Giáo trình Cơ sở di truyền tính chống chịu đối với thiệt hại do môi trường của cây lúa (Phần 2)

Nội dung text: Giáo trình Cơ sở di truyền tính chống chịu đối với thiệt hại do môi trường của cây lúa (Phần 2)

1. Chương 5 CƠ SỞ DI TRUYỀN TÍNH CHỐNG CHỊU ĐỘ ĐỘC NHÔM Năng suất cây trồng trên đất acid, đất phèn bị ảnh hưởng rất đáng kể do nhiều yếu tố: (1) độ độc sắt, (2) độ độc nhôm, (3) độ pH thấp, (4) thiếu lân, v.v Trong chương này, chúng ta đề cập đến tính trạng chống chịu độ độc nhôm của cây trồng trên đất chua (pH thấp), hoặc đất phèn (pH thấp, nhiều lưu hùynh, như đồng bằng sông Cửu Long) Độ độc nhôm được xem như yếu tố hạn chế chính đối với sự tăng trưởng của cây trồng (Kochian 1995). Người ta chưa biết nhiều về cơ chế chống chịu độ độc nhôm của cây trồng ở mức độ sinh học phân tử. Trong các loài mễ cốc, cây lúa mạch đen (rye) được xem như là cây có tính chống chịu độ độc nhôm tốt nhất. Aniol và Gustafson (1984) phát hiện tính chống chịu này ở cây lúa mạch đen, được điều khiển bởi những gen chủ lực định vị trên nhiễm sắc thể 3R và 6R, với những gen khác định vị trên nhiễm sắc thể 4R. Hai loci trội: Alt1 trên nhiễm thể số 6R và Alt2 trên nhiễm thể số 4R, đã được thiết lập bản đồ (Gallego và ctv. 1998, Miftahudin và ctv. 2002). Đối với lúa mì, tính trạng này được điều khiển bởi 2-3 gen trội hoặc đa gen (Aniol và Gustafson 1984). Người ta đã xác định được một gen chính AtlBH điều khiển tính trạng chống chịu độ độc nhôm, định vị trên nhiễm sắc thể 4DL, đóng góp 85% biến thiên kiểu hình (Riede và Anderson 1996). Tang và ctv. (2000) đã thiết lập bản đồ một gen điều khiển tính chống chịu nhôm trên một nhánh vai của nhiễm thể 4H của lúa mạch (barley), liên kết với marker Xbcd117, khoảng cách liên kết là 2,1 cM, liên kết với marker Xwg464 và Xcdo1395, khoảng cách liên kết là 2,1 cM. Đối với cây bắp, nhiều phòng thí nghiệm cũng đã tiến hành nghiên cứu tính trạng chống chịu độ độc nhôm, họ ghi nhận tính trạng này do đa gen điều khiển (Magnavaca và ctv. 1987). Nghiên cứu tính trạng này trong cây lúa vẫn còn ít báo cáo. Sử dụng kỹ thuật phân tử, Wu và ctv.(2000) đã xác định được nhiều QTL có liên quan đến tính chống chịu nhôm, trong một quần thể cận giao ngẫu nhiên của tổ hợp lai IR1552 / Azucena. Nguyễn và ctv.(2001) đã phát hiện 5 QTL điều khiển tính chống chịu nhôm, định vị rãi rác trên 5 nhiễm sắc thể, với một QTL chính thức định vị trên nhiễm thể số 1. Nguyễn và ctv. (2002) tìm thấy 10 QTL định vị trên 9 nhiễm sắc thể điều khiển tính chống chịu nhôm, trên cơ sở quần thể lưỡng bội kép (DH) của tổ hợp lai CT9993 / IR62266. Những phát hiện này khẳng định rằng: tính chống chịu độ độc nhôm là một tính trạng phức tạp Ðối với cây lúa, trước đây, người ta nghĩ rằng rễ lúa trong đất acid phải tiếp xúc và bị ngộ độc bởi ion H+, nhưng hiện nay người ta cho rằng chính ion Al3+ là tác nhân (Coronel 1980, Thaworuwong và van Díet 1974). Trong các thí nghiệm của tác giả, với pH từ 3.5 - 5.0, không thấy ảnh hưởng độc hại rễ lúa nếu không có sự hiện diện của nhôm. Chính sự phát triển của rễ lúa là chỉ tiêu quan sát dễ nhất ở các nồng độ gây độc hại của nhôm. Thông thường, độ gây độc hại của nhôm không xuất hiện ở pH lớn hơn 5,5 (Mc Cart và Kaprath 1965), mà chỉ gây thiệt hại trầm trọng ở pH nhỏ hơn 5,0. Kỹ thuật thanh lọc tính chống chịu độ độc nhôm trong môi trường dinh dưỡng có nhiều thuận lợi hơn thanh lọc ngay trên đất acid, bởi vì rất khó kiểm tra được nồng độ nhôm một cách chính xác trong đất (Froy 1974, Howeler và Cadavid 1976, Martinez 1976), chưa nói sự thay đổi pH làm ảnh hưởng đến dạng nhôm hoà tan và mức độ gây độc hại trong đất (Moore 1974).
2. Có 3 kỹ thuật thanh lọc nhôm trong môi trường dinh dưỡng: chiều dài rễ tuyệt đối, sự phục hồi sinh trưởng của rễ và nhuộm màu khi phản ứng với hematoxylin. Nhưng kỹ thuật đo chiều dài rễ tuyệt đối được áp dụng phổ biến nhất (Coronel 1980). Sau khi có được chiều dài tuyệt đối (MRL), người ta còn dùng phép tính chiều dài rễ tương đối (RRL) để làm giảm bớt sự sai biệt về di truyền của sự sinh trưởng rễ lúa (Coronel 1980). Khái niệm về chiều dài tương đối (RRL) được xem như là tỷ số của chiều dài rễ ở 2 mức độ nhôm khác nhau. Chiều dài rễ ở nồng độ 30 ppm Al RRL= Chiều dài rễ ở nồng độ 0 ppm Al Hiện tượng đầu tiên của cây trồng khi bị độ độc của nhôm là sự kéo dài của rễ bị ức chế. Rễ bị thương tổn trong điều kiện nồng độ nhôm cao, biểu hiện thông qua các triệu chứng như sau: ngắn, dầy, sậm màu, dòn dễ gãy, ít đâm nhánh, chiều dài tổng số của rễ và thể tích rễ cây giảm rõ rệt. Độ độc nhôm còn có thể ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của chồi thân, thông qua sự giới hạn di chuyển chất dinh dưỡng, và nước do hiện tượng hấp thu hoặc truyền dẫn qúa kém 5-1. GIỐNG LÚA NƯỚC SÁU CHỐNG CHỊU ĐỘ ĐỘC NHÔM Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Hầu hết các vùng lúa nước sâu ở ĐBSCL là đất phèn, nồng độ sắt và nhôm cao, gây độc hại cho cây lúa ở giai đoạn mạ trước khi mưa ngập, đặc biệt trong điều kiện mưa thất thường (van Breeman 1978, Võ Tòng Xuân và ctv 1982). Cây lúa chịu tác dộng của nhiều yếu tố cùng một lúc, chẳng hạn như sự thiếu lân, thừa sắt, nhôm và các hợp chất có chứa lưu huỳnh (S) trên đất phèn. Các biểu hiện về triệu chứng gây độc này rất phức tạp, vì sự tác động có tính chất tổng hợp của nó. Tính chống chịu độ độc nhôm của các giống lúa nước sâu phổ biến ở ĐBSCL đã được phân tích. Thí nghiệm được thực hiện tại IRRI, trong phytotron, nhiệt độ 29/21oC (ngày/đêm), ẩm độ tương đối 70%. Hàm lượng nhôm cho vào môi trường dinh dưỡng là 0 ppm và 30 ppm lấy từ dung dịch IM (AlCl3, 6H2O) Sau khi có được chiều dài tuyệt đối (MRL), người ta còn dùng phép tính chiều dài tương đối (RRL) để làm giảm bớt sự sai biệt về di truyền của sự sinh trưởng rễ lúa (Coronel 1980). Áp dụng phép thử chi bình phương về sự đồng nhất của phương sai (Gomez 1984), chúng tôi xếp nhóm những giống có tính chống chịu độ độc nhôm từ khá, trung bình đến nhiễm, so với giống đối kháng (bảng 1). Bảng 1. Chiều dài rễ tuyệt đối của các giống kháng ở nồng độ 0 và 30ppm Al trong môi trường dinh dưỡng (Buu 1987). Giống Chiều dài rễ (cm) RRL 0ppm Al 30ppm Al Leb Mue Nahng 13.75±1.65 9.37±0.61 0.68 Tàu nút (Lúa giáng) 10.30±1.34 7.04±1.57 0.68 Ba sào 10.05±1.41 4.43±0.97 0.65 Khao Daeng 13.19±1.42 8.44±1.10 0.64 Habiganj Aman 1 13.78±0.95 8.81±0.39 0.64
3. Nàng phước 12.18±1.72 7.71±1.76 0.63 HTAFR 77022-14-157-6-1 10.83±1.91 6.78±0.38 0.63 Sa quay 10.93±1.47 6.85±1.33 0.63 IR 11185-RRR-88-2 11.36±1.63 7.13±1.09 0.63 Ba chúc 9.30±0.89 5.78±0.93 0.62 IAC3 (ĐC kháng) 20.36±2.41 16.51±2.71 0.81 IR45 (ĐC nhiễm) 14.84±1.3 6.11±1.76 0.41 RRL: chiều dài rễ tương đối (relative root length) Ở bảng 1, các giống kháng có giá trị RRL đồng nhất (χ2=0,416, p=0,50). Giống Leb Mue Nahng 111 (LMN111), Habiganj Aman1, Khao Daeng và Ba sào đều được cả hai tiêu chuẩn về chiều dài tuyệt đối và tương đối. Các giống lúa nổi Ba sào (Đồng Tháp Mười), Nàng Phước (Tứ giác Long Xuyên) đều thể hiện tính kháng độ độc nhôm rất tốt. Giống Ba chúc và Tàu nút phổ biến ở vùng Tây Sông Hậu và Tứ Giác Long Xuyên cũng thể hiện tính kháng nhôm. Giống Sa quay thuộc nhóm lúa mùa sớm - phổ biến ở An Biên (Kiên Giang), trồng trên đất nhiễm mặn và than bùn, cũng đuợc ghi nhận có tính kháng. Khao Daeng - giống lúa nước sâu gạo đỏ của Thái Lan và giống lúa nổi LMN111 - trước đây được ghi nhận kháng nhôm rất khá (HilleRisLambers và Sittiyos 1985), cũng thể hiện kết quả tương tự trong thí nghiệm này. Dòng lúa nước sâu triển vọng IR11185-RRR-8-2 từ tổ hợp lai IR2070-414- 39/LMN111 được ghi nhận có tính kháng giống như LMN111. 39 dòng giống có giá trị RRL lớn hơn trung bình mẫu được liệt kê ở bảng 3 và được xếp nhóm theo sự đồng nhất về phương sai. Mức độ phản ứng đối với nồng độ nhôm ở 30 ppm thể hiện rất rõ (χ2=14.37). Không ghi nhận triệu chứng độc hại trên lá già. Các giống lúa nổi Nàng tri, Nàng đùm nhỏ, Nàng đùm to (Đồng Tháp Mười), Nàng Tây, Nàng son (Tứ Giác Long Xuyên) có phản ứng hơi kháng. Giống phổ biến trên vùng Tây Sông Hậu là Trắng Chùm, Trắng Lựa cũng có phản ứng hơi kháng. Giống Trắng lùn, Lúa Thước phổ biến trên đất phèn bị nhiễm mặn cho thấy có phản ứng nhiễm. Thực hiện cân trọng lượng khô bằng cách sấy mẫu trong tủ định ôn 150 0F trong 4 ngày. Cân riêng mẫu rễ lúa và mẫu chồi thân (Bảng 2) Nhìn chung trọng lượng khô của chồi và rễ đều có xu hướng giảm ở nồng độ 30 ppm Al, nhưng kết quả không rõ ràng như quan sát chiều dài rễ. Áp dụng khái niệm về chiều dài rễ tương đối (RRL) là phương pháp thanh lọc nhôm đơn giản và hiệu quả hơn hết. Trong thí nghiệm này, tương quan giữa RRL và chiều dài rễ tuyệt đối (MRL) rất chặt chẽ (hình 5-1) r = 0,798 (n=107) y= 0,039 x + 0,215 Hình 5-2 và 5-3 cho thấy, sự biến thiên của trọng lượng chất khô thường lớn hơn nhiều so với biến thiên về chiều dài. Do đó phương pháp đo chiều dài rễ để quan sát phản ứng chống chịu với độ độc nhôm có thể cho biết kết quả chính xác hơn cân trọng lượng khô. Bảng 2: Trọng lượng khô của rễ và chồi của các giống kháng ở 2 nồng độ nhôm 0ppm và 30ppm (Buu 1987).
4. Giống Trọng lượng rễ (mg/cây) Trọng lượng chồi (mg/cây) 0ppm Al 30ppm Al 0ppm Al 30ppm Al Leb Mue Nahng 22,2 20,2 53,2 48,5 Tàu nút (lúa giáng) 14,1 16,2 15,1 61,6 Ba sào 22,3 21,5 53,6 50,9 Khao Daeng 21,6 26,8 63,6 59,8 Habiganj Aman 1 20,9 16,5 55,5 40,8 Nàng phước 17,1 10,2 35,3 26,1 HTAFR 77022-14-157-6-1 13,0 15,3 30,4 38,0 Sa quay 21,6 18,0 65,7 51,5 IR 11185-RRR-88-2 16,4 18,1 38,5 43,4 Ba chúc 16,8 15,0 52,2 55,1 IAC3 (ĐC kháng) 28,6 27,3 53,2 59,4 IR45 (ĐC kháng) 30,5 17,3 56,7 39,5 Thí nghiệm nhuộm hematoxylin ở rễ lúa cũng khó so sánh và kết luận. Cần tiếp tục thanh lọc và ghi nhận mức độ phổ biến của từng giống lúa trên những loại đất phèn khác nhau (Sulfaquepts), kết hợp với sự thanh lọc độ độc sắt để có những kết luận tiếp theo giúp cho sự bố trí cơ cấu giống hợp lý và xác định mục tiêu lai tạo phù hợp cho từng vùng. Bảng 3a. Danh sách các dòng giống có RRL lớn hơn trung bình mẫu (Bửu 1987) Hạng Dòng giống RRL χ2 1 Leb Mue Nahng 111 0.68 0.416 2 Tàu nút (lúa giáng) 0.68 3 Ba saìo 0.65 4 Khao Daeng 0.64 5 Habigan j Aman 1 0.64 6 Naìng phæåïc 0.63 7 HTAFR 77022-14-157-6-1 0.63 8 Sa quay 0.63 9 IR1185-RRR-88-2 0.63 10 Ba chuïc 0.62 11 Nàng đùm nhỏ 0.60 3.361 12 Nàng đùm to 0.60 13 BGD4-7-3PE-1-12 0.60 14 Nàng tây 0.60 15 Habiganj Aman 8 0.58 16 FR13A 0.57 17 SPR7411-7-2-1 0.57 18 Cù là 0.56 19 Jhora 0.56 20 Trắng lựa 0.56 21 Nàng tây 0.56 22 Nàng tri 0.55 23 IR33277-1-507-1-13 0.55 24 IRRS 43/3 0.54 25 BKN 6986-1 0.54 26 IR5853-196-1-1 0.54 27 Baisbish 0.53 4.193 28 HKNPR 76010-108-2-0 0.53 29 SPR 7294-136-2-4-1-0-8-2 0.53 30 IR31086-12-1-3-3-1 0.53 31 Khama 0.53 32 Khao Dawk Mali 105 0.53
5. 33 Tàu nút 0.53 34 Huyết rồng D10 0.52 35 Nàng tây C 0.52 36 Nàng sen 0.52 37 IR28932-9-3-3 0.52 38 Trắng chùm 0.51 39 IR11288-B-B-69-1 0.51 x= 0.49 ± 0.02 MRL () Hình 5-1: Tương quan giữa chiều dài tuyệt đối (MRL) và chiều dài rễ tương đố i (Buu 1987) Hình 5-2: Biến thiên chiều dài rễ tương đối (RRL) và trọng lượng khô của rễ tương đối (RRW) ở nồng độ 30ppm Al của 2 giống đối chứng (Bửu 1987)
6. Hình 5-3: Biến thiên chiều dài rễ tuyệt đối (MRL) và Trọng lượng rễ (DRW) ở nồng độ 30ppm Al của 2 giống đối chứng (Bửu 1987) Bảng 3b: Kết qủa thanh lọc nhôm bộ giống lúa được sưu tập từ nhiều quốc gia (Khatiwada và ctv. 1996), giá trị RRL được theo thứ tự từ cao xuống thấp. Giống Nguồn gốc RRL (trung bình của 2 lần lập lại) Siyam Kuning Indonesia 1.159 Gudabang Putih “ 1.135 Siyam “ 1.105 Lemo “ 1.088 Khao Deang Thái Lan 1.083 Siyamhalus Indonesia 1.059 Bjm-12 “ 1.058 Ketan “ 1.056 Seribugangtang “ 1.050 Bater Raden Rati “ 1.047 Padi Kanji “ 1.043 Bjm-13 “ 1.040 Batang Pane “ 1.039 Bjm-14 “ 1.038 Cà Đung đỏ Việt Nam 1.037 Bjm-10 Indonesia 1.035 Padi Jambi ” 1.032 Gablak Cablak “ 0.956 Barito “ 0.944
7. Engatek Malaysia 0.930 Bjm-15 Indonesia 0.928 Siyam Kuning Indonesia 0.925 Quisidugo “ 0.922 Lúa Thước Việt Nam 0.918 Gudabang Kuning Indonesia 0.916 Bjm-17 “ 0.903 Kutik Putih “ 0.902 Kapuas “ 0.886 Baiang 6 “ 0.886 Pontianak “ 0.853 Nàng Côi Việt Nam 0.850 Bayar Kuning Indonesia 0.848 Bjm-11 “ 0.845 Trắng Hòa Bình Việt Nam 0.845 Alabio Indonesia 0.807 Khao Seetha Thái Lan 0.807 Gaw Diaw Bow Indonesia 0.801 Khao Taeng Thái Lan 0.800 Lúa Thước Cồ Việt Nam 0.794 Talang A Indonesia 0.784 Mahakam “ 0.783 Galambong “ 0.773 Tài Nguyên Việt Nam 0.768 Ketumbar Indonesia 0.742 Thơm Rằn Việt nam 0.738 Talang B Indonesia 0.729 Đuôi Trâu Việt Nam 0.701 Cà Đung Phèn “ 0.700 Gogo Ranceh Indonesia 0.698 Đốc Phụng Việt Nam 0.676 Nàng Gáo “ 0.671 Masirit Indonesia 0.670 Kapus “ 0.622 Yaca West Africa 0.661 S-1 “ 0.659 Atanha “ 0.623 Nàng Co Việt Nam 0.623 Thần Nông Đỏ “ 0.621 Pokkali India 0.617 Sóc nâu Việt Nam 0.587 Silla West Africa 0.573 S-4 “ 0.450 IRAT104 (chuẩn 0.828 kháng) 0.572 IR1552 (chuẩn nhiễm) CV % 12.50 LSD 0,05 0.213 5-2. XÁC ĐỊNH QTL ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHỊU ĐỘ ĐỘC NHÔM Bảy và ctv. (2003) đã sử dụng 171 dòng F6 (dòng cận giao tái tổ hợp = RILs) được chọn một cách ngẫu nhiên từ 312 dòng của tổ hợp lai IR64 / Oryza rufipogon (acc. 106424). Mẫu giống lúa hoang Oryza rufipogon này được thu thập từ Tràm Chim (Đồng Tháp Mười), nơi được xác định là đất phèn nặng. Các dòng RIL được tạo ra thông qua phương pháp chọn lọc SSD (single seed descent) cho đến F6 tại IRRI.
