Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam

Nội dung text: Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam

1. Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam 129a
2. Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam Lester W. Burgess Timothy E. Knight Len Tesoriero Phan Thúy Hiền 2009
3. Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia (ACIAR) được thành lập vào tháng 6 năm 1982 qua một Đạo luật của Quốc hội Australia. Nhiệm vụ chính của Trung tâm là giúp xác định những vấn đề nông nghiệp cần giải quyết ở các nước đang phát triển và giúp hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học của Australia và của các nước đang phát triển trong những lãnh vực mà Australia có thế mạnh đặc biệt. Khi các tên thương mại được dùng, điều này không có nghĩa là Trung tâm ủng hộ hay phân biệt đối với bất cứ sản phẩm nào. LOẠT TÀI LIỆU CHUYÊN KHẢO CỦA ACIAR Loạt tài liệu này gồm các kết quả nghiên cứu ban đầu do ACIAR hỗ trợ, hoặc các tài liệu được xem là có liên quan đến các mục tiêu nghiên cứu và phát triển của ACIAR. Loạt tài liệu này được phân phối trên khắp thế giới, chủ yếu là các nước đang phát triển. © Liên bang Australia 2009 Công trình này có bản quyền. Ngoài những sử dụng được phép theo Luật Bản quyền 1968, không một phần nào được phép sao chép lại bằng bất cứ tiến trình nào mà không có văn bản cho phép trước của Chính quyền Liên bang Australia. Các yêu cầu liên quan đến việc sao chép lại và bản quyền cần được gửi đến Ban Quản trị Bản quyền Liên bang Úc, Bộ Tổng Chưởng lý, Văn phòng Robert Garran, National Circuit, Barton, ACT, 2006 hoặc gửi đến Xuất bản bởi Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia (ACIAR) GPO Box 1571, Canberra ACT 2601, Australia Điện thoại: 61 2 6217 0500 aciar@aciar.gov.au Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009. Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam. Chuyên khảo ACIAR số 129a, 210 pp. ACIAR: Canberra. ISBN 978 1 921434 79 2 (bản in) ISBN 978 1 921434 80 8 (trực tuyến) Biên tập kỹ thuật bởi Biotext Pty Ltd Thiết kế bởi Clarus Design Pty Ltd In bởi Goanna Print Pty Ltd Dịch: All Language Typesetters & Printers Pty Ltd Hiệu đính bản dịch: Phan Thúy Hiền
4. Lời nói đầu Bệnh hại cây trồng tiếp tục gây thiệt hại mùa màng đáng kể ở Việt Nam và các khu vực khác có khí hậu nhiệt đới ở Đông Nam Á. Bệnh dịch vàng lùn và lùn xoắn lá trên lúa ở miền Nam Việt Nam gần đây đánh dấu những tác động đáng kể của bệnh cây đối với kinh tế xã hội ở cấp quốc gia. Sự bùng phát dịch bệnh trên các cây trồng có giá trị kinh tế có thể tác động lớn đến từng hộ nông dân tại những địa phương có ít cây trồng thay thế phù hợp – phức hợp bệnh héo trên gừng ở Quảng Nam là một ví dụ. Việc chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh là yếu tố quan trọng quyết định sự thành công của các biện pháp phòng trừ. Tuy nhiên, nhiều bệnh hại có các triệu chứng giống nhau, khiến cho việc chẩn đoán tại chỗ gặp nhiều khó khăn, đôi khi không thể thực hiện được. Vì vậy, các phòng thí nghiệm chẩn đoán là một thành phần không thể thiếu trong mạng lưới bảo vệ thực vật. Cán bộ nhận trách nhiệm làm công việc chẩn đoán bệnh cây cần phải trải qua quá trình đào tạo bài bản ở trình độ đại học và sau đại học về kỹ năng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng, ngoài ra còn phải nắm vững những khái niệm cơ bản về bệnh cây và quản lý bệnh hại tổng hợp. Việc chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh cũng vô cùng cần thiết cho việc xây dựng và phát triển một cơ sở dữ liệu bệnh cây quốc gia một cách khoa học. Cơ sở dữ liệu về bệnh cây ở Việt Nam sẽ là một phần then chốt cho sự thành công của công tác kiểm dịch thực vật. Hơn nữa, cơ sở dữ liệu quốc gia là một phần quan trọng của các biện pháp an ninh sinh học liên quan tới vấn đề trao đổi thương mại hàng nông sản, đặc biệt đối với những quốc gia thành viên của Tổ chức Thương mại Thế giới. Cuốn cẩm nang này được biên soạn nhằm giúp các nhà nghiên cứu bệnh cây phát triển những kỹ năng cơ bản trong việc chẩn đoán tác nhân gây bệnh, chủ yếu là các bệnh do nấm ở rễ và thân cây. Những bệnh này thường ẩn, không biểu hiện triệu chứng ngay nhưng gây ra những tổn thất đáng kể về mặt kinh tế xã hội ở Việt Nam. Lời nói đầu 3
5. Nội dung của cuốn sách này dựa trên kinh nghiệm của các tác giả cùng nhiều đồng nghiệp ở Australia và Việt Nam qua các chương trình tập huấn liên quan đến các dự án khác nhau được tài trợ bởi Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia (ACIAR), chương trình nâng cao năng lực cho Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn của AusAID, và Quỹ tài trợ Crawford của Viện Khoa học Kỹ thuật và Công nghệ. Cuốn cẩm nang này bổ sung cho các ấn phẩm khác của ACIAR và nhiều đồng nghiệp khác tại Việt Nam. Peter Core Tổng Giám Đốc Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia 4 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
6. Nội dung Lời nói đầu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Lời tựa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 Lời cảm ơn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 1 Giới thiệu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 1.1 Tài liệu tham khảo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2 Tổng quan về sức khỏe thực vật . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.1 Cỏ dại . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.2 Sâu hại . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.3 Thuốc bảo vệ thực vật . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.4 Dinh dưỡng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.5 Tình trạng đất . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 2.6 Môi trường . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 2.7 Lịch sử cây trồng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3 Quy trình chẩn đoán . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.1 Nghiên cứu cụ thể . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 4 Triệu chứng bệnh . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 4.1 Các triệu chứng thường gặp . . . . . . . . . . . . . . . . 43 4.2 Các bệnh trên lá, hoa hoặc quả . . . . . . . . . . . . . . . 45 4.2.1 Sự sản sinh bào tử trên lá bệnh . . . . . . . . . . . 46 4.2.2 Nấm và các tác nhân giống nấm ký sinh chuyên tính trên lá . . . . . . . . . . . . . . . 47 4.2.3 Nấm bệnh sản sinh ra hạch nấm trên mô bệnh . . . . 48 Nội dung 5
7. 4.3 Các bệnh ở rễ, gốc và thân cây . . . . . . . . . . . . . . . 49 4.4 Tài liệu tham khảo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 5 Trên đồng ruộng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 5.1 Dụng cụ cần thiết cho công tác chẩn đoán trên đồng ruộng . . . 54 5.2 Tiến hành điều tra đồng ruộng . . . . . . . . . . . . . . . 56 6 Trong phòng thí nghiệm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 6.1 Kiểm tra mẫu bệnh trong phòng thí nghiệm . . . . . . . . . 59 6.1.1 Héo và còi cọc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 6.1.2 Các bệnh ở lá . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 6.2 Kính lúp soi nổi và kính hiển vi . . . . . . . . . . . . . . . 61 6.2.1 Sử dụng kính lúp soi nổi . . . . . . . . . . . . . . 61 6.2.2 Sử dụng kính hiển vi . . . . . . . . . . . . . . . . 62 6.2.3 Chuẩn bị mẫu lam kính . . . . . . . . . . . . . . . 63 6.3 Phân lập nấm gây bệnh . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 6.3.1 Phân lập từ lá và thân . . . . . . . . . . . . . . . . 66 6.3.2 Phân lập từ rễ mảnh, nhỏ . . . . . . . . . . . . . . 68 6.3.3 Phân lập từ rễ và thân gỗ . . . . . . . . . . . . . . 69 6.3.4 Bẫy đất . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 6.3.5 Phương pháp pha loãng dung dịch đất . . . . . . . . 71 6.4 Cấy truyền từ các đĩa phân lập . . . . . . . . . . . . . . . 74 6.5 Làm thuần mẫu nấm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 6.5.1 Cấy đơn bào tử . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 6.5.2 Cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm . . . . . . . . . . . . 78 6.6 Nhận biết các mẫu nấm thuần . . . . . . . . . . . . . . . 79 6.7 Giám định nấm gây bệnh . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 6.8 Tài liệu tham khảo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 7 Phân loại nấm và tác nhân gây bệnh . . . . . . . . . . . . . . . 83 7.1 Các đặc tính chủ yếu của nấm và vi sinh vật giống nấm . . . . . 83 7.2 Phân loại nấm gây bệnh thực vật . . . . . . . . . . . . . . 84 7.3 Tài liệu tham khảo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 8 Lây bệnh nhân tạo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 8.1 Các phương pháp lây bệnh nhân tạo . . . . . . . . . . . . . 89 8.1.1 Lây bệnh lên lá và thân . . . . . . . . . . . . . . . 90 6 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
8. 8.1.2 Lây bệnh vào đất . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 8.2 Chuẩn bị nguồn bệnh cho quá trình lây bệnh nhân tạo . . . . . 92 8.2.1 Dịch bào tử . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 8.2.2 Môi trường hạt kê/vỏ trấu (thể tích 50:50) . . . . . . . 92 9 Quản lý bệnh hại tổng hợp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 9.1 Luân canh . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 9.2 Quản lý cây trồng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 9.2.1 Thoát nước tốt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 9.2.2 Làm ngập ruộng . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 9.3 Cây giống, hạt giống và các nguồn giống sạch bệnh khác . . . . 100 9.4 Kiểm dịch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 9.5 Dùng giống kháng bệnh hoặc chống chịu bệnh . . . . . . . . 101 9.6 Dùng gốc ghép kháng bệnh . . . . . . . . . . . . . . . . 101 9.7 Thuốc trừ nấm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 9.8 Vệ sinh . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 9.9 Tài liệu tham khảo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 10 Các bệnh thối rễ và thân có nguồn gốc từ đất . . . . . . . . . . . 105 10.1 Sclerotinia sclerotiorum . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 10.2 Sclerotium rolfsii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 10.3 Các loài Rhizoctonia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 10.4 Phytophthora và Pythium . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 10.4.1 Sinh sản vô tính . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 10.4.2 Sinh sản hữu tính . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 10.4.3 Xác định và phân biệt giữa Phytophthora và Pythium . . 117 10.4.4 Chu kỳ bệnh của nấm Oomycete - Phytophthora và Pythium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 10.4.5 Các loài Pythium . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 10.4.6 Các loài Phytophthora . . . . . . . . . . . . . . . 123 10.5 Fusarium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 10.5.1 Giới thiệu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 10.5.2 Nấm Fusarium gây bệnh ở Việt Nam . . . . . . . . . 126 10.5.3 Phân lập nấm Fusarium gây héo . . . . . . . . . . . 131 10.5.4 Fusarium oxysporum và Fusarium solani—các đặc điểm hình thái chính giúp cho việc giám định . . . . 132 Nội dung 7
9. 10.6 Verticillium albo-atrum và V. dahliae—nấm gây bệnh héo ngoại lai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134 10.7 Tuyến trùng ký sinh thực vật . . . . . . . . . . . . . . . . 137 10.7.1 Tách tuyến trùng ra khỏi đất và rễ nhỏ . . . . . . . . 139 10.8 Bệnh do vi khuẩn gây ra . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142 10.8.1 Héo vi khuẩn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142 10.8.2 Phân lập vi khuẩn gây bệnh cây . . . . . . . . . . . 144 10.9 Bệnh do vi rút gây ra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148 10.10 Tài liệu tham khảo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150 11 Các bệnh phổ biến trên một số cây trồng quan trọng . . . . . . . . 151 11.1 Các bệnh phổ biến trên ớt . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 11.2 Các bệnh phổ biến trên cà chua . . . . . . . . . . . . . . 154 11.3 Các bệnh phổ biến trên lạc . . . . . . . . . . . . . . . . 156 11.4 Các bệnh nấm phổ biến trên hành . . . . . . . . . . . . . 158 11.5 Các bệnh nấm phổ biến ở ngô . . . . . . . . . . . . . . . 160 12 Nấm, người và động vật: các vấn đề về sức khỏe . . . . . . . . . . 162 12.1 Các nấm có độc tính chủ yếu ở Việt Nam . . . . . . . . . . 164 12.2 Các loài Aspergillus có độc tính . . . . . . . . . . . . . . . 165 12.2.1 Aspergillus flavus . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 12.2.2 Aspergillus niger . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166 12.2.3 Aspergillus ochraceus . . . . . . . . . . . . . . . 167 12.3 Các loài Fusarium có độc tính . . . . . . . . . . . . . . . 168 12.3.1 Fusarium verticillioides . . . . . . . . . . . . . . . 168 12.3.2 Fusarium graminearum . . . . . . . . . . . . . . 169 13 Phòng thí nghiệm chẩn đoán và nhà lưới . . . . . . . . . . . . . 171 13.1 Phòng thí nghiệm chẩn đoán . . . . . . . . . . . . . . . 171 13.1.1 Vị trí phòng thí nghiệm . . . . . . . . . . . . . . 171 13.1.2 Phòng chuẩn bị . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 13.1.3 Phòng sạch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 13.2 Bố trí phòng thí nghiệm . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173 13.3 Thiết bị phòng thí nghiệm . . . . . . . . . . . . . . . . . 174 13.3.1 Thiết bị cho phòng sạch . . . . . . . . . . . . . . 174 13.3.2 Thiết bị cho phòng chuẩn bị . . . . . . . . . . . . 176 8 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
