Bài giảng Nhân giống vô tính

Nội dung text: Bài giảng Nhân giống vô tính

1. 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Khoa Nông học Chuyên đề1 NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TRỒNG 1. Một số khái niệm liên quan đến nhân giống NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH  * Sinh sản (Reproduction) : là khả năng sinh vật tái tạo các thế hệ. Phương thức rất đa dạng nhưng chính là sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính.  + Sinh sản hữu tính (Secxual reproduction) là có sự kết hợp của giao tử đực và cái > thành phôi >thành cơ thể mới hoàn chỉnh. Sinh sản hữu tính có thể là tự phối hoặc tạp giao.  + Sinh sản vô tính (Asecxual reproduction) không có sự kết hợp của giao tử đực và cái, ở cây trồng có các hình thức sau : Nhân giống vô tính cây trồng • Nhân giống (Propagation): là biện pháp kỹ thuật mà con người dùng để tái tạo các cá thể cần thiết thông qua hệ thống sinh sản = hữu tính hoặc vô tính ==>tuỳ vào mục đích cũng như các loại cây trồng. - Sinh sản vô phối (Agamic reproduction): phôi được tạo ra không qua thụ tinh giữa tế bào trứng & tinh trùng, do 2. Nhân giống cây trồng bằng phương pháp hữu tính hiện tượng tự nhiên để tạo ra dòng vô tính thông qua hạt + Khái niệm : nhân giống bằng phương pháp hữu tính là hình thức giống. cây con được hình thành từ hạt. Hạt được hình thành do kết quả thụ tinh giữa giao tử đực (hạt phấn) với giao tử cái (noãn). - Sinh sản sinh dưỡng (Vegetative reproduction): tạo * Từ hạt sẽ hình thành một cây mới mang đặc tính của cả cây bố một cơ thể mới hoàn chỉnh từ một bộ phận nào đó được và cây mẹ (trong trường hợp thụ phấn chéo) hoặc nghiêng hẳn về cây tách rời khỏi cơ thể mẹ như thân, rễ, lá, củ, chồi bố hoặc cây mẹ (trong trường hợp vô phối). Trong tự nhiên, nhiều loại cây trồng có thể sinh sản vừa * Hạt được hình thành do quá trình tự thụ phấn của hoa hoặc do thụ bằng hình thức hữu tính, vừa bằng hình thức vô tính, phấn nhân tạo. nhưng cũng có nhiều loại cây trồng chỉ sinh sản bằng hình thức hữu tính hoặc vô tính + Những ưu điểm + Những nhược điểm - PP đơn giản trong tự nhiên hoặc nhân tạo mà không * Cây con được sinh ra từ hạt sẽ có những tính trạng cần sử dụng dụng cụ thiết bị phức tạp mà lại tạo nên được thay đổi so với cây mẹ, mỗi một sự thay đổi đó là đại diện một số lượng lớn cây giống nên giá thành rẻ. của một tổ hợp gen mới được hình thành trong quá trình - Hạt giống có thể bảo quản được trong thời gian dài phân bào giảm nhiễm ==> thường không đồng đều và trong các dụng cụ đơn giản như bao bì, chum, vại, chai, không hoàn toàn mang các tính trạng như cây mẹ. lọ tuỳ thuộc từng loại hạt và sự rủi ro trong quá trình * Ðối với loại cây ăn quả, cây công nghiệp dài ngày thì bảo quản thấp, hạt giống đảm bảo tỷ lệ sống cao. nhân giống bằng phương pháp hữu tính ngày càng giảm, - Dễ dàng vận chuyển và phân phối khối lượng lớn hạt người ta chỉ áp dụng hình thức này trong các trường hợp giống từ nơi sản xuất đến nơi tiêu thụ. khó thành công trong phương pháp nhân giống vô tính, - Các loại sâu bệnh và virut phần lớn là không lây các loại cây có hạt đa phôi, sử dụng cho công tác lai tạo và truyền qua hạt nên cây giống mọc từ hạt là cây sạch bệnh. chọn lọc giống. 1
2. 7/18/15 3. Nhân giống vô tính 3. Nhân giống vô tính + Khái niệm : * Nhân giống vô tính cây trồng là phương pháp tạo cây * Dùng thân bò lan : con từ các cơ quan, bộ phận dinh dưỡng của cây như Hình: Thân bò lan cành, thân, rễ, lá, củ * Ðây là hình thức nhân giống phổ biến ở nhiều loại cây Biện pháp này thường áp dụng trồng và có thể diễn ra trong tự nhiên và nhân tạo. đối với một số loại cây có tia thân như cây dâu tây. Biện pháp này rất đơn giản vì loại cây này khi tia thân 3.1 Nhân giống vô tính tự nhiên bò đến đâu thì mỗi đốt sẽ hình * Là lợi dụng khả năng sinh sản dinh dưỡng của cây thành một cây mới, ta chỉ việc tách trồng để hình thành một cá thể mới có khả năng sống độc các cây mới đem trồng. lập với cây mẹ và mang các tính trạng của cây mẹ. Hình thức này bao gồm: 3. Nhân giống vô tính 3.2 Nhân giống vô tính nhân tạo * Tách chồi : Là hình thức có sự tác động của các biện pháp cơ học, • Chồi được hình thành từ gốc thân chính có đầy đủ thân, hoá học, công nghệ sinh