8. IR64 là giống lúa indica cho năng suất cao và phẩm chất gạo tốt, phát triển rộng khắp ở Châu Á, nhưng rất nhạy cảm với độ độc nhôm (Khatiwada và ctv. 1996). Lúa hoang Oryza rufipogon là loại hình đa niên, genome AA giống như bộ genome của lúa trồng IR64, chúng mọc hoang dại trong vùng đầm trũng, đất phèn ở Đồng Tháp Mười. Bố mẹ và con lai được thanh lọc nhôm trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida (Yoshida và ctv 1976). Nghiệm thức nhôm được thêm vào là 0 và 40 ppm Al (tương đương 1.48 mM), 3+ nhôm hoạt động Al từ AlCl3.6H2O ở pH 4. Dung dịch dinh dưỡng được thay mỗi ngày, điều chỉnh pH 5. Khay thí nghiệm và cây mạ được giữ trong điều kiện phòng thí nghiệm có nhiệt độ 27 ± 2 0C, với 12 giờ sáng 300 PPFD (photo proton flux density) Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lần nhắc lại. Chương trình MAPMARKER/EXP v.3.0 (Lander và ctv. 1987, Lincoln và ctv. 1992) được sử dụng để phân tích bản đồ liên kết gen, với hàm Kosambi (Kosambi 1944). Chương trình MAPMARKER/QTL version 1.1 được sử dụng để xácđịnh các loci ảnh hưởng đến những tính trạng số lượng mục tiêu trên cở sở phân tích bản đồ cách quãng (Paterson và ctv. 1988, Lincoln và ctv. 1992). Sử dụng LOD score = 2,4 làm ngưỡng chọn lọc sự hiện diện QTL trên cơ sở khoảng cách tổng số của bản đồ, và khoảng cách trung bình giữa những marker (Lander và Botstein 1989). Với ngưỡng này, một QTL có thể được phát hiện trong genome với xác suất tin cậy 0,05 (Paterson và ctv. 1988, Lander và Bostein 1989). Biến thiên kiểu hình được giải thích bởi tất cả QTL thông qua mô hình phương trình đa tuyến trong MAPMARKER/QTL. Tương tác giữa những loci trên bản đồ được thể hiện bằng cách sử dụng QTLMapper version 1.0 (Wang và ctv. 1999) Ba tính trạng mục tiêu được xem xét là • Chiều dài rễ đối chứng: CRL • Chiều dài rễ bị stress: SRL • Chiều dài rễ tương đối: RRL Phân tích ANOVA để phát hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa bố mẹ với con lai dòng cận giao tái tổ hợp được trình bày ở bảng 4
9. Bảng 4: Thông số của 3 tính trạng được ghi nhận trên bố mẹ và 154 dòng con lai RIL, 4 lần lập lại (Bảy và ctv. 2003) Tính trạng Min. Max. Trung bình CV (%) LSD0.01 CRL IR64 - - 11,30 - - O. rufipogon - - 7,10 - - RILs 4,48 19,28 9,98 11,12 2,02 SRL IR64 - - 2,56 - - O. rufipogon - - 5,50 - - RILs 1,76 9,83 3,99 16.18 1,18 RRL IR64 - - 0,20 - - O. rufipogon - - 0,77 - - RILs 0,18 0,88 0,41 18,93 14,30 5-2-1. Điều tra đa hình trong bố mẹ Sử dụng 5 enzyme EcoRI, EcoRV, DraI, HindIII và XbaI để phân cắt hạn chế genome của bố mẹ. Sử dụng 400 RFLP marker của Đại Học Cornell và của chương trình RGP (Nhật) trong nghiên cứu đa hình. Kết qủa có 274 probe (65,9%) thể hiện đa hình. Mức độ đa hình thể hiện tương ứng với các enzyme EcoRI (14,0%), EcoRV (12,5%), DraI (19,8%), HindIII (27,7%) và XbaI (19,5%) Trong 168 SSR marker được sử dụng, có 112 marker (66,7%) thể hiện đa hình. Tác giả xem xét 13 gen ứng cử viên điều khiển tính chống chịu độ độc nhôm theo nguồn số liệu GenBank, trong đó có 4 gen (30,8%) được tìm thấy biểu hiện đa hình giữa bố và mẹ 5-2-2. Phân ly và thiết lập bản đồ Đa hình được xem xét trên cơ sở 238 marker rất rõ ràng trong bố mẹ, từ đó chúng được sử dụng để điều tra trên quần thể con lai. Tác giả đã thiết lập bản đồ với 151 marker loci và phân tích QTL trong dòng con lai cận giao tái tổ hợp (RIL). Hầu hết những marker này để thể hiện băng lai đơn, trừ RG788 có hai copy. Marker này được đánh dấu là “suffix A và B”. Những alen không rõ nguồn gốc, không phải của bố mẹ (hoàn toàn mất tín hiệu) được tìm thấy trong quần thể RIL này là 7,3%. Trường hợp như vậy được xử lý như trường hợp thiếu số liệu. Phân ly của 151 marker trong bản đồ liên kết gen được trắc nghiệm thông qua phép thử Chi bình phương. Kết qủa cho thấy hầu hết (122 marker) phân bố theo lý thuyết Mendel 1:1, chiếm 80,7% tổng số. Hầu hết marker (118 marker) thiên lệch về IR64, 4 marker lệch về Oryza rufipogon, và 29 loci có ít nhất 50% alen thuộc về Oryza rufipogon. Mức độ lệch này (skewness) trong quần thể RIL [60% nghiêng về alen IR64, 40% nghiêng về alen lúa hoang] đã gây ảnh hưởng đến khả năng thiết lập bản đồ marker de novo trên cơ sở số liệu phân ly của nhhững dòng RIL (Bảy và ctv. 2003)
10. Bảng 5: Những QTL giả định trong trường hợp 3 tính trạng CRL, SRL và RRL (Bảy và ctv. 2003) Tính QTL Quãng Nhiễm Chiều Khoảng Ảnh LOD R2 trạng thể dài cách hưởng (%) (cM) với cộng [a] marker đầu tiên (cM) CRL QAlCr12.1 RG341-RZ397 12 8,9 4,0 1,834(I) 2,8 10,3 SRL QAlSr2.1 RG139-RG324 2 11,6 8,0 3,235(O) 2,9 26,4 QAlSr3.1 CDO1395-RG391 3 0,5 0,0 1,478(O) 6,2 18,7 QAlSr8.1 RG28-RM233 8 31,0 18,0 1,915(O) 3,1 20,8 Mô hình QTL tối hảo 45,6 RRL QAlRr1.1 RG406-RZ252 1 6,5 6,0 0,100(O) 2,4 9,0 QAlRr3.1 CDO1395-RG391 3 0,6 0,0 0,167(O) 8,3 24,9 QAlRr7.1 RZ629-RG650 7 29,8 18,0 0,126(O) 5,4 22,5 QAlRr8.1 RG28-RM223 8 31,0 18,0 0,104(O) 2,5 20,8 QAlRr9.1 RM201-WALI7 9 10,0 8,0 0,109(O) 2,6 9,9 Mô hình QTL tối hảo [b] 70,8 (I): IR64, (O): Oryza rufipogon [a] biến thiên kiểu hình được giải thích bởi từng QTL riêng biệt [b] biến thiên kiểu hình được giải thích bởi tất cả QTL Chiến lược thiết kế một bản đồ liên kết gen từ quần thể có tính chất nghiêng lệch như vậy (skewness) đã được Wang và ctv. (1994) đề xuất. Trước tiên, những marker này cùng thuộc về nhóm liên kết đã được xác định trên cơ sở bản đồ có mật độ cao về liên kết di truyền trong cây lúa (Causse và ctv. 1994, Harushima và ctv. 1998, Temnykh và ctv. 2001). Sau đó, tỉ lệ tái tổ hợp, vị trí thứ tự trên nhiễm sắc thể được xác định bằng lệnh “Three Point” và “First Order” trong phần mềm chương trình máy tính, ở LOD = 3,0 trên cơ sở số liệu của quần thể RIL. Đối với những marker mà vị trí của nó chưa được biết rõ, chúng ta phải dùng phương pháp phân tích hai điểm với LOD 10-12 để tìm thấy nhóm liên kết của chúng. Câu lệnh “Try” được sử dụng đối với những marker không liên kết (unlinked). Kết qủa phân tích cho thấy, 151 marker loci phân ra thành 13 nhóm liên kết (riêng nhiễm thể số 1 có hai nhóm liên kết). Các nhiễm sắcthể được định hướng theo nhánh vai ngắn nằm phía trên của vị trí tâm động (Singh và ctv. 1996). Thứ tự của marker trên bản đồ được xếp theo nguyên tắc thống nhất của Đại Học Cornell (Causse và ctv. 1994, Temnykh và ctv. 2001), của chương trình genome cây lúa (RGP) tại Nhật (Harushima và ctv. 1998), và bản đồ cây lúa được phát triển từ quần thể O. sativa x O. rufipogon (Xiong và ctv. 1997, Xiao và ctv. 1998). Tổng chiều dài bản đồ là 1.755 cM, khoảng cách trung bình giữa hai marker là 11,6 cM (hình 5-4) Nhiễm sắc thể số 10 có số marker thể hiện ít nhất. Cho dù 12 SSR và 20 RFLP định vị trên nhiễm thể này, nhưng chỉ có 6 marker được thiết lập trên bản đồ. Sự thể hiện đa hình kém trên nhiễm thể số 10 cho thấy: ở một vài vùng của genome giống lúa trồng và lúa hoang có thể biểu hiện khá phổ biến hiện tượng suy giảm (descent), hoặc O. rufipogon đóng vai trò dẫn xuất của con lai (derivative) tạo ra trạng thái gần gũi về huyết thống (proximity) của loài hoang dại mọc ở đồng ruộng của nông dân trồng lúa Châu Á (thí dụ hiện tượng lúa cỏ) 5-2-3. Bản đồ QTL
11. Tác giả xác định 9 QTL với giá trị LOD 2,4 đã được phân lập đối với 3 tính trạng mục tiêu (bảng 5). Những QTL giả định này được ghi nhận với nhiễm sắc thể mà nó định vị, giá trị LOD, phần trăm biến thiên kiểu hình được giải thích, ảnh hưởng cộng (additive effect). Số QTL điều khiển tính trạng thay đổi từ 1 QTL đối với CRL cho đến 5 QTL đối với RRL. Biến thiên kiểu hình cũng thay đổi từ 9,0% đến 26,4%. Vị trí của những QTL được xem xét trên hình 5-4 Tính trạng chiều dài rễ đối chứng (CRL): chỉ có 1 QTL, đó là QAlCr12.1, định vị trên nhiễm thể số 12, hai marker kế cận của nó là RG341 và RZ397, điều khiển tính trạng chiều dài rễ trong điều kiện không có stress do nhôm. QTL này giải thích 10,3% biến thiên kiểu hình với 1 alen (chiều dài rễ dài hơn) từ giống lúa IR64. Sự gia tăng của chiều dài rễ do alen này là 1,83cm Tính trạng chiều dài rễ bị stress do nhôm (SRL): có 3 QTL ảnh hưởng, được tìm thấy trên nhiễm thể số 2, 3 và 8. Đó là QAlSr2.1 định vị trên nhiễm thể số 2, hai marker kế cận là RG139 và RG324, nó có giá trị R2 cao nhất (26,4%). Tiếp theo sau đó là QAlSr8.1, hai market kế cận là RG28 và RM223, trên nhiễm thể số 8 (20,8%). Và cuối cùng là QAlSr3.1, hai marker kế cận là CDO1395 và RG391, trên nhiễm thể số 3 (18,2%). Những QTL này đóng góp 45,5% biến thiên kiểu hình. Ở đây Oryza rufipogon có những alen ưu thế về tính trạng chiều dài rễ trong cả 3 QTL nói trên. Ảnh hưởng allelic thay đổi từ 1,46 cm (QalSr3.1) đến 3,24 cm (QalSr2.1 ) Tính trạng chiều dài rễ tương đối (RRL): có 4 QTL ảnh hưởng, được tìm thấy trên nhiễm thể số 1, 3, 7 và 8. Đó là QAlRr1.1 định vị trên nhiễm thể số 1, hai marker kế cận là RG406 và RZ252, nó có giá trị R2 là 9,0%). Kế đến là QAlRr3.1, hai market kế cận là CDO1395 và RG391, trên nhiễm thể số 3 (24,9% cao nhất). Tiếp theo sau đó là QAlRr7.1, hai market kế cận là RZ629 và RG650, trên nhiễm thể số 7 (22,5%). QAlRr8.1, hai market kế cận là RG28 và RM233, trên nhiễm thể số 8 (20,8%). Và cuối cùng là QAlRr9.1, hai marker kế cận là RM201 và WALI7, trên nhiễm thể số 9 (9,9%). Tổng số QTL trong mô hình giả định như vậy đã giải thích được 70,8% biến thiên kiểu hình. Ảnh hưởng của alen thay đổi từ 10,0% (QAlRr1.1) đến 16,7% (QAlRr3.1) (Bảy và ctv. 2003) 5-2-4. Phân tích epistasis Hiện tượng epistasis là thành phần quan trọng của di truyền đối với những tính trạng phức tạp như tính chống chịu độ độc nhôm. Tương tác giữa QTL và những loci cải biên có thể được xem như một dạng chính của epistasis đối với các tính trạng số lượng (Yu và ctv. 1997). Phân tích epistasis giữa các loci trên bản đồ của 3 tính trạng chính được thể hiện ở bảng 6, nhờ phần mềm QTLMapper version 1.0 (Bảy và ctv. 2003) Bảng 6: Phân tích epistasis đối với những loci của gen điều khiển tính trạng chiều dài rễ đối chứng (CRL), chiều dài rễ bị xử lý (SRL), và chiều dài rễ tương đối (RRL) trong quần thể RIL của tổ hợp lai IR64 x Oryza rufipogon (Bảy và ctv. 2003) Tính Nhiễm Quãng giữa 2 Nhiễm Quãng giữa 2 A(i) A(j) AA(ij) LOD trạng sắc thể marker (i) sắc thể marker (j) CRL 2 RM233-RM203 5 RM249-RM164 0,03 0,18 1,39 2,84 4 S2486-RZ590 12 RM17-RG901 0,43 0,29 1,19 3,11 6 Rali33-RG172 12 RM17-RG901 0,18 0,53 1,60 4,16 7 RZ509-RM2 9 Wali7-RZ404 0,18 0,32 1,92 3,82 R2(%) 0,00 0,00 51,21 SRL 3 S1845-CDO1395 6 RG653-RZ828 1,00 0,10 0,39 5,20 R2(%) 22,84 0,00 0,00 RRL 1 RM1-RM283 3 CDO1395-RG391 0,030 0,112 0,033 7,73