10. 13.4 Nhà lưới cho việc nghiên cứu bệnh cây . . . . . . . . . . . 177 13.4.1 Khu chuẩn bị . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179 13.4.2 Hỗn hợp giá thể . . . . . . . . . . . . . . . . . 179 13.4.3 Vệ sinh nhà lưới . . . . . . . . . . . . . . . . . 180 13.4.4 Quản lý và dinh dưỡng cây . . . . . . . . . . . . . 181 Phụ lục 1 Cách làm một que cấy dẹp . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 Phụ lục 2 Sức khỏe và an toàn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Phụ lục 3 Môi trường, khử trùng và bảo quản mẫu vi sinh vật . . . . . . 186 Các chữ viết tắt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204 Chú giải thuật ngữ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205 Tủ sách . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208 Bảng Bảng 8.1 Các phương pháp lây bệnh nhân tạo . . . . . . . . . . . . 89 Bảng 10.1 Các đặc tính của các tác nhân gây bệnh phổ biến tồn tại trong đất ở Việt Nam . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 Bảng 10.2 Đặc tính của Sclerotinia sclerotiorum . . . . . . . . . . . 109 Bảng 10.3 Đặc tính của Sclerotium rolfsii . . . . . . . . . . . . . . 112 Bảng 10.4 Đặc tính của các loài Rhizoctonia . . . . . . . . . . . . . 115 Bảng 10.5 Đặc tính của các loài Pythium . . . . . . . . . . . . . . 122 Bảng 10.6 Đặc tính của các loài Phytophthora . . . . . . . . . . . . 123 Bảng 10.7 Fusarium oxysporum (héo do tắc bó mạch) . . . . . . . . . 128 Bảng 10.8 Đặc điểm của bệnh héo Fusarium . . . . . . . . . . . . . 130 Bảng 10.9 Các đặc điểm để phân biệt Fusarium oxysporum và Fusarium solani . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134 Bảng 10.10 Đặc điểm của Verticillium albo-atrum và V. dahliae . . . . . 136 Bảng 11.1 Các bệnh phổ biến trên ớt . . . . . . . . . . . . . . . . 152 Bảng 11.2 Các bệnh phổ biến ở cà chua . . . . . . . . . . . . . . . 154 Bảng 11.3 Các bệnh phổ biến trên lạc . . . . . . . . . . . . . . . . 156 Bảng 11.4 Các bệnh nấm phổ biến trên hành . . . . . . . . . . . . 158 Bảng 11.5 Các bệnh nấm phổ biến trên ngô . . . . . . . . . . . . . 160 Bảng 12.1 Các nấm có độc tính chủ yếu ở Việt Nam . . . . . . . . . 164 Bảng A3.1 Các chất kháng sinh thông dụng . . . . . . . . . . . . . 188 Nội dung 9
11. Bảng A3.2 Thời gian cần cho việc khử trùng nóng ẩm và nóng khô ở các mức nhiệt độ khác nhau . . . . . . . . . . . . . . . 197 Bảng A3.3 Thời gian khuyến cáo để khử trùng các lượng dung dịch khác nhau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 Hình Hình 2.1 Những nhân tố chủ yếu trong việc duy trì sức khỏe thực vật . . 25 Hình 2.2 Hư hại do sâu gây ra: (a) sùng trắng (hình trong) làm hư hại rễ ngô, (b) cây ngô bị héo do sùng trắng, (c) rệp gây hại, (d) lá có màu đồng thau điển hình do nhện chích hút ở mặt dưới của lá (hình trong) . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 Hình 2.3 Thiếu dinh dưỡng gây ra các triệu chứng giống bệnh: (a) thối cuống quả do thiếu canxi ở cây cà chua, (b) thiếu kali ở câyhọ thập tự, (c) thiếu boron ở cây súp lơ xanh . . . . . . . 28 Hình 2.4 Rễ cây mọc ngang do chạm phải lớp đất cứng trong cấu trúc đất (tầng đế cày) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Hình 2.5 Cỏ cứt lợn (Ageratum conyzoides): (a) loại hoa màu tím, (b) loại hoa màu trắng, (c) rễ cỏ Ageratum conyzoides bị tuyến trùng Meloidigyne gây hại gây ra các nốt sưng, (d) cỏ Ageratum conyzoides héo rũ do vi khuẩn Ralstonia solanacearum, (e) triệu chứng vàng lá hoa lá trên cỏ Ageratum conyzoides giống như ở cúc tây (hình trong: triệu chứng vàng lá hoa lá cúc tây Callistephus chinensis) . . . . . . 31 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình chẩn đoán . . . . . . . . . . . . . . . . 33 Hình 3.2 Các bước phân lập, làm thuần và lây bệnh nhân tạo nấm gây thối nõn dứa, Phytophthora nicotianae . . . . . . . . . . . 34 Hình 3.3 Thảo luận với nông gia về bệnh héo trên gừng . . . . . . . . 36 Hình 3.4 Điều tra bệnh héo gừng ở Quảng Nam vào tháng 1 năm 2007: (a) gừng với triệu chứng héo nhanh, (b) cây gừng bị vàng, dấu hiệu của héo chậm, (c) các ruộng gần nhau, một ruộng bị héo nhanh, một ruộng không có triệu chứng héo, (d) và (e) các mẫu cây được đào lên một cách cẩn thận bằng dao rựa, giữ cho hệ thống rễ còn nguyên, (f) túi mẫu với nhãn đánh số điểm lấy mẫu, tên nông dân và ngày lấy mẫu . . . 37 Hình 3.5 Chuẩn bị và kiểm tra các mẫu cây bị bệnh héo gừng để chọn lọc mẫu cho phòng thí nghiệm . . . . . . . . . . . . . . 38 Hình 3.6 Quy trình phân lập các vi sinh vật có khả năng gây bệnh từ củ gừng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 10 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
12. Hình 3.7 Phân lập Fusarium oxysporum từ miếng cấy gừng trên môi trường chọn lọc (aga peptone pentachloronitrobenzene) cho Fusarium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 Hình 3.8 Thí nghiệm chỉ thị sinh học để phân lập Ralstonia solanacearum từ củ gừng bị bệnh: (a) ngọn cây chỉ thị ở công thức đối chứng (trái) ngọn cây chỉ thị héo trong nước chiết từ các miếng gừng (phải), (b) ngọn ớt bị héo có triệu chứng hóa nâu ở mạch dẫn, (c) phân lập R. solanacearum từ ngọn ớt, (d) và (e) lây bệnh nhân tạo trên mướp đắng với vi khuẩn đã được phân lập từ cây chỉ thị . . . . . . . . . . . 41 Hình 4.1 Sự hình thành bào tử trên lá của nhiều nấm bệnh khác nhau . 46 Hình 4.2 Nấm bệnh và các tác nhân giống nấm gây bệnh trên lá: (a) phấn trắng trên bầu bí, (b) gỉ trắng trên cải bắp, (c) đốm lá Cercospora và gỉ sắt trên lạc, (d) sương mai trên cải bắp . . . . 47 Hình 4.3 Hình thành hạch nấm bởi (a) Rhizoctonia solani, (b) Sclerotium rolfsii và (c) Sclerotinia sclerotiorum . . . . . . . . 48 Hình 4.4 Những bệnh ở gốc, rễ và thân: (a) sưng rễ họ thập tự, (b) héo trên họ thập tự (khỏe [trái] và bệnh [phải]) gây ra do sưng rễ (Plasmodiophora brassicae), (c) héo Fusarium trên cây cúc tây (chú ý đến sự hình thành khối bào tử trên thân), (d) teo thắt do Rhizoctonia sp., (e) thối rễ ớt do Phytophthora gây héo trầm trọng, (g) thối rễ và quả lạc do Pythium, (h) quả thể của Gibberella zeae gây ra thối thân ngô . 50 Hình 5.1 Trao đổi với nông dân trên đồng ruộng . . . . . . . . . . . 51 Hình 5.2 Dụng cụ cần thiết khi điều tra đồng ruộng . . . . . . . . . 55 Hình 6.1 Kiểm tra các tản nấm dưới kính lúp soi nổi . . . . . . . . . 62 Hình 6.2 Quan sát bào tử nấm dưới kính hiển vi . . . . . . . . . . . 63 Hình 6.3 Các bộ phận của kính hiển vi . . . . . . . . . . . . . . . 64 Hình 6.4 Kỹ thuật phân lập tác nhân gây bệnh từ các mô hóa gỗ: (a) cắt rời rễ phụ, (b) rửa mẫu, (c) cắt bỏ phần dưới thân ở chỗ tiếp giáp với mặt đất, (d) phun xịt mẫu với cồn 70%, (e) để cồn bay hơi, (f) cắt mô thân cây bệnh thành từng miếng cấy nhỏ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 Hình 6.5 Bẫy Phytophthora từ đất bằng cánh hoa và lá . . . . . . . . . 71 Hình 6.6 Sơ đồ các nồng độ sử dụng trong phương pháp pha loãng dung dịch đất . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 Hình 6.7 Đĩa phân lập từ dung dịch đất pha loãng chứa Fusarium spp. trên môi trường thạch peptôn PCNB (lý tưởng là số tản nấm khoảng từ 10 đến 30) . . . . . . . . . . . . . . . . 73 Hình 6.8 Sơ đồ một đĩa phân lập từ rễ cho thấy (hình trong) nhiều loại nấm mọc ra từ cùng một đoạn rễ . . . . . . . . . . . . 75 Nội dung 11
13. Hình 6.9 Những nấm tạp thường thấy trên các đĩa cấy: (a) Penicillium sp. (gây tạp từ không khí), (b) Cladosporium sp. (trong mẫu cấy sạch), (c) Trichoderma sp. (mọc từ một mẩu rễ bị bệnh) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 Hình 6.10 Các bước cấy đơn bào tử . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 Hình 6.11 Quy trình cấy đơn bào tử, thao tác chọn lựa một bào tử đúng cách . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 Hình 6.12 Cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm, ví dụ đầu của một sợi nấm Rhizoctonia sp. được lấy từ đĩa môi trường thạch nghiêng. . . . 79 Hình 6.13 Tản nấm của một số nấm bệnh thông thường trên môi trường thạch đường khoai tây . . . . . . . . . . . . . . . 80 Hình 8.1 Lây bệnh nhân tạo bằng phương pháp lây bệnh lên thân: (a) gây vết thương vào thân dưới của cây, (b) cấy nguồn bệnh vào vị trí vết thương, (c) bọc vị trí vết thương bằng ny lông, (d) sợi nấm phát triển trên mặt đất từ thân bị bệnh, (e) cây được lây bệnh (trái) và cây đối chứng (phải) . . . . . . 91 Hình 8.2 Các phương pháp lây bệnh nhân tạo bằng cách đưa vi sinh vật vào đất . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 Hình 8.3 Một bình tam giác chứa nguồn bệnh . . . . . . . . . . . . 93 Hình 8.4 Chuẩn bị giá thể hạt kê/vỏ trấu trong bình tam giác . . . . . 94 Hình 8.5 Chuẩn bị giá thể hạt kê/vỏ trấu cho quá trình lây bệnh nhân tạo: (a) hạt kê và vỏ trấu đã được ngâm trong nước cất 24 giờ, (b) trộn đều các thành phần của giá thể, (c và d) đưa giá thể vào bình tam giác dùng một phễu tự chế, (e) bình tam giác được nút kín bằng bông gòn gói trong vải màn, (f) cổ bình được phủ bằng giấy nhôm sẵn sàng cho vào nồi hấp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 Hình 9.1 Minh họa bằng sơ đồ các biện pháp phòng trừ thích hợp đối với các nhóm bệnh thông thường . . . . . . . . . . . . . 99 Hình 9.2 Cuốc cỏ rãnh làm tăng khả năng thoát nước trong một vườn hồ tiêu bị bệnh thối rễ Phytophthora . . . . . . . . . 100 Hình 9.3 Các biện pháp ngăn ngừa mang nguồn bệnh qua giày dép: bao bọc ngoài giày dép bằng nhựa (trái) và khử trùng giày sau khi kiểm tra một ruộng trồng bị bệnh có nguồn gốc từ đất (phải) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 Hình 10.1 Chu kỳ bệnh Sclerotinia sclerotiorum . . . . . . . . . . . 110 Hình 10.2 Sclerotinia sclerotiorum gây hại: (a) đậu cô ve leo, (b) xà lách, (c) cải bắp (thối ướt), (d) cải bắp, (e) quả thể đĩa từ hạch nấm ở tàn dư cây đậu tương; (f) quả thể đĩa cạnh cây đậu cô ve lùn; (g) đậu cô ve leo (hạch nấm hình thành trên quả đậu); (h) hạch nấm nảy mầm tạo ra quả thể đĩa . . . . . . . 111 12 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
14. Hình 10.3 Sclerotium rolfsii: (a) trong thí nghiệm lây bệnh nhân tạo (chú ý các sợi nấm lan ra), (b) trên dưa hấu đã bị thối, (c) thối gốc với sự hình thành các hạch nấm hình cầu màu nâu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 Hình 10.4 Các ví dụ về bệnh Rhizoctonia: (a) triệu chứng nhọn như đầu mác ở rễ bệnh, (b) bệnh khô vằn trên lúa do Rhizoctonia, (c) hạch nấm của Rhizoctonia trên cải bắp bị bệnh, (d) bệnh do Rhizoctonia trên vỏ ngô . . . . . . . . . 114 Hình 10.5 Du động bào tử Pythium được giải phóng qua bọc giả (trái), và du động bào tử Phytophthora được giải phóng trực tiếp từ cành mang bọc bào tử (phải) . . . . . . . . . . . . . . 116 Hình 10.6 Sơ đồ minh họa quá trình sinh sản hữu tính ở Pythium, liên quan đến sự tiếp xúc giữa túi đực và túi noãn để tạo ra bào tử trứng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 Hình 10.7 Pythium sp. (trái) và Phytophthora sp. (phải), cho thấy đặc tính mọc nhanh và tạo thành các sợi nấm khí sinh trên đĩa Pythium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 Hình 10.8 Chu kỳ bệnh đã được đơn giản hoá của tác nhân gây bệnh thuộc lớp nấm trứng . . . . . . . . . . . . . . . . . . .120 Hình 10.9 (a) Thể trứng của Pythium spinosum với thùy thể đực bám vào, (b) bào tử trứng trưởng thành của P. mamillatum, (c) bọc bào tử P. mamillatum với ống tháo và bọc giả chứa các du động bào tử đang phát triển, (d) bọc bào tử của P. irregulare với các du động bào tử trưởng thành trong bọc giả có vách mỏng trước khi được giải phóng ra ngoài, (e) Các bọc bào tử hình ngón ở P. myriotilum, (f) cành mang bọc bào tử và bọc bào tử đặc trưng của Phytophthora sp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .121 Hình 10.10 Các bệnh do Pythium trên lạc: (a) thối rễ con và thối thân cây con do Pythium trong điều kiện rất ẩm ướt, (b) so sánh hai cây trưởng thành, cây khỏe (trái), cây còi cọc do thối rễ nặng (phải), (c) thối rễ cái và quả lạc trầm trọng do Pythium. . .123 Hình 10.11 Bệnh do Phytophthora palmivora ở sầu riêng: (a) cây vàng lá, (b) thối mục thân, (c) thối quả. Bệnh do P. palmivora ở cacao: (d) tàn lụi cây con, (e) quả bị đen. Thối rễ (héo nhanh) hồ tiêu do P. capsici: (f) rụng lá, (g) héo. Bệnh do P. infestans: (h) mốc sương khoai tây. . . . . . . . . . . . .125 Hình 10.12 Bệnh do các loài Fusarium gây ra: (a) Fusarium oxysporum f. sp. pisi gây héo đậu Hà Lan, (b) khối bào tử phân sinh Fusarium oxysporum f. sp. zingiberi trên củ gừng, (c) thân cây bị hóa nâu do F. oxysporum, (d) quả thể của F. graminearum trên thân ngô. . . . . . . . . . . . . . . .127 Nội dung 13