học để điều khiển sự phát sinh lá, rễ. Tuỳ từng loại cây trồng mà có các loại chồi khác các cơ quan, bộ phận của cây như rễ, chồi, lá hình thành nhau như chồi thân (chuối), chồi ngầm (khoai nước, sen), một cây hoàn chỉnh hoàn toàn có khả năng sống độc lập chồi cuống quả, chồi chóp quả (dứa). Các chồi này sau khi với cây mẹ - Mang đặc tính di truyền như cây mẹ. tách khỏi cơ thể mẹ có thể đem trồng ngay hoặc qua giai đoạn vườn ươm. Phân ra 2 loại : * Nhân giống bằng thân củ, thân rễ (thân sinh địa) : - Nhân giống vô tính được thực hiện trong điều kiện tự • Trên thân của loại cây sinh địa có mang các chồi hoặc nhiên (in vivo) > cây giống tạo ra có kích thước lớn nhiều mắt chồi, mỗi mắt có thể phát triển thành chồi và (Macro propagation) thành cây hoàn chỉnh, do vậy có thể dùng cây sinh địa để - Nhân giống vô tính được thực hiện trong phòng thí nhân giống như hành, khoai tây, gừng, hoàng tinh nghiệm (in vitro) > cây giống có kích thước nhỏ (Micro propagation). 4. Nhân giống vô tính in vivo 4. Nhân giống vô tính in vivo Gồm các hình thức : tách cây, giâm cành, chiết cành, ghép mắt để tạo cây 4.2 Ưu điểm của phương pháp nhân giống vô tính in vivo con có đặc tính giống hệt cây mẹ. 4.1 Cơ sở khoa học - Tỷ lệ thành công cao + Tất cả các loại thực vật đều có đặc tính tái sinh, tức là, khi tách + Đạt được từ 50% đến 100% tuỳ theo từng đối tượng rời một cơ quan bộ phận nào đó của cây ra khỏi cây mẹ thì lúc đó cây trồng và các biện pháp áp dụng. trạng thái nguyên vẹn của cây bị vi phạm, nhờ có đặc tính tái sinh mà + Hiện nay, sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng để cây có khả năng khôi phục lại trạng thái nguyên vẹn của mình. + Ðặc tính tái sinh ở thực vật lớn hơn động vật rất nhiều. Vận dụng khích thích sự ra rễ bất định cho cành chiết cành giâm thì đặc tính tái sinh của thực vật mà con người điều khiển cây trồng theo tỷ lệ ra rễ đạt tới 100%. hướng có lợi như biện pháp cắt tỉa tạo tán cho cây cảnh, cây lấy búp ; nhân giống vô tính cây trồng - Thời gian tạo cây giống nhanh + Trong biện pháp nhân giống vô tính cây trồng thì khả năng ra rễ bất định của cành chiết, cành giâm hoặc liền vết ghép đều dựa vào Từ vài ngày đến vài tháng tuỳ theo từng đối tượng cây đặc tính tái sinh để đảm bảo tính nguyên vẹn của cây và biện pháp áp dụng. ===> Tạo cây hoàn chỉnh 2
3. 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 4. Nhân giống vô tính in vivo 4.3 Các phương pháp nhân giống in vivo 4.2 Ưu điểm của phương pháp nhân giống vô tính in vivo 4.3.1. Nhân giống vô tính bằng tách cây - Mỗi cây thường chỉ có một gốc và một bộ rễ = BPKT tác động để cây phát sinh nhiều gốc, mỗi gốc có bộ rễ riêng biệt, rồi tách tạo cây mới. - Tạo cây giống có kích thước lớn Ví dụ : cưa gốc cho nảy chồi rồi vun đất vào gốc cho ra rễ, tách ra trồng. PP Cây giống có kích thước lớn hơn nhiều so với phương pháp nhân này chậm, hiệu quả thấp, tốn công nên ít được áp dụng. giống in vitro (từ 1 đốt đến nhiều đốt cây tuỳ thuộc vào đối tượng cây trồng và nhu cầu của hệ số nhân giống). 4.3.2. Nhân giống vô tính bằng giâm, chiết cành PP dựa trên khả năng hình thành rễ bất định của cành giâm hoặc chiết khi được cắt rời khỏi cây mẹ. Phương pháp này thường được áp dụng cho cả hai - Cây giống mang đặc tính di truyền và có tuổi nhóm cây thân gỗ và thân thảo như cây vải, nhãn, cam, chanh, khoai tây, mía, sinh học như cây mẹ. dứa, hoa cúc, cẩm chướng * Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bất định Khi cắt cành giâm ra khỏi cơ thể cây mẹ hoặc khoanh vỏ cành chiết thì bắt - Thao tác và trang thiết bị đơn giản đầu hoạt hoá sự hình thành rễ bất định. Yếu tố gây hoạt hoá sự hình rễ bất định quyết định là auxin. * Các giai đoạn hình thành rễ bất định * Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bất định Chia làm 3 giai đoạn : Sự hình thành rễ bất định là một quá trình phản phân - Phản phân hoá của TB tiền tượng tầng để trở lại hoá của tế bào tiền tượng chức năng phân chia TB của mô phân sinh tượng tầng để tầng, tiếp đó là tái phân hoá để hình thành mầm rễ (hình) tạo khối TB bất định (callus) Cần lượng auxin cao (10-4 – 10-5 g/cm3) - Tái phân hoá TB rễ từ các TB bất định để tạo mầm rễ bất định Cần lượng auxin thấp hơn (10-7 g/cm3) Hình: Sự phản