12. 4 Rali26-RG788B 5 RM249-RM164 0,024 0,065 0,006 3,34 9 RM201-Wali7 12 RG543-RG341 0,029 0,036 0,060 3,35 R2(%) 0,000 36,59 0,000 Dấu * và biểu thị mức độ ý nghĩa 0,05 và 0,01, theo thứ tự A(i): ảnh hưởng alellic ở site (i) A(j): ảnh hưởng allelic ở site (j) AA(ij): tương tác không alen giữa site (i) và site (j) R2(%): biểu thị mức độ kiểu hình được giải thích ở site (i), site (j) và ảnh hưởng epistatic (ij) Khi xem xét tính trạng chiều dài rễ trong điều kiện có xử lý nhôm, trên nhiễm sắc thể số 3, quãng giữa hai marker S1845-CDO1395 có một tương tác với khu vực được xác định bởi RG653-RZ828 (trên nhiễm thể số 6). Ảnh hưởng allelic tại site (i) rất có ý nghĩa về thống kê và được giải thích 22,8% kiểu hình thể hiện ra. Tuy nhiên, ảnh hưởng allelic ở site (j) và ảnh hưởng tương tác không alen giữa site (i) và site (j) không biểu thị mức độ ý nghĩa rõ ràng, và không có ảnh hưởng đến biến thiên kiểu hình (bảng 6). Chiều dài rễ trong điều kiện bình thường, chỉ có một QTL định vị trên nhiễm thể số 12 điều khiển trong giống IR64. Tuy nhiên, bốn cặp loci có tính chất epistatic đã được ghi nhận với mức độ có ý nghĩa cao. Ảnh hưởng chính của những loci này không biểu hiện biến thiên về kiểu hình, nhưng nó biểu hiện ở hiện tượng tương tác không alen với nhau, với R2=51,2%. Kết qủa này cũng được công bố bởi Zhang và ctv. (2001). Khi xem xét tính trạng chiều dài rễ tương đối, tác giả tìm thấy 6 khu vực khác nhau trên nhiễm sắc thể (1, 3, 4, 5, 9, và 12) biểu thị tương tác với nhau. Ảnh hưởng allelic ở site (j) được ghi nhận rất có ý nghĩa, với 36,59% kiểu hình được giải thích bới QTL. Ảnh hưởng allelic ở site (i) và ảnh hưởng epistatasis không có ý nghĩa thống kê, và R2 cũng bằng 0 (bảng 6). Khu vực QAlRr3.1 định vị trên nhiễm thể số 3 có tương tác không alen với khu vực RM1- RM283 trên nhiễm thể số 1, cho dù tương tác này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Khu vực QAlRr9.1 định vị trên nhiễm thể số 9 tương tác với khu vực RG543-RG341 trên nhiễm thể số 12, cho kết qủa không có ý nghĩa về mặt thống kê. Trong một quần thể mapping khác, Wu và ctv. (2000) đã tìm thấy 3 cặp loci tương tác theo kiểu epistasis, với biến thiên kiểu được giải thích khoảng 20% đối với tính trạng chiều dài rễ tương đối, trong khi kết qủa này (IR64 x O. rufipogon) cho thấy epistasis không có ý nghĩa (R2=0,00). Phân tích epistasis cho thấy tính chống chịu độ độc nhôm ở giai đoạn cây mạ được điều khiển bởi ưu thế của hoạt động gen cộng tính, giống như cây lúa mì (Bona và ctv. 1994) và cây bắp (Lima và ctv. 1995). Kết qủa phân tích QTL và epistasis cho thấy kiểu gen có năng suất cao như IR64 có thể kết hợp với nguồn cho gen chống chịu độ độc nhôm của Oryza rufipogon, làm tăng cường tính chống chịu của IR64 thông qua biểu hiện kiểu hình của con lai. Trong việc khai thác chiến lược MAS (marker-assisted selection), QTL chính liên kết với CDO1395 định vị trên nhiễm thể số 3 có thể được xem như ứng cử viên để áp dụng việc chọn con lai có gen chống chịu độ độc nhôm (Bảy và ctv. 2003) Chiều dài rễ tương đối (RRL) là một thông tin vô cùng quan trọng, liên quan trực tiếp đến tính chống chịu nhôm của cây lúa. Do đó, QTL điều khiển tính trạng RRL được sử dụng để so sánh với những tư liệu tham khảo có liên quan. Có 5 QTL điều khiển tính trạng RRL đã được công bố trong một quần thể mapping khác. Khu vực QAlRr.1 (R2=9,0%) định vị trên nhiễm thể số 1, được tìm thấy tương tự như vậy ở quần thể IR1522 x Azucena (Wu và ctv. 2000), CT9993 x IR62266 (Nguyễn và ctv. 2002), OM269 x Chiêm bầu (Nguyễn và ctv. 2001) (Hình 5-5) Khu vực QAlRr9.1 định vị trên nhiễm thể số 9, được tìm thấy tương tự như vậy trên quần thể IR1552 x Azucena (Wu và ctv. 2000), CT9993 x IR62266 (Nguyễn và ctv. 2002) (Hình 5-5) Nhằm xác định những QTL chung cho lúa và loài mễ cốc khác, Bảy và ctv. (2003) đã so sánh với kết qủa được công bố trên lúa mì (Riedle và Anderson 1996), trên cây lúa mạch
13. đen “rye” (Miftahudin và ctv. 2002), cây bắp (Sibov và ctv. 1998), và cây lúa mạch (barley) (Tang và ctv. 2000), trên cơ sở sử dụng bản đồ so sánh (Ahn và Tanksley 1993), Gale và Devos 1998) và trên cơ sở sử dụng một bộ “RFLP probe” có tính chất so sánh của Đại Học Cornell. Phân tích này cho thấy khu vực QAlRr3.1 có ảnh hưởng kiểu hình lớn nhất được giải thích bởi QTL (R2=24,9%) trong quần thể IR64 x Oryza rufipogon, và chúng có ảnh hưởng khá thấp (R2=9%) trong quần thể IR1552 x Azucena (Wu và ctv. 2000), định vị trên nhiễm thể số 3, tương đồng với gen điều khiển chống chịu độ độc nhôm thuộc nhóm số 4 của Triticeae (hình 5-6) 5-2-5. Ứng dụng marker trong chọn giống chống chịu và gen ứng cử viên Những marker phân tử liên kết chặt chẽ với những QTL sẽ vô cùng hữu ích cho nhà chọn giống trong chiến lược MAS, để chúng ta có thể chọn lọc cá thể mong muốn ở những thế hệ đầu tiên. Nhiễm sắc thể số 1 đã được các nhà khoa học Nhật thực hiện kỹ thuật đọc trình tự (sequencing), với 418 BAC clone, trong đó 353 clone đã được đọc xong vào tháng Tư năm 2002. Họ sử dụng bản đồ tổng hợp (integrated genetic map) và tìm ra RG406, một trong những marker liên kết với QTL ở nhiễm thể này (QAlRr1.1), với khoảng cách di truyền là 0,3 cM. Marker này được neo bởi BAC clone ký hiệu là OSJNBa0014K08f trên contig số 20 thuộc bản đồ vật lý cây lúa “Clemson”. Chuỗi ký tự của BAC đã được gửi đi để phân tích gen mục tiêu theo chương trình “rice genome” tại Nhật Bản. Không có trình tự nào liên quan đến cơ chế loại trừ acid hữu cơ được tìm thấy trong BAC. Đối với QAlRr9.1, người ta tìm thấy trong CT9993 là giống có tính chống chịu độ độc nhôm mạnh nhất (Nguyễn và ctv. 2000). Một QTL chủ lực khác điều khiển tính chống chịu nhôm được tìm thấy trong CT9993 x IR62266 (R2=28,7%), định vị trên nhiễm thể số 8 liên kết với hai marker kế cận là C1121 và M53. Một trong những QTL chủ lực được xác định trong nghiên cứu của Bảy và ctv. (2003) cũng được tìm thấy trên nhiễm thể số 8 (R2=20,8%), liên kết với RG28 và RZ650. Theo kết qủa bản đồ tổng hợp của “Japanese Oryzabase”, marker C1121 cách khoảng với marker RG333 là 27,7 cM, và giữa hai marker RG28 với RG333 là 21,8 cM. Điều này cho thấy, những QTL này định vị trên cùng một vùng của nhiễm sắc thể. Như vậy QTL này có thể được xem là một trong hai quần thể có nền tảng di truyền khác nhau. QTL có ảnh hưởng lớn nhất là QAlRr3.1 (R2=22,9%) trong quần thể IR64 x Oryza rufipogon, nhưng một QTL có ảnh hưởng nhỏ hơn (R2=9,0%) trong quần thể IR1552 x Azucena đều cùng định vị trên nhiễm sắc thể số 3. Xét theo hiện tượng “synteny” trong chương mở đầu, chúng tương đồng với chromosome thuộc nhóm số 4 của Triticeae (Gale và Devos 1998). Những công bố trước đó khẳng định rằng có một vùng genome được bảo tồn trên vai nhánh dài của nhiễm thể tương đồng số 4 điều khiển tính chống chịu nhôm trong cây lúa mì (AltBH), trong cây rye (Alt3), trong cây lúa mạch (Alp) (Miftahudin và ctv. 2002). Gen điều khiển tính chống chịu độ độc nhôm trong lúa mì và “rye” liên kết khá chặt với marker BCD1230, và liên kết không chặt chẽ lắm với CDO1395, nhưng riêng cây lúa mạch, gen này liên kết rất chặt với CDO1395. Như vậy, điều này gợi ra một ý tưởng rằng AltBH, Alt3 và Alp là những gen có loci tương đồng (orthologous loci) vì mức độ cao của hiện tượng “synteny” giữa những nhiễm sắc thể 4DL, 4RL, và 4HL. Chúng có thể cùng chia sẻ một chức năng chung. Một trong những cơ chế chống chịu trong Triticeae là cơ chế loại thải nhôm (Al exclusion) (Kochian 1995). Cơ chế này được trung gian bởi tiến trình phóng thích nhôm hoạt động từ acid hữu cơ (chủ yếu là malic acid), acid hữu cơ giữ chặt Al+++ theo dạng “chelate” trong vùng rễ và ngăn cản nhôm xâm nhập vào đỉnh rễ lúa. Minh chứng về hiện tượng sinh lý học này đã được giải thích rất rõ ràng nhờ những loci tương đồng điều khiển tính trạng chống chịu nhôm trong Triticeae. QTL chủ lực điều khiển tính chống chịu nhôm được ghi nhận trên nhiễm sắc thể số 3 biểu hiện sự tương đồng với các gen điều khiển tính chống chịu nhôm thuộc nhóm số 4 của Triticeae. Nhưng sự biểu hiện về mặt sinh lý thực vật của tính chống chịu này rất thiếu trong
14. cây lúa so với các cây trong nhóm Triticeae. Đánh giá kiểu hình những cây bố mẹ cho thấy Oryza rufipogon có khả năng chống chịu nhôm cao nhất so với các giống thuộc Oryza sativa. Bảy và ctv. (2003) đã cố gắng tìm những gen ứng cử viên liên quan đến tính chống chịu nhôm trên nhiễm sắc thể số 3 trên cơ sở số liệu sau khi đọc trình tự (sequencing). Trong 160 BAC clone phân lập từ nhiễm sắc thể số 3, chỉ có 53 clone được xác định trình tự chuỗi mã. Điều không may mắn trong nghiên cứu này là: hầu hết những clone này định vị trên nhánh vai dài của nhiễm sắc thể, trong khi gen điều khiển tính chống chịu nhôm được xác định trên nhánh vai ngắn. Tuy nhiên, người ta rất cần phải thực hiện một sự kết nối rất tốt giữa bản đồ di truyền và bản đồ vật lý để tìm hiểu những gen ứng cử viên như vậy trên nhiễm sắc thể số 3. Chuỗi mã di truyền của bàn đồ gen cây lúa đã được công bố (Goff và ctv. 2002, Yu và ctv. 2002) là điều kiện vô cùng thuận lợi. 5-2-6. Tạo ra clone của những QTL điều khiển tính chống chịu nhôm từ lúa hoang Những QTL được xác định trong genome của Oryza rufipogon là những ứng cử viên đầy tiềm năng đối với việc phát triển các dòng gần như đẳng gen (NILs) để cloning các gen điểu khiển tính chống chịu nhôm trong cây lúa. Những QTL chủ lực trên nhiễm sắc thể sổ 3 sẽ được chú ý trước tiên. Chúng giải thích khoảng 25% biến thiên kiểu hình và biểu hiện tương đồng với những gen chống chịu nhôm thuộc nhóm số 4 của Triticeae QAlRr1.1 trên nhiễm sắc thể số 1 có ảnh hưởng rất thấp (9,0%) đối với biến thiên kiểu hình. Tuy nhiên, khu vực của chúng biểu hiện một cách ổn định với một QTL đã được phát hiện từ những công trình nghiên cứu trước đây thuộc 3 quần thể mapping khác. QAlRr7.1 trên nhiễm sắc thể số 7 có ảnh hưởng lớn đứng hàng thứ hai (22,5%) đối với biến thiên kiểu hình. Hiện nó tạm thời là QTL duy nhất trong quần thể mapping này, chưa được báo cáo trong các quần thể trước đó. QAlRr8.1 trên nhiễm sắc thể số 8 có có ảnh hưởng lớn (20,8%) đối với biến thiên kiểu hình. Nó biểu hiện một QTL trên cùng một khu vực của nhiễm sắc thể trong quần thể mapping của CT9993 x IR62266, trong đó, giống CT9993 được xác định là giống có khả năng chống chịu nhôm tốt nhất trong Oryza sativa (Nguyễn và ctv. 2000) Tuy nhiên, vì các vùng trong genome chứa những QTL giả định (QAlRr7.1, QAlRr8.1) vẫn còn rất rộng (29,8 và 31,0 cM, theo thứ tự), chúng ta cần phải nghiên cứu thêm những marker để bổ sung và lấp đầy khoảng trống, nhằm thỏa mãn mục tiêu cloning chính xác hơn QAlRr9.1 trên nhiễm sắc thể số 9 có ảnh hưởng thấp (9,9%) đối với biến thiên kiểu hình. Nhưng nó biểu hiện khá ổn định trong 3 quần thể mapping khác nhau. Nó liên kết chặt chẽ với marker WALI7 (2,0 cM), một cDNA của genome cây lúa mì Phát triển quần thể NIL sẽ giúp cho các nhà chọn giống đánh giá đúng đắn ảnh hưởng của các alen điều khiển tính chống chịu nhôm của lúa hoang Oryza rufipogon du nhập vào giống lúa trồng. Các quần thể hồi giao qui mô lớn dẫn xuất từ quần thể NIL đặc biệt, cũng có thể được khuyến cáo trong thực hiện yêu cầu “fine mapping” và “cloning” những QTL mục tiêu (Bảy và ctv. 2003) Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế sinh lý cây trồng và các gen điều khiển tính chống chịu nhôm trong cây lúa sẽ cho chúng ta biết được sự tiến hóa và tính chất đa dạng của hiện tượng chống chịu nhôm trong cây lúa và những loài mễ cốc khác có quan hệ gần gủi. 5-3. CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỐNG CHỊU NHÔM Viện Lúa ĐBSCL đã tiến hành thu thập mẫu quần thể lúa hoang Oryza rufipogon trong năm 1989-1991 tại Tràm Chim, Đồng Tháp Mười, ký hiệu acc.106412, acc.106423, acc.106424 (Ngân hàng gen IRRI), nơi được xem là đất phèn nặng. Viện Lúa Quốc Tế thực hiện cặp lai giữa IR64 và những quần thể này. Con lai F2 được chuyển về Viện Lúa ĐBSCL để thanh lọc trong điều kiện đất phèn ở Trại Hoà An, Phụng Hiệp, Cần Thơ.