15. Hình 10.13 Héo Fusarium trên chuối do F. oxysporum f. sp. cubense: (a) các triệu chứng héo trầm trọng, (b) triệu chứng nứt thân, (c) hóa nâu mạch dẫn. Héo Fusarium trên cẩm chướng do F. oxysporum f. sp. callistephi: (d) héo trầm trọng gây chết cây, (e) thân cây héo với nhiều khối bào tử phân sinh màu trắng trên bề mặt. Héo Fusarium ở đậu Hà Lan do F. oxysporum f. sp. pisi: (f) các triệu chứng héo trên đồng ruộng (chú ý các đám cây chết), (g) hóa nâu mạch dẫn ở cành bị héo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .129 Hình 10.14 Mẫu cấy Fusarium oxysporum (trái) và F. solani (phải) nuôi cấy được bốn ngày, trong đĩa Petri 60mm trên môi trường thạch đường khoai tây . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 Hình 10.15 Phân biệt giữa Fusarium oxysporum (trái) và F. solani (phải): (a) và (b) bào tử lớn, (c) và (d) bào tử nhỏ và một số bào tử lớn, (e) và (f) bào tử nhỏ trong bọc giả trên tế bào sinh bào tử (lưu ý F. oxysporum có tế bào sinh bào tử ngắn và F. solani có tế bào sinh bào tử dài) . . . . . . . . . . . . . 133 Hình 10.16 Bào tử hậu của Fusarium solani hình thành trên môi trường thạch lá cẩm chướng (CLA) (Bào tử hậu F. oxysporum trông tương tự) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134 Hình 10.17 Verticillium dahliae: (a) Mẫu nấm trên môi trường thạch đường khoai tây (nấm mọc chậm), (b) hạch nấm nhỏ trên thân cây bông già, (c) sợi nấm trong mạch xylem bị bệnh, (d) cây hồ trăn héo do V. dahliae, (e) và (f) lá cà tím héo do V. dahliae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 Hình 10.18 Tuyến trùng: (a) ký sinh thực vật với kim chích, (b) không ký sinh thực vật, không có kim chích. . . . . . . . . . . . .137 Hình 10.19 Hệ thống rễ cây bị phá hủy do: (a) tuyến trùng nốt sưng, (b) tuyến trùng gây loét rễ, cả hai bệnh đều làm cây còi cọc và vàng lá . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .138 Hình 10.20 Các triệu chứng của tuyến trùng nốt sưng: (a) triệu chứng sưng rễ, (b) tuyến trùng cái ký sinh trong các nốt sưng . . . . 138 Hình 10.21 Sơ đồ minh họa quy trình tách tuyến trùng từ rễ hoặc đất . . . 139 Hình 10.22 Bộ dụng cụ phễu Baerman để tách tuyến trùng . . . . . . . 140 Hình 10.23 Bộ dụng cụ khay Whitehead để tách tuyến trùng . . . . . . .141 Hình 10.24 Bệnh do vi khuẩn gây ra: (a-c) mướp đắng bị héo do vi khuẩn, (d) cháy lá do vi khuẩn, (e) Ralstonia solanacearum gây héo nhanh trên gừng, (f) thối nhũn cải thảo do Erwinia aroideae, (g) Pseudomonas syringae trên lá bầu bí . . . . . . .143 Hình 10.25 Phương pháp phân lập Ralstonia solanacearum từ thân bị bệnh . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .145 14 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
16. Hình 10.26 Sơ đồ minh họa đĩa cấy vi khuẩn, cho thấy thứ tự các vạch cấy và hơ lửa khử trùng que cấy giữa các bước . . . . . . . . 146 Hình 10.27 Đĩa cấy vi khuẩn phát triển sau 2 ngày ở nhiệt độ 25°C . . . . 146 Hình 10.28 Chà xát rễ hoặc thân rễ để chuẩn bị dịch vi khuẩn trước khi cấy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147 Hình 10.29 Các bệnh do vi rút: (a) vi rút héo đốm cà chua ở ớt, (b) vi rút biến vàng củ cải đường ở dưa chuột, (c) vi rút vàng lá xoăn lá ở cà chua, (d) vi rút khảm củ cải ở cây ăn lá họ cải bắp (phải), cây khỏe (trái), (e) vi rút ở dưa chuột, (f) quăn lá do vi rút ở mãn đình hồng (Althaea rosea) . . . . . . . . . .149 Hình 11.1 Các bệnh trên ớt: (a) cây ớt khỏe (trái) và bị héo (phải) có thể do một số bệnh gây ra, (b) thân biến màu nâu, triệu chứng điển hình của bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra, (c) thối gốc mốc trắng do Sclerotium rolfsii gây ra, (d) thối rễ Phytophthora do nấm Phytophthora capsici gây ra, (e) ớt bị nhiễm vi rút héo đốm cà chua, (f) quả ớt bị bệnh thán thư do nấm Colletotrichum sp. gây ra. . .153 Hình 11.2 Các bệnh ở cà chua: (a) triệu chứng lá quăn, vàng do vi rút gây ra trên những chồi mới mọc. (b) vết loét do vi khuẩn Pseudomonas syringae gây ra trên quả cà chua, (c) Sưng rễ tuyến trùng do Meloidogyne sp. gây ra, (d) đốm mốc lá do Cladosporium fulvum, (e) đốm vòng trên lá do Alternaria solani . . . . . . . . . . . . . . . . . .155 Hình 11.3 Các bệnh ở lạc: (a) gỉ sắt lạc do nấm Puccinia arachidis gây ra, (b) đốm lá Cercospora (Cercospora arachidicola) và gỉ sắt, (c) lạc bị thối rễ gây triệu chứng biến vàng và còi cọc, (d) thối rễ con và thối quả do Pythium sp., (e) vết bệnh trên lá mầm lạc với rất nhiều bào tử của nấm Aspergillus niger, (f) thối rễ Pythium ở cây con, (g) cây khỏe (trái) và cây bị thối rễ gây còi cọc (phải) . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 Hình 11.4 Các bệnh ở hành: (a) đốm lá Stemphylium, (b) sương mai do nấm Peronospora sp., (c) Các triệu chứng thối rễ màu hồng do nấm Phoma terrestris . . . . . . . . . . . . . . 159 Hình 11.5 Các bệnh ở ngô: (a) ung thư ngô do Ustilago maydis, (b) khô vằn do Rhizoctonia solani, (c) sợi nấm trắng mọc trên bắp ngô bị nhiễm bệnh do Fusarium verticillioides . . . .161 Hình 12.1 Hạt ngô nhiễm Fusarium graminearum và sơ đồ minh họa quá trình độc tố nấm từ sợi nấm thấm vào mô hạt. . . . . . .163 Hình 12.2 Aspergillus flavus hình thành bào tử trên hạt lạc bị nhiễm bệnh trên môi trường phân lập . . . . . . . . . . . . . . 163 Nội dung 15
17. Hình 12.3 Aspergillus flavus, ba tản nấm trên môi trường Czapek yeast autolysate agar (trái), bào tử vô tính mọc đầy trên đầu cành bào tử phân sinh (giữa), bào tử vô tính (phải) . . . . 165 Hình 12.4 Aspergillus niger, ba tản nấm trên môi trường Czapek yeast autolysate agar (trái), bào tử vô tính mọc đầy trên đầu cành bào tử phân sinh dài (giữa), bào tử vô tính (phải) . . 166 Hình 12.5 Aspergillus ochraceus, ba tản nấm trên môi trường Czapek yeast autolysate agar (trái), bào tử vô tính mọc đầy trên đầu cành bào tử phân sinh (giữa), bào tử vô tính (phải) . . . . . .168 Hình 12.6 Thối Fusarium ở ngô do Fusarium verticillioides (trái), và mẫu nuôi cấy thuần trên môi trường PDA (phải) . . . . . 169 Hình 12.7 Thối Fusarium ở ngô do F. graminearum (trái), và mẫu nuôi cấy thuần trên môi trường PDA (phải) . . . . . . . . . 170 Hình 13.1 Sắp xếp thiết bị trong một phòng thí nghiệm chẩn đoán (phòng thí nghiệm tại Chi cục BVTV Nghệ An): (a) và (b) hai vị trí trong phòng sạch, (c) và (d) hai vị trí trong phòng chuẩn bị. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 Hình 13.2 Sơ đồ phòng thí nghiệm chẩn đoán, biểu thị sơ đồ bố trí thiết bị và bàn. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .173 Hình 13.3 Dụng cụ cần thiết cho việc phân lập, cấy truyền, làm thuần và giám định các tác nhân nấm và vi khuẩn gây bệnh . . . . .176 Hình 13.4 Sơ đồ minh họa thiết kế một nhà lưới thích hợp cho việc lây bệnh nhân tạo và các công việc thí nghiệm với tác nhân gây bệnh thực vật. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178 Hình 13.5 Nhà lưới dùng cho nghiên cứu bệnh cây tại Chi cục BVTV Quảng Nam: (a) hình ảnh tổng quát của nhà lưới với lưới chống côn trùng, (b) lưới che nắng và mái tôn nhựa polycarbonate phẳng với các bộ quạt cầu thông gió . . . . . .178 Hình 13.6 Chuẩn bị phân bón thương phẩm để dùng trong nhà lưới . . .181 Hình A1.1 Hướng dẫn từng bước làm que cấy dẹp . . . . . . . . . . .184 16 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
18. Lời tựa Cuốn cẩm nang này được biên soạn nhằm giới thiệu những kỹ năng cơ bản trong việc chẩn đoán các bệnh nấm hại cây trồng tại Việt Nam. Nội dung của sách chủ yếu dựa vào kinh nghiệm đạt được qua hai dự án của Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia (ACIAR) ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam.1 Sách cũng tham khảo các cẩm nang khác đã hoặc sắp được xuất bản. Bốn phòng thí nghiệm chẩn đoán với chi phí thấp đã được xây dựng tại các tỉnh miền Trung Việt Nam trong dự án ACIAR hiện tại.2 Những phòng thí nghiệm này được đặt tại các Chi cục Bảo vệ thực vật (PPSD) tại các tỉnh Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Nghệ An, và tại trường Đại học Nông Lâm Huế. Họ được tài trợ các trang thiết bị cần thiết để phân lập và giám định các chi nấm và vi khuẩn gây bệnh phổ biến tồn tại trong đất và một số nấm và vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên lá. Các phòng thí nghiệm này cũng có cũng có cơ sở vật chất để thực hiện quá trình lây bệnh nhân tạo đối với các bệnh mới được tìm ra ở Việt Nam. Cán bộ kỹ thuật các phòng thí nghiệm này đã được tập huấn kỹ năng cơ bản trong phòng thí nghiệm thông qua các lớp tập huấn tại trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội và tại Chi cục Bảo vệ thực vật Quảng Nam, nơi có một phòng thí nghiệm giảng dạy đã được xây dựng. Các cán bộ này cũng đã thường xuyên tham gia việc điều tra bệnh hại định kỳ trên đồng ruộng và đã chẩn đoán các mẫu bệnh cây do nông dân thu thập. Mỗi phòng thí nghiệm có một thư viện nhỏ và một máy vi tính để truy cập thông tin từ mạng internet, một nguồn thông tin thiết yếu cho những người làm công tác chẩn đoán bệnh cây. 1 CS2/1994/965 Chẩn đoán và phòng trừ bệnh hại cây trồng tại miền Bắc Việt Nam (1998–2001) và CP/2002/115 Chẩn đoán, khuyến nông và phòng trừ bệnh hại cây trồng tại các tỉnh miền Trung Việt Nam (2005–2008). 2 CP/2002/115 Chẩn đoán, khuyến nông và phòng trừ bệnh hại cây trồng tại các tỉnh miền Trung Việt Nam (2005-2008) Lời tựa 17
19. Mỗi tỉnh đã được xây dựng một nhà lưới nhỏ phục vụ cho lây bệnh nhân tạo và đánh giá hiệu quả của thuốc trừ nấm và việc thay đổi thành phần giá thể đất trong việc hạn chế bệnh hại. Việc thiết kế và điều hành các nhà lưới cho công việc thí nghiệm và sản xuất cây con sạch bệnh là chủ đề cho các hoạt động tập huấn ở Việt Nam và Australia. Tiến sĩ Ngô Vĩnh Viễn, Viện trưởng Viện Bảo vệ thực vật, đã đề nghị rằng tất cả cán bộ dự án nên được tập huấn và phát triển chuyên môn trong các lĩnh vực này. Nhóm dự án ACIAR hiện tại đã tham quan các vườn ươm cây tại Đà Lạt, một phần trong chương trình tập huấn. Sự phối hợp giảng dạy tiếng Anh với tập huấn về bệnh cây là một khía cạnh quan trọng trong việc phát triển năng lực của cán bộ trong dự án hiện tại. Nhiều đồng nghiệp của chúng tôi trong dự án này giờ đây có thể tìm kiếm tư vấn qua thư điện tử (với sự trợ giúp của các hình ảnh kỹ thuật số) về các vấn đề nảy sinh trên các bệnh mới. Các đồng nghiệp từ Việt Nam và Australia đã đóng góp các hình ảnh và đoạn viết cho cuốn cẩm nang này - những đóng góp này đã được đề cập đến đối với từng cá nhân. Công việc chẩn đoán bệnh cây là nền tảng cơ bản cho việc thiết kế các thí nghiệm phòng trừ bệnh hại, và xây dựng các biện pháp phòng trừ cho mục đích khuyến nông. Việc chẩn đoán chính xác một số lượng lớn bệnh hại và giám định các tác nhân gây bệnh tới loài dựa vào kinh nghiệm có được qua nhiều năm. Chúng tôi hy vọng cuốn sách này sẽ trợ giúp các đồng nghiệp Việt Nam mới vào nghề trong những nghiên cứu khởi đầu của họ về chẩn đoán bệnh cây tại phòng thí nghiệm và trên đồng ruộng. 18 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