phân hoá TB tượng tầng để hình thành rễ bất định - Mầm rễ sinh trưởng để hình thành rễ bất định Lát cắt dọc và cắt ngang mầm rễ bất định Cần lượng auxin rất thấp (10-11 - 1012 g/cm3) hoặc không IBA, -NAA, 2,4D được sử dụng trong sản xuất cần auxin. * Phương pháp xử lý auxin cho ra rễ bất định 4.3.3 Nhân giống vô tính bằng chiết cành Có ba phương pháp chính: - PP xử lý nồng độ loãng : vài chục ppm – Vài trăm ppm * Ưu điểm : + Với phương thức giâm cành thì ngâm phần gốc vào dung dịch auxin trong - Cây con dễ sống, sinh trưởng nhanh, mọc khoẻ thời gian 12 đến 24 giờ rồi cắm cành giâm vào giá thể. - Cây con mang đầy đủ đặc tính di truyền của cây mẹ + Với phương thức chiết cành thì trộn dung dịch xử lý với đất bó bầu trước khi bó bầu xung quanh vết khoanh vỏ. - Cây thấp, tán gọn nên thuận tiện cho chăm sóc và thu hoạch - PP xử lý nồng độ đặc : từ 1000 – 10.000 ppm * Nhược điểm : + Với phương thức giâm cành thì nhúng rất nhanh phần gốc vào dung dịch auxin trong khoảng 1-2 giây rồi cắm ngay vào giá thể - Hệ số nhân giống không cao, chỉ sử dụng trong sản + Với phương thức chiết cành thì dùng bông tẩm dung dịch xử lý và chỉ cần xuất nhỏ bôi lên trên vết khoanh vỏ trên (nơi sẽ xuất hiện rễ) trước khi bó bầu - Cây nhanh già cỗi, tuổi thọ vườn cây thấp, khả năng - Sử dụng dạng bột: chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường không cao Trong thành phần có chứa auxin với một tỷ lệ nhất định được phối trộn với một loại bột nào đó. Khi giâm cành chỉ cần chấm vết cắt của cành giâm vào - Cây mẹ bị khai thác nhiều làm giảm tuổi thọ, sức sống chế phẩm bột rồi cắm vào giá thể. 3
4. 7/18/15 * Các hình thức chiết cành * Các hình thức chiết cành + Chiết cành trên cây + Chiết cành bằng biện pháp uốn vít cành Áp dụng phổ biến cho nhóm cây thân gỗ: - Cây ăn quả: nhãn, vải hồng xiêm, chanh, roi, Hình: Biện pháp uốn vít cành Đối tượng cây thân bụi, thân thảo: cam, quýt, bưởi đỗ quyên, kim ngân, ráy thơm - Cây công nghiệp: chè, cà phê Cách tiến hành : uốn vít cành xuống rồi phủ đất lên, sau một thời - Cây rừng: bạch đàn, quế, hương gian phần được phủ đất sẽ ra rễ Chọn những cành trên cây có tuổi sinh học (hình). Ðể kích thích ra rễ nhanh có thể gây vết thương nhẹ lên cành uốn trung bình hay còn gọi là cành bánh tẻ để chiết. tại phần phủ đất. Cắt rời từng phần - Cách tiến hành: khoanh vỏ cách nhau khoảng đã ra rễ để tạo cây mới. 2-3 cm đến tận phần gỗ (hình). - Cách tiến hành: khoanh vỏ cách nhau khoảng 2-3 cm đến tận phần gỗ (hình). Thường phơi cành từ 12 – 24 giờ rồi bó bầu. Hình: Cách khoanh vỏ cành chiết Hỗn hợp bó + Ðối với cây khó ra rễ: hồng xiêm, mận, mơ, a,b. khoanh vỏ c. Bóc và cạo sạch vỏ Bọc lynon bầu chiết mít nên xử lý cho vết khoanh vỏ dung dich auxin ( -NAA) 4000 -8000 ppm hoặc trộn dung dich auxin vào hỗn hợp bó bầu (40 - 100 ppm). Hình: Cách bó bầu cành chiết + Nguyên liệu bó bầu: sử dụng hỗn hợp giữa đất vườn hoặc đất bùn ao phơi khô, đập nhỏ trộn với một trong số nguyên liệu hữu cơ: trấu bổi, mùn cưa, rơm rác mục , rễ bèo tây với tỷ lệ 2/3 đất với 1/3 nguyên liệu hữu cơ. Ðảm bảo 70% độ ẩm của hỗn hợp bó bầu. Phía ngoài của bầu chiết bọc bằng giấy lynon trong. Buộc chặt hai đầu bầu chiết vào cành để bầu không bị xoay xung quanh cành chiết. a. Ra rễ bất định b. Cắt cành chiết Hình: Sự ra rễ bất định của cành chiết đủ tiêu chuẩn cắt * Các hình thức giâm cành 4.3.4 Nhân giống vô tính bằng giâm cành + Giâm cành bằng biện pháp cắt cành hoặc cắt thân. * Ưu điểm : Đối tượng: cây thân gỗ: nhãn, vải, cam, chanh, bưởi, cà - Cây con giữ đựơc các tình trạng di truyền của cây mẹ, vườn cây phê, chè; các loại cây rau, cây hoa thân thảo: khoai tây, hoa đồng đều thuận tiện chăm sóc, thu hoạch cúc - Thời gian nhân giống tương đối nhanh, hệ số nhân giống cao Cách tiến hành - Chu kỳ khai thác ngắn, hiệu quả kinh tế cao * Kích thước – Vị trí– Số lá – Xử lýauxin – Chăm sóc * Nhược điểm : - Tuổi thọ vườn cây thấp, chu kỳ kinh doanh ngắn a. Giâm lá nguyên vẹn b. Giâm mẩu lá - Người sản xuất có trình độ kỹ thuật nhất định - Tốn nhiều công chăm sóc (Cắt thân nằm ngang) (Cắt đốt đơn) (Cắt đốt kép) 4