15. Ba dòng có triển vọng đã được khảo nghiệm là AS1007 IR64 / Oryza rufipogon (Acc.106412) AS833 IR64 / Oryza rufipogon (Acc.106424) AS996 IR64 / Oryza rufipogon (Acc.106412) Chúng đều có thời gian sinh trưởng ngắn (95-100 ngày), dạng cây cải tiến, năng suất cao, chống chịu rầy nâu và bệnh đạo ôn, chống chịu được độc nhôm, thích nghi trên đất phèn ở ĐBSCL, đặc biệt là giống AS996. Từ 38064 ha năm 2000, giống AS996 đã phát triển gần 100 nghìn ha vào năm 2002 Bảng 7: Kết qủa thanh lọc nhôm (30ppm Al) ở giai đoạn mạ Vật liệu Chiều dài rễ tương đối (RRL) Oryza rufipogon (acc.106412) 1.158 AS996 1.133 OM1490 1.058 OM1314 0.899 Cà đung đỏ (chuẩn chống chịu) 0.843 IR29 (chuẩn nhiễm) 0.514 LSD0.05 0.230 Bảng 8: Khảo nghiệm năng suất giống lúa vụ đông xuân 2000 trên vùng đất có vấn đề Giống Tân Mộc Mộc Thủ Thủ Tân Trụ Vĩnh Thị Xã Châu Trung Thạnh Hóa 1 Hóa 2 Thừa 1 Thừa 2 Hưng Thành bình AS996 7.93 7.15 5.40 8.30 7.20 5.98 5.53 6.50 5.60 6.62 OM1870 7.87 7.01 4.25 7.13 6.86 5.89 5.87 6.73 5.23 6.31 OM2401 7.47 6.30 4.34 7.00 7.53 5.88 5.93 6.26 5.53 6.24 IR64 7.33 6.94 4.68 7.20 6.40 5.69 6.47 5.93 4.80 6.16 CM16-27 7.13 6.44 3.88 7.67 7.67 5.88 5.73 6.38 4.63 6.15 OM2031 6.60 7.08 3.89 7.10 6.83 5.57 5.53 6.26 4.47 5.92 T.bình 7.73 6.82 4.41 7.42 7.08 5.82 5.84 6.35 5.04 LSD 0.05 0.435 Bảng 9: Phân tích tương tác giữa kiểu gen và môi trường (đông xuân 2000, hè thu 2000) Đông xuân 2000 Giống Trung bình Hệ số gốc SE AS996 6.48 0,84 0,141 OM1840 6.41 1,13 0,082 IR64 6.30 0,81 0,183 OM2401 6.24 0,89 0,128 CM16-27 6.19 1,19 0,108 OM2031 5.93 1,12 0,113 Hè thu 2000 Giống Trung bình Hệ số gốc SE OM2401 4.60 1.85 0.238 AS996 4.52 0.71 0.251 OM2395 4.49 1.42 0.409 CM42-94 4.33 0.68 0.172 OM2031 4.25 1.12 0.235 IR64 4.14 0.22 0.271
16. Bảng 10: Khảo nghiệm AS996 trên vùng đất phù sa có nước tưới, đông xuân 2000 (t/ha) Giống Tân Châu Châu Phú Phú Tân Long Thoại Trung Xuyên Sơn bình Đông xuân 2000 OM2031 5.90 7.73 6.33 8.00 7.33 7.05 AS996 8.67 8.25 5.67 8.14 7.73 7.69 OM1870 7.50 7.53 7.00 7.55 7.17 7.35 CM16-27 6.83 7.65 6.50 7.04 7.70 7.14 OM2401 6.51 7.45 6.73 7.68 7.37 7.14 IR64 6.85 8.57 6.33 7.61 7.00 7.27 Hè thu 2000 Giống An Phú Thoại Long Dien Phú Tân Chợ Mới Trung Sơn bình OM2031 6.70 4.40 5.00 5.80 5.30 5.44 AS996 7.60 5.30 4.90 6.10 5.50 5.88 OM2395 6.70 5.00 4.70 7.06 4.90 5.67 CM42-94 6.30 5.10 5.60 5.90 4.80 5.54 OM2401 6.23 5.30 5.40 5.30 5.00 5.44 IR64 6.80 5.40 4.80 5.80 4.60 5.48 Bảng 11: Tương tác giữa kiểu gen x môi trường trên vùng đất phù sa có nước tưới Đông xuân 2000 Hè thu 2000 Trung Hệ số gốc SE Trung Hệ số gốc SE bình bình AS996 7.06 1.304 0.529 5.90 1.255 0.247 OM2031 7.69 1.555 0.798 5.49 1.043 0.209 OM2395 7.35 0.334 0.169 5.69 1.254 0.370 OM2401 7.14 0.728 0.326 5.47 0.499 0.181 CM42-94 7.15 0.711 0.304 5.55 0.679 0.204 IR64 7.27 1.367 0.365 5.31 1.270 0.055 Giống AS996 được công nhận giống quốc gia vào năm 2002, là giống được lai tạo thành công theo chiến lược du nhập gen mục tiêu từ lúa hoang vào lúa trồng chống chịu được độ độc nhôm
17. Hình 5-4: Bản đồ QTL các tính trạng chống chịu nhôm với 151 marker loci từ 171 dòng RIL của IR64 x Oryza rufipogon (acc 106424). Tính trạng CRL: chiều dài rễ đối chứng, SRL: chiều dài rễ trong điều kiện xử lý nhôm, RRL: chiều dài rễ tương đối (Bảy và ctv. 2003) IR1552 x CT9993x OM269 x IR64 x BS125 x IR1552 x CT9993 x IR64 x Azucena IR62266 Chiêm bầu O. rufipogon O. longistaminata Azucena IR62266 O. rufipogon (Wu et al (Nguyen et (Nguyen et //BS125 (Causse (Wu et al, (Nguyen et 2000) al 2002) al 2001) et al 1994) 2000) al 2002) Hình 5-5: So sánh QTL điều khiển tính chống chịu nhôm trên (a) nhiễm sắc thể số 1, và (b) nhiễm sắc thể số 9 (Bảy và ctv. 2003)
18. Cây lúa Cây lúa Barley Lúa mì Rye IR64 x O. rufipogon IR1552xAzucena (Tang và ctv. (Riede& (Miftahudin (Wu và ctv. 2000) 2000) Anderson 1996) và ctv. 2002) Hình 5-6: So sánh QTL điều khiển tính trạng chống chịu nhôm giữa những cây thuộc nhóm mễ cốc (Bảy và ctv. 2003) TÀI LIỆU THAM KHẢO Ahn S, SD Tanksley. 1993. Comparative linkage maps of rice and maize genomes.Proc Natl Acad Sci USA 90:7980 -7984 Aniol A, IP Gustafson.1984.Chromosome location of genes controlling aluminum tolerance in wheat, rye, and triticale.Can J Genet Cytol 26:701-707 Bona L, BF Carver, RJ Wright, VC Baligar. 1994. Aluminium tolerance of segregating wheat population in acid soil and nutrient solutions.Commu Soil Sci Plant Anal 25:327 – 339 Bảy ND, DS Brar, BC Buu, NV Tao, PN Luong, HT Nguyen. 2003. Identification and mapping of the QTL for aluminum tolerance introgressed from new source, Oryza rufipogon Griff, into indica rice (Oryza sativa L.). Theor Appl Genet 106:583-593 Bùi chí Bửu. 1987. Nghiên cứu một vài đặc tính quan trọng của các giống lúa nước sâu địa phương ở Đồng Bằng Sông Cửu long cho công tác chọn giống. Luận án PTS Khoa học nông nghiệp. Viện KHKTNNVN, Hà Nội. 112 pp. Causse MA, TM Fulton, YG Cho, SN Ahn, J Chunwongse, K Xu, J Xian , Z Yu, PC Ronald, SE Harrington, G Second, SR McCouch, SD Tanksley. 1994. Saturated molecular map of the rice genome based on an interspecific backcross population.Genetics 138:1251-1274 Coronel VP. 1980. Response of rice and wheat at seedling stage to aluminium. Peper presented at IRRI. Saturday seminar, Nov. 8, 1980, Los Banos, Philippines. 55 p. Gale MD, KM Devos.1998. Comparative genetics in the grasses. Proc Natl Acad Sci USA 95:1971-1974 Gallego FJ, B Calles, C Benito.1998. Molecular markers linked to the aluminum tolerance gene Alt1 in rye.Theor Appl Genet 97:1104 - 1109 Goff SA, D Ricke D, TH Lan, G Presting G,et al. 2002. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L.ssp.japonica ). Science 296:92-100 Gomez KA and AA Gomez. 1984. Statistical procedures for Agricultural Research, IRRI, Second edition. 680 pages
19. Harushima Y, M Yano, A Shormura, M Sato, T Shimano, Y Kuboi, T Yamamoto, SY Lin, BA Antinio, A Parco, H Kajiya, N Huang, K Yamamoto, N Nagamura, N Kurata, GS Khush, T Sasaki. 1998. A high-density rice genetic linkage map with 2,275 markers using a single F2 population.Genetics 148:479 –494 HilleRisLambers D, and P Sittiyos. 1985. Rice breeding for deepwater areas. Paper presented at the Int. Rice Research conference, 1-5 June 1985. IRRI. 17p. (mimeo). Howeler RH and LP Cadacid. 1976. Screening of rice cultivars for tolerance to Al - toxicity in nutrient solutions as compares with a field screening method. Agron.J. 68 (4): 551-555. Khatiwada SP, D Senadhira, AL Carpena, RS Zeigler, PG Fermadez. 1996.Variability and genetics of tolerance for aluminum toxicity in rice (Oryza sativa L.).Theor Appl Genet 93:675 –681 Kochian LV. 1995.Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plants.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 46:237-260 Lander ES, D Bostein.1989. Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps.Genetics 121:185-181 Lander ES, P Green, J Abrahamson, A Barlow, DJ Daly, SE Lincoln, L Newburg. 1987. MAPMAKER:an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations.Genomics 1:174-181 Lima M, M Filho, PR Furlani. 1995. Diallel cross among inbred lines of maize differing in aluminum tolerance.Braz J Genet 18:579-584 Magnacava R, CO Gardner, RB Clark.1987. Inheritance of aluminum tolerance in maize. In: Gabelman HW, Loughman BC (eds): Genetic aspects of plant mineral nutrition. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp 201-212 Martinez CP. 1976. Aluminum toxicity studies in rice (Oryza Sativa L.) Ph.D. Thesis, Oregon State University, Corvalis, Oregon. 113g. McCart GD and EJ Kamprath. 1965. Supplying Ca and Mg for cotton on sandy low cation exchange capacity soils. Agronomy. J. 57: 404-406. Miftahudin G, J Scoles, JP Gustafson. 2002. AFLP markers tightly linked to the aluminum tolerance gene Alt3 in rye (Secale cereale L.).Theor Appl Genet 104:626-631 Nguyen VT, BD Nguyen, S Sakarung, C Matinez, AH Paterson, AH Nguyen. 2002. Mapping genes controlling Al tolerance in rice:comparing different genetic backgrounds.Mol Genet Genomics (in press) Nguyen VT, LD Thanh, AH Paterson, LT Binh, HT Henry. 2000. Rapid screening method for aluminum tolerance in rice in nutrient solution (in Vietnamese with English abstract,ISSN: 0866-8566). J Genet Appl 2:5-11 Nguyen VT, MD Burrow, HT Nguyen, BT Le, TD Le, AH Paterson. 2001. Molecular mapping of genes conferring aluminum tolerance in rice (Oryza sativa L.).Theor Appl Genet 102:1002-1010 Panaud O, X Chen, SR McCouch. 1996. Development of microsatellite markers and characterization of simple sequence length polymorphism (SSLP)in rice (Oryza sativa L.). Mol Gen Genet 252:597-607 Paterson AH, ES Lander, JD Hewitt, S Paterson, S Lincoln, SD Tankley. 1988. Resolution of quantitative traits into Mendelian factors by using a complete linkage map of restriction fragment length polymorphisms.Nature 335:721-726 Riede CR, JA Anderson. 1996. Linkage of RFLP markers to an aluminum tolerance in wheat.Crop Sci 36:905-909
20. Sibov ST, M Gaspar, MJ Silva, LMM Ottoboni, P Arruda, AP Souza. 1998. Two genes control aluminum tolerance in maize:genetic and molecular mapping analyses.Genome 42:475-482 Singh K, T Ishii T, A Parco, N Huang, DS Brar, GS Khush. 1996. Centromere mapping and orientation of the molecular linkage map of rice (Oryza sativa ).Proc Natl Acad Sci USA 93:6163-6168 Tang Y, ME Sorrels, LV Kochian, DF Garvin. 2000. Identification of RFLP markers linked to barley aluminum tolerance gene Alp .Crop Sci 40:778-782 Temnykh S, G DeClark, A Lukashova, L Lipovich, S Cartinhour, SR McCouch. 2001. Computational and experimental analysis of microsatellites in rice (Oryza sativa): frequency, length variation, transposon association,and genetic marker potential.Genome Res 11:1444-1452 Thawornwong N and A van Dibst. 1974. Influence or high acidity and aluminum on the growth of lowland rice. Plant and soil 41: 141-159. van Breemen N, and LJ Pons. 1978. Acid sulfate soil and rice. Pages 739-761. Soil and rice. IRRI, Los Banos Philippines. Wang D, J Zhu, Z Li , AH Paterson. 1999. Manual for QTLMapper.Version 1.0. A computer software for mapping QTLs Wang GL, DJ Mackill, JM Bonman, SR McCouch, MC Champoux, RJ Nelson. 1994. RFLP mapping of genes conferring complete and partial resistance to blast in a durably resistant rice cultivar.Genetics 136:1421-1434 Wu P, CD Liao, B Hu, KK Yi, WZ Jin, JJ Ni , C He. 2000. QTLs and epistasis for aluminum tolerance in rice (Oryza sativa L.) at different seedling stages.Theor Appl Genet 100:1295 –1203 Xiao J, J Li, S Grandillo, SN Ahn, L Yuan, SD Tanksley, SR McCouch SR. 1998. Identification of trait-improving quantitative trait loci alleles from a wild rice relative,Oryza rufipogon .Genetics 150:899-909 Xiong L, KD Lui, XK Dai, SW Wang, CG Xu, DP Zhang, MAS Maroof, T Sasaki, Q Zhang. 1997.A high density RFLP map based on the F 2 population of a cross between Oryza sativa and O.rufipogon using Cornell and RGP markers.Rice Genet Newslett 14:110- 115 Xuan VT, LT Duong, and VT Guong. 1982. Deepwater rice trials in farmer field in the Mekong Delta in Vietnam. Pages 271-278 in Proceeding of the 1981 Int. Deepwater rice Workshop IRRI, Los Banos, Philippines. Yoshida S, DA Forno, JA Cock, KA Gomez. 1976. Laboratory manual for plant physiological studies of rice,3rd edn.International Rice Research Institute, Manila, The Philippines Yu J, S Hu, J Wang, GKS Wong et al. 2002. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp.indica ). Science 296:79-92 Zhang WP, XY Shen, P Wu, B Hu, CY Liao. 2001. QTLs and epistasis for seminal root length under a different water supply in rice (Oryza sativa L.).Theor Appl Genet 103:118-123