20. Lời cảm ơn Nhóm tác giả thành thực cảm ơn Tiến sĩ T.K. Lim trong việc gợi ý sự ra đời của cuốn cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam và Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia đã trợ giúp tài chính cho việc hình thành cuốn sách. Tác giả chính cũng cảm ơn sự hỗ trợ và khuyến khích vô giá của ACIAR trong những hoạt động chẩn đoán, nghiên cứu, nâng cao năng lực tại Việt Nam hơn 12 năm qua. Nhóm tác giả cũng chân thành cảm ơn các hiệu trưởng qua nhiều nhiệm kỳ các đồng nghiệp của chúng tôi trong ngành bệnh cây và các cán bộ Phòng Hợp tác Quốc tế, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội vì sự ủng hộ của họ từ năm 1992. Nhóm tác giả cũng bày tỏ lòng biết ơn tới cán bộ Viện Bảo vệ Thực vật vì sự chỉ dẫn và hỗ trợ, đặc biệt là Tiến sĩ Ngô Vĩnh Viễn, Viện trưởng. Chúng tôi cũng cảm ơn sự giúp đỡ của các cán bộ Trường Đại học Sydney, Vườn Thực vật Hoàng gia Sydney và Domain Trust, và Bộ Nông nghiệp Bang New South Wales trong các hoạt động nghiên cứu và giảng dạy tại Việt Nam. Chúng tôi cũng cảm ơn sự quảng đại, lòng hiếu khách và hỗ trợ của các đồng nghiệp tại các Chi cục Bảo vệ Thực vật ở Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Nghệ An, Quảng Trị và Lâm Đồng, trường Đại học Nông Lâm Huế, Trung tâm Bảo vệ Thực vật Vùng 4, và các nông dân hợp tác tại các tỉnh trên và một số tỉnh khác. Dự án hiện tại của chúng tôi đặc biệt là sự đền đáp lại công lao đóng góp của tất cả những người liên quan. Những đồng nghiệp sau đây ở Việt Nam và Australia đã đóng góp cho sách chỉ dẫn này qua các hình ảnh về bệnh cây, các nhận xét liên quan và tư vấn về mặt biên tập. Tuy nhiên, nhóm tác giả là những người chịu trách nhiệm về nội dung và hình ảnh minh họa. Australia — Barry Blaney, Julian Burgess, Eric Cother, Norma Cother, Nerida Donovan, Phillip Davies, Mark Fegan, Col Fuller, David Guest, Ailsa Hocking, Greg Johnson, Edward Liew, Suneetha Medis, Dorothy Noble, Tony Pattison, Brett Summerell và Ameera Yousiph. Lời cảm ơn 19
21. Việt Nam— Đặng Lưu Hoa, Đậu Thị Vinh, Hồ Đắc Thọ, Phạm Thị Hòa, Hoàng Thị Minh Hương, Huỳnh Thị Minh Loan, Lương Minh Tâm, Ngô Vĩnh Viễn, Nguyễn Kim Vân, Nguyễn Thị Nguyệt, Trần Nguyễn Hà, Nguyễn Vĩnh Trường, Phạm Thanh Long, Trần Kim Loang, Trần Thị Nga và Trần Út. 20 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
22. 1 Giới thiệu Bệnh hại cây trồng gây ra những thiệt hại nghiêm trọng cho thu nhập của nhiều nông dân Việt Nam qua việc làm giảm năng suất và chất lượng nông sản. Chi phí cho các biện pháp phòng trừ như thuốc trừ nấm càng làm giảm hơn nữa thu nhập của người dân. Một số bệnh do nấm gây ra có thể sản sinh độc tố nấm, như aflatoxin, nhiễm vào các sản phẩm thức ăn (như ngô và lạc). Sự lẫn tạp độc tố nấm có thể gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người và động vật. Đôi khi bệnh bùng phát thành dịch tàn phá các cây trồng chính. Những dịch bệnh như vậy có thể tác động nghiêm trọng đến kinh tế và xã hội của toàn thể một vùng hoặc quốc gia. Chẳng hạn như trong năm 2006, dịch vàng lùn và lùn xoắn lá đã gây thiệt hại lớn trên lúa ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, ảnh hưởng đến một triệu hecta lúa thuộc 22 tỉnh thành. Bệnh dịch này trực tiếp ảnh hưởng đến hàng triệu gia đình nông dân. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam từ lâu đã nhận ra tầm quan trọng của bệnh cây trong nông nghiệp. Bộ có một mạng lưới rộng lớn các trung tâm nghiên cứu và một mạng lưới cán bộ bảo vệ thực vật tại các cấp tỉnh và huyện trên khắp Việt Nam. Những thành viên trong mạng lưới này hỗ trợ công tác chẩn đoán bệnh cây và cung cấp thông tin về các biện pháp phòng trừ bệnh. Nhiệm vụ này là một thử thách lớn, do sự phong phú của cây trồng, bệnh hại, và sự đa dạng của các vùng khí hậu ở Việt Nam. Việc phòng trừ bệnh hại thành công phụ thuộc vào việc xác định chính xác bệnh và tác nhân gây bệnh. Một số bệnh thông thường có thể được chẩn đoán chính xác trên đồng ruộng thông qua các triệu chứng điển hình. Chẳng hạn như bệnh ung thư ngô, thối thân do Sclerotinia, tuyến trùng nốt sưng, sưng rễ và gỉ sắt lạc đều có những triệu chứng điển hình và hiển nhiên khi nhìn bằng mắt thường. Tuy nhiên, có nhiều bệnh có các triệu chứng không điển hình tương tự nhau (như héo rũ, còi cọc, vàng lá). Một số bệnh này có thể được chẩn đoán một cách chính xác tại phòng thí nghiệm khi quan sát dưới kính hiển vi. Nhiều nấm bệnh và tuyến trùng ký sinh có thể được giám định bằng cách này. Phần 1. Giới thiệu 21
23. Tuy nhiên, một số nấm và vi khuẩn gây bệnh chỉ có thể được xác định bằng cách phân lập trên môi trường nhân tạo. Một khi đã được phân lập, các mẫu vi sinh vật sạch có thể được giám định bằng kính hiển vi và, nếu cần, có thể khẳng định lại kết quả bằng kỹ thuật phân tử hoặc các phương pháp khác tốn kém hơn. Hầu hết các nấm bệnh gây thối rễ và thân cây chỉ có thể chẩn đoán bằng cách phân lập trên môi trường nhân tạo. Hầu hết các bệnh virút chỉ có thể được xác định chính xác trong phòng thí nghiệm virút. Các bộ kit chẩn đoán sẵn có hiện nay có thể chẩn đoán nhanh và chính xác một số bệnh do vi rút và vi khuẩn ngay trên đồng ruộng; tuy nhiên, những bộ kit này có giá tương đối đắt. Cuốn cẩm nang này được biên soạn nhằm trợ giúp trong việc xây dựng và vận hành các phòng thí nghiệm nhỏ để chẩn đoán các bệnh nấm thông thường ở cấp tỉnh tại Việt Nam. Cuốn sách đặc biệt quan tâm, đề cập đến các bệnh nấm gây thối thân và rễ, gây thiệt hại đáng kể cho nhiều nông dân Việt Nam hàng năm. Nhiều bệnh trong số này vẫn chưa được giám định chính xác. Trong cuốn sách này, các thuật ngữ về nấm được dùng với nghĩa truyền thống như vẫn thường dùng ở Việt Nam hiện nay. Vì vậy những thuật ngữ này được dùng để đề cập đến nhóm nấm thực cũng như các loài dạng sợi giống nấm trong lớp nấm trứng, và nấm mốc nhờn nội ký sinh. Tuy nhiên, tầm quan trọng trong việc hiểu rõ những tiếp cận mới về phân loại nấm hiện đại đã được nhấn mạnh trong cuốn sách. Một trong những hệ thống phân loại hiện đại các sinh vật này cũng được khái quát lại trong cuốn sách. Các bệnh nấm là đối tượng hữu ích cho việc tập huấn về chẩn đoán. Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia (ACIAR) đã hỗ trợ việc xây dựng bốn phòng thí nghiệm chẩn đoán ở cấp tỉnh, bao gồm việc cả việc tập huấn cho cán bộ về kỹ năng trong phòng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng. Đã có tiến triển đáng khích lệ, mặc dù phải cần nhiều năm kinh nghiệm và thực hành để quen với việc chẩn đoán các bệnh do nhiều tác nhân gây ra - nấm, vi khuẩn, virút, phytoplasma và tuyến trùng. Cán bộ phòng thí nghiệm chẩn đoán phải ghi chép lại tất cả các thông tin liên quan đến việc chẩn đoán trong một cuốn sổ có mã số lưu trữ và tất cả các mẫu bệnh đều phải được ghi chép lại. Thông tin về sự xuất hiện bệnh có thể được nhập vào cơ sở dữ liệu bệnh hại cây trồng quốc gia, đây là một phần quan trọng trong các tiến trình an ninh sinh học hỗ trợ cho việc xuất khẩu sản phẩm nông nghiệp. Giờ đây khi Việt Nam đã gia nhập Tổ chức Thương mại Thế giới thì vai trò của cơ sở dữ liệu quốc gia lại càng trở nên quan trọng. Một cơ sở dữ liệu quốc gia về bệnh cây và một mạng lưới các phòng thí nghiệm chẩn đoán sẽ giúp Việt Nam đáp ứng được những thử thách trong việc thiết lập và duy trì an ninh sinh học. Một cách lý tưởng, các phòng thí nghiệm cần phải duy trì một bộ sưu tập các mẫu vi sinh vật hại và tiêu bản bệnh (xem Shivas and Beasley 2005). 22 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
24. Bệnh chỉ là một trong những yếu tố tác động đến sức khỏe thực vật và do đó tác động đến năng suất cây trồng. Điều quan trọng là những người làm công tác chẩn đoán bệnh cây phải nắm được tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến sức khỏe cây trồng và có tác động qua lại với bệnh - sâu hại, cỏ dại, dùng thuốc trừ sâu, tính chất đất, khí hậu địa phương và các yếu tố môi sinh khác. Sự cộng tác chặt chẽ giữa nông dân và cán bộ bảo vệ thực vật sẽ giúp cho việc chẩn đoán và phòng trừ bệnh thành công. Nông dân có thể rất giỏi quan sát và cung cấp thông tin quan trọng để trợ giúp cho việc chẩn đoán từ những quan sát và kinh nghiệm của chính họ. Cuốn cẩm nang này được sắp xếp thành các phần sau: • tổng quát về sức khỏe thực vật và các yếu tố ảnh hưởng • quy trình chẩn đoán tác nhân gây bệnh trong phòng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng • các triệu chứng bệnh cây • quy trình và thiết bị làm việc trên đồng ruộng • quy trình và thiết bị làm việc trong phòng thí nghiệm • giới thiệu sơ lược về phân loại nấm • các phương pháp lây bệnh nhân tạo • quản lý bệnh hại tổng hợp • các bệnh do nấm có nguồn gốc từ đất • các bệnh thường gặp trên một số cây trồng có ý nghĩa kinh tế • ảnh hưởng sức khỏe từ nấm gây bệnh • thiết kế, xây dựng và vận hành các phòng thí nghiệm và nhà lưới dùng cho chẩn đoán • phụ lục về cách làm que cấy dẹp, sức khỏe an toàn trong công việc, cũng như các công thức nấu môi trường, các phương pháp khử trùng, và các phương pháp lưu giữ mẫu nấm • Gợi ý một thư viện tham khảo cho các phòng thí nghiệm chẩn đoán. 1.1 Tài liệu tham khảo Shivas R. and Beasley D. 2005. Management of plant pathogen collections. Australian Government Department of Agriculture, Fisheries and Forestry. At: . Phần 1. Giới thiệu 23
25. 2 Tổng quan về sức khỏe thực vật Sức khỏe thực vật là một nhân tố quyết định đối với năng suất cây trồng và do vậy cũng là nhân tố quyết định tới thu nhập của nông dân. Vì vậy, vấn đề quản lý sức khỏe cây trồng là vô cùng quan trọng để tối đa hóa lợi nhuận. Cải thiện tăng tăng THU NHẬP CỦA SỨC KHỎE THỰC VẬT NĂNG SUẤT NGƯỜI DÂN Bệnh chỉ là một trong những nhân tố ảnh hưởng đến sức khỏe cây trồng. Các nhân tố khác bao gồm sâu hại, cỏ dại, dinh dưỡng, thuốc bảo vệ thực vật, tình trạng đất và môi sinh (Hình 2.1). Tất cả các nhân tố này phải được xem xét đến trong quá trình chẩn đoán bởi vì mỗi nhân tố có thể tác động đến cây và gây ra các triệu chứng tương tự như các triệu chứng bệnh. Mỗi nhân tố cũng có thể có tiềm năng ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh trong cây. Các nhà nghiên cứu bệnh cây làm công tác chẩn đoán cần phải hiểu rõ về tất cả các nhân tố tác động đến sức khỏe và bệnh của cây. Trên đồng ruộng, cán bộ bệnh cây cần phải ghi chép lại thông tin về tất cả các yếu tố liên quan (xem phiếu điều tra đồng ruộng ở Phần 5), và thảo luận lịch sử ruộng và việc quản lý cây trồng với nông dân. Việt Nam có phạm vi rộng lớn các vùng khí hậu nông nghiệp khác nhau. Chẳng hạn như các tỉnh miền trung và bắc có mùa đông từ mát tới lạnh thích hợp cho các tác nhân gây bệnh có nguồn gốc ôn đới. Nhiệt độ thấp hạn chế sự phát triển của một số cây trồng khiến cho chúng dễ bị các bệnh thường gặp ở cây con và một số bệnh khác. Hơn nữa, chu kỳ khí hậu hàng năm bao gồm những giai đoạn rất ẩm ướt và những giai đoạn quá khô. Khí hậu như vậy có thể gây stress cho cây trồng và tạo điều kiện thuận lợi cho một số bệnh, nhất là bệnh trên rễ và thân cây gây ra bởi các tác nhân tồn tại trong đất. Thực tế thì sự ngập nước và thoát nước kém là những yếu tố chính tạo điều kiện cho sự gây hại của những bệnh này ở Việt 24 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
26. SÂU HẠI BỆNH DINH DƯỠNG MÔI TRƯỜNG Sức khỏe LỊCH SỬ CÂY thực vật t TRỒNG bảo vậ thực THUỐC vệ TÌNH TRẠNG ĐẤT CỎ DẠI Hình 2.1 Những nhân tố chủ yếu trong việc duy trì sức khỏe thực vật Nam. Vì vậy, lên luống cao và thoát nước tốt là các biện pháp canh tác then chốt trong việc quản lý bệnh hại tổng hợp. Một người làm công tác chẩn đoán phải hiểu rõ các ảnh hưởng này. 2.1 Cỏ dại Nhiều sâu hại và tác nhân gây bệnh tồn tại trên ký chủ phụ là cỏ dại khi không có mặt cây trồng là ký chủ chính. Vì vậy, phòng trừ cỏ dại một cách hữu hiệu là một biện pháp phòng trừ quan trọng và cũng là một phần không thể thiếu trong quản lý bệnh hại tổng hợp (integrated disease management - IDM). Hơn nữa, cỏ dại mọc chung với cây trồng sẽ cạnh tranh nước, dinh dưỡng và ánh sáng, vì vậy sẽ gây stress cho cây trồng và tăng tác hại của bệnh. Phần 2. Tổng quan về sức khỏe thực vật 25
27. 2.2 Sâu hại Trong quá trình tìm kiếm và lấy thức ăn sâu hại có thể gây hại đến cây tương tự như các triệu chứng bệnh (Hình 2.2). Chẳng hạn như rệp, bọ nhảy trên lá, bọ trĩ, nhện và ruồi trắng có thể gây tổn thương cho lá cây tương tự như các triệu chứng của một số bệnh trên lá. Những sâu hại này cũng có thể đóng vai trò như vectơ truyền virút và vi khuẩn. Sâu đục thân, sùng ăn rễ cây làm ảnh hưởng đến quá trình hút nước của cây và có thể gây héo tương tự như triệu chứng héo do các bệnh thối rễ và tắc bó mạch gây ra. 2.3 Thuốc bảo vệ thực vật Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có thể khiến cho lá bị hư hại, gây ra các triệu chứng như cháy lá hoặc đốm lá. Những triệu chứng này có thể bị nhầm lẫn với những triệu chứng cháy lá và đốm lá do nhiều tác nhân gây bệnh là nấm và vi khuẩn gây ra. Thuốc trừ cỏ có thể gây stress cho cây, làm chúng dễ mẫn cảm hơn với tác nhân gây bệnh. 2.4 Dinh dưỡng Dinh dưỡng không đầy đủ thường làm cho cây còi cọc và rễ tăng trưởng kém (Hình 2.3). Những triệu chứng này cũng có thể có nguyên nhân từ các tác nhân gây bệnh thối rễ. Các dấu hiệu khác của việc thiếu khoáng chất và có độc tố cũng có thể tương tự như những triệu chứng do một số bệnh gây ra. Chẳng hạn như thiếu đạm gây ra vàng lá, đặc biệt là các lá ở phía dưới. Vàng lá cũng là triệu chứng của bệnh ở phần rễ, do phá hủy quá trình vận chuyển đạm lên cây. Thiếu chất khoáng hoặc có độc tố có thể làm cho cây dễ mẫn cảm với một số bệnh hại. 26 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