5. 7/18/15 + Giâm cành bằng biện pháp cắt lá 4.4. Nhân giống vô tính bằng phương pháp ghép - Có hai kiểu cắt lá : * cắt toàn bộ lá và cắt mẩu lá (hình: a,b) . Khi lá cắt rời khỏi cây mẹ thì rễ Ghép là PP lấy một bộ phận của những cây giống tốt, đang sinh trưởng như bất định sẽ được hình thành tại phần cuống lá hoặc trực tiếp trên lá. đoạn cành, đoạn rễ, mầm ngủ lắp đặt vào vị trí thích hợp trên cây khác gọi * Nếu phần cuống lá có cả mắt ngủ thì mắt ngủ sẽ bật chồi hình thành cây là gốc ghép để tạo thành một tổ hợp ghép, cùng STPT và tạo nên một cây mới hoặc cũng có thể tự trên phần lá hình thành chồi mới để thành cây hoàn chỉnh. a. Cơ sở khoa học của phương pháp ghép + Trong kỹ thuật giâm cành cần chú ý : * PP ghép dựa vào đặc tính tái sinh liền vết thương của cây. Tế bào tại - Giá thể là cát ẩm: cát thô, cát mịn, cát đen, cát vàng tuỳ theo từng đối phần bị thương trên cây có khả năng tái phân chia liên tục thành một đám tế tượng cây trồng mà sử dụng loại cát nào cho thích hợp. bào để liền vết thương và tiếp nhận phần được ghép vào cây. - Cát có đặc tính: trơ, thoát nước và xốp sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự * Khi ghép cần áp sát phần mô phân sinh tượng tầng của phần ghép với ra rễ. Cát dùng làm giá thể phải sạch để tránh nấm, khuẩn hoặc các tạp chất gốc ghép, tại đó mô phân sinh của gốc ghép hoạt động mạnh làm lấp đầy chỗ làm chết cành giâm. Thường sử dụng loại cát mới khai thác hoặc cát cũ thì trống giữa hai vết cắt, các tổ chức mô tế bào của phần ghép và gốc ghép dần phải được rửa sạch bằng cách ngâm cát trong HCl hoặc thuốc tím trong vài dần hoà hợp, gắn với nhau. Hệ thống mạch floem và xylem dần được liên kết giờ sau đó rửa nhiều lần dưới vòi nước lại với nhau và thông suốt. Lúc này, chồi ghép được cung cấp chất dinh dưỡng - Cành giâm cần thường xuyên phun ẩm đảm bảo độ ẩm bão hoà trên bề và nước, gốc ghép và chồi ghép trở thành một cơ thể mới. mặt lá cho đến khi cành giâm xuất hiện rễ bất định * Cây nhân giống bằng phương pháp ghép vẫn hoàn toàn giữ được những tính trạng như cây mẹ. b. Mục đích, ưu nhựơc điểm của PP ghép c. Phương pháp ghép mắt *Mục đích - Hình thức ghép khác nhau: ghép áp, ghép cành, ghép mắt (theo đối - PP khác khó thực hiện hoặc kém hiệu quả. tượng và mục đích ghép để lựa chọn hình thức ghép thích hợp). - Thay = 1 phần hay bộ phận cây khác. - Ghép mắt và có các kiểu ghép : ghép nêm, ghép chữ T, U, H, I, - Tận dụng những ưu điểm của gốc ghép * Ưu điểm của phương pháp : - Cải tạo phần bị hại (gãy, sâu bệnh) của cây - Hình thức ghép rất phổ biến, áp dụng cho nhiều loại giống cây trồng. - Sử dụng PP ghép để test cây chống chịu bệnh - Thao tác đơn giản, thuận tiện. Hệ số nhân giống cao. Dễ dàng bảo quản * Ưu điểm và vận chuyển vật liệu ghép. Cây khỏe, tuổi thọ cao - Giữ được các tính trạng của cây mẹ. Hệ số nhân cao, cây có tuổi thọ cao Cách tiến hành : - Có khả năng thay đổi giống khi cần mà không phải trồng mới (giống cũ, - Mắt ghép: chọn mắt ghép trên cành "bánh tẻ", không bị sâu bệnh (hình ). năng suất thấp, sâu bệnh ) hoặc cứu chữa các bộ phận hỏng (bị hại ở gốc, rễ Tách mắt ghép theo kiểu bóc vỏ (cành táo ), hoặc cắt vát phần mắt (cành dẫn tới chết toàn cây thì ghép để thay rễ) chanh, bưởi, cam ) (hình) - Khai thác các ưu điểm của cây làm gốc ghép như : khả năng ST, chống chịu sâu bệnh và Đ/K ngoại cảnh bất lợi. Sử dụng trong công tác lai giống Sau khoảng 15-20 ngày có thể mở dây buộc và cắt miếng vỏ đậy phía ngoài * Nhược điểm miếng ghép (hình). Ðể kích thích mắt ngủ mọc mầm nhanh, sau khi mở dây - Cây làm gốc ghép trồng bằng hạt nên ST không đồng đều khó chăm sóc buộc khoảng 7 ngày tiến hành cắt ngọn gốc ghép (cách mắt ghép từ 2-3 cm), o - Cần có kỹ thuật, trình độ am hiểu về kỹ thuật ghép, giống cây trồng nên cắt nghiêng khoảng 45 về phía ngược chiều với mắt ghép để tránh nước - Cần đầu tư để chọn tổ hợp ghép thích hợp theo từng loại cây và từng vùng nhỏ vào mắt ghép. Phương pháp ghép "cửa sổ" có tỷ lệ sống cao khoảng từ 70-100% tuỳ theo từng loại cây. * Cách tiến hành 5.Nhân giống vô tính in vitro - Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ðây là PP nhân giống được thực hiện trong phòng thí Chọn cành nghiệm nên còn gọi là PP nhân giống trong ống nghiệm. Tách mắt ghép trên thân gỗ. Tách mắt ghép trên cây họ cam chanh “bánh tẻ” - Khác với các PP nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc ghép mắt, PP nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có thể tạo ra số lượng cây giống lớn, đồng đều mà các PP nhân giống khác không thể. - PP không phụ thuộc vào Đ/K thời tiết, có thể tiến hành quanh năm. - Ðây là một hướng đang được ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất Buộc chặt mắt ghép Hình: Mắt ghép sau khi tháo dây buộc và nảy chồi cây giống hàng năm đã cung cấp một lượng đáng kể cây giống có chất vào gốc ghép lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa, khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp 5