21. Chương 6 CƠ SỞ DI TRUYỀN TÍNH CHỐNG CHỊU THIẾU LÂN 6-1. GIỚI THIỆU CHUNG Hiện tượng thiếu lân trong đất canh tác rất phổ biến trong vùng trồng lúa ở Châu Á, nhất là đất phèn, đất acid ở miền Nam Việt Nam. Hiện tượng thiếu lân do nhiều nguyên nhân khác nhau, tùy theo tính chất của đất trồng lúa: khả năng cố định lân của đất, hàm lượng lân dễ tiêu và lân tổng số qúa thấp trong đất. Ở Châu Á, diện tích đất trồng lúa bị thiếu lân nghiêm trọng ước khoảng 35 triệu ha (Ni và ctv. 1998). Sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giống lúa chống chịu hay không chống chịu với điều kiện thiếu lân đã được ghi nhận (IRRI 1971, 1976, Katyal và ctv. 1980, Gunawardena và ctv. 1978, Ikehashi và Ponnamperuma 1978, Senanayake 1984, Fageria và ctv. 1988), mở ra triển vọng chọn tạo giống lúa năng suất cao kết hợp với tính chống chịu thiếu lân (phosphorous deficiency). Những giống lúa như vậy có thể được chia thành hai dạng hình • Giống chống chịu điều kiện P trong đất cao, nhưng khả năng cố định P rất lớn • Giống chống chịu điều kiện P trong đất rất thấp, không có hiện tượng cố định Trong dạng hình thứ hai, biện pháp bón thêm phân lân có tính khả thi và hiệu qủa hơn hết, nhưng ở những vùng lúa nước trời, người ta khó có thể thuyết phục nông dân bón phân lân cho đến khi họ thấy được bón lân thực sự mang lại hiệu qủa về năng suất, và chứng minh cho họ thấy đáp ứng của phân lân rất chậm và từ từ cho cây lúa sử dụng, so với hiệu qủa tức thì của việc bón phân đạm. Lân là một nguyên tố vô cùng cần thiết đối với sinh vật. Nó là thành phần quan trọng trong kiến trúc của phosphate đường, nucleic acid, coenzyme, và phospholipid. Là một thành phần của nucleic acid, nó tham gia trong qúa trình phân cắt tế bào và truyền tín hiệu di truyền đối với những tính trạng. Nó còn có chức năng dự trữ năng lượng dưới dạng adenosine triphosphate cũng như vận chuyển năng lượng trong suốt qúa trình tổng hợp đường, tinh bột và protein. Dưới dạng “nicotamide adenine dinucleotide phosphate”, lân đóng vai trò vận chuyển ion H+ trong chu trình Krebs và chu trình phân giải glucose (glycolysis) Cây trồng hấp thu lân từ trong đất. Tất cả P trong đất bắt nguồn từ microcrystallite apatite của đá mẹ “magmatic” (Chaubey và ctv. 1994) 6-1-1. Đất thiếu lân Thông thường, hiện tượng thiếu dinh dưỡng trong đất đi kèm theo độ pH đất. Cả hai nhóm đất acid và đất kiềm đều có hiện tượng thiếu lân. Tính chất acid của đất làm gia tăng hàm lượng nhôm, măn-gan và sắt trong dung dịch đất (Ikehashi và Ponnamperuma 1978, Clark và Brown1974). Lân tác động với Al, Mn, và Fe dưới dạng hợp chất khó hòa tan. Trong đất kiềm, P dễ tiêu tùy thuộc vào hoạt tính của Ca. Phân P được bón vào bị giữ lại ở mặt ngoài theo cơ chế hấp phụ (adsorption) và bị kết tủa ở dạng calcium phosphate, nếu chúng duy trì ở dạng này, cây không thể hấp thụ được, dần dần, lân được chuyển đổi thành những hợp chất apatite khó tan. Sự thiếu lân xảy ra khá phổ biến trong đất trồng lúa ở Bangladesh, Cambodia, Nhật, nepal, Philippines, Đông Nam Trung Quốc, Sri Lanka, Đài Loan, Thái Lan và Việt Nam (Ikehashi và Ponnamperuma 1978) 6-1-2. Hiện tượng thiếu lân trên cây lúa P là một nguyên tố di chuyển trong cây nói chung. Xét trên góc độ dinh dưỡng, lân di chuyển từ lá già sang lá non. Hiện tượng đầu tiên được ghi nhận trên lá già, biểu thị màu xanh
22. đậm. Trong suốt thời gian bị stress do thiếu lân, sắc tố đỏ trên lá lúa cũng có thể xuất hiện, cho kết qủa pha trộn giữa hai màu xanh đỏ. Cây giảm cường lực và năng suất. Rễ cây trở nên mọc dài ra, mảnh khảnh, đôi khi ở dạng sợi mỏng như chỉ. Trong trường hợp cây lúa, hiện tượng thiếu lân biểu hiện ở giai đoạn rất sớm, cây thấp lùn, cằn lại, đẻ chồi kém. Lá lúa trở nên ngắn, hẹp chiều ngang, mọc thẳng và có màu xanh đậm. Bởi vì P di chuyển, nên lá lúa non vẫn còn thể hiện sự khỏe mạnh bình thường so với lá già, có thể lá già đã chuyển sang màu nâu và chết. 6-1-3. Biểu hiện của giống lúa chống chịu thiếu lân Một giống lúa được gọi là chống chịu với stress do thiếu P khi giống ấy sản xuất ra một khối lượng chất khô nhiều hơn giống nhiễm khi chúng được trồng trong điều kiện thiếu lân (Chaubey và ctv.1994), và chúng sản sinh ra lượng chất khô tương đương với các giống nhiễm khi được cung cấp lân tối hảo. Ưu điểm của giống chống chịu như vậy là chúng có thể duy trì khá ổn định ở cả hai điều kiện có lân bình thường, hoặc lân được cung cấp với một lượng ít cho cây (Gerloff 1987). Một giống cây trồng vừa chịu được điều kiện đất nghèo lân, vừa chịu được điều kiện bón lân thấp hay bón bình thường được định nghĩa là giống không đáp ứng với P (P-non responsive genotype) (Gerloff 1987) Người ta chưa thể định tính một cách chính xác những thuộc tính của sự kiện “ mức độ hiệu qủa của lân đối với cây trồng” (P-efficiency). Khái niệm P-efficiency là một ý tưởng được nhiều nhà khoa học đề cập. Do đó, có nhiều định nghĩa khác nhau của các nhà nghiên cứu đối với khái niệm này. • Clark và Brown (1974 a) cho rằng: “hiệu qủa đáp ứng của P” là khả năng của cây trồng ở một mức độ P cho phép để tích lũy hàm lượng P cao hơn. • Koyama và ctv. (1973) cho rằng: một giống biểu hiện tính chống chịu lân phải có năng lượng dinh dưỡng cao hơn đối với P trong đất so với giống nhiễm. • Giống chống chịu thiếu lân là giống có số lượng chất khô được sản sinh ra trên đơn vị hàm lượng P được hấp thu bởi cây trồng (Chaubey và ctv. 1994) Tuy nhiên, những định nghĩa này trên đều thống nhất: chỉ số thu hoạch (HI = harvest index) là thuộc tính quan trọng của “hiệu qủa đáp ứng của P” • Fox (1978) cho rằng “ hiệu qủa đáp ứng của P” là số lượng chất khô có thể thu hoạch được trên một đơn vị thời gian, trong điều kiện cây được trồng trong đất thiếu lân • Clark (1976) cho rằng cây có hiệu qủa đáp ứng với P cao phát triển tốt hơn, sản sinh nhiều chất khô hơn, biểu hiện hiện tượng thiếu lân ít hơn so với cây có hiệu qủa đáp ứng với P thấp, khi chúng được trồng so sánh trong điều kiện đất thiếu lân • Vài tác giả khác định nghĩa về “hiệu qủa đáp ứng của P” như là những giá trị đo lường của trọng lượng chất khô trên đơn vị lân được sử dụng, và trên đơn vị lân hấp thu (Chaubey và ctv. 1994) • Blair và Cordero (1978) cho rằng một cây có “hiệu qủa đáp ứng với P” khi nó biểu hiện khả năng hấp thu P cao trên đơn vị chiều dài rễ, hoặc trên đơn vị diện tích Những kết qủa nghiên cứu về sinh môi học được thực hiện đối với các loài hoang dại cho thấy khả năng hấp thu P trên một đơn vị chiều dài rễ hay trên một đơn vị diện tích và việc sử dụng P bên trong cây, không có thể được xem như chức năng thích nghi của cây trong điều kiện bị stress do thiếu lân (Chapin 1980) Do đó, mức độ thích nghi của các thông số này được xem như những tiêu chuẩn có tính chất phân lập giống chống chịu và giống nhiễm, vẫn còn là câu hỏi lớn chưa có giải đáp. Một trong những tiêu chuẩn phải lựa chọn để đánh giá “hiệu qủa đáp ứng với P” có thể là sự tích lũy P trên đơn vị trọng lượng chất khô được tích lũy trên một đơn vị thời gian (Chesholm và Blair 1988b)
23. Tốc độ tăng trưởng chậm làm giảm stress có tính chất biến dưỡng của cây trồng trong điều kiện đất thiếu lân, là một tiến trình rất có hiệu qủa để chọn lọc cây có hiệu qủa đáp ứng với P cao (Chapin 1980). Chesholm và Blair (1988a) cho rằng tốc độ tăng trưởng tương đối và sự phân bố chất khô đến rễ và chồi thân có thể được sử dụng làm tiêu chuẩn chọn lọc cây chống chịu và cây nhiễm với stress do thiếu lân tốt hơn so với phương pháp thu hoạch trọng lượng chất khô ở giai đoạn cuối cùng Trong cây lúa, nhất là cây lúa dạng hình cải tiến, năng suất cao, sự thiếu lân thể hiện các yếu tố hạn chế rất nghiêm trọng cho sự tăng trưởng (Gunawardena và Wijeratne 1978). So sánh với các loài cây trồng khác, cây lúa có sức chống chịu thiếu lân tốt hơn hết (Chaubey và ctv. 1994) Giống lúa chống chịu thiếu lân sẽ tạo ra khả năng hấp thu lân cao hơn giống nhiễm (Koyama 1973). Giống lúa có hiệu qủa đáp ứng với P có xu hướng hấp thu một lượng lớn P và sử dụng nó một cách có hiệu qủa trong điều kiện trồng chúng ở đất nghèo lân (Katyal 1984) Tính chống chịu sự thiếu lân của giống lúa được đo lường bằng giá trị: số chồi / cây, năng suất (Gunawardena 1979). Trọng lượng khô của chồi là tính trạng rất nhạy cảm với hiện tượng thiếu lân (Fageria và ctv. 1988), kế đến là trọng lượng khô của rễ, số chồi. 6-2. KỸ THUẬT THANH LỌC Kỹ thuật thanh lọc giống lúa chống chịu stress do thiếu lân được IRRI đề xuất: Bốn hạt thóc nẩy mầm được chọn từ mỗi giống lúa được đặt trên một tấm lưới nylon, có khung là tấm xốp trắng, giúp cây nổi trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có chứa 0,5 mg / lít P đặt trong thau nhựa có thể tích 5 lít (Ponnamperuma 1977). Một nghiệm thức khác với 4 hạt nẩy mầm / giống được trồng trong môi trường dinh dưỡng đối chứng với 10 mg / l P. Giống lúa IR26 được xem như giống đối chứng chống chịu (T), và IR36 là đối chứng nhiễm (S). Sau mỗi loạt bao gồm 50 giống thanh lọc là xen giữa bởi giống đối chứng T và S. Điều chỉnh độ pH của môi trường dinh dưỡng hàng ngày ở pH 6,0, và dung dịch dinh dưỡng được thay mỗi tuần một lần Bốn tuần sau khi gieo, hiệu qủa đáp ứng với P của mỗi giống lúa được quan sát và cho điểm theo phần trăm số chồi tương đối (relative tiller % = RT %) Số chồi trong dung dịch chứa 0,5 ppm P RT% = x 100 Số chồi trong dung dịch chứa 10,0 ppm P RT% được chuyển đổi thành thang điểm chuẩn trong hệ thống đánh giá (SES) của Viện Lúa Quốc Tế RT% Thang điểm SES Hiệu qủa đáp ứng với P 80-100 1 Cao 60- 79 3 Hiệu qủa 40- 59 5 Trung bình 20- 39 7 Không hiệu qủa 0- 19 9 Rất không hiệu qủa Trong điều kiện đồng ruộng, IRRI đề nghị phương pháp thí nghiệm trên ruộng nông dân. Phân tích P tổng số, P dễ tiêu trước và sau khi ngập nước. Hai lô có bón lân và không bón lân đều được cày, xới, đánh bùn, và san mặt ruộng giống nhau. Bón 50-25-20 kg NPK / ha cho lô đối chứng và 50-0-20 kg NPK / ha cho lô xử lý thiếu lân. Các giống lúa được cấy thành hàng dài 5m, khoảng cách cấy 20x20 cm. Giống chuẩn nhiễm được trồng sau 20 dòng,
24. và giống chuẩn chống chịu được trồng ngẫu nhiên trong các giống trắc nghiệm. Vào lúc 4-8 tuần sau khi cấy, người ta tiến hành đo đếm số chồi / cây. Vào lúc lúa chín, chọn 20 khóm lúa / giống ở hàng giữa để thu hoạch, rồi ghi nhận năng suất. Hoạt động của acid phosphatase (APA) được xét nghiệm bằng cách sử dụng p- nitrophenyl-phosphate làm hoạt chất ở pH 4,0 (Clark 1976) Xác định hàm lượng lân trong chồi và rễ lúa tính bằng mg / cây và xác định hiệu qủa sử dụng P ở chồi (SPUE), ở rễ (RPUE) trên một đơn vị lân được hấp thụ (Ni và ctv. 1996) 6-3. CƠ CHẾ CHỐNG CHỊU THIẾU LÂN Tính trạng chống chịu stress do thiếu lân của cây lúa có thể được xem xét trên hai cơ chế khác nhau (Ni và ctv. 1998): (1) hiệu ứng bên trong (internal efficiency), và (2) hiệu ứng bên ngoài (external efficiency). • Hiệu ứng bên trong biểu thị yêu cầu lân của cây ở mức độ thấp • Hiệu ứng bên ngoài là khả năng bắt giữ, hấp thu lân không dễ tiêu trong đất Cơ chế hiệu ứng bên trong có thể được nghiên cứu thông qua phương pháp thanh lọc trong dung dịch Yoshida như mô tả ở trên với 2 nghiệm thức P = 0,5 mg / l và P = 10 mg/l Ni và ctv. (1996) đã thự hiện một thí nghiệm để giải thích cơ chế này như nhau: Chọn 6 cây mạ non / mỗi giống lúa xử lý ở 2 nghiệm thức đủ lân (10ppm) và thiếu lân (0,5ppm) trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida. Lấy mẫu vào lúc 2 tuần, 4 tuần sau khi nuôi cấy. Phân tích hàm lượng lân trong chồi (SPC) và trong rễ (RPC), phân tích hiệu qủa sử dụng P trên tổng lượng chất khô ở chồi (SPUE: shoot-P use efficiency) và rễ (RPUE: root-P use efficiency), tính bằng mg hàm lượng lân hấp thu. Biến thiên kiểu gen đối với tính trạng chống chịu thiếu lân được định nghĩa là hiệu số giữa hai giá trị thu được trong hai điều kiện đủ lân và thiếu lân (Gouley và ctv. 1993) Bảng 1: So sánh giá trị trung bình SPC, RPC (mg / cây) và SPUE, RPUE (g/mg) trong hai nghiệm thức xử lý đủ lân và thiếu lân, vào lúc 2 tuần sau khi nuôi cấy (Ni và ctv. 1996) Giống 0,5 ppm P 10 ppm P Giảm SPC RPC SPC RPC SPC RPC Tesanai 2 0,35a 0,13a 1,60a 0,28a 1,25a 0,15a IR55178 0,29b 0,09b 1,54a 0,28a 1,25a 0,19a IR20 0,19c 0,06c 0,89b 0,21b 0,70b 0,15a pp2462-11 0,36a 0,13a 2,06c 0,32a 1,70c 0,19a IR31406 0,16c 0,09b 1,82d 0,41c 1,66c 0,25b Giống 0,5 ppm P 10 ppm P Tăng SPUE RPUE SPUE RPUE SPUE RPUE Tesanai 2 0,33a 0,36a 0,11a 0,11a 0,22ab 0,25a IR55178 0,37a 0,44b 0,12a 0,10a 0,25ab 0,34b IR20 0,29b 0,48b 0,10a 0,09a 0,19a 0,39b pp2462-11 0,37a 0,34a 0,10a 0,10a 0,27b 0,24a IR31406 0,36a 0,33a 0,12a 0,09a 0,24ab 0,24a Những số theo sau cùng một chữ không khác biệt có ý nghĩa ở mức độ 0,01 (DMRT) Biến thiên kiểu gen có ý nghĩa đối với SPC, RPC, với sự giảm giá trị giữa 2 nghiệm thức quan sát 10ppm P và 0,5ppm P. Giống IR20 thể hiện tính chống chịu cao đối với stress do thiếu P, chênh lệch giá trị trung bình thấp nhất ở chồi và rễ (bảng 1), trong khi đó IR31406 được xem là giống nhạy cảm nhất với stress