28. a b c d Hình 2.2 Hư hại do sâu gây ra: (a) sùng trắng (hình trong) làm hư hại rễ ngô, (b) cây ngô bị héo do sùng trắng, (c) rệp gây hại, (d) lá có màu đồng thau điển hình do nhện chích hút ở mặt dưới của lá (hình trong) Phần 2. Tổng quan về sức khỏe thực vật 27
29. a b c Hình 2.3 Thiếu dinh dưỡng gây ra các triệu chứng giống bệnh: (a) thối cuống quả do thiếu canxi ở cây cà chua, (b) thiếu kali ở câyhọ thập tự, (c) thiếu boron ở cây súp lơ xanh 2.5 Tình trạng đất Sự ngập nước (thoát nước kém), cấu trúc đất nghèo nàn, đất có tầng sét cứng và 'tầng đế cày' (lớp đất cứng trong cấu trúc đất) có thể cản trở sự phát triển của rễ. Rễ bị còi cọc sẽ làm giảm lượng nước và dinh dưỡng lên cây, gây stress cho cây. Rễ còi cọc cũng có thể gây héo và vàng lá, tương tự như các triệu chứng của nhiều loại bệnh cây. Tầng đế cày có thể làm cho rễ mọc ngang (Hình 2.4), làm giảm chức năng và sự phát triển của rễ; gây stress cho cây, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của một số bệnh hại. 28 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
30. Hình 2.4 Rễ cây mọc ngang do chạm phải lớp đất cứng trong cấu trúc đất (tầng đế cày) 2.6 Môi trường Những điều kiện khí hậu khác nhau có thể gây hư hại và gây stress cho cây, và vì vậy có hại cho sức khỏe của cây. Những điều kiện này, bao gồm nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao, ẩm ướt và mưa, cùng với mưa đá, lũ lụt, hạn hán và bão tố dẫn đến việc tăng tỷ lệ và mức độ gây hại của bệnh. Nhiệt độ cao, độ ẩm thấp và hạn hán có thể làm cây héo trầm trọng và chết. Điều kiện gió kết hợp với mưa tạo cơ hội cho sự xâm nhiễm và lan truyền của nhiều loại nấm và vi khuẩn gây bệnh trên lá. Đất ẩm ướt là điều kiện thuận lợi cho các bệnh thối rễ do Phytophthora và Pythium. Cây bị stress do hạn hán có thể là điều kiện thuận lợi cho sự xâm nhập của các bệnh trên rễ, và thối thân. Sự có mặt của bệnh thối rễ trong điều kiện đất khô có thể gây chết cây. Bão tố hoặc gió lớn làm lắc lư cây có thể làm hư hại đến hệ thống rễ của cây. Hư hại như vậy có thể tạo điều kiện cho sự xâm nhập của các tác nhân gây thối rễ dẫn đến hiện tượng cây suy thoái dần và chết. Ví dụ như, bão tố và gió lớn là một nguyên nhân đáng ngờ trong việc gây tàn lụi cây cà phê và cây vải ở Việt Nam. Phần 2. Tổng quan về sức khỏe thực vật 29
31. 2.7 Lịch sử cây trồng Hiểu biết về lịch sử cây trồng có thể giúp chẩn đoán bệnh. Chẳng hạn như, thông tin về nguồn gốc của hạt và hạt có được xử lý thuốc trừ nấm hay không có thể giúp suy luận xem bệnh hạt giống có phải là nguyên nhân ảnh hưởng đến cây trồng không. Như đã thảo luận ở trên, việc tìm hiểu diễn biến thời tiết trước khi dịch bệnh bùng phát là vô cùng quan trọng. Điều kiện ẩm ướt và lạnh có lợi cho nhiều tác nhân gây bệnh thối rễ nhưng cây có thể tồn tại mặc dù có tổn thương rễ bởi vì trong điều kiện này cây thoát nước chậm. Tuy nhiên, nếu thời tiết trở nên nóng bức và mức độ thoát nước nhanh, cây bị bệnh có thể héo rất nhanh và chết. Sự xuất hiện của vectơ môi giới truyền virút trên một cây trồng trước đó có thể chỉ ra rằng virút do vectơ đem đến đã xâm nhiễm vào cây trồng và gây ra các triệu chứng như đã quan sát được. Hiểu biết về các cây trồng trước và bệnh của chúng cũng có thể là một gợi ý trong việc xác định bệnh tiềm tàng trên cây trồng hiện tại. Chẳng hạn như, một số công thức luân canh sẽ gia tăng mức độ hại của một số bệnh do tác nhân gây bệnh có nguồn gốc từ đất. Ví dụ, luân canh liên tục cây trồng trong họ Solanaceae có thể làm tăng bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum. 30 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
32. Nghiên cứu cụ thể Cỏ dại với vai trò là ký chủ phụ - Cỏ cứt lợn (Ageratum conyzoides) Cỏ dại có thể đóng vai trò như ký chủ phụ cho nhiều tác nhân quan trọng gây bệnh trên cây trồng. Cỏ cứt lợn (Ageratum conyzoides) là một cỏ dại thường thấy ở Việt Nam (Hình 2.5), mọc lẫn với cây trồng, mọc trên ruộng giữa các vụ trồng và dọc theo đường đi. Loài cỏ này là ký chủ phụ của một số tác nhân gây bệnh quan trọng và là nơi bảo tồn nguồn bệnh hại cho cây trồng vụ sau. Sự có mặt của loài cỏ này sẽ làm mất đi lợi ích của việc luân canh mà nông dân thực hiện để hạn chế nguồn bệnh trong đất. Cỏ cứt lợn là ký chủ phụ của Ralstonia solanacearum (gây héo xanh vi khuẩn), tuyến trùng nốt sưng và có khả năng gây cả bệnh vàng lá hoa lá cúc tây, một bệnh do phytoplasma và có môi giới truyền bệnh là bọ nhảy trên lá, vectơ này thường truyền bệnh cho những cây mẫn cảm với bệnh như như cúc tây, khoai tây, cà rốt và dâu tây. Việc phòng trừ cỏ dại ký chủ phụ là vô cùng quan trọng. a c d b e Hình 2.5 Cỏ cứt lợn (Ageratum conyzoides): (a) loại hoa màu tím, (b) loại hoa màu trắng, (c) rễ cỏ Ageratum conyzoides bị tuyến trùng Meloidigyne gây hại gây ra các nốt sưng, (d) cỏ Ageratum conyzoides héo rũ do vi khuẩn Ralstonia solanacearum, (e) triệu chứng vàng lá hoa lá trên cỏ Ageratum conyzoides giống như ở cúc tây (hình trong: triệu chứng vàng lá hoa lá cúc tây Callistephus chinensis) Phần 2. Tổng quan về sức khỏe thực vật 31
33. 3 Quy trình chẩn đoán Các bước chính trong quy trình chẩn đoán là: • thu thập mẫu bệnh ngoài đồng ruộng • kiểm tra các mẫu bệnh thu thập được trong phòng thí nghiệm • lây bệnh nhân tạo • chẩn đoán bệnh. Các bước này được minh họa trong Hình 3.1. 3.1 Nghiên cứu cụ thể Trong phần này, hai nghiên cứu cụ thể được trình bày để minh họa cho quy trình chẩn đoán: • chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh thối nõn dứa - Phytophthora nicotianae • điều tra một phức hợp bệnh – héo trên gừng do vi khuẩn và nấm Fusarium. 32 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
34. ĐIỀU TRA ĐỒNG MẪU DO NÔNG RUỘNG DÂN HOẶC CÁN BỘ Trò chuyện với nông dân, HUYỆN THU THẬP kiểm tra cây bị bệnh, ghi Lấy thông tin RUỘNG chép, thu thập mẫu TRÊN ĐỒNG Kiểm tra kỹ lưỡng mẫu Bệnh có khả năng do bệnh trong phòng tuyến trùng hoặc virút thí nghiệm Có thể là các bệnh do vi Phân lập và phát hiện khuẩn hoặc nấm tuyến trùng PHÂN LẬP Giám định hình thái Giám định bởi Viện Bảo vệ những nấm bệnh không Phân lập và làm thuần thực vật hoặc một trung thể nuôi cấy trên môi tâm tin cậy khác trường nhân tạo Xác nhận một bệnh mới bởi một trung tâm quốc Giám định Bệnh phổ biến gia hoặc quốc tế Lây bệnh nhân tạo GIÁM ĐỊNH GIÁM Hoàn tất chẩn đoán Khuyến cáo nông dân biện pháp phòng trừ hiệu quả nhất / chiến lược IDM Hình 3.1 Sơ đồ quy trình chẩn đoán Phần 3. Quy trình chẩn đoán 33
35. Nghiên cứu cụ thể chẩn đoán 1 Chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh thối nõn dứa - Phytophthora nicotianae Hình 3.2 minh họa một ví dụ về các bước trong quy trình chẩn đoán. BẮT ĐẦU Điều tra Điều tra đồng ruộng: ghi chép và lưu Thu thập mẫu cây bị đồng ruộng lại các triệu chứng, sự phân bố bệnh bệnh và các chi tiết khác Hoàn thành quy tắc Koch Lây bệnh nhân tạo Tái hiện lại triệu chứng bệnh như đã thấy trên đồng ruộng Trồng cây khỏe trong chậu Trộn nguồn nấm với đất Phytophthora nicotianae phát đất đã có nguồn bệnh sạch bệnh triển trên giá thể hạt kê Hình 3.2 Các bước phân lập, làm thuần và lây bệnh nhân tạo nấm gây thối nõn dứa, Phytophthora nicotianae (Ảnh do Đặng Lưu Hoa cung cấp) 34 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
36. Nghiên cứu cụ thể chẩn đoán 1 Chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh thối nõn dứa - Phytophthora nicotianae Hình 3.2 minh họa một ví dụ về các bước trong quy trình chẩn đoán. Cắt từng miếng cấy nhỏ và Chọn lựa mẫu cấy từ Rửa và khử trùng bề chuyển vào đĩa cấy, các dụng cụ phần ranh giới giữa mô mặt mẫu cấy đều phải được khử trùng. khỏe và mô bệnh Phòng thí nghiệm Đặt các miếng cấy lên môi trường chọn lọc Phân lập và làm thuần Đặt các đĩa cấy vào tủ Giám định mẫu cấy đã được Cấy truyền tản nấm và đỉnh Các tản nấm mọc làm thuần bằng phương sinh trưởng lên môi trường từ các miếng cấy pháp cấy đỉnh sinh trưởng thạch nước cất của sợi nấm (P. nicotianae) Phần 3. Quy trình chẩn đoán 35
37. Nghiên cứu cụ thể chẩn đoán 2 Điều tra một phức hợp bệnh - héo trên gừng do vi khuẩn và nấm Fusarium Giới thiệu Bệnh héo trên gừng được ghi nhận lần đầu tiên tại Quảng Nam vào năm 2000. Bệnh gây ra thiệt hại nghiêm trọng, nhiều nông dân thất thu 100%. Một nghiên cứu sơ bộ năm 2006 cho thấy bệnh héo có nguyên nhân do cả vi khuẩn và nấm Fusarium. Một cuộc điều tra hệ thống về phức hợp bệnh này đã được tiến hành vào tháng 1 năm 2007, một phần trong dự án CP/2002/115 “Chẩn đoán, khuyến nông và phòng trừ bệnh hại cây trồng tại các tỉnh miền Trung Việt Nam” (2005-2008) của Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia. Mục tiêu của nghiên cứu là phân lập, tìm ra các tác nhân có liên quan đến bệnh và xác định tầm quan trọng của chúng đối với bệnh. Mười cây bị bệnh đã được thu thập từ 10 ruộng khác nhau thuộc hai huyện Phú Ninh và Tiên Phước, hai khu vực trồng gừng chính tại Quảng Nam. Các ruộng được lựa chọn ngẫu nhiên để lấy mẫu trước khi mẫu được kiểm tra chi tiết. Trên ruộng Thông tin được thu thập từ nông dân tại mỗi ruộng trồng (Hình 3.3). Các nông dân xác nhận là có hai loại héo: héo nhanh và héo chậm. Lá cây bị héo nhanh có triệu chứng giống như 'luộc trong nước sôi'. Ngược lại, lá những cây bị héo chậm có hiện tượng biến vàng (Hình 3.4). Những nhận xét này cho thấy rằng có hai bệnh liên quan và các triệu chứng héo đã mô tả được giả thiết là héo vi khuẩn (héo nhanh) và héo Fusarium (héo chậm). Hình 3.3 Thảo luận với nông dân về bệnh héo trên gừng 36 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
38. Nghiên cứu cụ thể chẩn đoán 2 Điều tra một phức hợp bệnh - héo trên gừng do vi khuẩn và nấm Fusarium Giới thiệu Bệnh héo trên gừng được ghi nhận lần đầu tiên tại Quảng Nam vào năm 2000. Bệnh gây ra thiệt hại nghiêm trọng, nhiều nông dân thất thu 100%. Một nghiên cứu sơ bộ năm 2006 cho thấy bệnh héo có nguyên nhân do cả vi khuẩn và nấm Fusarium. Một cuộc điều tra hệ thống về phức hợp bệnh này đã được tiến hành vào tháng 1 năm 2007, một phần trong dự án CP/2002/115 “Chẩn đoán, khuyến nông và phòng trừ bệnh hại cây trồng tại các tỉnh miền Trung Việt Nam” (2005-2008) của Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia. a b Mục tiêu của nghiên cứu là phân lập, tìm ra các tác nhân có liên quan đến bệnh và xác định tầm quan trọng của chúng đối với bệnh. Mười cây bị bệnh đã được thu thập từ 10 ruộng khác nhau thuộc hai huyện Phú Ninh và Tiên Phước, hai khu vực trồng gừng chính tại Quảng Nam. Các ruộng được lựa chọn ngẫu nhiên để lấy mẫu trước khi mẫu được kiểm tra chi tiết. Trên ruộng Thông tin được thu thập từ nông dân tại mỗi ruộng trồng (Hình 3.3). Các nông dân xác nhận là có hai loại héo: héo nhanh và héo chậm. Lá cây bị héo nhanh có triệu chứng giống như 'luộc trong nước sôi'. Ngược lại, lá những cây bị héo chậm có hiện tượng biến vàng (Hình 3.4). Những nhận xét này cho thấy rằng có hai bệnh liên quan và các triệu chứng c d héo đã mô tả được giả thiết là héo vi khuẩn (héo nhanh) và héo Fusarium (héo chậm). e f Hình 3.4 Điều tra bệnh héo gừng ở Quảng Nam vào tháng 1 năm 2007: (a) gừng với triệu chứng héo nhanh, (b) cây gừng bị vàng, dấu hiệu của héo chậm, (c) các ruộng gần nhau, một ruộng bị héo nhanh, một ruộng không có triệu chứng héo, (d) và (e) các mẫu cây được đào lên một cách cẩn thận bằng dao rựa, giữ cho hệ thống rễ còn nguyên, (f) túi mẫu với nhãn đánh số điểm lấy mẫu, tên nông dân và ngày lấy mẫu Phần 3. Quy trình chẩn đoán 37
39. Nghiên cứu cụ thể chẩn đoán 2 (tiếp theo) Trong phòng thí nghiệm Chuẩn bị mẫu cấy Rễ cây được rửa cẩn thận để loại bỏ đất bẩn. Sau đó kiểm tra mẫu cây và lấy các mẫu nhỏ lấy từ những phần bị bệnh trên cây đem vào phòng thí nghiệm để kiểm tra dưới kính hiển vi và phân lập tác nhân gây bệnh (Hình 3.5). Nhẹ nhàng rửa đất khỏi rễ Kiểm tra cây (lá, mầm, củ, rễ) và ghi lại triệu chứng Tuyến trùng nốt sưng (Meloidogyne sp.) có trong một số mẫu rễ Cắt củ ra khỏi rễ và thân Hình 3.5 Chuẩn bị và kiểm tra các mẫu cây bị bệnh héo gừng để chọn lọc mẫu cho phòng thí nghiệm 38 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
40. Nghiên cứu cụ thể chẩn đoán 2 (tiếp theo) Trong phòng thí nghiệm Phân lập các vi sinh vật có khả năng gây bệnh từ mô bệnh Chuẩn bị mẫu cấy Các củ gừng được khử trùng bề mặt, gọt vỏ và khử trùng bề mặt lần nữa. Từ mỗi củ cắt Rễ cây được rửa cẩn thận để loại bỏ đất bẩn. Sau đó kiểm tra mẫu cây và lấy các mẫu nhỏ lấy ra một lát, sau đó các miếng cấy nhỏ lại được cắt ra từ lát cắt trên và cấy lên môi trường từ những phần bị bệnh trên cây đem vào phòng thí nghiệm để kiểm tra dưới kính hiển vi và peptone PCNB (pentachloronitrobenzene) và môi trường chọn lọc cho Phytophthora. Lấy phân lập tác nhân gây bệnh (Hình 3.5). một miếng cấy nhỏ, dằm nát và dùng que cấy khuẩn cấy lên môi trường King's B để phân lập vi khuẩn (Hình 3.6). Củ được khử trùng bề mặt trong cồn êtylic 70% trong 5 giây và hơ qua lửa đèn cồn Củ được gọt vỏ (bỏ lớp ngoài) sau đó khử trùng bề mặt lần nữa trong cồn êtylic 70% Củ đã gọt vỏ được hơ qua lửa đèn cồn và một lát cắt được cắt ra ở phần củ giáp với thân lá, tất cả dụng cụ đều được khử trùng Năm miếng cấy nhỏ được cắt ra từ lát cắt, cấy hai miếng lên môi trường PPA và hai miếng lên môi trường PSM Miếng cấy còn lại được dằm nát trong nước vô trùng trên một lam kính và dùng que cấy khuẩn cấy lên môi trường King's B để phân lập vi khuẩn Hình 3.6 Quy trình phân lập các vi sinh vật có khả năng gây bệnh từ củ gừng Phần 3. Quy trình chẩn đoán 39