6. 7/18/15 b. Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào 5.1. Cơ sở khoa học của nhân giống vô tính in vitro + Tính phân hoá: là sự biến đổi của các TB phôi sinh thành các TB của các Dựa vào tính toàn năng, sự phân hoá và phản phân hoá. mô chuyên hoá đảm nhiệm các chức năng khác nhau. Trong cơ thể thực vật a. Tính toàn năng của tế bào - Haberland (1902) đầu tiên cho rằng: mỗi có khoảng 15 loại mô đảm nhiệm các chức năng khác nhau (mô dậu, mô dẫn, TB bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát mô bì, mô khuyết ) nhưng chúng đều có cùng nguồn gốc từ TB phôi sinh đã triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì trải qua giai đoạn phân hoá TB để hình thành các mô riêng biệt. mỗi TB đã chuyên hoá đều chứa một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) +Tính phản phân hoá: là các TB đã được phân hoá thành các mô riêng tương đương với lượng thông tin di truyền của một cơ thể trưởng thành. Vì biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất định chúng vẫn vậy, trong điều kiện nhất định một tế bào bất kỳ đều có thể phát triển thành có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào. một cơ thể hoàn chỉnh > Tính toàn ngăng Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan sinh dưỡng của cây như lá, thân , thì giai đoạn tạo mô sẹo (callus), đây chính là những tế bào đã quay trờ về trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ quan sinh dưỡng như lá, thân trước đó. Hình: Sử dụng nuôi cấy các loại mô bất kỳ trên cây Phân hoá tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá Phản phân hóa Bản chất 5.2. Mục đích của PP nhân giống vô tính in vitro - Nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật Phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá gen. liệu cho công tác tạo giống Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng thể thì một số gen được hoạt hoá và một số gen khác bị tốt để cung cấp cây giống (cây lương thực, rau, ức chế. Ðiều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN. Khi nằm trong một cơ hoa, cây cảnh, dược liệu, cây lâm nghiệp ) thể hoàn chỉnh giữa các TB có sự ức chế lẫn nhau, nhưng - Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virút. khi được tách rời và trong những điều kiện nhất định thì - Bảo quản các tập đoàn gen, đặc biệt đối với các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả loại cây dễ bị nhiễm bệnh trong điều kiện tự năng mở tất cả các gen để hình thành một cá thể mới. Ðó nhiên (khoai tây, khoai lang ) hoặc các cây dễ bị chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô TB. giao phấn. 5.3. Ưu, nhược điểm của PP nhân giống in vitro 5.3. Ưu, nhược điểm của PP nhân giống in vitro E.F. Gerge (1993) nêu lên một số ưu, nhược điểm chính sau đây: b. Những nhược điểm a. Những ưu điểm - Cây giống tạo ra có kích thước nhỏ và đôi khi xuất hiện các dạng - Khả năng hình tạo số lượng lớn cây giống từ một mô, cơ quan của cây cây không mong muốn (biến dị, mọng nước). với kích thước nhỏ khoảng 0,1- 10 mm. - Cây giống in vitro được cung cấp nguồn hydrat carbon nhân tạo - Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo được sẽ nên khả năng tự tổng hợp các vật liệu H/C (tự dưỡng) của cây kém. không bị nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài. - Cây giống in vitro được nuôi dưỡng trong bình thuỷ tinh hoặc - Sử dụng vật liệu sạch virút và có khả năng nhân nhanh số lượng lớn cây bình nhựa nên độ ẩm không khí thường bão hoà > khi trồng cây ra sạch virút. ngoài Đ/K tự nhiên cây thường bị mất cân bằng nước (xốc nước) > - Hoàn toàn chủ động điều chỉnh được: thành phần DD, ánh sáng, nhiệt cây héo và chết. độ, chất ĐTST theo ý muốn. - Vì vậy, trước khi chuyển cây từ Đ/K in vitro ra Đ/K in vivo, cây - Hệ số nhân giống cao nên có khả năng sản xuất số lượng lớn cây giống cần trải qua giai đoạn "huấn luyện " để quen dần với Đ/K MT bên trong một thời gian ngắn (khoảng từ 36 đến 1012 / năm) ngoài có độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh. - Có thể tiến hành quanh năm mà không bị chi phối bởi Đ/K ngoại cảnh - Cần trang thiết bị cần thiết và kỹ thuật viên phải có tay nghề cao. . - Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong thời gian dài trong điều kiện in vitro 6
