn Tinh trùng di ng Du paraffin a Petri Các m nh v và t bào khác l ng xu ng Hình 2.5. K thu t t o gi t l ng sau ly tâm Ly tâm t c cao và r a: s d ng cho nh ng m u quá ít tinh trùng, m u có th pha loãng ho c không pha loãng. S di chuy n – lng (migration-sendimantation) : ây là m t s c i bi n k thu t swim-up kt h p v i m t b ưc l ng. ây là m t k thu t nh nhàng nh ưng hi u su t r t th p i v i tinh trùng kém di ng nên không ưc dùng r ng rãi trong IVF Gn ây Zavos và cs. ã ngh s d ng ng tube nhi u ng n (multi-chamber tube) thu nh n các tinh trùng nh m s d ng cho các k thu t h tr sinh s n b ng ph ươ ng pháp swim-up và lng. So sánh v i ly tâm theo gradient n ng , k thu t này cho th y m t k t qu t t h ơn i v i tính di ng, hình thái tinh trùng bình th ưng, s óng xo n NST và cu i cùng, t l các tinh trùng ch t trong quá trình x lý c ng gi m. 32
33. Còn nhi u bi n pháp thu nh n tinh trùng khác, ch ng h n dùng các h t th y tinh (glass beads), l c b ng kh i s i th y tinh (Glass wool filtration), c t Sephadex, t o s di chuy n xuyên qua màng c a dòng tinh trùng (Transmembrance migration). Tuy nhiên, các ph ươ ng pháp này ph c tp nên ít ưc s d ng. * Kích ho t tinh trùng Các ch t kích thích th ưng ưc s d ng là pentoxifylline và 2-Deoxuadenosine, chúng làm gia t ng c ơ ch ho t hóa ATP n i bào, kích thích di ng c a các tinh trùng yu trong m u, làm t ng t l th tinh và mang thai i v i các m u tinh d ch không t t * L i ích c a vi c chu n b tinh trùng : Vi c ch n ưc các tinh trùng bình th ưng, di ng t t, ng th i cô c chúng trong m t th tích nh s t o nhi u thu n l i cho các ph ươ ng pháp iu tr : - Lo i ưc các t bào ch t, h u h t các vi sinh v t và ph n l n các ch t c. - Lo i ưc ph n l n prostaglandins có trong tinh d ch, tránh s co th t t cung trong ph ươ ng pháp IUI. - Kích thích s ho t hóa u tinh trùng, t o thu n l i cho quá trình th tinh. - Gi m ph n l n các nguy c ơ nhi m khu n t tinh d ch, b i các ph ươ ng pháp chu n b tinh trùng hi n nay có th phát hi n và lo i ưc h u h t vi sinh v t có trong tinh d ch. - Tránh nguy c ơ s c ph n v ( ôi khi x y ra) khi cho tinh d ch vào bu ng t cung. - Gi m ưc nguy c ơ t o kháng th kháng tinh trùng ng ưi v khi cho quá nhi u tinh trùng ch t vào bu ng t cung. Chu n b tinh trùng cho các k thu t vi th tinh có m t s khác bi t in hình. chu n b cho ICSI, ph i kt h p nhi u ph ươ ng pháp, c bi t v i các m u tinh d ch quá ít tinh trùng, không th chu n b b ng cách ly tâm hay các k thu t swim-up thông th ưng. III. K THU T H TR S TH TINH III.1. D N TINH NHÂN T O (Artificial Insemination_AI) Dn tinh nhân t o (còn g i gieo tinh ; sinh s n nhân t o) là nh ng k thu t ưa tinh trùng (ã ưc thu nh n, ch n l c) vào c ơ quan sinh d c c a con cái ( ã ưc chu n b tr ưc cho vi c nh n tinh). D n tinh nhân t o ra i nh m t ng nhanh t c c i t o di truy n c a loài. Do v y, ưc phát tri n và ng d ng nhanh vào nông nghi p. ng ưi, d n tinh nhân t o ưc s d ng iu tr các tr ưng h p vô sinh liên quan n quá trình giao ph i không (hay khó) x y ra nam c ng nh ư các b nh màng âm o, t cung làm cho tinh trùng gi m hay m t kh n ng th tinh n . Ngòai ra, d n tinh nhân t o còn ưc s d ng làm t ng hi u qu th tinh và h n ch các b nh lây qua ưng sinh d c. Tùy vào v trí ưa tinh trùng vào c ơ quan sinh d c cái, AI ưc phân thành b n hình th c k thu t, bao g m: - ITI (IntraTubal Insemination): b ơm tinh trùng vào ng d n tr ng. - IFI (IntraFollicular Insemination): b ơm tinh trùng vào vòi tr ng. - ICI (IntraCervical Insemiantion): b ơm tinh trùng vào c t cung. - IUI (IntraUterine Insemination): b ơm tinh trùng vào t cung. 33
34. Trong các k thu t d n tinh nhân t o, IUI ưc s d ng nhi u và ã ưc chu n hóa. ti n hành k thu t này, tr ưc h t tinh trùng ưc thu nh n, ki m tra s l ưng và ch t l ưng. ng th i, con cái s ưc theo dõi th i k ng d c s n sàng nh n tinh. Nh m ch ng, các con cái nh n tinh ph i ưc gây r ng nhi u tr ng b ng hormone. Dn tinh nhân t o trên i t ưng ng v t có m t s thu n l i: (1) c i t o ưc di truy n ca loài khi s d ng tinh trùng gi ng t t, (2) phát huy kh nng s d ng tinh trùng, (3) sau khi con c ch t, tinh trùng v n có th ưc thu nh n và s d ng, (4) gi m ưc các b nh lây lan qua ưng giao ph i, (5) ti n l i và có hi u qu kinh t cao. Bên c nh ó, k thu t AI c ng g p ph i m t s khó kh n: (1) ph i phát hi n chính xác th i k ng d c c a con cái, (2) ph i t p hu n cho ng ưi thao tác (d n tinh viên), (3) c n m t s k thu t ph tr khác nh ư ông l nh tinh, các k thu t ki m tra, ánh giá tinh trùng, ánh giá con v t nh n, theo dõi sau d n tinh Cn l ưu ý: k thu t IUI th c hi n trên ng ưi s d có nguy c ơ a thai (do gây siêu bào noãn làm chín h ơn m t tr ng) nên ng ưi m có th sinh ôi, sinh ba Nguy c ơ nhi m trùng khi th c hi n IUI cao n u b nh vi n không ưc trang b hi n i. III.2. TH TINH IN VITRO ( In vitro fertilization_IVF) Nang tr ng Tinh d ch ông l nh/ gi i ông Tinh d ch 0 30% Percoll Nuôi c y 39 C, 28 gi , 5% CO 2 45% Percoll Cn tinh trùng 0 s ơ b trong 6 – 8 gi , 39 C, 5% CO 2 (3 tri u tinh trùng/ml) Tr ng tr ng thành Tinh trùng ho t hóa (10 – 15 tr ng) Th tinh (10 tri u tinh trùng/ml) Hình 2.6. Quy trình th tinh in vitro bò (I. Gordon, 2003) (Môi tr ng nuôi tr ng thành tr ng: TCM-199, Gonadotrophins, Oestradiol, 10% FCS. Tinh d ch sau khi gi i ông c ly tâm r a m t l n b ng dung d ch Percoll, 500 g, 10 phút. Sau 0 khi r a, tinh trùng c s ơ b 6 – 8 gi , ho t hóa iu ki n 39 , 5% CO 2). Th tinh trong in vitro là quá trình k t h p gi a tinh trùng v i tr ng t o ra h p t , ưc th c hi n bên ngoài c ơ th m , t i phòng thí nghi m (trong h p l ng, h p Petri, ng nghi m). Tuy 34