41. Nghiên cứu cụ thể chẩn đoán 2 (tiếp theo) Kết quả phân lập các tác nhân có khả năng gây bệnh Fusarium spp. đã được phân lập từ củ (Hình 3.7) của những cây có triệu chứng héo chậm - vàng lá và có tuyến trùng nốt sưng - ở một số điểm điều tra. Những mẫu nấm phân lập được làm thuần bằng cách cấy đơn bào tử và được giám định là Fusarium oxysporum. Các mẫu nấm F. oxysporum có hình thái giống hệt nhau trên môi trường thạch lá cẩm chướng và môi trường thạch đường dextrose khoai tây, chỉ ra rằng chúng có thể là nấm gây bệnh. (Các mẫu cấy của F. oxysporum hoại sinh thường có hình thái không đồng nhất.) Hình 3.7 Phân lập Fusarium oxysporum từ miếng cấy gừng trên môi trường chọn lọc (aga peptone pentachloronitrobenzene) cho Fusarium Không phân lập được Phytophthora từ củ gừng. Chẩn đoán nhanh Ralstonia solanacearum dùng Bộ Kít Pocket Diagnostic® cho kết quả dương tính đối với củ lấy từ ba cây có triệu chứng héo nhanh, chứng tỏ là vi khuẩn này có trong mô củ. Dùng Kít thử tương tự cho kết quả âm tính đối với củ từ một cây có triệu chứng héo chậm (héo vàng) - F. oxysporum đã được phân lập từ củ này. Nhiều khuẩn lạc khác nhau đã được phân lập từ môi trường King's B và không thể xác định một cách chính xác khuẩn lạc thuần R. solanacearum. Bởi vì các cây được lấy làm mẫu có những triệu chứng từ hiển nhiên đến rất nặng và đã phải chịu tình trạng đất rất ướt trước khi lấy mẫu, đây là điều kiện thuận lợi cho sự xâm nhập của các vi khuẩn không gây bệnh vào mô cây đã bị bệnh. Vì lý do trên, một thí nghiệm chỉ thị sinh học đã được tiến hành để tìm cách phân lập được vi khuẩn R. solanacearum (Hình 3.8). Mô bên trong của các củ lấy thêm từ những mẫu cây thu thập tại sáu ruộng trước đó đã được cắt thành từng miếng nhỏ và lắc kỹ với 30 mL nước vô trùng. Sau đó dung dịch này được đổ vào những lọ nhỏ và cắm vào đó các cây con 40 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
42. Nghiên cứu cụ thể chẩn đoán 2 (tiếp theo) cà chua và ớt vừa được cắt bỏ phần rễ và gốc thân (ớt và cà chua được dùng như cây chỉ thị để bẫy vi khuẩn). Các lọ nhỏ này được đặt trong nhà kính ở 25-30°C. Trong vòng 4-8 ngày, một số ngọn ớt và cà chua biểu hiện triệu chứng héo đi và thử thấy dịch khuẩn ứa ra. Những cây con đối chứng được cắm vào nước vô trùng vẫn khỏe bình thường. a b c d e Hình 3.8 Thí nghiệm chỉ thị sinh học để phân lập Ralstonia solanacearum từ củ gừng bị bệnh: (a) ngọn cây chỉ thị ở công thức đối chứng (trái) ngọn cây chỉ thị héo trong nước chiết từ các miếng gừng (phải), (b) ngọn ớt bị héo có triệu chứng hóa nâu ở mạch dẫn, (c) phân lập R. solanacearum từ ngọn ớt, (d) và (e) lây bệnh nhân tạo trên mướp đắng với vi khuẩn đã được phân lập từ cây chỉ thị. Phần 3. Quy trình chẩn đoán 41
43. Nghiên cứu cụ thể chẩn đoán 2 (tiếp theo) Một đoạn thân của mỗi cây chỉ thị bị héo được dầm nát trong nước vô trùng và dùng que cấy khuẩn cấy lên môi trường King's B. Sau đó, một khuẩn lạc từ môi trường này được cấy truyền để làm thuần và tiêm vào thân cây mướp đắng 6-tuần tuổi để đánh giá khả năng gây bệnh. Một số cây mướp đắng biểu hiện triệu chứng héo rũ và quá trình phân lập được lặp lại với những cây này để lấy mẫu vi khuẩn R. solanacearum thuần gửi đi giám định tại một trung tâm tiêu chuẩn quốc tế. Lây bệnh nhân tạo để xác định nguyên nhân chính gây bệnh Fusarium oxysporum f. sp. zingiberi đã được ghi nhận rộng rãi tại nhiều nước là nguyên gây bệnh héo Fusarium ở gừng. Tuy nhiên, những mẫu nấm F. oxysporum phân lập được từ gừng ở Quảng Nam cần được lây bệnh nhân tạo trên các giống gừng ở địa phương để chứng minh rằng đó là nấm gây bệnh chứ không phải nấm hoại sinh. Vì vậy, những mẫu Fusarium đại diện được cấy lên giá thể hạt kê/trấu để dùng cho việc lây bệnh nhân tạo. Bởi vì R. solanacearum cũng được biết đến là nguyên nhân gây ra bệnh héo vi khuẩn trên gừng, các mẫu R. solanacearum cũng được dùng lây bệnh nhân tạo trên các giống gừng địa phương để hoàn tất quy tắc Koch (tiêu chí dùng để thiết lập mối liên hệ nhân quả giữa tác nhân gây bệnh và bệnh). Để giám định chính xác tác nhân gây bệnh, các mẫu vi khuẩn R. solanacearum thuần cũng được gửi đi giám định tại một phòng thí nghiệm tiêu chuẩn quốc tế. Loài vi khuẩn này rất đa dạng, bao gồm nhiều chủng khác nhau gây hại trên các ký chủ khác nhau và đòi hỏi áp dụng các biện pháp luân canh cây trồng khác nhau để phòng trừ bệnh. Các mẫu tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne cũng được gửi tới một phòng thí nghiệm tiêu chuẩn để giám định loài một cách chính xác. Sau khi lây bệnh nhân tạo thành công Khi đã khẳng định được các vi sinh vật gây héo là nguyên nhân gây bệnh trên gừng, các cán bộ đã tìm kiếm nguồn gừng sạch bệnh trồng trên những ô trình diễn nhỏ nơi đất không có nguồn bệnh. Đất được coi là không có nguồn bệnh nếu các vụ cây trồng trước đó không có héo vi khuẩn (và tuyến trùng nốt sưng). Lưu ý rằng R. solanacearum có phổ ký chủ rất rộng. Mặc dù F. oxysporum f. sp. zingiberi chỉ gây ra bệnh trên gừng, nó có thể tồn tại ở rễ của những cây không phải là ký chủ và không biểu hiện triệu chứng. Vệ sinh tốt cho cây trồng là vô cùng cần thiết sao cho đất từ những ruộng có bệnh không được đưa vào ruộng sạch bệnh qua giầy dép và các dụng cụ làm ruộng. 42 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
44. 4 Triệu chứng bệnh Việc chẩn đoán bắt đầu bằng việc quan sát cẩn thận tất cả các bộ phận của cây bị bệnh - lá, hoa, quả, thân và rễ. Việc xác định tác nhân chính gây bệnh có thể sẽ rất khó khăn vì nhiều tác nhân gây bệnh không thể được nhận ra bằng mắt thường. Những tác động của tác nhân gây bệnh lên cây - triệu chứng - có thể giúp trong việc xác định sự có mặt của một hay nhiều tác nhân gây bệnh. Các triệu chứng của bệnh có thể gây ra bởi: • các mô của cây bị tổn thương • rối loạn các chức năng sinh lý của cây: – hấp thụ nước và dinh dưỡng – quang hợp – phát triển. Cần ghi chép cẩn thận các triệu chứng của bệnh trong một cuốn sổ nhật ký đồng ruộng và chụp lại triệu chứng bệnh bằng máy ảnh kỹ thuật số (nếu có thể). 4.1 Các triệu chứng thường gặp Các triệu chứng không điển hình thường gặp có thể có nguyên nhân từ nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau. Héo, ngả vàng và còi cọc là những triệu chứng không điển hình thông thường (xem những phần về tác nhân gây héo). Héo thường do các tác nhân gây héo mạch dẫn, thối rễ, sưng rễ, thối cổ rễ, thối thân cây và do đất quá khô. Những bệnh này và nhiều bệnh khác cũng có thể gây ra triệu chứng còi cọc và biến vàng. Vì vậy, cần thiết phải kiểm tra tất cả các bộ phận của cây - quan trọng nhất là rễ. Phần 4. Triệu chứng bệnh 43
45. Các tác nhân làm tổn thương rễ hoặc các mô thân – điển hình là nấm và tuyến trùng - làm rối loạn quá trình hấp thụ nước và dinh dưỡng gây hiện tượng héo, biến vàng và còi cọc, bắt đầu bằng việc cây sinh trưởng kém và khi bệnh phát triển, toàn cây héo, biến vàng và chết. Các bệnh héo vi khuẩn gây triệu chứng héo, chết cây và một số bệnh do virút cũng gây hiện tượng héo, còi cọc và cây chết. Các triệu chứng bệnh trên lá có thể do nấm (đốm và rụi lá), do vi khuẩn (đốm và rụi lá), và do virút ký sinh thực vật (khảm hoặc hoa lá, lá còi và lá bị cuốn lại). Virút cũng có thể gây ra các triệu chứng không điển hình (vàng lá, héo và còi cọc). Tuyến trùng ký sinh thực vật chủ yếu tác động đến hệ thống rễ, gây ra các vết thương trên rễ, sưng rễ, và rễ phân ly nhanh kèm theo các u sưng làm cho cây còi cọc, biến vàng, héo và đôi khi có thể chết cây. Một số triệu chứng có thể giúp xác định nguyên nhân gây bệnh bởi vì chúng là triệu chứng điển hình đối với một số tác nhân gây bệnh nhất định. Chẳng hạn như, triệu chứng nốt sưng trên rễ do Meloidogyne spp. (tuyến trùng nốt sưng) hoặc sưng rễ do Plasmodiophora brassicae, có thể dễ dàng chẩn đoán chính xác ngay trên ruộng. Cây họ đậu như lạc và đậu tương có các nốt sần ở rễ - những chỗ sưng nhỏ ở rễ gây ra do sự cộng sinh của vi khuẩn cố định đạm như Rhizobium spp. Những nốt sần này có lợi cho cây và quan trọng đối với sức khỏe của cây. Các nốt sần khỏe khi cắt ra thường có màu hồng. Do có rất nhiều các triệu chứng khác nhau có thể quan sát thấy trên đồng ruộng, các nhà bệnh cây cần kiểm tra các cây bị bệnh hết sức cẩn thận và ghi chép rõ ràng nhằm giúp cho việc chẩn đoán được chính xác. Hơn nữa, các nhà nghiên cứu bệnh cây cần đặt câu hỏi cho nông dân để lấy thông tin về lịch sử cây trồng và sự phát triển của bệnh. Một cây có thể bị vài tác nhân khác nhau gây hại, gây ra một loạt các triệu chứng bệnh. Các bệnh được nghi là do vi rút gây ra cần được chuyển đến một phòng thí nghiệm và kiểm tra bởi các chuyên gia về virút có kinh nghiệm trong việc giám định virút. Việc xác định chính xác tuyến trùng ký sinh thực vật, vi khuẩn gây bệnh và các tác nhân liên quan cũng đòi hỏi có sự kiểm tra của các chuyên gia. Ngược lại, nhiều nấm bệnh có thể được chẩn đoán một cách thành công trên đồng ruộng hoặc trong một phòng thí nghiệm cơ bản, miễn là có đầy đủ tài liệu tham khảo. 44 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
46. Tìm trợ giúp nếu bạn không tự tin trong việc xác định nguyên nhân của bệnh. Đừng phỏng đoán - lợi nhuận của nông dân sẽ phụ thuộc vào kết quả chẩn đoán và lời khuyên của bạn. Chỉ khoảng một nửa số mẫu gửi đến phòng thí nghiệm chẩn đoán là thực sự do các tác nhân gây bệnh gây ra. Cây có thể bị ảnh hưởng bởi các nhân tố khác như thuốc trừ sâu hoặc stress do môi trường. 4.2 Các bệnh trên lá, hoa hoặc quả Nhiều nấm gây các bệnh trên lá (lá, cuống lá và thân), hoa hoặc quả, và thường sản sinh ra các bào tử từ những cấu trúc tạo-bào-tử trên mô bệnh. Bào tử nhờ gió hoặc mưa phát tán đến các cây khác, khiến bệnh lan truyền. Nấm bệnh có thể tích lũy số lượng rất nhanh chóng và gây ra bùng phát dịch trong những điều kiện thời tiết thuận lợi . Sự có mặt của những cấu trúc tạo-bào-tử như quả cành hoặc quả thể, cành bào tử phân sinh hoặc cành mang bọc bào tử động là đặc điểm quan trọng cho việc giám định hình thái nấm bệnh và việc chẩn đoán bệnh do nấm gây ra. Dùng một kính lúp để giúp cho việc nhận dạng cấu trúc của nấm trên đồng ruộng. Tuy nhiên, để có thể xác định chính xác bào tử và các cấu trúc tạo thành bào tử phải dùng kính hiển vi trong phòng thí nghiệm. Nhiều nấm bệnh gây đốm (vết thương) trên lá, hoa hoặc quả. Đốm vàng là các vết bệnh do mất màu và đốm nâu là các vết bệnh chết hoại. Các đốm nâu được gọi là 'hoại tử' bởi vì nấm bệnh khi xâm nhập đã làm cho các mô bị chết. Các nấm bệnh gây vết thương trên lá, hoa và quả thường có thể phân lập được và phát triển được trong môi trường nhân tạo. Nấm hoại sinh cũng có thể mọc được trên các mô cây bị bệnh như là những nấm ký sinh bậc hai. Thí dụ như, các loài nấm hoại sinh của chi Alternaria và Pestalotia thường mọc trên mô lá bị bệnh và sản sinh bào tử trên mô. Những loài hoại sinh này có thể làm cho việc chẩn đoán bị sai lệch bởi vì chúng thường được nhìn thấy rõ dưới kính hiển vi và mọc rất nhanh trên môi trường phân lập. Phần 4. Triệu chứng bệnh 45
47. 4.2.1 Sự sản sinh bào tử trên lá bệnh Nấm có thể tạo thành các bào tử vô tính từ các sợi nấm chuyên hóa gọi là cành bào tử phân sinh. Trong các loài của Stemphylium, Botrytis, Aspergillus, Penicillium, Bipolaris, Alternaria và Cercospora, các cành bào tử phân sinh phát triển trên mô bệnh từ sợi nấm (Hình 4.1). Một số loài (như Septoria, Diaporthe, Didymella, Ascochyta và Phoma) sản sinh bào tử vô tính trong những cấu trúc đặc biệt gọi là quả cành, những loài khác (như Colletotrichum, Cylindrosporium) bào tử được sản sinh trong các cấu trúc gọi là đĩa cành. Bào tử sản sinh ra từ cành bào tử phân sinh trên bề mặt mô bệnh Stemphyllium Botrytis Aspergillus Penicillium Bipolaris Alternaria Cercospora Bào tử sản sinh ra từ đĩa cành Colletotrichum Cylindrosporium Bào tử sản sinh ra trong quả cành trên mô bệnh Septoria Diaporthe Didymella Ascochyta Phoma Hình 4.1 Sự hình thành bào tử trên lá của nhiều nấm bệnh khác nhau 46 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