7. 7/18/15 5.4 Điều kiện nuôi cấy in vitro *Phòng cấy, nuôi và nhà ươm cây in vitro Trang thiết bị và phòng nuôi cấy mô *cho phòng chuẩn bị môi trường Tủ cấy đơn Tủ cấy đôi Tủ sấy (khử trùng khô) Cân phân tích , cân kỹ thuật Buồng nuôi cấy Nhà ươm cây Máy đo pH Nồi hấp (khử trùng ướt) * Môi trường nuôi cấy * Thành phần môi trường dinh dưỡng - Năm 1898, Haberland đề xướng ra tính toàn năng - Môi trường nuôi cấy: là giá thể có đầy đủ chất dinh củaTB,ông tiến hành những thí nghiệm đầu tiên về nuôi cấy dưỡng, các hoạt chất như các nguyên tố vi lượng, vitamin, mô nhưng không thành công. Do những hiểu biết về nhu cầu chất điều hoà sinh trưởng. DD khoáng, đặc biệt là vai trò của các chấtĐTST còn hạn - Tuỳ theo từng loại cây và cơ quan nuôi cấy mà người chế. ta đã có các môi trường riêng cho chúng. - Ðến nay đã có hàng trăm loại môi trường DD nhân tạo đã Ví dụ: + MT cơ bản nhất là MS (Murashige Skoog) cho được xây dựng và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại nhiều đối tượng cây trồng. môi trường đều bao gồm những nhóm chất chính sau đây: + Môi trường Adnerson cho cây thân gỗ. + Các loại muối khoáng (đa lượng, vi lượng) + MT Gamborg cho nuôi cấy tế bào trần. + Nguồn carbon hữu cơ (thường đường saccaroza 2-3% ) + MT CHU cho nuôi cấy bao phấn.v.v + Vitamin (B1, B2, B6, ) + Chất điều tiết sinh trưởng (nhóm auxin, xytokinin ) + Nhóm chất tự nhiên (nước dừa, dịch chiết nấm, rau quả ) + Chất làm đông môi trường (agar) * Độ pH của môi trường. +(2) Nhân giống vô tính bằng phát sinh chồi bất định (adventitiou - pH của MT nuôi cấy thích hợp cho đa số các loại cây trồng từ 5,5 - 6,0. shoots) hoặc phôi vô tính (somatic embryos) - Nếu pH thấp thì agar sẽ không đông sau khi hấp khử trùng. - Khi pH 7 thì sẽ làm kết tủa một số muối vô cơ và phân giải Chồi có thể hình thành bằng hình thức trực tiếp hoặc gián tiếp : một số chất hữu cơ sẽ làm chết cây. - Khử trùng ướt (hấp MT) ở 1 amp * Chồi phát sinh trực tiếp từ một mẩu mô hoặc cơ quan tách ra từ * Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro cây mẹ > Các bộ phận cây đều sử dụng cho việc nhân giống in vitro : Có hai hình thức nhân giống vô tính in vitro : Ðoạn thân : thuốc lá, cam, chanh + (1)Tạo cây từ chồi nách, chồi đỉnh hoặc mô phân sinh. Mảnh lá : thuốc lá, cà chua, bắp cải Các bộ phận của hoa : suplơ, lúa mỳ, đồng tiền, phong lan Mô phân sinh (meristem) có kích thước khoảng từ 0,1 - 0,5 mm với mục đích nuôi cấy làm sạch virus thì bắt buộc phải nuôi cấy meristem. Tỷ lệ thành công không cao. Nhánh củ, bẹ củ : hành tỏi, họ hoa huệ Liliaceae, Iridaceaee Trong trường hợp này cần phải thực hiện qúa trình phản phân hoá và tái phân hoá tế bào để bắt các tế bào sinh dưỡng hình thành chồi Hình: Mô phân trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo (callus) Hình: Nuôi cấy sinh đỉnh * Ở các đối tượng một lá mầm như lan, dưa, chuối, hoa loa chồi nách, (meristem) chồi đỉnh kèn sự phát triển chồi thường phải qua giai đoạn dẻ hành (protocorm), như vậy, mẫu cấy sẽ hình thành hàng loạt thể protocorm, tiếp theo, các protocorm sản sinh protocorm mới hoặc phát triển thành cây 7
8. 7/18/15 Hình ảnh minh họa +(2) Nhân giống vô tính bằng phát sinh chồi bất định (adventitiou shoots) hoặc phôi vô tính (somatic embryos) Chồi có thể hình thành bằng hình thức trực tiếp hoặc gián tiếp : * Chồi phát sinh trực tiếp từ một mẩu mô hoặc cơ quan tách ra từ cây mẹ > Các bộ phận cây đều sử dụng cho việc nhân giống in vitro : Ðoạn thân : thuốc lá, cam, chanh Thể protocorm và sự phát sinh chồi từ protocorm cây phong lan Mảnh lá : thuốc lá, cà chua, bắp cải Các bộ phận của hoa : suplơ, lúa mỳ, đồng tiền, phong lan Nhánh củ, bẹ củ : hành tỏi, họ hoa huệ Liliaceae, Iridaceaee Trong trường hợp này cần phải thực hiện qúa trình phản phân hoá và tái phân hoá tế bào để bắt các tế bào sinh dưỡng hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo (callus) * Ở các đối tượng một lá mầm như lan, dưa, chuối, hoa loa Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh (meristem) - a,b mô phân sinh ; c kèn sự phát triển chồi thường phải qua giai đoạn dẻ Nuôi cấy qua giai đoạn callus tái sinh cây; d,e cây hành (protocorm), như vậy, mẫu cấy sẽ hình thành hàng loạt thể protocorm, tiếp theo, các protocorm sản sinh protocorm mới hoặc phát triển thành cây Hình ảnh minh họa 5.5 Các bước tiến hành trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Giáo sư Murashige của trường Ðại học California đã chia quy trình nhân giống in vitro làm ba giai đoạn (Murashige, 1974) và một giai đoạn tiếp sau in vitro: 1. Tạo vật liệu nuôi cấy khởi đầu in vitro 2. Nhân nhanh chồi, cụm chồi in vitro Thể protocorm và sự phát sinh chồi từ protocorm cây phong lan 3. Tạo cây hoàn chỉnh, huấn luyện cây con 4. Chuyển cây ra trồng ngoài Đ/K tự nhiên Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh (meristem) - a,b mô phân sinh ; c Nuôi cấy qua giai đoạn callus tái sinh cây; d,e cây Giai đoạn 1: Tạo vật liệu khởi đầu in vitro Giai đoạn 2 : Nhân nhanh - Đưa mẫu vào nuôi cấy phải đảm bảo yêu cầu : + Mục đích: * kích thích sự phát sinh số lượng lớn chồi Tỷ lệ nhiễm thấp - Tỷ lệ sống cao - Tốc độ sinh trưởng nhanh ==> có thể sử dụng đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa, thân, rế, lá trên một đơn vị mẫu cấy được tính theo số chồi, số đốt cấy thường chọn mô non (ít chuyên hoá - đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ ) ban đầu, số protocorn ban đầu Ví dụ : Măng tây: chồi ngọn - Khoai tây: mầm - Dứa: chồi nách, chồi đỉnh ===> đạt hệ số nhân cao nhất. - Bắp cải: mảnh lá - Suplơ: hoa tự Chọn đúng PP khử trùng mẫu sẽ đem lại tỷ lệ sống cao và MT DD thích hợp * Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang MT nhân sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl2 0,1% xử nhanh có bổ sung chất ĐTST nhóm xytokinin để tái sinh từ lý trong 5-10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc một chồi thành nhiều chồi. Hệ số nhân phụ thuộc vào số H202, dung dịch Br * Một số dạng MT DD phổ biến: White (1943), Heller (1953), Murashige và lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Skoog (1962) ===> Cần đảm bảo một trong các yêu cầu : Chất hữu cơ: đường sarcaroza - Phát triển chồi nách Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit Hocmon: auxin (IAA, IBA, NAA, 2,4D); Xytokinin (BA, BA, Kin, 2P); - Tạo chồi bất định (cụm chồi) - Tạo phôi vô tính 8
9. 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Hình ảnh minh họa * Tạo chồi bất định, phôi vô tính và của in vitro Khoai tây * Tạo chồi bất định (adventitiou shoots) : + Phải thực hiện QT phản phân hoá và tái phân hoá để bắt các TB soma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô seo. ( lan, dứa, chuối, hoa loa kèn thường gặp sự phát triển cây qua giai đoạn dẻ hành (protocorm): từ mẫu cấy tạo thành hàng loạt protocorm. Từ đó, tiếp tục sản sinh protocorm mới hoặc phát triển thành cây. Hình : Phát sinh cụm chồi do xytokin HS nhân chồi cây xuyên khung * Tạo phôi vô tính (somatic embryos): + Phải thực hiện QT phản phân hoá và tái phân hoá TB để tế bào soma hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo. Phôi vô tính có cấu trúc lưỡng cực bao gồm cả chồi mầm và rễ mầm Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo. * Tạo củ in vitro ( Microtuber): + Đối tượng: khoai tây, khoai lang, hoa loa kèn :nhân giống = tạo củ Hình: Tái sinh cây từ phôi vô tính (somatic embryo) in vitro. Hình: Tạo củ khoai tây in vitro và củ in vitro Giai đoạn 3 : Tạo cây hoàn chỉnh và huấn luyện cây con Giai đoạn 4 : Ra cây ngoài điều kiện tự nhiên. + Khi cây trong ống nghiệm đã + Khi có số lượng lớn chồi > tạo đủ tiêu chuẩn (về chiều cao, số lá, cây hoàn chỉnh ( MT auxin). Mỗi chồi số rễ), được chuyển ra trồng ngoài khi ra rễ là thành một cây hoàn chỉnh. điều kiện tự nhiên. + Phôi vô tính chỉ cần cấy chúng +Trước khi trồng ngoài đất, cây trên MT không có chất ĐTST hoặc MT trong ống nghiệm thường được chứa xytokinin nồng độ thấp thì phôi Hình: Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro cây dưa lai chuyển ra trồng vào giá thể xốp sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh. nhẹ (trấu hun, xơ dừa ) đặt trong Hình: Ra cây in vitro + Khi đã có cây in vitro hoàn chỉnh nhà lưới có điều chỉnh ánh sáng, độ trong vườn ươm. Cây đầy đủ các cơ quan như thân, rễ, lá thì ẩm thích hợp cho cây thích nghi khoai tây, cây dưa lai . trước khi đưa ra ngoài điều kiện tự dần với môi trường tự nhiên. nhiên cần có giai đoạn huấn luyện cây + Sau một thời gian cây con để thích nghi với những thay đổi về cứng cáp sẽ được trồng ra đất. nhiệt độ, ẩm độ, sự mất nước, sâu bệnh để chuyển trạng thái cây từ dị Nhà dưỡng sang tự dưỡng. ươm cây 5.6. Một số hạn chế trong kỹ thuật nhân cây in vitro * Tính bất định về mặt di truyền (genetic instability). Mục đích của nhân giống in vitro là tạo ra quần thể cây đồng nhất với số lượng rất lớn. Tuy nhiên, trong một số trường hợp tạo ra những biến dị soma. Tần số biến dị cũng hoàn toàn khác nhau và không lặp lại. Cây tạo ra thông qua GĐ tạo mô sẹo (callus) sẽ có nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh. * Những nhân tố gây ra biến dị tế bào soma - Kiểu di truyền (Genotype): Tần số biến dị ảnh hưởng bởi genotyp của các loài cây trồng khác nhau. Nói chung cây càng có mức bội thể cao thì càng dễ biến bị. - Số lần cấy chuyển: Số lần cấy chuyển càng nhiều thì độ biến dị càng cao. Theo Amstrong và Phillips (1988): khi nuôi cấy lâu dài thường gây ra biến dị nhiễm sắc thể. - Loại mô (Tissue): Nói chung nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh in vitro ít bị biến dị hơn so với nuôi cấy các cơ quan khác. 9
10. 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam • *.Sự nhiễm mẫu (explant contamination). Các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại * Sản sinh các chất độc từ mô nuôi cấy trừ trong giai đoạn khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi (Toxic compounds phenol). cấy. Tuy nhiên, một số loại vi khuẩn như: Agrobacterium, Bacillus, Corylabacterium, Erwinnia và Pseudomonas có Do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tanin hoặc hydroxyphenol. thể xâm nhiễm vào mô dẫn, tồn tại trong mô và gây tác + Các phương pháp loại trừ sự hoá nâu: hại khi tế bào bắt đầu phân chia (sau 1-2 tuần nuôi cấy). - Bổ sung than hoạt tính vào MT nuôi cấy (0,1 - 0,3%): hiệu quả Để khắc phục hiện tượng trên cần: trên các loài phong lan Phalenopsis, Cattleya và Aerides. Tuy nhiên than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây do hấp phụ một số chất ĐTST + Chọn cây mẹ đúng tiêu chuẩn. và dinh dưỡng cần thiết khác. + Sử dụng một số chất kháng sinh - Bổ sung polyvinyl pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hoá tốt ở Nhưng mô thực vật rất mẫn cảm với kháng sinh và có mẫu một số cây ăn quả, (táo, hồng). phản ứng đến kiểu di truyền do đó cần rất thận trọng khi - Sử dụng mô non hoặc giảm các vết thương cho mẫu cấy khi khử trùng. sử dụng kháng sinh. Chất kháng sinh thường gây ra sự - Ngâm mẫu vào DD ascorbic và xytric vài giờ trước khi cấy. huỷ hoại ty thể và lạp thể nên sẽ ảnh hưởng đến di truyền - Nuôi cấy mẫu trong MT lỏng, có nồng độ oxy thấp, không có tế bào chất ánh sáng (1 - 2 tuần). - Cấy chuyển mẫu liên tục (1-2 ngày/lần) sang môi trường mới trong 1 - 2 tuần Một số giải pháp: * Hiện tượng thuỷ tinh hoá (Vitrification). - Hiện tượng cây bị “thuỷ tinh hoá”: - Giảm sự hút nước của cây bằng cách tăng nồng tức là thân lá cây mọng nước, trong suốt, cây rất khó độ đường hoặc các chất gây Π cao. sống khi đưa ra ngoài MT do bị mất nước rất mạnh. - Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong MT. - Hiện tượng này thường xảy ra khi: + Nuôi cấy trong MT lỏng hay MT ít agar, sự trao đổi - Giảm sự sản sinh ethylen trong bình nuôi cấy. khí thấp. - Xử lý axit abxixic hoặc một số chất ức chế ST. + nuôi cấy các loại cây: táo, mận, hoa cẩm chướng, hoa đồng tiền, hoa cúc. Trên đây là tóm tắt toàn bộ các bước trong qui trình vi nhân giống in vitro chung cho các loại cây trồng. Tuỳ từng loại cây mà có các quy trình nhân giống riêng mang tính đặc thù cho mỗi giống. 10