25. Biến thiên kiểu gen của SPUE và RPUE có ý nghĩa ở nghiệm thức 0,5ppm P, nhưng không có ý nghĩa ở nghiệm thức 10ppm P. Khác biệt giá trị tăng lên của SPUE và RPUE rất có ý nghĩa trong khi giảm hàm lượng lân từ 10ppm xuống 0,5ppm (bảng 1). IR20 thể hiện sự khác biệt rõ nhất đối với giá trị SPUE Bảng 2: Hoạt động của acid phospatase ở rễ (RAPA) và hoạt động acid phosphatase tiết ra bên ngoài (EAPA) tính bằng μmol PNP/g trọng lượng rễ tươi / giờ, trong điều kiện thiếu lân và đủ lân, giai đoạn 2 và 4 tuần sau khi nuôi cấy trong môi trường (Ni và ctv. 1996) Giống 0,5ppm P 10ppm P P-stress kích hoạt RAPA EAPA RAPA EAPA Psi-RAPA Psi-EAPA (2 tuần sau khi trồng) Tesanai 2 172,94a 29,73a 121,71a 12,57ac 51,23a 17,16a IR55178 98,26b 27,37c 68,97b 13,22ab 29,29b 14,15b IR20 141,26c 37,93b 116,68a 15,23b 24,58c 22,02c pp2462-11 183,32a 25,37c 129,90a 13,35ab 53,42d 12,02d IR31406 80,84c 19,75d 96,00b 10,66c -15,16e 9,09e (4 tuần sau khi trồng) Tesanai 2 179,16a 26,55a 158,10a 15,81a 21,06a 10,74a IR55178 200,48b 33,13b 175,26b 21,75b 25,22b 11,38a IR20 147,81c 30,14c 144,55c 19,07c 3,26c 11,07a pp2462-11 176,77a 22,65d 155,16a 14,90d 18,61d 7,75b IR31406 117,55d 21,29d 107,87d 13,62d 9,68c 7,67b Những số theo sau cùng một chữ không khác biệt có ý nghĩa ở mức độ 0,01 (DMRT) Psi: viết tắt từ chữ “P-stress induced” Hoạt động của men acid phosphatase trong rễ (RAPA: root-acid phosphatase acitivities) và acid phosphatase tiết ra bên ngoài (EAPA: excreted acid phosphatase acitivities) được xác định. Sau đó, người ta ước đoán giá trị P-stress kích hoạt RAPA và EAPA bằng cách tính hiệu số chênh lệch giữa RAPA và EAPA trong 2 nghiệm thức đủ lân và thiếu lân. Khi thiếu lân, giống lúa bị kích hoạt sản sinh ra men acid phosphatase ở rễ và bên ngàoi vùng rễ. Biến thiên kiểu gen đối với giá trị RAPA và EAPA rất có ý nghĩa ở mức độ 0,01 (bảng 2) Giá trị Psi-RAPA không ổn định giữa các giống so với giá trị Psi-EAPA. Sau 2 tuần, giá trị Psi-RAPA của giống pp2462-11 cao nhất, và giá trị Psi-EAPA của IR20 cao nhất, sau đó là giống Tesanai-2. Biến thiên kiểu gen của giá trị Psi-EAPA giảm theo thời gian sinh trưởng của cây (bảng 2). Hayashi và Takijima (1953) quan sát hoạt động phosphatase ngoại bào ở rễ lúa trong điều kiện thiếu lân sẽ gia tăng gấp 2-fold so với rễ lúa mọc trong điều kiện bình thường. Những nghiên cứu trước đây đã ghi nhận rễ cây lúa 12 ngày tuổi có hoạt động phosphatase cao gấp 5 lần trong đất thiếu lân so với cây lúa bình thường, và sau đó hoạt động này giảm xuống sau 20 ngày tuổi (Hirata và ctv. 1982) Psi thay đổi theo hàm lượng lân ở trong rễ và trong chồi. Sau hai tuần, Psi-EAPA tương quan chặt với sự giảm SPC, và sau 4 tuần Psi-EAPA tương quan chặt với sự giảm RPC (Ni và ctv. 1996). Tương quan âm cũng được ghi nhận giữa sự giảm SPC và sự tăng RPUE, giữa sự giảm SPC và sự giảm RPC. Giống lúa chống chịu thiếu lân được đánh giá trên cơ sở mức độ suy giảm hàm lượng lân tích lũy và mức độ gia tăng hiệu qủa sử dụng P trong điều liện hàm lượng P thấp ở dung dịch dinh dưỡng Cơ chế tránh né stress do thiếu lân của cây trồng được thể hiện bằng cách điều tiết sự tăng trưởng chậm lại trong đất nghèo lân, thí dụ như các loài thuộc Agrostis, Eucalyptus, Carex, v.v (Chaubey và ctv. 1994) 6-3. DI TRUYỀN TÍNH CHỐNG CHỊU THIẾU LÂN
26. Người ta đã cố gắng tìm hiểu những tính trạng di truyền có liên quan đến hiện tượng chống chịu sự thiếu lân, thông qua tính trạng hình thái học, sinh lý học, sinh hóa học trong qúa trình hấp thu khoáng chất, cơ chế hấp thu Tính trạng hình thái học có liên quan là chiều dài rễ, đường kính rễ, lông hút, nhưng chúng thường thể hiện với giá trị biến thiên cao do ảnh hưởng mạnh mẽ của môi trường chưa kiểm soát được trong thí nghiệm Tính trạng hấp thu P trong đất và tính trạng sử dụng P được hấp thu ở trong cây là hai yếu tố không liên kết với nhau Những giống lúa IR8, IR20, IR36, IR64, Mahsuri, TCNJ1, H4, Bg90-2 được đánh giá là giống có hiệu qủa đáp ứng với P cao, và chúng có mức thích nghi rộng, nên được xem như vật liệu cho nghiên cứu di truyền và tạo giống mới Thuận lợi của kỹ thuật sinh học phân tử đã giúp cho các nhà nghiên cứu có thể thực hiện bản đồ di truyền dễ dàng hơn, nhất là đối với tính trạng số lượng như thế này. Majumder và ctv. (1989) đề xuất giả thuyết rằng tính trạng chống chịu thiếu lân của cây lúa là một tính trạng di truyền số lượng với ảnh hưởng rất mạnh mẽ về ưu thế lai. Trong khi đó, kết qủa nghiên cứu của Chaubey và ctv. (1994) cho những nhận xét khác hơn QTL điều khiển tính chống chịu thiếu lân đã được thực hiện trên quần thể con lai của Nipponbare x Kasalath (japonica x indica) (Wissuwa và ctv. 1998). Tính chống chịu này biểu hiện thông qua sự khác biệt giữa các kiểu gen về mức độ hấp thu P (P-uptake) và mức độ hiệu qủa sử dụng P bên trong. Một QTL điều khiển tính trạng “P-uptake” được tìm thấy trên bản đồ ở vai nhiễm dài thuộc nhiễm sắc thể số 12, quãng 13,2 cM, liên kết với marker kế cận C443-G2140. Vị trí xác định ở 54,5 cM, và cách marker C443 một khoảng cách di truyền có giá trị 3,0 cM. Những QTL thứ yếu được tìm thấy trên nhiễm sắc thể số 2, 6 và 10 (Wissuwa và ctv. 2002). Công trình đầu tiên của Ni và ctv. (1998) về sự có mặt của một QTL chủ lực điều khiển tính chống chịu thiếu lân đã được công bố trên nhiễm sắc thể số 12. Nó dường như chưa rõ ràng về ảnh hưởng của QTL đối với mức độ hấp thu P hoặc hiệu qủa sử dụng P. Một nghiên cứu sâu hơn trên quần thể dòng gần như đẳng gen (NIL) được phát triển bởi ba lần hồi giao với Nipponbare. Dòng NIL này có tên là “NIL-C443” với 91% nền tảng di truyền của Nipponbare, nhưng mang trong nó một đoạn Kasalath 50-cM trên nhiễm sắc thể số 12, thể hiện cặp marker thuộc quãng C443-G2140, nơi định vị của một QTL giả định điều khiển tính chống chịu thiếu lân. Ảnh hưởng của QTL chủ lực này một lần nữa xác định cả trong hai điều kiện thí nghiệm: đồng ruộng và trong chậu (Wissuwa và Ae 2001a, 2001b). trong điều kiện trồng lúa trên đất thiếu lân, dòng NIL-C443 có khả năng hấp thu P gấp 3 lần so với Nipponbare. Trong khi đó, cả hai không biểu hiện sự khác biệt gì khi trồng chúng trong đất có đủ lân. Ảnh hưởng của QTL C443 rất chuyên biệt đối với hiện tượng thiếu lân. Đối với yêu cầu phát triển chiến lược MAS (chọn giống nhờ marker phân tử), hay yêu cầu “map-based cloning”, vị trí của một QTL cần được biết rõ với mức độ tin cậy và chính xác cao (Paterson và ctv. 1990, Yano và Sasaki 1997, Yano và ctv. 2000) Hiện nay, QTL C443 được thực hiện bản đồ với một quãng 13,2 cM, và việc xác định QTL C443 đã dựa trên cơ sở một dòng NIL có chứa “50-cM Kasalath segment”. Điều này chưa đủ cho yêu cầu thực hiện MAS, bởi vì một quãng 13 cM có thể còn chứa nhiều gen không mong muốn khác xen vào, nhất là đối với giống Kasalath, donor của QTL C443, một giống lúa bản địa có đặc tính nông học tổng quát rất kém. Hơn nữa, có thể một QTL được hình thành trên bản đồ có quãng giả định qúa rộng như vậy tương ứng với một “cluster” của những gen, mỗi gen có ảnh hưởng tương đối nhỏ. Quần thể “mapping” được phát triển bằng phương pháp hồi giao hoàn toàn phù hợp với yêu cầu thành lập bản đồ QTL (Yano 2001) vì hầu hết các yếu tố di truyền không liên quan đến QTL này trong quần thể phân ly qúa lâu
27. 6-3-1. Lập bản đồ QTL bằng AFLP Quần thể cận giao tái tổ hợp (RIL) F8 của cặp lai IR20 x IR55178-3B-9-3 bao gồm 285 dòng đã được sử dụng trong nghiên cứu (Ni và ctv. 1998). IR20 được xem là giống cho gen chống chịu. Phân tích AFLP theo phương pháp của Vos và ctv. (1995). cả hai hệ thống PstI/MseI và EcoRI/MseI đều được sử dụng để phát sinh ra những marker đa hình AFLP, với 58 cặp primer. Một bộ AFLP marker trên bản đồ của quần thể đơn bội kép IR64/Azucena và quần thể RIL của IR74/FR13A đã được sử dụng như những marker có tính chất neo đối với mỗi nhóm liên kết gen. tất cả những AFLP marker được tìm thấy trên 12 nhóm liên kết gen ở LOD > 3, trong phân tích MAPMARKER (Lander và ctv. 1987). Khoảng cách trên bản đồ di truyền (cM) được tính dựa theo hàm Kosambi (Kosambi 1944) Điều tra DNA trên bố mẹ cho thấy: có 26 RFLP marker đa hình. Như vậy 26 RFLP marker này và 30 AFLP đã được dùng như những “anchor” (neo) để hình thành bản đồ di truyền (Ni và ctv. 1998), với tổng số chiều dài là 1371,8 cM, trung bình của quãng là 7,62 cM, với giá trị nhỏ nhất trên nhiễm sắc thể số 4 (2,07 cM), và giá trị lớn nhất trên nhiễm sắc thể số 3 (11,49 cM). Có 7 đoạn còn trống >30cM, và 2 đoạn >50cM trên nhiễm thể số 1 và 2 (hình 6-1). Bảng 3: QTL điều khiển các tính trạng có liên quan đến hiện tượng chống chịu thiếu lân: RTA: khả năng đẻ nhánh tương đối, RSDW: trọng lượng khô tương đối của chồi, RRDW: trọng lượng khô tương đối của rễ, theo phương pháp phân tích SMA (single- marker analysis) (Ni và ctv. 1998) Tính QTL Quãng giữa 2 NST LOD Marker Trung bình alen Pe R2 trạng marker IR20 IR55178 (%) RTA 1 E4/M1-8- 1 2,42 E4/M1-8 93,1 73,7 27,0 9,9 E4/M3-8- 2 E3/M8-3- 6 7,82 E3/M8-3 65,2 99,6 -34,4 33,6 E1/M7-7- E5/M4-3 68,8 99,8 -31,0 27,5 E1/M7-7 71,0 98,8 -27,8 23,1 3 RG9-RG241 12 16,51 RG9 104,6 61,7 42,9 54,0 P1/M7-7 100,8 64,5 36,3 37,7 RG241 102,1 66,9 35,2 35,6 E1/M5-7 97,5 64,5 33,0 31,7 E3/M6-4 96,6 67,2 29,4 25,4 RSDW 1 E4/M1-8- 1 2,66 E4/M1-8 68,3 54,1 14,3 10,8 -E4/M3-8 2 E3/M8-3- 6 7,90 E3/M8-3 48,4 70,7 -22,4 34,0 -E1/M7-7 E5/M4-3 50,4 71,5 -21,1 30,7 E1/M7-7 52,7 70,8 -18,1 22,7 3 E1/M7-7-75- 9 2,47 E1/M7-5 68,6 52,5 16,1 14,9 RG451 4 RG9-RG241 12 16,98 RG9 76,7 45,4 31,3 60,8 RG241 74,3 49,2 25,1 40,4 P1/M7-7 72,8 48,9 23,9 35,7 E3/M6-4 70,6 49,8 20,8 28,0 E1/M5-7 69,3 50,6 18,7 23,3 RRDW 1 E4/M1-8- 1 2,42 E4/M1-8 126,2 104,9 21,3 8,9 ~E4/M3-8 2 E4/M8-3~ 6 5,80 E3/M8-3 97,9 130,2 -32,3 25,2 ~E1/M7-7 E5/M4-3 100,4 132,1 -31,7 23,4 E1/M7-7 103,2 131,6 -28,4 18,9 3 RG9~RG241 12 12,05 RG9 139,9 92,9 47,0 44,2 RG241 138,9 96,8 42,1 37,4
28. E3/M6-4 131,8 98,7 33,1 24,2 P1/M7-7 131,1 99,3 81,8 24,6 E1/M5-7 128,6 101,5 27,1 16,8 NST: nhiễm sắc thể, Pe: ảnh hưởng kiểu hình, R2: phần trăm biến thiên kiểu hình được giải thích bởi QTL Nhiễm sắc thể số 6 Nhiễm sắc thể số 12 Hình 6-1: Bản đồ QTL tính trạng liên quan hiện tượng chống chịu thiếu lân (RTA, RSDW, RRDW), quần thể RIL của tổ hợp lai IR20 / IR55178, trên nhiễm sắc thể số 6 và 12, với AFLP marker (Ni và ctv. 1998)
29. Gen chủ lực điều khiển tính chống chịu thiếu lân được ký hiệu là PHO. Gen này được phát hiện nhờ AFLP marker: P1/M7-7 và E1/M5-7, và RFLP marker RG9 – RG241 trên nhiễm sắc thể số 12 (hình 6-1) (Ni và ctv. 1998). QTL điều khiển tính trạng khả năng đẻ nhánh giải thích được 54% biến thiên kiểu hình, tương tự, QTL điều khiển tính trạng trọng lượng khô của chồi: 60,8% và QTL điều khiển tính trạng trọng lượng khô của rễ: 44,2% (bảng 3). QTL được phát hiện trên nhiễm sắc thể số 6 ở marker loci E3/M8-3 và E1/M7-7 giải thích được 33,6% biến thiên kiểu hình của tính trạng khả năng đẻ nhánh, 34% trọng lượng khô của chồi, 25,2% trọng lượng khô của rễ (hình 6-1, bảng 3) QTL được phát hiện trên nhiễm sắc thể số 1 ở marker loci E4/M1-8 và E4/M3-8 giải thích được 9,9% biến thiên kiểu hình của tính trạng khả năng đẻ nhánh, 10,8% trọng lượng khô của chồi, 8,9% trọng lượng khô của rễ Chỉ có một QTL được phát hiện trên nhiễm sắc thể số 9 ở marker loci E1/M7-5 và RG451 giải thích được 14,9% biến thiên kiểu hình của tính trạng trọng lượng khô của chồi. Ở cây bắp, trọng lượng khô trung bình được sử dụng như một thống số để đánh giá tính chống chịu thiếu lân (Reiter và ctv. 1991). Tuy nhiên, khả năng đẻ nhánh tương đối (RTA) vẫn được xem như dấu chuẩn có mức độ tin cậy cao nhất trong đánh giá tính chống chịu thiếu lân của cây lúa (Hung 1985, Chaubey và ctv. 1994). Chúng ta vừa thảo luận ở trên với 3 tính trạng: khả năng đẻ nhánh tương đối (RTA), trọng lượng khô tương đối của chồi (RSDW) và trọng lượng khô tương đối của rễ (RRDW). Chúng tham gia rất tích cực vào hiện tượng chống chịu thiếu lân. Trong đó, RTA có thể được xác định một cách dễ dàng hơn trong mối quan hệ với tính chống chịu và được xem như tiêu chuẩn chọn lọc then chốt. 6-3-2. Lập bản đồ QTL bằng RFLP Công trình nghiên cứu của Wissuwa và ctv. (1998) ở Nhật Bản có thể được xem như thí nghiệm kiểu mẫu trong phân tích QTL có liên quan đến tính trạng chống chịu thiếu lân. Nhóm tác giả này căn cứ trên hai hiện tượng cơ bản: khả năng hấp thu P và hiệu qủa sử dụng P trong cây. Giống lúa japonica có tên “Nipponbare” (có nguồn gốc ở Nhật) được lai với giống lúa indica “Kasalath” (có nguồn gốc ở Assam, Ấn Độ). Con lai F1 được lai lui với giống tái tục Nipponbare. Chọn ngẫu nhiên 98 dòng con lai BC1F1, thu hoạch mỗi dòng một đến hai hạt theo phương pháp “SSD” (single seed descent) trong suốt 5 thế hệ liên tục (Lin và ctv. 1998). Tác giả sử dụng lá của quần thể BC1F5 để ly trích DNA và phân tích RFLP (restriction fragment length polymorphism) Trong khi đó, tác giả thức hiện đánh giá kiểu hình ở quần thể BC1F16. Quần thể này còn được gọi là BIL (Backcross inbred lines). 6-3-2-1. Đánh giá kiểu hình Bên cạnh đó, nhóm tác giả đã đánh giá kiểu hình của 14 giống lúa có khả năng hấp thu P khác nhau làm chuẩn giá trị để so sánh: IR26, IR36 (IRRI, Philippines), Yamadanishiki (Nhật), Oryza Sabana-6, IAC47, IAC1246, CT11891-2-2-7 (CIAT, Colombia), Progresso, CNA4143, CNA4128, CNA4291, CNA7013 (Brazil), Morogsol (Ấn Độ), WAB 99-84 (WARDA, Tây Châu Phi). Nghiệm thức không bón lân trên đất nghèo lân là nghiệm thức xử lý. Nghiệm thức đối chứng được bón 60kg P2O5 / ha. Sau khi trồng 125 ngày, cây lúa thí nghiệm được đếm số chồi / cây. Số chồi này được cắt và mang về phòng thí nghiệm, sấy khô ở 65oC trong 5 ngày. Mẫu được nghiền sau khi xác định trọng lượng khô của từng mẫu, cho qua rây “1-mm mesh”. Hàm lượng P trong mô được tính trên 1mg mẫu bột lá, sử dụng máy sắc ký để đo P theo phương pháp Hanson (1950), sau khi xử lý với HNO3, HClO4, H2SO4 (3:1:1). Hàm