48. Một số nấm bệnh cũng sản sinh ra bào tử từ những cấu trúc sinh sản hữu tính trên lá, thân hoặc quả. Thí dụ, Fusarium graminearum (Gibberella zeae) sản sinh ra bào tử túi trong một túi bào tử nằm bên trong quả thể trên thân và bắp ngô trưởng thành bị bệnh. Nấm này gây bệnh thối thân và bắp ngô. Quả thể có hình dạng tương tự quả cành, nhưng quả cành sinh ra bào tử vô tính và không có túi bào tử. 4.2.2 Nấm và các tác nhân giống nấm ký sinh chuyên tính trên lá Bệnh sương mai, phấn trắng và gỉ sắt do các loài nấm ký sinh chuyên tính gây ra. Những nấm bệnh này chỉ có thể xâm nhiễm, mọc và sản sinh bào tử trong mô ký chủ còn sống - chúng không thể phân lập được và không mọc trong môi trường nhân tạo - và thường chỉ có thể gây hại cho một hoặc hai loài hoặc giống ký chủ. Ví dụ, gỉ sắt lạc chỉ có thể gây hại cho lạc. a b c d Hình 4.2 Nấm bệnh và các tác nhân giống nấm gây bệnh trên lá: (a) phấn trắng trên bầu bí, (b) gỉ trắng trên cải bắp, (c) đốm lá Cercospora và gỉ sắt trên lạc, (d) sương mai trên cải bắp Phần 4. Triệu chứng bệnh 47
49. Những triệu chứng của bệnh sương mai, phấn trắng và gỉ sắt thường rất hiển nhiên (Hình 4.2). Chúng hấp thụ chất dinh dưỡng từ các tế bào cây sống, làm cho các mô bị vàng. Sự quang hợp trong mô lá bị giảm, dẫn đến hiện tượng cây kém phát triển. 4.2.3 Nấm bệnh sản sinh ra hạch nấm trên mô bệnh Trong điều kiện ẩm thấp, một số nấm bệnh sản sinh ra sợi nấm và/hoặc hạch nấm trên bề mặt cây bị bệnh. Sợi nấm của một số loài Rhizoctonia mọc ở gốc thân và lá bị bệnh. Ở Việt Nam, một số loài Rhizoctonia sản sinh ra hạch màu nâu có hình dạng bất định trên mô lá ngô và cải bắp bị bệnh (Hình 4.3a). Sclerotium rolfsii gây thối gốc thân trên nhiều rau màu hàng năm trong điều kiện thời tiết nóng ẩm ở Việt Nam. S. rolfsii sản sinh ra những sợi nấm màu trắng trên gốc thân bị bệnh và các hạch tròn nhỏ màu nâu (Hình 4.3b) hình thành từ những sợi nấm này. Sclerotinia sclerotiorum sản sinh ra các sợi nấm màu trắng và hạch to màu đen trên thân và lá của nhiều cây trồng lá rộng, như đậu cô ve lùn và cô ve leo, cà chua, cải bắp, khoai tây và xà lách (Hình 4.3c). a b c Hình 4.3 Hình thành hạch nấm bởi (a) Rhizoctonia solani, (b) Sclerotium rolfsii và (c) Sclerotinia sclerotiorum 48 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
50. 4.3 Các bệnh ở rễ, gốc và thân cây Nấm bệnh có thể gây bệnh nghiêm trọng cho rễ, cổ rễ (gốc thân) hoặc thân cây. Một số nấm bệnh chỉ gây hại cho cây con, làm cây con chết trước hoặc sau khi nảy mầm; một số loại khác chỉ gây hại ở rễ con, và một số loài chỉ gây hại trên thân (như Sclerotinia sclerotiorum và Sclerotium rolfsii). Các triệu chứng trên rễ có thể không điển hình. Thối rễ con, rễ chính, gốc hoặc thân phá hủy quá trình dẫn nước và dinh dưỡng, làm cho cây còi cọc, lá biến vàng, héo và đôi khi làm chết cây. Các chi nấm thường gây những bệnh này ở Việt Nam là Phytophthora, Pythium, Fusarium, Sclerotinia, Sclerotium, Rhizoctonia và Phoma (Hình 4.4). Một tác nhân ký sinh rễ, Plasmodiophora brassicae, gây ra sưng rễ họ thập tự, là loài ký sinh chuyên tính và không thể mọc trên môi trường nhân tạo. Nhóm nấm đảm Basidiomycota gây hại ở gốc và rễ những cây lưu niên (Shivas and Beasley 2005), nhìn chung khó phân lập trong môi trường nhân tạo. Nấm bệnh thối rễ có thể khó phân lập bởi vì có thể có nhiều nấm và vi khuẩn hoại sinh trong các mô rễ bị bệnh, các vi sinh vật hoại sinh này cũng có thể mọc trên môi trường phân lập - thường mọc lấn át các nấm bệnh. 4.4 Tài liệu tham khảo Shivas R. và Beasley D. 2005. Quản lý mẫu bệnh thực vật, Bộ Nông nghiệp, Thủy sản và Lâm nghiệp Australia. Tại: . Phần 4. Triệu chứng bệnh 49
51. c a b d e f g h Hình 4.4 Những bệnh ở gốc, rễ và thân: (a) sưng rễ họ thập tự, (b) héo trên họ thập tự (khỏe [trái] và bệnh [phải]) gây ra do sưng rễ (Plasmodiophora brassicae), (c) héo Fusarium trên cây cúc tây (chú ý đến sự hình thành khối bào tử trên thân), (d) teo thắt do Rhizoctonia sp., (e) thối rễ ớt do Phytophthora gây héo trầm trọng, (g) thối rễ và quả lạc do Pythium, (h) quả thể của Gibberella zeae gây ra thối thân ngô 50 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
52. 5 Trên đồng ruộng Nông dân và cán bộ bảo vệ thực vật huyện thường là những người đầu tiên phát hiện ra bệnh trên cây trồng. Sau đó họ có thể yêu cầu các cán bộ nghiên cứu bệnh cây xác định bệnh và tác nhân gây bệnh. Nếu mẫu bệnh được gửi tới phòng thí nghiệm chẩn đoán, nông dân hoặc cán bộ huyện cần lưu ý thu thập tất cả những thông tin liên quan và gửi kèm cùng với mẫu bệnh (Hình 5.1). Các cán bộ huyện có thể cung cấp thông tin về bệnh theo phiếu điều tra bệnh trên đồng ruộng (Phần 5). Tuy nhiên, tốt hơn hết là các cán bộ nghiên cứu bệnh cây cùng với cán bộ huyện đến tận nơi gặp gỡ nông dân và kiểm tra cây bệnh trên đồng ruộng. Các cán bộ bệnh cây có thể thu thập mẫu bệnh còn mới để giám định trong phòng thí nghiệm đồng thời thu thập thông tin về giống cây trồng, biện pháp canh tác, cây trồng vụ trước và dữ liệu khí hậu. Những thông tin này đặc biệt quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh cây. Một danh sách những dụng cụ cần thiết cho việc điều tra đồng ruộng của các cán bộ nghiên cứu bệnh cây được đưa ra ở Phần 5.1. Mẫu bệnh cần được bảo quản trong điều kiện mát và chuyển đến phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt để được kiểm tra chi tiết. Hình 5.1 Trao đổi với nông dân trên đồng ruộng Phần 5. Trên đồng ruộng 51
53. Disease Surveying: Field Notes Collector’s name: Collection date: Farmer’s details: Name: Phone: Address: Diseased sample: Type of sample collected: Crop species: Variety/rootstock: Source of seeds/plants: Plant maturity: Symptoms (compare with healthy specimens): Signs (evidence of the pathogen): Field observations: Percentage affected: Distribution/patterning: Paddock history: Other plant species present: Rainfall, irrigation events: Soil type: Association with terrian (slope of land): Where was the problem first observed: Chemical use (herbicides, insecticides, fungicides): Additional information (insect damage, other diseases): 52 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
54. Tên người lấy mẫu Mô tả triệu chứng bệnh (so sánh với mẫu khỏe): Có trồng chung với các loài cây khác không? trừ nấm Phần 5. Trên đồng ruộng 53
55. 5.1 Dụng cụ cần thiết cho công tác chẩn đoán trên đồng ruộng Cần chuẩn bị các dụng cụ cần thiết một cách cẩn thận trước mỗi đợt điều tra. Những dụng cụ sau đây rất cần cho việc lấy mẫu bệnh cây và ghi lại những thông tin liên quan. Nhiều dụng cụ trong danh mục này có thể được mua từ các chợ địa phương ở Việt Nam. Khung 5.1 là bản kiểm kê dụng cụ điều tra đồng ruộng (Hình 5.2). Cần có một sổ tay để ghi chép lại triệu chứng bệnh và những thông tin về cây trồng và lịch sử ruộng trồng. Một kính lúp cầm tay được sử dụng để kiểm tra các cấu trúc của nấm, như hạch nấm và quả cành. Một máy ảnh kỹ thuật số, nếu có, có thể dùng để ghi lại hình ảnh các triệu chứng của bệnh trên đồng ruộng. Nên có một số phong bì, túi giấy và bao ny lông các cỡ để đựng mẫu cây. Dùng bút dạ loại không xóa được ghi lại các thông tin quan trọng như tên và địa chỉ nông dân, địa điểm lấy mẫu và đánh số mẫu lên mặt ngoài của túi đựng mẫu. Các dụng cụ cắt khác nhau được dùng để lấy mẫu: • một dao rựa lớn để chặt các thân cây lớn (như chuối) hoặc thân gỗ (như cây bông), và để đào toàn bộ phần rễ cây cũng như thu thập những mẫu đất nhỏ • một dao rựa nhỏ để chặt các thân cành cứng nhỏ (như cây ớt) • hai hoặc ba dao nhỏ sắc dùng cắt thân mềm (như dưa hấu, cà chua) để kiểm tra bó mạch hóa nâu và dịch vi khuẩn, hoặc lấy mẫu dùng trong phòng thí nghiệm • kéo cắt cành để thu thập số lượng mẫu lớn. Khung 5.1 Bản kiểm kê dụng cụ điều tra đồng ruộng Sổ ghi chép và bút Dao và kéo cắt cành Máy ảnh kỹ thuật số Lọ thủy tinh nhỏ Kính lúp cầm tay Chai nước sạch Túi giấy, túi ny lông và phong bì Lọ rửa chứa cồn êthanol Bút dạ không xóa được Thùng đựng đá và chai nước đá (dự Dao rựa nhỏ và lớn trữ một số trong ngăn đá tủ lạnh) Nước uống và mũ nón Các dụng cụ này có thể dễ dàng được vận chuyển bằng xe máy. Các dụng cụ đào xới thường có thể mượn từ nông dân vì vận chuyển bằng xe máy thì cồng kềnh và nguy hiểm. 54 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
56. Cần đem theo một lọ thủy tinh nhỏ để kiểm tra dịch khuẩn từ thân cành của mẫu bệnh được nghi là héo vi khuẩn. Phải dùng nước sạch để rửa dụng cụ cắt và để dùng kiểm tra dịch khuẩn. Nên khử trùng bề mặt dụng cụ cắt bằng cồn êthanol 70% trước khi chuyển qua khu vực khác trên ruộng hoặc lấy mẫu cây khỏe. Cần có một thùng đựng nước đá bằng nhựa chắc để giữ cho mẫu bệnh được mát trong lúc di chuyển từ ruộng đến phòng thí nghiệm. Dùng các chai nước đá để giữ cho thùng mát và nên dự trữ sẵn các chai nước trong ngăn đá cho mục đích này. Mang nước uống và mũ nón khi đi điều tra cũng rất quan trọng, để tránh nắng và khát. Không được di chuyển từ ruộng này sang ruộng khác với giày dép, quần áo hoặc dụng cụ đã dính bùn. Bùn có thể chứa các tác nhân gây bệnh và đem theo chúng từ ruộng cây bị bệnh sang ruộng cây khỏe. Hình 5.2 Dụng cụ cần thiết khi điều tra đồng ruộng Phần 5. Trên đồng ruộng 55
57. 5.2 Tiến hành điều tra đồng ruộng Bước 1 Chuẩn bị dụng cụ điều tra (Phần 5.1) và liên hệ phương tiện đi lại. Bước 2 Thảo luận về bệnh với nông dân và cán bộ bảo vệ thực vật huyện. Bước 3 Bước chậm qua ruộng cây trồng và ghi nhận những loại triệu chứng bệnh hiện có trên ruộng, phân bố của bệnh và bất cứ yếu tố đất đai nào hoặc các yếu tố khác liên quan đến bệnh (xem các triệu chứng bệnh ở Phần 4). Khi bước qua ruộng cần quan sát cẩn thận các dấu hiệu tổn thương do côn trùng, sự hiện diện của các vectơ truyền virut, cỏ dại và tổn thương do thuốc bảo vệ thực vật. Trò truyện với nông dân về những quan sát của họ. Bước 4 Cẩn thận đào những cây bị bệnh ra khỏi đất và kiểm tra tất cả các bộ phận của cây để tìm các triệu chứng. So sánh cây bị bệnh với cây khỏe. Héo, còi cọc và lá chuyển vàng thường là dấu hiệu của bệnh gây hại ở rễ hoặc thân cây (xem Khung 5.2). Kiểm tra cẩn thận xem rễ có bị thối, có các vết loét, u sưng hay có sự hình thành nhiều rễ con ở một phần nào đó của bộ rễ không. Quan sát tìm cấu trúc nấm ở phần gốc thân, chẳng hạn như hạch nấm của Sclerotium rolfsii hoặc Sclerotinia sclerotiorum. Lá có dạng khảm hoặc đốm, ngả vàng, lá quăn, lá cuốn, cây còi cọc hoặc thấp lùn có thể là dấu hiệu của bệnh gây do virút gây ra. Một số virút cũng gây các triệu chứng giống như héo. Sử dụng kính lúp cầm tay kiểm tra các vết đốm trên lá để tìm các cấu trúc nấm như quả cành hoặc đĩa cành. Nấm phấn trắng, sương mai, và gỉ sắt cũng sinh sản trên bề mặt lá và tạo thành các khối bào tử nhìn rất rõ. Nấm sương mai thường phát triển ở mặt dưới lá. Ngược lại, nấm phấn trắng thường được thấy rõ hơn ở mặt trên lá. 56 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
58. Đốm lá với hình thái mọng nước, xanh trong giọt dầu thường là dấu hiệu của bệnh do vi khuẩn gây ra (xem Khung 5.3). Cắt ngang thân để kiểm tra sự hóa nâu của mạch dẫn, dấu hiệu của bệnh héo do nấm hoặc vi khuẩn. Kiểm tra thân cắt xem có dịch khuẩn không bằng cách nhúng phần thân cắt vào nước sạch (xem Khung 5.3). Nhiều bệnh có thể cùng gây hại ở các bộ phận khác nhau của cây cùng một thời điểm. Bước 5 Vẽ và ghi chép lại các triệu chứng bệnh bằng sơ đồ minh họa. Dùng kính lúp cầm tay quan sát cẩn thận để tìm các cấu trúc nấm và chụp ảnh. Khung 5.2 Phát hiện tuyến trùng Tuyến trùng có thể gây ra các triệu chứng không điển hình (còi cọc, biến vàng và héo) trên nhiều loại cây trồng. Những triệu chứng này xuất hiện do tuyến trùng làm giảm khả năng hấp thụ nước và chất dinh dưỡng từ rễ cây. Có thể nhận ra các dấu hiệu tổn thương do tuyến trùng gây ra bằng cách kiểm tra kỹ phần rễ cây (xem phần tuyến trùng). Mật độ tuyến trùng trong đất có thể được xác định bằng các phương pháp dựa vào sự di chuyển của tuyến trùng để tách rời chúng ra khỏi đất (ví dụ phương pháp dùng khay Whitehead hoặc phễu Baermann), hoặc các kỹ thuật thụ động (như sàng). Có thể nhận dạng tuyến trùng ký sinh qua sự có mặt của kim chích hút. Cấu trúc này có thể được quan sát dưới kính hiển vi hoặc kính lúp soi nổi loại tốt. Có một số các chi tuyến trùng khác nhau có thể gây bệnh cho cây trồng. Các tuyến trùng bệnh cây thông thường gồm có Meloidogyne spp. và Pratylenchus spp. Phần 5. Trên đồng ruộng 57