30. lượng P tổng số được hấp thu được tính theo trọng lượng chất khô và P trong mô, và hiệu qủa sử dụng lân được biểu thị bằng trọng lượng chất khô (g) / mg P được hấp thu Bảng 4: Ảnh hưởng stress do thiếu lân (-P) so với nghiệm thức có bón lân (+P) trong 14 giống lúa đối chứng (Wissuwa và ctv. 1998) Thông số +P -P Giảm Mức độ giảm trong (%) quãng (%) P hấp thu (mg / cây) 8,95 3,48 61,0 28,9-96,5 Hàm lượng P ở mô (mg P / g) 0,86 0,67 22,9 6,8-40,4 Trọng lượng khô (g / cây) 10,45 5,19 50,4 5,3-94,1 Số chồi 9,37 5,00 46,7 15,4-87,5 +P: thí nghiệm được bón 60kg P2O5 / ha -P: thí nghiệm trên đất thiếu P, lân dễ tiêu (1,0 mg P. kg-1 đất, Truog-P; 4,5 mg P / kg đất, Bray2-P) Bảng 5: Hệ số tương quan giữa các tính trạng mục tiêu trong 98 dòng BILs (Wissuwa và ctv. 1998). Tất cả hệ số tương quan đều có ý nghĩa ở mức độ 0,01. Hiệu qủa sử Trọng lượng Số chồi dụng P khô Khả năng hấp thu P (mg/cây) -0,72 0,96 0,75 Hiệu qủa sử dụng P (g trọng lượng khô / -0,60 -0,52 mg P) 0,74 Trọng lượng khô (g / cây) 6-3-2-2. Xây dựng bản đồ QTL Bản đồ liên kết gen bao gồm 245 RFLP marker có nguồn gốc từ chương trình RGP (Rice genome program) của Nhật được mô tả bởi Lin và ctv.(1998). Số liệu về số chồi / cây và hàm lượng lân trong cây được chuyển đổi thành giá trị log trước khi phân tích. Phân tích QTL theo phương pháp CIM (composite interval mapping) của Zeng (1994), trên cơ sở phần mềm PLABQTL (Utz và Melchinger 1996, Haley và Knott 1992) Bởi vì mô hình chuyên môn để phân tích trên quần thể BIL chưa hoàn thiện, các tác giả đã sử dụng số liệu này như số liệu “F2 backcross” và marker dị hợp tử xem như số liệu thiếu. Bước một, qui trình SIM (simple interval mapping) phải được hoàn tất để chọn lọc các giá trị “cofactor”. Chọn trên computer các ngưỡng “F-to-enter” và “F-to-drop” ở mức độ 6.0 nhằm ngăn ngừa trường hợp nhiều marker liên kết với một QTL như là những cofactor. Sử dụng những cofactor này để giảm biến thiên do yếu tố cặn. Tác giả đã tìm kiếm QTL giả định với phương pháp CIM ở thang điểm LOD > 2,80. RFLP và phân tích liên kết trong trường trường hợp dòng BIL (backcross inbred lines) được mô tả khá chi tiết bởi Lin và ctv. (1998). Giá trị khoảng cách trung bình giữa 245 RFLP marker trong bản đồ QTL là 4,8 cM. Phần trăm dị hợp (4,6%) khác biệt không có ý nghĩa với giá trị hi vọng 3,1%, và tỉ lệ phân ly phù hợp với định luật Mendel 3:1 đối với hầu hết các marker. Bốn QTL giả định đối với tính trạng hấp thu P đã được tìm thấy trên nhiễm sắc thể số 2, 6, 10 và 12 (hình 6-2, bảng 6), giải thích được 54,5% biến thiên kiểu hình của tính trạng hấp thu P. Một trong những QTL này liên kết với C443 trên nhiễm sắc thể số 12, có ảnh hưởng chính, và đóng góp rất lớn đến biến thiên kiểu hình (Wissuwa và ctv. 1998)
31. Bảng 6: QTL giả định đối với tính trạng hấp thu P, hiệu qủa sử dụng P, trọng lượng khô, số chồi trong điều kiện stress do thiếu lân (Wissuwa và ctv. 1998) Quãng giữa hai Nhiễm Vị trí Khoảng LOD R2 Ảnh Alen marker thể (cM) cách (%) hưởng dương (cM) thay thế tính Hấp thu P G227-C365 2 106 +3 2,82 5,8 +971 K C498-R1954 6 13 +2 3,52 9,8 +705 K R162-R2447 10 32 +6 4,70 7,7 -621 N G2140-C443 12 30 -3 10,74 27,9 +1938 K Total 16,25 54,5 Hiệu qủa G227-C365 2 106 +3 5,22 9,8 -0,346 N sử dụng P C946-R1854 4 86 -4 4,35 9,4 +0,303 K G2140-C443 12 28 -4 6,57 19,1 -0,465 N Total 11,40 42,1 Trọng C1488-C63 3 86 -1 3,08 6,4 -992 N lượng chất C191-C498 6 10 +1 4,71 9,7 +1560 K khô G2140-C443 12 30 -3 10,50 26,5 +3193 K Total 12,89 45,4 Số chồi R347-C335 4 32 +2 4,37 9,8 +1,84 K C901-G1406 12 2 -1 3,90 9,5 +1,54 K G2140-C443 12 30 -3 7,87 20,6 +1,86 K Total 10,97 40,3 Những marker nằm gần QTL nhất được gạch dưới chữ số trong cột 2 Khoảng cách tính từ marker gần nhất (cM) trong cột 5 Ảnh hưởng thay thế cả hai alen Nipponbare và Kasalath trên cơ sở giá trị chưa chuyển đổi thành logarit Cột cuối cùng biểu thị alen ảnh hưởng kiểu hình của K (Kasalath) và N (Nipponbare) Giá trị “total” của khoảng cách bao gồm tất cả QTL giả định theo mô hình ” multiple-QTL”
32. Hình 6-2: Bản đồ QTL các tính trạng trọng lượng khô (dry weight), hấp thu P (P uptake), hiệu qủa sử dụng P (P-use efficiency), và số chồi (tiller number), trên quần thể BILs của tổ hợp lai Nipponbare x Kasalath, với RFLP marker (Wissuwa và ctv. 1998)
33. Ba trong số bốn QTL chủ lực, có một QTL rất quan trọng thuộc về giống Kasalath. Trong 3 QTL điều khiển tính trạng trọng lượng khô, có 2 QTL định vị trên nhiễm thể số 6 và 12 cùng với tính trạng hấp thu P QTL liên kết với C443 trên nhiễm thể số 12 có ảnh hưởng rất lớn đối với cả 4 tính trạng mục tiêu, giải thích 27,9% biến thiên kiểu hình của hấp thu P, 19,1% đối với hiệu qủa sử dụng P, 26,5% đối với trọng lượng chất khô, và 20,6% đối với khả năng đẻ nhánh (Wissuwa và ctv. 1998). Kết luận này tương đương với nhận xét của Ni và ctv. (1998). Không có QTL nào liên quan đến trọng lượng chất khô được tìm thấy trên nhiễm sắc thể số 2 và 10, nhưng các đỉnh ở cùng những quãng đối với “tính trạng hấp thu P” đã được phát hiện trong trường hợp quãng giữa G222-C365 (LOD=2,30) trên nhiễm thể số 2, và quãng giữa R1629-R2447 (LOD=2,19) trên nhiễm thể số 10. Tương tự, QTL đối với tính trạng trọng lượng chất khô trên nhiễm thể số 3 thể hiện đồng thời với một đỉnh thấy được với hấp thu P nhưng LOD qúa thấp (2,24) Đối với tính trạng hiệu qủa sử dụng P, có 3 QTL giả định giải thích 42,1% biến thiên kiểu hình (bảng 6). QTL chủ lực trên nhiễm thể số 12 và QTL thứ yếu trên nhiễm thể số 2 xuất hiện đồng vị trí với QTL của tính trạng hấp thu P (hình 6-2). Ảnh hưởng alen của Nipponbare làm gia tăng hiệu qủa sử dụng P, và alen của Kasalath làm gia tăng khả năng hấp thu lân, đã được ghi nhận (Wissuwa và ctv. 1998). QTL giả định trên nhiễm thể số 4 không tương ứng với đỉnh trong tất cả tính trạng mục tiêu Đối với tính trạng khả năng đẻ nhánh, 3 QTL giả định giải thích 40,3% biến thiên kiểu hình (bảng 6), trong đó C443 đã giải thích 20,6%. Ảnh hưởng alen của Kasalath làm gia tăng tính trạng này (Wissuwa và ctv. 1998), một tính trạng được xem như tiêu chuẩn chọn lọc của nhiều nhà chọn giống (Ni và ctv. 1998) Những giống chống chịu stress do thiếu lân cần phải phối hợp được cả hai tính trạng hấp thu P và sử dụng P có hiệu qủa ở bên trong cây lúa. Như vậy có hai QTL chung cho cả hai tính trạng này định vị trên nhiễm sắc thể số 2 và 12 với cùng quãng giữa 2 marker G227- C365 và G2140-C443. Ảnh hưởng alen của Kasalath trong 2 QTL này: làm gia tăng hấp thu P, nhưng làm giảm hiệu qủa sử dụng P. Hiện tượng như vậy do sự xuất hiện cả hai loci giữa những quãng đều có ý nghĩa, cả hai liên kết rất chặt chẽ theo kiểu thúc đẩy (repulsion, dạng trans), hoặc chỉ có một loci nằm bên trong quãng với biểu hiện ảnh hưởng ngược đối với hấp thu P và sử dụng hiệu qủa P. Chọn lọc các alen của Kasalath dương tính để cải tiến tính trạng hấp thu lân, đồng thời nó làm giảm hiệu qủa sử dụng P, là không thể chấp nhận được (Wissuwa và ctv. 1998). Tuy nhiên, chính khả năng hấp thu P cao là điều kiện chính để giúp cây lúa chống chịu hiện tượng thiếu lân, trong khi đó hiệu qủa sử dụng lân có ảnh hưởng thứ yếu trong việc gia tăng tính chống chịu thiếu lân. Nhìn lại hệ số tương quan ở bảng 5, chúng ta sẽ thấy rõ hơn điều đó. Trong thí nghiệm này, trọng lượng khô vào lúc 125 ngày sau khi trồng là một giá trị chỉ thị tính chống chịu thiếu lân, bởi vì chúng ta không thể dùng năng suất hạt để xác định trong điều kiện các dòng BIL thể hiện rất khác nhau về thời gian sinh trưởng, dẫn đến ngày thu hoạch rất chênh lệch. Trọng lượng chất khô trong điều kiện đất thiếu lân thay đổi tùy theo khả năng hấp thu P của giống lúa. Fageria và ctv. (1988) không tìm thấy một sự tương quan có ý nghĩa giữa năng suất hạt và khả năng hấp thu P, trong điều kiện thí nghiệm của nhóm tác giả này không qúa nghiêm trọng về ảnh hưởng stress do thiếu lân. Các tác giả ghi nhận: năng suất hạt chỉ giảm khoảng 14% tương ứng với mức độ P được bón vào, và hàm lượng P ở mô vẫn còn duy trì khá tốt, trên 1mg P / gr chất khô, mà ở mức độ này, người ta định nghĩa đó là ngưỡng thiếu lân đối với cây lúa ở giai đoạn đẻ nhánh.
34. Một thí nghiệm khác tại IRRI (1994) cho thấy tương quan giữa hấp thu lân và năng suất hạt r = 0,40, và Koyama (1973) ghi nhận rằng: năng suất hạt tùy thuộc chủ yếu vào khả năng hấp thu P, với khả năng hấp thu P càng cao, mức độ chống chịu thiếu lân càng lớn. Trọng lượng chất khô có tương quan khá chặt với khả năng hấp thu lân so với năng suất hạt trong rất nhiều nghiên cứu trước đó, do sự khác biệt về giống, khác biệt về khả năng chuyển vị P từ mô sinh trưởng sang mô sinh dục (Wissuwa và ctv. 1998), và do sự khác biệt về chỉ số thu hoạch (HI). Những nhà chọn giống đã cố gắng phát triển chương trình cải tiến giống mới, kết hợp khả năng hấp thu P với gia tăng chỉ số HI trong mục tiêu gia tăng sự chống chịu thiếu lân, hơn là tập trung mục tiêu cải tiến hiệu qủa sử dụng lân. Gia tăng hiệu qủa sử dụng P sẽ thu được những ảnh hưởng ngược lại, bởi vì hàm lượng P trong hạt thấp là vấn đề của chất lượng hạt (Hedley và ctv. 1994). Hàm lượng P trong hạt có ảnh hưởng rất lớn đến cây mạ, rễ phát triển nhanh trong giai đoạn đầu, ảnh hưởng đến khả năng hấp thu lân. Khả năng đẻ nhánh tuyệt đối và khả năng đẻ nhánh tương đối chính là những thông tin gián tiếp đối với tính trạng chống chịu thiếu lân của cây lúa (Hung 1985, Chaubey và ctv. 1994), được đề nghị làm giá trị chỉ thị (indicator). Nó có thuận lợi là dễ xác định trong suốt giai đoạn tăng trưởng, không giống như trọng lượng khô hoặc khả năng hấp thu lân. Trong 3 QTL điều khiển tính trạng khả năng đẻ nhánh, có một QTL thể hiện đồng vị trí với QTL(C443) đối với khả năng hấp thu lân và trọng lượng khô. Một trong những yếu điểm của giá trị chỉ thị gián tiếp (khả năng đẻ nhánh) để tìm kiếm QTL đối với tính trạng có liên quan (chống chịu thiếu lân) là: những QTL như vậy có thể đại diện cho những giá trị khác nhau về kiểu gen chỉ có liên quan đến số chồi mà không có ý nghĩa đối với tính trạng mục tiêu sau cùng. Khả năng đẻ nhánh tổng quát và mức độ nhảy cảm đối với hiện tượng thiếu lân có mối liên quan khá cao nếu chúng ta sử dụng số liệu số chồi tuyệt đối, và ngược lại nếu chúng ta sử dụng số liệu số chồi tương đối (tỉ lệ giữa giá trị số chồi bị stress do thiếu lân trên giá trị số chồi ở lô bón lân đầy đủ). Những QTL đối với số chồi trong hình 6-2 cho thấy: chúng định vị ở khu vực 32 cM trên nhiễm thể số 4 và 2 cM trên nhiễm thể số 12, trong quãng có mức độ ý nghĩa cho phép, ảnh hưởng di truyền đến tính trạng số chồi trong điều kiện không có stress (Ray và ctv. 1996). QTL chính trên nhiễm thể số 12 (C443) không kết với với cả hai tính trạng: số chồi (Ray và ctv. 1996) và số bông / bụi (Lin và ctv. 1996). Sử dụng số chồi (một tính trạng gián tiếp) có thể cho chúng ta xác định được một QTL chính của tính trạng chống chịu thiếu lân, nhưng Wissuwa và ctv. (1998) đã thất bại trong việc tìm kiếm những QTL giả định có ảnh hưởng phụ trong tính trạng hấp thu lân, hoặc tính trạng trọng lượng khô. Khả năng hấp thu lân trong đất nghèo lân dường như còn lệ thuộc vào đặc điểm của rễ lúa. Người ta đã tập trung nghiên cứu nhằm giải thích những QTL giả định biểu thị ảnh hưởng của chúng đối với tính trạng chống chịu thiếu lân. Một vị trí trên nhiễm sắc thể số 6 đã được phát hiện (C498, 13-cM) với một QTL phủ lên khu vực ấy liên quan đến khả năng hấp thu lân (Ray và ctv. 1996). QTL này giải thích 10% biến thiên kiểu hình của tổng số rễ trong một cặp lai indica x japonica, và alen của indica có ảnh hưởng dương tính. QTL trên nhiễm sắc thể số 2, 6, và 12 là những ứng cử viên tốt đối với tính trạng khả năng hấp thu lân, bởi vì alen dương tính có nguồn gốc từ Kasalath, giống chống chịu thiếu lân rất ưu việt. Wissuwa và ctv. (1998) đề nghị thiết lập quần thể NIL (neraly-isogenic lines) để tách biệt rõ ràng vùng trên nhiễm sắc thể có chứa QTL giả định đối với khả năng hấp thu lân, và để thực hiện những nghiên cứu cơ bản về sinh lý học, tìm hiểu cơ chế hấp thu P của cây lúa (Yano và Sasaki 1997). Khi ấy, nhà chọn giống có thể áp dụng chiến lược MAS trên cơ sở QTL được xác định rõ ràng, để chuyển khả năng hấp thu P từ giống bản địa Kasalath vào giống cải tiến, có chỉ số HI cao, có năng suất cao, trong điều kiện bị thiếu lân. 6-3-3. Gen Pup-1: một QTL chủ lực làm gia tăng khả năng hấp thu lân Nghiên cứu của tập thể tác giả Wissuwa tại Nhật được phát triển sâu hơn thông qua bản đồ gen Pup-1 (Wissuwa và ctv. 2002). Một QTL được lên bản đồ với sự đáp ứng khá rộng của quãng giữa hai marker bao hàm một “cluster” của các gen, mỗi gen sẽ có một ảnh
35. hưởng nhất định so với một locus đơn độc. Quần thể “mapping” được phát triển theo dạng quần thể NIL trên cơ sở hồi giao với bố mẹ là giống tái tục (recurrent) hoàn toàn thỏa mãn với yêu cầu của kỹ thuật “fine mapping” đối với QTL. Khái niệm này được áp dụng thành công đối với “fine mapping” những QTL mục tiêu trên cây bắp (Dorweiler và ctv. 1993), trên cây cả chua (Alpert và Tanksley 1996), trên cây lúa (Yamamoto và ctv. 1998). Những kết qủa cho thấy vài QTL có thể được xử lý giống như gen đơn theo di truyền Mendel. Wissuwa và ctv. (2002) đã hình thành quần thể lập bản đồ QTL thứ hai bằng cách hồi giao NIL-C443 với Nipponbare. Tại một đoạn phân tử 50-cM marker của Kasalath, người ta đã công bố rất nhiều kết qủa trong chương trình genome cây lúa của Nhật. Các họ F2 được chọn lọc và đánh giá ở ngoài đồng có hàm lượng lân rất nghèo trong đất. Phân tích QTL tiêu chuẩn được hoàn thiện bởi mô hình “substitution mapping” do Paterson và ctv. (1990) đề xuất. NIL-C443 được hình thành thông qua hai lần hồi giao bổ sung của một dòng BC1F2 đã được tuyển chọn trong quần thể “mapping” đầu tiên, với Nipponbare được dùng là giống tái tục. Điều tra kiểu gen nhằm duy trì những alen của Kasalath ở QTL C443, cũng như chọn những alen không phải Kasalath ở các loci không có liên quan, thông qua qui trình sử dụng 118 RFLP marker trên genome cây lúa. Bổ sung thêm chi tiết đoạn nhiễm thể 12 chứa 50-cM Kasalath, NIL-C443 còn chứa những đoạn ngắn Kasalath trên nhiễm thể số 1, 8 và 10, chúng không liên kết với khả năng hấp thu lân trong phân tích QTL sơ khởi (Hình 6-3). Quần thể “mapping” thứ cấp được dùng trong kỹ thuật “fine map” đối với QTL chủ lực điều khiển tính trạng hấp thu P được phát triển thông qua hồi giao giữa NIL-C443 với Nipponbare. Tác giả đã thu thập 150 cây F2 để đánh giá kiểu gen với 42 RFLP marker, và một nhóm phụ gồm 50 gia đình F2 được chọn lọc để đánh giá kiểu hình. Đánh giá kiểu gen được thực hiện với 42 RFLP marker được chọn lọc từ bản đồ gốc, mật độ cao RFLP, với 3267 marker, thuộc chương trình genome cây lúa của Nhật (chúng ta có thể theo dõi trên web site http:rgp.dna.affrc.go.jp/Publicdata.html). Trên nhiễm sắc thể 12, có 22 marker, trong đó 16 marker định vị một đoạn lớn của Kasalath, giữa 30,0 và 72,5 cM. Những marker còn lại phủ trên nhiễm sắc thể số 1 của Kasalath (8 marker), nhiễm sắc thể số 8 (4 marker), và nhiễm sắc thể số 10 (8 marker) (Wissuwa và ctv. 2002). Phân tích QTL được hoàn thành bằng cách sử dụng số liệu của 50 họ F2 để đánh giá kiểu hình. Kết qủa đánh giá kiểu hình cho thấy số chối tương đối trong điều kiện thiếu lân so với điều kiện đủ lân được khẳng định là một dự đoán gián tiếp đối với khả năng hấp thu lân (Ni 1998, Wissuwa và ctv. 1998, 2002) Chúng ta thực hiện một kỹ thuật được gọi là “substitution mapping” (tạm dịch là lập bản đồ chi tiết theo phương pháp loại trừ dần) đối với gen Pup1. 6-3-3-1. Bản đồ QTL của Pup-1 Bảng 7: Bản đồ gen Pup-1 đối với tính trạng khả năng hấp thu lân trên nhiễm thể số 12 (Wissuwa và ctv. 2002) Quãng giữa marker Vị trí LOD R2 Ảnh Ảnh (cM) hưởng hưởng cộng trội Bản đồ trên cơ sở F2 (n=50) S14025-S13126 53,6 16,6 78,9 0,56 0,05ns Bản đồ trên cơ sở F3 (n=160) S14025-S13126 54,8 11,5 28,1 0,69 0,38* Bản đồ QTL đầu tiên của Wissuwa và ctv. 1998
36. C443-G2140 54,5 10,7 27,9 - - Trong kỹ thuật “fine mapping” ở F2, một QTL định vị trên nhánh vai dài của nhiễm thể số 12 đã giải thích 78,9% biến thiên kiểu hình (bảng 7), với 2 marker kế cận S14025 và S13126, nó liên kết với S14025 với khoảng cách 1,3 cM. Nhóm tác giả đã sử dụng ký hiệu Pup-1 (viết tắt từ chữ phosphorous uptake 1) để chỉ định QTL này. Phân tích QTL cho thấy Pup-1 là do hoạt động của gen cộng tính, trong khi đó ảnh trưởng gen trội không có ý nghĩa. Bên cạnh khu vực rất lớn trên nhiễm thể 12 của Kasalath, NIL-C443 còn có những đoạn quan trọng khác của Kasalath trên nhiễm thể số 1, 8, và 10 (hình 6-3) ảnh hưởng đến tính trạng khả năng hấp thu lân. Trong kỹ thuật “fine mapping” ở F3, biến thiên do kiểu hình được giải thích bởi QTL giảm xuống còn 28,1%. Đây là kết qủa tốt, bởi vì các số liệu từ cá thể được thu thập không có tính chất lập lại. Pup1 liên kết với 2 marker kế cận S14025 và S13126, và liên kết chặt với S13126 Trong thí nghiệm đầu tiên về bản đồ QTL (Wissuwa và ctv. 1998), Pup1 nằm giữa hai marker C443-G2140, và liên kết chặt với C443 ở khoảng cách di truyền là 3 cM. Trong thí nghiệm này, nhóm tác giả đã sử dụng bản đồ liên kết gen của Kurata và ctv. (1994). Vị trí của C443 ở cột mốc tương ứng với vị trí 54,5 cM, cộng thêm khoảng cách 3 cM của gen Pup-1 (hình 6-3) Số chồi được phân bố trong quần thể đồng hợp tử F3 theo biểu đồ hình chuông (phân bố chuẩn), trong khi đó quần thể dị hợp F3 không phân bố chuẩn Thực hiện kỹ thuật “substitution mapping” trên đoạn mục tiêu của nhiễm sắc thể số 12 giống Kasalath, Wissuwa và ctv. (2002) đã chọn ra 6 họ có chất lượng thông tin cao trong số 160 cá thể F3. Các họ (family) khác biệt nhau trên 5 đoạn của nhiễm thể số 1, 8 và 10 trong genome cây lúa Kasalath (hình 6-3), nhưng tất cả các cây trong cùng một họ đều chứa đựng đoạn giống nhau của Kasalath. Biến thiên kiểu gen trong những họ chỉ được ghi nhận trên nhiễm sắc thể số 12. Vị trí của gen Pup-1 có thể được xem xét theo qui trình loại dần từng bước một (step-wise exclusion). Trong kiểu gen của họ 14, gen Pup-1 định vị giữa hai marker S10705-C449. Trong kiểu gen họ 92 và 93, người ta có thể rút ngắn quãng chứa gen Pup-1 giữa hai marker S10704-G2140, bởi vì nó thể hiện một biến thiên kiểu gen nằm ở bên ngoài quãng mà nó không có liên quan đến biến thiên của kiểu hình (số chồi). Tất cả các dòng của họ số 6 có chứa đoạn nhiễm sắc của Nipponbare thuộc quãng giữa marker R1869-S14025, biểu hiện sự phân ly của kiểu hình. Như vậy, S14025 có thể được xem như một marker kế cận trong phân tích QTL như vậy. Trong họ số 97 và 114, có xu hướng loại ra quãng S13752-G21410 (-C449). Như vậy, theo phương pháp loại dần các yếu tố, người ta có thể xác định rằng chỉ có marker S13126 là một “thể đồng dạng phân ly” (co-segregates) với gen Pup-1 (Wissuwa và ctv. 2002). Gen Pup-1 vẫn tiếp tục thể hiện ảnh hưởng của nó trong khi xác định genome của giống cho (donor) (Wissuwa và Ae 2001a, 2001b) Sử dụng quần thể NIL có thể sẽ có những rủi ro như đoạn nhiễm thể rất nhỏ của “giống cho” tồn tại và ảnh hưởng tiềm ẩn của chúng lại không đóng góp gì (Paterson và ctv. 1990). Kiểu tồn tại như vậy (relics) sẽ biểu hiện một cách ngẫu nhiên trong quần thể phân ly. Trong thí nghiệm của Wissuwa và ctv. (2002) không có “relics” trong NIL-C443 gây ảnh hưởng đến tính trạng khả năng hấp thu lân và hơn 80% biến thiên về số chồi đã được giải thích bởi locus Pup-1. Tương tác theo kiểu epistasis giữa Pup-1 và vùng còn lại trong genome cũng không có ý nghĩa.
37. Phương pháp tiếp cận có thể được sử dụng để xác định chính xác vị trí gen Pup-1: phân tích QTL, đặt vị trí Pup-1 trong quãng 3 cM liên kết với marker S14025 và S13126. Phương pháp lập bản đồ chi tiết bằng cách loại trừ dần (substitution mapping) cho thấy: Pup-1 chỉ đồng phân ly với marker S13126. Quãng định vị như vậy được giới hạn bởi S14025-S13752, nằm bên ngoài quãng có chứa gen Pup-1 (Wissuwa và ctv. 2002). Hiện tượng tái tổ hợp trong quãng S14025-S13126 của họ số 6, trong quãng S13126- S13752 của họ số 97, 114 (hình 6-5) cho thấy chính sự tái tổ hợp sẽ có thể giúp cho giá trị bản đồ cao hơn về giải thích sự kiện. Tuy nhiên, nhóm tác giả này đề xuất phải đưa thêm nhiều marker trong các quãng như vậy để định vị chính xác hơn Pup-1. Chính Pup-1 là QTL chủ lực gây ảnh hưởng chính đến tính trạng mục tiêu đáp ứng yêu cầu thí nghiệm về bản đồ. Yamamoto và ctv. (1998) chứng minh rằng những QTL thứ yếu cũng có khả năng cung cấp thông tin chính xác cao. Một QTL có thể được xem như một yếu tố di truyền gen đơn theo Mendel hoặc là kết qủa của một “cluster” của những gen thứ yếu? Đó là câu hỏi đã được đặt ra rất sớm. Trong trường này, chỉ có một QTL định vị trên nhiễm sắc thể số 12, giải thích hơn 80% biến thiên kiểu hình, có thể được xem tương đương với yếu tố trong di truyền Mendel. Tuy nhiên, với quãng 3 cM chứa Pup-1 qúa đủ rộng rãi để chứa nhiều gen. Như vậy, Pup-1 được giả định do hậu qủa của nhiều gen liên kết rất chặt (Wissuwa và ctv. 2002) 6-3-3-2. Ứng dụng trong chọn giống Ứng dụng marker phân tử trong chọn giống (MAS) là mục tiêu của nghiên cứu di truyền tính chống chịu thiếu lân. Ở đây, giống Kasalath được xem như “giống cho”. Giống Kasalath là giống bản địa, có nguồn gốc ở bang Assam, Ấn Độ, thân cao, dễ đổ ngã, hạt nhỏ, và dễ rụng. Phương pháp tiếp cận được ưa thích nhất là chuyển gen Pup-1 vào giống lúa cải tiến theo kiểu hồi giao, với sự trợ giúp của MAS (Melchinger 1990, Hospital và Charcosset 1997). Người ta phải chọn lựa marker liên kết chặt với gen Pup-1 biểu thị mức độ chính xác cao khi đánh giá so sánh kiểu gen với kiểu hình đối với tính trạng hấp thu P trong điều kiện đất thiếu P. Việc ứng dụng MAS sẽ giúp nhà chọn giống tiết kiệm công sức lao động và thời gian khi đánh giá trên đồng ruộng. Chọn lọc cá thể đồng hợp tử đối với alen của giống tái tục (recurrent) (giống có dạng hình cải tiến, năng suất cao) trên một số lượng lớn marker loci, phủ hết bộ genome của cây sẽ làm giảm đi số thế hệ cần thiết để phục hồi genome giống tái tục ở những loci không có liên quan (Hospital và Charcosset 1997). Frisch và ctv. (1999) ước đoán chỉ cần bốn thế hệ hồi giao được sự hỗ trợ của MAS, chúng ta có thể ứng dụng trên một quần thể nhỏ có số “marker point” khá hạn chế để chuyển một alen mục tiêu vào giống cải tiến. Điều này có thể giúp chúng ta rút ngắn hơn 2 thế hệ so với phương pháp hồi giao truyền thống. Nếu quần thể lớn và “marker point” nhiều, chúng ta sẽ rút ngắn hơn 3 thế hệ. Pup-1 được xác định giữa hai marker kế cận S14025 và S13126 (S13752) là tiền đề để các nhà chọn giống áp dụng MAS để hội tụ gen này vào con lai có triển vọng, nằm đáp ứng mục tiêu chọn tạo giống lúa chống chịu thiếu lân. Với một quãng 3-4 cM vừa đủ nhỏ để giảm thiểu ảnh hưởng “linkage drag” (liên kết không định hướng), sự hội tụ các tính trạng không mong muốn với alen mục tiêu ở mức độ chấp nhận được của các nhà chọn giống (Frisch và ctv. 1999). Đối với mục tiêu “map-based clonig”, quãng 3-4 cM được xem như qúa lớn. Như vậy muốn clone được gen Pup-1, chúng ta cần phải bổ sung thêm nhiều marker liên kết chặt chẽ với gen này trong một bản đồ có tên chuyên môn là “high-resolution”. 6-3-3-3. Sử dụng dòng gần như đẳng gen trong nghiên cứu sinh lý học Quần thể NIL không những là công cụ có tiềm năng trong nghiên cứu di truyền, mà còn cho phép chúng ta xét nghiệm những tiến trình sinh lý cây trồng liên quan đến gen mục
38. tiêu, bởi vì quần thể NIL làm giảm biến thiên không có liên quan đến tính trạng mục tiêu. Nhóm tác giả đã sử dụng quần thể NIL-C443 trong so sánh với Nipponbare và NIL bổ sung có chứa đoạn nhiễm thể của Kasalath thuộc nhiễm sắc thể số 1, 8 và 10, thiếu đoạn nhiễm sắc thể số 12, để định tính QTL điều khiển sự hấp thu P (Wissuwa và Ae 1999). Nghiên cứu như vậy cho thấy rằng: chỉ có nhiễm sắc thể số 12 tham gia vào sự khác biệt khả năng hấp thu lân của cây lúa Nhóm tác giả chưa xác định được cơ chế sinh lý của tính trạng hấp thu P tương ứng với từng kiểu gen khác nhau. Những thí nghiệm tiếp sau đó đã khẳng định khả năng hấp thu lân cao của NIL-C443 là do sự tăng trưởng mạnh hơn của rễ lúa so với dòng hấp thu lân thấp, hoặc do hiện tượng hấp thu P có hiệu qủa tốt hơn trên một đơn vị rễ lúa (tính theo kích cỡ)(còn được gọi là hiệu qủa của rễ = root efficiency). Tốc độ tăng trưởng của rễ lúa trong giai đoạn mạ của NIL-C443 được kích thích trong điều kiện thiếu lân (Wissuwa và Ae 2001a). Dòng NIL-C443 duy trì khả năng hấp thu lân cao hơn trong khi mức độ khác biệt về tăng trưởng của rễ giảm. Điều này gợi ra một khái niệm: gen Pup-1 ảnh hưởng cả hai tính trạng tăng trưởng của rễ và hiệu qủa của rễ. Giả định rằng có một QTL, một gen, hoặc một cơ chế sẽ không đúng. Pup-1 có thể chứa một “cluster” của những gen, mỗi gen sẽ ảnh hưởng đến một cơ chế khác nhau, hoặc điều tiết gen khi đáp ứng với tín hiệu “stress” theo kiểu “up” hoặc “down” hàng loạt các gen khác không định vị cùng khu vực với QTL này. Khả năng gen Pup-1 chỉ ảnh hưởng cơ chế có tính chất nguyên nhân, thí dụ như hiệu qủa của rễ và tăng trưởng của rễ đóng vai trò thứ yếu. Dòng NIL-C443 có 91% alen của Nipponbare và 9% alen của Kasalath. Do đó những ảnh hưởng thứ yếu có thể là nguyên nhân gây ra sự khác biệt alen ở những loci bên ngoài quãng chứa gen Pup-1. Nếu một gen (hay nhiều gen) ở một QTL giả định nào đó được “clone”, chức năng của chúng sẽ có thể có ảnh hưởng số liệu căn bản của gen (gene-databases)(Wissuwa và ctv. 2002). Chỉ có những tính trạng đồng phân ly với QTL, với khả năng hấp thu P cao, dường như có liên quan trực tiếp đến cơ chế chống chịu thiếu lân như vậy (Wissuwa và ctv. 2002). Những dòng NIL mới có thể được phát triển thông qua kỹ thuật “fine mapping”. Những họ được sử dụng trong kỹ thuật “substitution mapping” (hình 6-4) sẽ có thể nhận được một điểm khởi động tuyệt hảo, vì những dòng NIL khác biệt về kích cỡ và vị trí của đoạn nhiễm thể Kasalath đã được ly trích một cách trực tiếp, hoặc sau một thế hệ nối tiếp. Các tác giả đề nghị sử dụng toàn bộ NIL trong thí nghiệm sinh lý học để có những giải thích cụ thể hơn về cơ chế chống chịu trên cơ sở sinh lý và di truyền. R21 74 S17 78 R665 R244 R2635 R1377 Hình 6-3: Kiểu gen của NIL-C443 cho thấy đoạn nhiễm thể số 1, 8, 10 và 12 của Kasalath, và bản đồ liên kết gen trên nhiễm thể số 12 trên cơ sở số liệu marker của 150 cây F2 thuộc quần thể QTL thứ cấp (Wissuwa và ctv. 2002)