59. Bước 6 Thu thập mẫu bệnh để kiểm tra và phân lập tác nhân gây bệnh trong phòng thí nghiệm. Hầu hết các mẫu cây và đất, kể cả các mẫu gồm cả rễ và đất, cần được thu thập và bảo quản trong túi giấy. Mẫu đựng trong bao ny lông thường bị hấp hơi, kích thích sự phát triển của vi khuẩn hoại sinh, làm cản trở việc phân lập tác nhân gây bệnh. Các mẫu lá nhỏ tốt nhất nên được bảo quản trong một hộp nhựa nhỏ có lót giấy thấm. Ghi nhãn các mẫu cẩn thận và bảo quản chúng trong thùng nước đá khi vận chuyển. Bước 7 Phân tích thông tin đã thu thập từ nông dân, các ghi chép về triệu chứng bệnh và phân bố của bệnh để xác định tác nhân nào có khả năng gây bệnh nhất. Dùng kết quả phân tích này để định hướng cho công việc tiếp theo tại phòng thí nghiệm. Nếu có thể nên kiểm tra kỹ các mẫu bệnh trong phòng thí nghiệm trong vòng vài giờ sau khi lấy mẫu. Bước 8 Không bước vào phòng thí nghiệm khi vẫn mang quần áo hoặc giày dép vừa đi điều tra đồng ruộng về. Tắm và thay quần áo sạch trước khi vào phòng thí nghiệm. Khung 5.3 Phát hiện vi khuẩn gây bệnh Vi khuẩn gây bệnh cây chỉ có thể xâm nhiễm vào cây qua các lỗ hở tự nhiên, như các lỗ hổng ở mép lá và đầu rễ, hoặc qua các vết thương gây ra do côn trùng hoặc trong quá trình phát triển rễ phụ. Một khi đã vào trong cây, một số vi khuẩn gây bệnh có thể lan nhanh theo hệ thống mạch dẫn. Phương pháp kiểm tra dịch khuẩn là cách chẩn đoán nhanh xem cây có bị nhiễm vi khuẩn gây héo hay không. Phương pháp này giúp phân biệt nhanh giữa các bệnh héo do vi khuẩn và do nấm gây ra. Cắt một đoạn ngắn thân cây bệnh và nhúng vết cắt vào một lọ thủy tinh nhỏ đựng nước sạch. Nếu dịch khuẩn chảy ra từ vết cắt và nước trở nên vẩn đục sau vài phút thì khả năng cây đã bị vi khuẩn gây hại. Để kết quả kiểm tra có độ tin cậy cao hơn, nên lập lại thao tác tương tự dùng một đoạn thân từ cây khỏe làm đối chứng. 58 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
60. 6 Trong phòng thí nghiệm Trong phần này, các hướng dẫn được đưa ra nhằm trợ giúp các cán bộ mới vào nghề, giúp họ phát triển những kỹ năng cần thiết cho một cán bộ chẩn đoán bệnh cây, bao gồm các cách: • dùng kính hiển vi • phân lập • cấy truyền • làm thuần • giám định • lây bệnh nhân tạo. Với kinh nghiệm của mình, cán bộ chẩn đoán bệnh cây có thể thay đổi các quy trình sao cho có hiệu quả cao nhất. Các phương pháp bảo quản mẫu nấm sống, các công thức nấu môi trường nuôi cấy và quy tắc cũng như phương pháp khử trùng được trình bày ở Phụ lục 3. 6.1 Kiểm tra mẫu bệnh trong phòng thí nghiệm Những quy trình sau đây được áp dụng để kiểm tra những cây có triệu chứng héo, còi cọc và bệnh trên lá. Bước đầu tiên là xem xét cẩn thận toàn bộ cây và so sánh những quan sát này với những quan sát trên đồng ruộng. Phần 6. Trong phòng thí nghiệm 59
61. 6.1.1 Héo và còi cọc Nếu cây bị héo và còi cọc, khả năng có nguyên nhân từ bệnh héo do tắc bó mạch hoặc thối thân hoặc rễ. 1. Kiểm tra sự hóa nâu của mạch dẫn (a) Nếu mạch dẫn hóa nâu, có thể là bệnh héo do nấm hoặc vi khuẩn. Kiểm tra dịch khuẩn. • Nếu có dịch khuẩn, chuẩn bị đĩa cấy khuẩn. • Nếu không có dịch khuẩn, có thể là bệnh héo Fusarium hoặc Verticillium. Cấy phần thân hóa nâu ra đĩa để phân lập nấm. (b) Nếu mạch dẫn không hóa nâu, có thể là bệnh thối rễ hoặc thân do nấm thực hoặc một loài giống nấm hoặc tuyến trùng gây ra. (Ghi chú: nên kiểm tra thêm các triệu chứng do virút bởi vì một số virút gây bệnh cũng gây triệu chứng héo và còi cọc.) 2. Kiểm tra tìm hạch và sợi nấm (a) Nếu có hạch, tìm cách phân lập Sclerotinia sclerotiorum, S. rolfsii hoặc Rhizoctonia spp. dựa vào hình thái loại hạch quan sát được. (b) Nếu không có hạch, có thể là bệnh thối rễ, tuyến trùng hoặc sưng rễ ở cây họ thập tự. 3. Kiểm tra tìm bằng chứng bệnh tuyến trùng (nốt sưng rễ hoặc vết loét rễ). (a) Nếu có, tách tuyến trùng ra để xác định tác nhân gây bệnh và gửi đến một phòng thí nghiệm tuyến trùng để giám định loài. (b) Nếu không có, và có thối rễ (màu nâu), tìm cách phân lập nấm hoặc tác nhân giống nấm gây bệnh 6.1.2 Các bệnh ở lá Nếu lá có các dấu hiệu bệnh, kiểm tra vết bệnh dưới một kính lúp soi nổi. 1. Kiểm tra tìm triệu chứng khảm, vằn, lá cuốn hoặc lá còi. (a) Nếu có, có thể là bệnh do virút. Gửi mẫu bệnh đến một phòng thí nghiệm chẩn đoán virút thực vật. (Ghi chú: biến vàng và đốm cũng có thể do virút gây ra, chẳng hạn như virút đốm vòng đu đủ và virút đốm héo cà chua.) (b) Nếu không có, có thể tác nhân gây bệnh là nấm hoặc vi khuẩn. 2. Kiểm tra tìm đốm lá xanh trong dạng giọt dầu, cháy lá hoặc dịch khuẩn. (a) Nếu có, có thể tác nhân gây bệnh là vi khuẩn. Phân lập bằng cách cấy dịch khuẩn từ nhựa cây lên môi trường King's B. (b) Nếu không có, có thể tác nhân gây bệnh là nấm. 60 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
62. 3. Kiểm tra tìm các cấu trúc nấm dưới kính lúp soi nổi. Nếu được thực hành nhiều, nấm sương mai, gỉ trắng (Albugo candida), phấn trắng và gỉ sắt có thể được xác định bằng cách quan sát mẫu bệnh dưới kính lúp soi nổi và kính hiển vi. Do những nấm này đều ký sinh chuyên tính, chúng không thể phát triển trên môi trường nhân tạo. Nếu có các dấu hiệu của các nấm bệnh khác (sợi nấm, bào tử hoặc các cấu trúc sinh sản), cần chuẩn bị mẫu lam kính để quan sát dưới kính hiển vi. Các chi gây bệnh đốm lá thông thường có thể xác định được bao gồm Alternaria, Cercospora, Stemphylium, Septoria và Phomopsis. Có thể kích thích sự hình thành bào tử bằng cách để ẩm lá bị bệnh trong điều kiện có ánh sáng. Kiểm tra lá bệnh hàng ngày để tìm dấu hiệu của nấm bệnh. (Ghi chú: nấm và vi khuẩn hoại sinh mọc nhanh trong môi trường ẩm nên có thể dẫn đến việc chẩn đoán sai.) Cũng nên cấy mô bệnh ở mép ngoài của vết đốm lá lấy từ mẫu bệnh mới thu thập lên một môi trường nghèo dinh dưỡng để phân lập tác nhân gây bệnh (xem Phần 6.3). 6.2 Kính lúp soi nổi và kính hiển vi Kính lúp soi nổi và kính hiển vi là những thiết bị không thể thiếu được trong một phòng thí nghiệm chẩn đoán và cán bộ chẩn đoán bệnh cây cần phải làm quen với việc điều chỉnh, bảo dưỡng và sử dụng kính. 6.2.1 Sử dụng kính lúp soi nổi Kính lúp soi nổi được dùng để kiểm tra mẫu bệnh nhằm tìm ra các cấu trúc nấm nhỏ, như quả cành, đĩa cành, khối bào tử và quả thể với độ phóng đại thấp (tới khoảng ×100). Với kính lúp soi nổi, có thể dễ dàng lấy và chuyển những cấu trúc nấm trên sang lam kính để chuẩn bị cho việc quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại cao hơn (tới ×400). Một kính lúp soi nổi cũng được sử dụng cho các công việc tỉ mỉ như cấy đơn bào tử nảy mầm hoặc cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm trong quá trình làm thuần mẫu nấm, để kiểm tra tuyến trùng và chuyển chúng sang một lam kính để quan sát dưới kính hiển vi. Bằng cách này có thể xác định xem tuyến trùng có phải là ký sinh thực vật hay không. Kính lúp soi nổi cũng rất hữu ích trong việc kiểm tra các tản nấm đang phát triển (Hình 6.1). Mỗi kính lúp soi nổi cần có một gương gắn vào có thể điều chỉnh độ nghiêng để cung cấp ánh sáng thẳng và chéo góc cho các mẫu có độ tương phản ánh sáng thấp. Lý tưởng nhất là kính có gắn nguồn ánh sáng dùng để rọi sáng phía trên bề mặt mẫu, tuy nhiên nếu không có cũng có thể khắc phục bằng cách dùng một nguồn sáng riêng rẽ bên ngoài. Phần 6. Trong phòng thí nghiệm 61
63. Hình 6.1 Kiểm tra các tản nấm dưới kính lúp soi nổi 6.2.2 Sử dụng kính hiển vi Cần tuân thủ cẩn thận các chỉ dẫn đi kèm theo kính hiển vi để đảm bảo kính được dùng đúng cách và tránh hư hại. Điều quan trọng là không được để vật kính bị xước hoặc chạm vào mặt thạch, nấm hoặc các mẫu nhuộm. Các miếng lamen thường rất mỏng và, nếu vỡ, có thể làm đứt tay. Điều chỉnh kính hiển vi 1. Đặt một lam kính chứa mẫu trên bàn giữ của kính hiển vi. 2. Bật đèn và điều chỉnh ánh sáng đến khoảng 50% độ sáng. 3. Chỉnh mẫu thật nét với vật kính ×10. 4. Đóng màng ngăn quang trường của kính cho nhỏ lại. 5. Chỉnh độ nét màng ngăn quang trường bằng cách thay đổi độ cao của tụ kính. 6. Xoay hai nút chỉnh trung tâm tụ sáng cho đến khi ảnh của màng ngăn quang trường ở trung tâm - chi tiết này rất quan trọng! 7. Mở màng ngăn quang trường cho đến khi vừa ra khỏi tầm nhìn (nghĩa là cho đến khi vừa lớn hơn khung nhìn một chút). 8. Chỉnh màng chỉnh độ mở để nhìn rõ mẫu. Số chỉnh (số độ mở) trên màng chỉnh độ mở nên vào khoảng 75% của số độ mở vật kính đang sử dụng. 9. Quan sát mẫu (Hình 6.2 và 6.3). 62 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
64. 6.2.3 Chuẩn bị mẫu lam kính Các mẫu bào tử nấm hoặc cấu trúc tạo bào tử như túi quả cành, quả thể bầu hoặc quả thể kín có thể được cố định trên lam kính trong nước. Cố định mẫu trong nước 1. Nhỏ một giọt nước cất nhỏ lên lam kính. 2. Đặt mẫu vào vị trí giọt nước, dưới một kính lúp soi nổi. 3. Đặt lamen sao cho một cạnh chạm lam kính gần mép giọt nước. 4. Từ từ hạ cạnh bên kia của lamen xuống sao cho lamen trùm lên trên giọt nước - phương pháp này giúp đẩy các bọt khí ra khỏi mẫu lam. 5. Dùng một miếng giấy thấm hoặc giấy lọc để thấm đi phần nước thừa phía ngoài lamen. Các bào tử từ cây bị bệnh hoặc mẫu nấm được nuôi cấy nhân tạo có thể được lấy ra dùng một que cấy và đặt vào vị trí giọt nước. Các cấu trúc tạo bào tử lớn hơn cần được kiểm tra dưới kính lúp soi nổi, sau đó được đặt vào một giọt nước và làm dẹp bằng cách dùng một dụng cụ có bề mặt phẳng ép nhẹ lên lamen. Khi kiểm tra lại bằng mẫu lam, có thể phân biệt được quả cành và quả thể: quả cành chỉ chứa bào tử phân sinh trong khi cả quả thể kín và quả thể bầu chứa cả túi bào tử và bào tử túi. Hình 6.2 Quan sát bào tử nấm dưới kính hiển vi Phần 6. Trong phòng thí nghiệm 63
65. Vật kính Bàn giữ Tụ kính Nút chỉnh độ mở màng chỉnh Nút chỉnh trung tâm tụ kính Nút chỉnh độ nét Nút chỉnh bàn giữ Vòng chỉnh độ mở quang trường Thị kính Vật kính Bàn giữ Tụ kính Nút chỉnh độ mở màng chỉnh Nút chỉnh trung tâm tụ kính Vòng chỉnh Chỉnh tụ điểm thô và độ mở quang chính xác trường Nút chỉnh bàn giữ Hình 6.3 Các bộ phận của kính hiển vi 64 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
66. Các cấu trúc với mô mềm, như quả thể đĩa của Sclerotinia sclerotiorum, cần dùng lưỡi dao cạo ướt hoặc dao mổ cắt thành những lát mỏng rồi đặt vào vị trí giọt nước để làm mẫu lam. 6.3 Phân lập nấm gây bệnh Không cần phải tuân thủ một cách chính xác những kỹ thuật phân lập nấm gây thối rễ, thân và lá sau đây, mà có thể sử dụng những kỹ thuật này làm định hướng và thay đổi chúng tùy theo từng tác nhân gây bệnh và cây trồng cụ thể sao cho có kết quả tốt nhất. Điều quan trọng là học hỏi và tích lũy kinh nghiệm bằng cách thử nghiệm các phương pháp khác nhau. Cán bộ làm công tác chẩn đoán bệnh cây nên tham dự các khóa tập huấn về các kỹ năng trong phòng thí nghiệm nếu họ chưa từng được tập huấn về các kỹ năng này trước đây. Điều quan trọng là học cách phân biệt giữa các loài gây bệnh và với các loài hoại sinh thông thường. Thực hành quy trình phân lập và cấy truyền với một loạt các nấm bệnh khác nhau. Các kỹ thuật phân lập có thể được cải thiện bằng cách: • thay đổi thời gian khử trùng bề mặt mẫu bệnh • gọt bỏ lớp ngoài mẫu bệnh • điều chỉnh thành phần môi trường nuôi cấy (chẳng hạn như pH, dinh dưỡng và nồng độ aga) • thêm kháng sinh vào môi trường. Cồn êtyl (70%) là chất khử trùng bề mặt chuẩn cho các dụng cụ phòng thí nghiệm và các mẫu bệnh. Dung dịch Javen cũng có thể được dùng làm chất khử trùng bề mặt, nhưng thường mất tác dụng nếu để lâu và tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng. Luôn luôn thấm khô mô bệnh trên giấy thấm đã được khử trùng trước khi phân lập. Phần 6. Trong phòng thí nghiệm 65
67. Chọn mô mới bị bệnh để phân lập. Không nên sử dụng các mô đã bị bệnh lâu bởi vì trên bề mặt các mô bệnh này thường có rất nhiều nấm và vi khuẩn hoại sinh phát triển. Bề mặt của mô cây thường có nhiều nấm và vi khuẩn hoại sinh, chúng cần phải được tiêu diệt trước khi có thể phân lập tác nhân gây bệnh. Nhiều loại nấm và vi khuẩn hoại sinh mọc rất nhanh trên môi trường phân lập, vì thế rất khó để phân lập tác nhân gây bệnh. Không dùng môi trường thạch đường khoai tây (PDA) hoặc môi trường giàu hydrat cacbon để phân lập nấm từ các mô cây bị bệnh, nhất là nếu phân lập từ rễ. Nấm và vi khuẩn hoại sinh mọc rất nhanh trên các môi trường giàu hydrat cacbon và ức chế sự phát triển của nấm bệnh mọc chậm hơn. Sự thành công trong việc phân lập nấm từ mô cây bị bệnh phụ thuộc vào một số yếu tố: • loại mô bị bệnh (lá, thân, rễ) • phương pháp khử trùng bề mặt • thao tác cấy • môi trường phân lập • các điều kiện nuôi các đĩa phân lập. Kinh nghiệm quá khứ là một công cụ vô giá trong việc lựa chọn quy trình phân lập phù hợp. Kinh nghiệm thường giúp phán đoán loại nấm gây bệnh nào có khả năng gây ra các triệu chứng đặc biệt nào đó. Khi còn nghi ngờ, nên lấy thông tin từ các cơ sở dữ liệu bằng hình ảnh, sổ lưu thông tin mẫu bệnh và các tài liệu đã phát hành. 6.3.1 Phân lập từ lá và thân Việc phân lập từ thân thường được cải thiện bằng cách gọt bỏ phần vỏ hoặc các mô thân bên ngoài trước khi khử trùng bề mặt. Các bước cơ bản phân lập từ lá hoặc thân 1. Lau sạch bàn làm việc bằng cồn êtyl 70% 2. Nhúng dụng cụ (kẹp và dao hoặc dao mổ) trong cồn êtyl 70% và hơ khô trên ngọn lửa. (Cồn mêtyl có thể được dùng thay cho cồn êtyl.) 3. Rửa mẫu lá hoặc thân trong nước để loại bỏ đất bụi và các tạp chất khác. 66 Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam