Giáo trình Công nghệ gen trong nông nghiệp - Trần Thị Lệ

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ gen trong nông nghiệp - Trần Thị Lệ

1. TRẦN THỊ LỆ (chủ biên) NGUYỄN HOÀNG LỘC-TRẦN QUỐC DUNG GIÁO TRÌNH CÔNG NGHỆ GEN TRONG NÔNG NGHIỆP HUẾ 2006
2. Lời nói đầu Giáo trình này được biên soạn nhằm cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản và ứng dụng của công nghệ gen trong lĩnh vực nông nghiệp. Do sách được xuất bản lần đầu và công nghệ sinh học là một ngành khoa học phát triển rất nhanh chóng đặc biệt trong thời gian gần đây nên khó tránh khỏi thiếu sót. Tuy vậy, chúng tôi vẫn mạnh dạn xuất bản với mong muốn phục vụ cho nhu cầu học tập của sinh viên ngành nông nghiệp. Chúng tôi rất mong được các đồng nghiệp và sinh viên đóng góp nhiều ý kiến để cho lần biên soạn sau đạt được chất lượng tốt hơn. Những nhận xét và ý kiến đóng góp xin vui lòng gửi về Khoa Nông học, Trường đại học Nông Lâm, Đại học Huế. Chúng tôi trân trọng cảm ơn TS. Lê Việt Dũng đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho giáo trình này. Xin chân thành cám ơn Dự án Giáo dục Đại học Huế đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho chúng tôi hoàn thành giáo trình. Các tác giả
3. Chương 1 Sản xuất, xác nhận và độ bền vững của cây trồng chuyển gen 1.1. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật Cho đến nay hơn 150 loài thực vật khác nhau, trong đó có rất nhiều loài cây trồng, đã được chuyển gen thành công. Những thực vật chuyển gen và các diễn biến nổi bật của công nghệ gen thực vật được giới thiệu ở bảng 1.1. Để tạo ra cây biến đổi gen trong những năm qua một loạt các phương pháp khác nhau đã được thực hiện. Trong đó, ba phương pháp sau đây được sử dụng phổ biến (giới thiệu ở các mục từ 1.1.1 đến 1.1.3). Bảng 1.1. Diễn biến nổi bật của công nghệ gen thực vật. Năm Những phát triển quan trọng 1980 - Lần đầu tiên chuyển DNA vi khuẩn vào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens. 1983 - Marker chọn lọc, Ti-plasmid được loại bỏ các gen không cần thiết. 1984 - Biến nạp vào tế bào trần. 1985 - Kháng thuốc diệt cỏ. 198 - Kháng virus. - Lần đầu tiên đưa cây biến đổi gen ra đồng ruộng. 1987 - Kháng côn trùng. - Biến nạp phi sinh học. 1988 - Điều khiển sự chín ở cà chua. 1989 - Kháng thể ở thực vật bậc cao. 1990 - Biến nạp phi sinh học ở ngô. - Tính bất dục đực nhân tạo. 1991 - Thay đổi thành phần carbohydrate. - Tạo alkaloid tốt hơn. Công nghệ gen trong nông nghiệp 1
4. 1992 - Thay đổi acid béo - Biến nạp phi sinh học ở lúa mỳ. - Lần đầu tiên phân giải plastic nhờ cây biến đổi gen. - Cà chua biến đổi gen FlavorSaver xuất hiện trên thị trường. 1994 - Lần đầu tiên hơn 10 gen được chuyển đồng thời vào thực vật. 1998 - Trên thế giới có 48, trong đó Mỹ có 35, loại thực vật biến đổi gen được thị trường hóa. - Lúa biến đổi gen với giá trị dinh dưỡng tốt hơn. - Cây biến đổi gen được trồng trên diện tích hơn 40 triệu ha. 1999 - Cho đến nay khoảng 9.000 thí nghiệm về cây biến đổi gen được đưa ra đồng ruộng (ở EU: 1.360). Phương pháp chuyển gen được chọn lựa tùy thuộc các loại vector biến nạp được sử dụng. Các vector này là các plasmid đã được thiết kế thích hợp. 1.1.1. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mục đích của công nghệ gen thực vật là tạo ra những cây biến đổi gen có những đặc tính mới. Ở đây, DNA ngoại lai được đưa vào tế bào thực vật và tồn tại bền vững trong hệ gen (genome). Các vi khuẩn đất A. tumefaciens và một số loài họ hàng của chúng có khả năng chuyển một phần nhỏ DNA vào tế bào thực vật và qua đó kích thích tạo khối u (callus). Những khối u này là không gian sống của vi khuẩn. Một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn cũng được tạo ra trong những khối u này. Những opine phổ biến nhất là nopalin và octopin. Về hóa học opine là những sản phẩm ngưng tụ của một amino acid với một cetoacid hoặc một amino acid với đường. Octopin được tạo nên từ các amino acid là arginine và pyruvate, còn nopalin được tạo nên từ arginine và -cetoglutaraldehyd. Công thức cấu tạo của opine được trình bày ở hình 1.1. A. tumefaciens đã thực hiện “kỹ thuật gen” với mục đích tạo ra cây biến đổi gen có lợi cho nó. Như vậy, việc khẳng định kỹ thuật gen là một quá trình nhân tạo là không hoàn toàn đúng. Khả năng chuyển DNA của A. tumefaciens được ứng dụng trong công nghệ gen hiện đại. Để hiểu được quá Công nghệ gen trong nông nghiệp 2
5. trình này, điều đầu tiên là cần làm rõ sự tương tác sinh học giữa Agrobacterium với thực vật. COOH COOH COOH COOH HC NH CH HC NH CH CH2 CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH NH NH C C H N NH H N NH 2 2 Octopin Nopalin Hình 1.1. Công thức cấu tạo của opine. Việc sử dụng A. tumefaciens bắt đầu từ 1970, khi người ta phát hiện vi khuẩn này có khả năng tạo nên khối u ở cây hai lá mầm bị thương, được gọi là khối u cổ rễ (Hình 1.2). Trong những năm 1970, các nhà khoa học đã tìm thấy trong các chủng A. tumefaciens tạo khối u có một plasmid rất lớn kích thước khoảng 200-800 kb. Từ những thí nghiệm trên những chủng A. tumefaciens không độc (không có plasmid này), người ta đã khẳng định plasmid nói trên cần thiết cho việc tạo khối u. Vì vậy, chúng được gọi là Ti- plasmid (tumor inducing-plasmid). Công nghệ gen trong nông nghiệp 3
6. Hình 1.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. a: Dưới kính hiển vi điện tử. b: Khối u ở cây và từ khối u này xuất hiện chồi một cách tự nhiên. Ti-plasmid mang các gen mã hóa cho protein phân giải opine, nhận biết những tế bào thực vật bị thương, cắt và vận chuyển đoạn T-DNA (transfer-DNA). T-DNA là một phần của Ti-plasmid, được chuyển vào thực vật. Trên đó định vị những gen tạo khối u và tổng hợp opine. T-DNA được giới hạn bởi hai vùng, bờ trái và bờ phải (LB: left border và RB: right border). Các bờ này gồm một trình tự lặp lại của 25 bp, là trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA. T-DNA được đưa vào DNA trong nhân tế bào thực vật. Vị trí gắn vào thường là ngẫu nhiên, tuy nhiên thường là những vùng có khả năng sao chép. Quá trình lây nhiễm được mô tả ở hình 1.3. Bị thương Nhiễm sắc thể của vi khuẩn Ti-plasmid với T-DNA Agrobacterium Nhiễm sắc thể trong nhân tế bào thực vật Agrobacterium Tế bào thực vật Vi khuẩn bám vào tế bào thực vật và chuyển T-DNA vào nhân Agrobacterium Khối u trong khối u T-DNA của vi khuẩn trong DNA nhân của Công nghệtế genbào thtrongực v ậtnông nghiệp Các tế bào khối 4 u thực vật
7. Hình 1.3. Sơ đồ lây nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Trong opine người ta phân biệt hai loại octopin và nopalin. Một số chủng vi khuẩn A. tumefaciens chứa Ti-plasmid của loại octopin và một số khác là của nopalin. Những plasmid octopin chỉ có thể tạo octopin và phân giải chúng, nhưng không tạo và phân giải được nopalin. Có sự khác nhau giữa các loại plasmid ở Agrobacterium, đó là Ti- plasmid của loại nopalin chỉ chứa một bản sao (copy) của T-DNA, trong khi plasmid octopin chứa đến ba bản sao. Ở hình 1.4, trên đoạn T-DNA định vị những gen tổng hợp opine và tạo khối u. Khối u được tạo nên là do hai loại phytohormone (auxin và cytokinin) được tạo ra ở trong tế bào thực vật bị nhiễm, chúng kích thích sự phân chia tế bào và tạo nên mô không phân hóa (callus). tms tmr nos T-DNA RB noc vir tra ori Hình 1.4.Ti-plasmid của Agrobacterium dạng nopalin. T-DNA: Transfer- DNA, LB: Bờ trái. RB: Bờ phải, ori: khởi đầu sao chép của A.tumefaciens. noc: Phân giải nopalin, nos: Tổng hợp nopalin. tmr: Tổng hợp cytokinin, Công nghệ gen trong nông nghiệp 5
8. tms: Tổng hợp auxin, tra: Vận chuyển tiếp hợp, vir: Vùng virulence (vùng độc tính). Điều kiện cho việc chuyển T-DNA vào thực vật trước hết là tế bào bị thương. Khi tế bào bị thương chúng tiết ra các hợp chất phenol (acetosyringone), chất có vai trò quan trọng trong việc nhận biết và gắn kết vi khuẩn với tế bào thực vật. Cơ chế nhận biết được giải thích là nhờ tính đặc hiệu của A. tumefaciens với cây hai lá mầm, ở cây một lá mầm thì phản ứng này chỉ có ở một ít loài. Vì vậy, Agrobacterium chỉ được sử dụng hạn chế cho việc biến nạp gen ở cây một lá mầm. Khi bổ sung syringone người ta có thể biến nạp gen vào nấm nhờ A. tumefaciens. Thực vật một lá mầm quan trọng như ngô cũng có thể được biến nạp bằng A. tumefaciens. Khối u xuất hiện bởi những gen của A. tumefaciens Sự phát triển khối u sau khi nhiễm A. tumefaciens dựa trên tác dụng của hai phytohormone. Các enzyme cần thiết cho tổng hợp phytohormone được mã hóa chủ yếu từ những gen trên T-DNA. Sự tổng hợp auxin được thực hiện bởi hai gen là tms1 và tms2. Gen tms1 mã hóa tryptophan-2- monooxygenase xúc tác cho sự biến đổi tryptophan thành indol-3-aceamide. Sản phẩm của gen tms2 là indol-3-acetamide-hydrogenase, xúc tác để tạo ra auxin là indolylacetic acid (IAA). Ngoài ra, T-DNA còn mang gen tmr mã hóa cho enzyme isopentenyltransferase. Enzyme này gắn 5’-AMP vào chuỗi bên isoprenoid để tổng hợp nên tiền cytokinin là isopentenyladenin và isopentenyladenosin. Hydroxyl hóa tiền cytokinin bằng những enzyme thực vật để tạo nên cytokinin. Auxin được tạo nên cùng với cytokinin làm cho khối u lớn lên, nhờ kích thích sự phân chia của các tế bào không phân hóa. - H CH2OH CH2-COO C=C CH3 N HN-CH2 H N N N N H Công nghệ gen trong nông nghiệp 6
9. Hình 1.5. Cấu tạo của indol-3-acetate (một loại auxin) và zeatin (một loại cytokinin). A. tumefaciens nhận biết acetosyringone nhờ một chất nhận, được mã hóa bằng một gen ở vùng vir (virulence), vùng vir bao gồm nhiều gen. Sự nhận biết bằng chất nhận dẫn đến sự hoạt hóa của tất cả gen vir. Một sản phẩm gen vir khác là một endonuclease nhận biết bờ phải và trái của T- DNA và cắt T-DNA ở những vị trí này. Sau đó, một protein gắn vào sợi đơn của T-DNA và phức hệ này được chuyển vào thực vật cũng nhờ tác dụng của các sản phẩm gen vir (Hình 1.6). LB RB T-DNA LB RB  LB RB  virE2 virD2 virD2 LB RB Phức hệ T-DNA -Protein Hình 1.6. Sơ đồ biểu diễn quá trình di chuyển T-DNA của Ti-plasmid. 1: T-DNA với bờ phải và bờ trái được chèn vào Ti-plasmid. 2: Sợi đơn được cắt ra nhờ protein được mã hóa bởi gen virD2. 3: Sợi đơn của T-DNA được Công nghệ gen trong nông nghiệp 7
10. giải phóng và kết hợp với protein do virD2 và virE2 mã hóa, chỗ đứt ở sợi đơn thứ hai được tổng hợp bổ sung. 4: Lấp đầy chỗ trống trong Ti-plasmid (đường gạch nối đậm). Sợi T-DNA tự do được vận chuyển vào tế bào thực vật ở dạng phức hệ DNA-protein. Quá trình này phức tạp nên không thích hợp cho việc ứng dụng trong công nghệ gen vì có ba nguyên nhân sau: - Do tạo khối u nên không thể tái sinh được cây hoàn chỉnh và khỏe mạnh từ tế bào biến nạp gen. - Sự tổng hợp opine là không mong muốn vì cây tiêu tốn năng lượng không cần thiết. - DNA lạ (ngoại lai) không thể đưa vào Ti-plasmid cũng như T-DNA. Những plasmid có kích thước > 200 kb là quá lớn, khó thao tác trong phòng thí nghiệm. Người ta đã thành công trong việc sửa đổi Ti-plasmid và T-DNA để các phytohormone này không được tạo nên. Trong những bước tiếp theo gen tổng hợp opine được cắt ra và đưa vào những gen chỉ thị (xem mục 1.2), ví dụ: gen kháng kanamycin. Ngày nay, người ta sử dụng hệ thống được gọi là vector hai nguồn (binary vector), ở đây chức năng của Ti-plasmid được thực hiện hai ở plasmid. Plasmid lớn mang vùng vir và plasmid nhỏ mang bờ trái và phải của T-DNA. Đây là những vùng của T-DNA duy nhất cần thiết cho việc vận chuyển gen vào thực vật, plasmid nhỏ là đủ cho vận chuyển chính xác thậm chí chỉ với một bờ. Giữa bờ phải và trái một gen chọn lọc và những gen lạ được chèn vào. Sơ đồ cấu tạo của một vector hai nguồn được giới thiệu ở hình 1.7. Ưu điểm của vector này là các thao tác chỉ thực hiện với plasmid nhỏ. Tất cả những công việc tạo dòng, cả việc đưa DNA lạ, có thể thực hiện trong những tế bào E. coli, còn plasmid lớn đã hoàn thiện và được chuyển vào A. tumefaciens. Quá trình biến nạp được thực hiện ở những mô thực vật phù hợp, ví dụ: mô lá. Chúng được ủ với vi khuẩn A. tumefaciens, sau đó vi khuẩn được loại bỏ và mô tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Cây Arabidopsis thaliana đã trở thành cây mô hình quan trọng trong nghiên cứu di truyền thực vật. Phương pháp biến nạp được mô tả là phương Công nghệ gen trong nông nghiệp 8
11. pháp thấm qua, ở đây không chỉ là tế bào hoặc mô mà có thể cây hoàn chỉnh được sử dụng. Cây chưa nở hoa được ngâm từng phần vào dung dịch A. tumefaciens. Sau đó, sàng lọc thế hệ cây con của những cây được biến nạp này để xác định cây biến đổi gen. Dĩ nhiên, phương pháp này thích hợp chỉ với cây rất nhỏ có chu kỳ sống ngắn và có khả năng sản sinh ra lượng hạt lớn, vì hiệu quả của phương pháp này không cao. vir Ti-plasmid Không có T- DNA A.t. ori LB RB T2 Gen P2 T1 MG P1 Mod. T-DNA RB LB E.c. ori E. coli plasmid với T- DNA KmR Hình 1.7. Sơ đồ hệ thống vector hai nguồn để biến nạp bằng A. tumefaciens. Các gen tạo khối u và tổng hợp nopalin được loại ra, T-DNA mang một gen đánh dấu để chọn lọc trong thực vật (MG). Các gen khác được chèn vào. A.t ori: Khởi đầu sao chép để nhân lên trong A. tumefaciens, E.c. ori: Khởi đầu sao chép để nhân lên trong E. coli. KmR: gen kháng Công nghệ gen trong nông nghiệp 9
12. kanamycin để chọn lọc trong E. coli và A. tumefaciens. P1, P2: Promoter, T1, T2: Terminator, vir: Vùng vir. Ý nghĩa của những gen vir ở sự chuyển A. tumefaciens-T-DNA được giải thích như sau: Gen virA mã hóa cho một protein màng, là chất nhận hợp chất phenol ở tế bào cây bị thương. Sự nhận biết chất này dẫn đến sự hoạt hóa sản phẩm gen virG, đến lượt nó lại kích thích sự sao chép và sự biểu hiện của tất cả gen vir. Sự hoạt hóa của protein thuộc gen virG có thể do sự vận chuyển những nhóm phosphate (phosphoryl hóa). Hai protein được mã hóa từ gen virD2 và virE2 quan trọng đối với việc chuyển T-DNA. Protein virD2 là một endonuclease, cắt sợi đơn đặc hiệu ở bờ phải và trái của T-DNA, Protein virE2 gắn lập tức vào sợi đơn và ngăn cản sự gắn lại với Ti-plasmid (Hình 1.7). Sau đó, bằng cơ chế tổng hợp sửa chữa DNA, từ sợi đơn còn lại trong Ti-plasmid xuất hiện lại một T-DNA hoàn chỉnh. Ngoài ra, một protein virD2 gắn vào đầu 5’ của T-DNA sợi đơn đã được cắt ra bằng liên kết đồng hóa trị. Bằng cách này xuất hiện một phức hệ DNA-protein và được chuyển vào tế bào thực vật. Quá trình này xảy ra như thế nào vẫn chưa biết hết mọi chi tiết, nhưng có thể là 11 protein được mã hóa từ gen virB tạo nên một lỗ hổng, qua lỗ này phức hệ DNA-protein được vận chuyển vào thực vật. Khi đến tế bào thực vật phức hệ này đi vào nhân tế bào. Protein virD2 và virE2 chứa trình tự định vị nhân đặc hiệu cho phép phức hệ đi qua màng nhân và gắn vào DNA thực vật một cách ngẫu nhiên ở những chỗ gãy trên sợi của DNA của tế bào thực vật. Tuy nhiên, vị trí tái tổ hợp được quan sát là đặc hiệu, bao gồm những trình tự rất ngắn 5-10 bp. Quá trình kết hợp được thực hiện nhờ các enzyme thực vật, có thể có sự tham gia của protein virD2. 1.1.2. Chuyển gen bằng phương pháp phi sinh học Biến nạp phi sinh học là một phương pháp rất có triển vọng ở thực vật, được phát triển năm 1987 bởi Sanford và cộng tác viên, đặc biệt ở cây ngũ cốc vì thường không thể biến nạp được bằng A. tumefaciens và sự tái sinh cây từ tế bào trần gặp khó khăn. Để vượt qua thành tế bào người ta thiết kế một dụng cụ để bắn những hạt wolfram hoặc vàng mang DNA vào tế Công nghệ gen trong nông nghiệp 10
13. bào. Hạt này nhỏ đến nỗi khi đi vào tế bào nó không gây hại kéo dài (Hình 1.8). Ưu điểm của phương pháp này: - Không cần phải phân hủy thành tế bào bằng enzyme. - Về lý thuyết mọi tế bào và mô đều có thể được biến nạp. - Không phức tạp như ở sự biến nạp A. tumefaciens. Sự so sánh hai phương pháp trình bày ở bảng 1.2. Hình 1.8. Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử của hạt vàng (a) và wolfram (b) trong cùng tỷ lệ cho sự biến nạp phi sinh học. Bảng 1.2. So sánh biến nạp bằng A. tumefaciens và phi sinh học. Biến nạp nhờ A. tumefaciens vào Biến nạp phi sinh học vào callus mảnh lá Các mảnh lá được nuôi cấy chung với vi Tạo callus hoặc phôi vô tính, 8-12 khuẩn, 1-2 ngày tuần Các mẫu lá phát triển Biến nạp phi sinh học Xử lý kháng sinh để diệt vi khuẩn và Phát triển callus không chọn lọc, chọn lọc các tế bào thực vật biến nạp, 2- 4 ngày 4 tuần Callus phát triển trong điều kiện Chuyển mẫu lá lên môi trường tái sinh chọn lọc, 8-12 tuần Công nghệ gen trong nông nghiệp 11
14. và chọn lọc (tạo callus và chồi), 6-10 tuần Tái sinh trong điều kiện chọn lọc, 8-12 tuần Mẫu lá trên môi trường không có phytohormone (tạo rễ), 4-6 tuần Cây biến đổi gen Cây biến đổi gen Vector sử dụng cho biến nạp phi sinh học đơn giản hơn vector biến nạp bằng A. tumefaciens (Hình 1.9). SmaI EcoRI BamHI Ter Pro MG AmpR E. coli ori Hình 1.9. Vector sử dụng cho biến nạp phi sinh học. Trên cơ sở một vector của E. coli, một Makergen (không trình bày promoter và terminator) để chọn lọc thực vật. Ngoài ra, còn có một vị trí tạo dòng giữa một promoter và một terminator đặc hiệu cho thực vật để chèn gen ngoại lai vào, AmpR: gen kháng ampicillin. Phương pháp này đã thành công trong việc đưa 10 gen đồng thời vào các plasmid khác nhau và có thể được sử dụng cho bất cứ loài sinh vật nào, ví dụ vi khuẩn, nấm, tảo và động vật. Trong khi các phương pháp khác chỉ phù hợp với việc đưa gen lạ vào nhiễm sắc thể của nhân thì bằng phương pháp này người ta có thể biến nạp Công nghệ gen trong nông nghiệp 12
15. cả ty thể và lạp thể (Bảng 1.3). Năm 1988, đã biến nạp thành công ty thể của nấm men Saccharomyces cerevisiae và ty thể của tảo xanh Chlamydomonas. Thiết bị đầu tiên để chuyển gen là súng bắn gen. Máy hiện đại sử dụng khí helium nén làm đạt đến vận tốc bắn tối ưu và thao tác an toàn (Hình 1.10). Tốc độ bắn đạt 1300 m/s (so sánh với vận tốc âm thanh trong không khí 343 m/s). Tỷ lệ biến nạp hoặc hiệu quả của phương pháp phụ thuộc vào nhiều yếu tố: lượng DNA/hạt vàng hoặc wolfram, tốc độ hạt, số lượng hạt, độ lớn và loại tế bào và mật độ của tế bào hoặc mô được sử dụng. Bảng 1.3. Một số gen đã được chuyển vào ty thể của thực vật bậc cao. Gen biến nạp Chức năng Gen -endotoxin của Bacillus thuringensis Kháng côn trùng 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphatsynthase Kháng glyphosate-(Round -Glucuronidase up) Neomycin-phosphotransferase Gen chỉ thị (phản ứng tạo màu) Kháng kanamycin Nòng súng Đĩa nhựa mang các vi đạn bằng vàng có bọc DNA Đĩa nhựa được chặn lại bởi tấm lưới Các vi đạn bằng vàng được bọc DNA Tế bào đích của thực vật Hình 1.10. Sơ đồ súng bắn gen (gene gun, bombardment). Công nghệ gen trong nông nghiệp 13
16. Biến nạp phi sinh học chỉ mới đạt được sự biểu hiện tạm thời (transient) của các gen ở hành, đậu tương, lúa và ngô. Sự biểu hiện tạm thời có nghĩa là gen biến nạp ban đầu hoạt động nhất thời và sau đó thì mất hoặc sự biểu hiện bị cản trở bởi sự methyl hóa DNA sau phiên mã. Chỉ một số ít biến nạp bền vững được mô tả và thực tế phương pháp này có ý nghĩa lớn đối với cây ngũ cốc. Tuy nhiên vẫn còn một số khó khăn: Hiệu quả của phương pháp này thấp, chỉ khoảng 0,05% đỉnh sinh trưởng đậu tương tái sinh sau khi biến nạp. + DNA biến nạp không phải luôn luôn bền vững trong DNA của nhân tế bào nên thường biểu hiện tạm thời. Thường chỉ một số ít tế bào của mô được biến nạp và vì vậy không phải lúc nào cũng tái sinh được cây thay đổi gen đồng nhất. + Phần lớn phải sử dụng mô phân sinh để biến nạp, ví dụ phôi lúa hoặc dung dịch tế bào ngô. 1.1.3. Chuyển gen bằng tế bào trần Trừ tảo là sinh vật đơn bào, tế bào thực vật tồn tại ở dạng mô. Sự gắn giữ các tế bào thực hiện qua carbohydrate cao phân tử là pectin. Chúng tạo nên những cái gọi là lá mỏng trung tâm gắn các tế bào lân cận lại với nhau. Để tạo nên tế bào trần từ những mô lá trước hết cần phải phân giải pectin nhờ enzyme pectinase. Bước tiếp theo thành tế bào, phần lớn gồm cellulose, phải được phân giải nhờ enzyme cellulase. Kết quả xuất hiện tế bào tròn, không có thành (Hình 1.11), để bền vững chúng phải được giữ trong một dung dịch đồng thẩm thấu. Công nghệ gen trong nông nghiệp 14
17. 30 µm Hình 1.11. Tế bào trần cây thuốc lá dưới kính hiển vi. Vector được sử dụng cho biến nạp tế bào trần giống như vector của biến nạp phi sinh học (Hình 1.9). DNA được biến nạp vào tế bào trần có thể thực hiện bằng hai cách: + Thứ nhất, sử dụng chất polyethyleneglycol, khi có mặt chất này các tế bào trần hòa lẫn vào với nhau và qua đó các phân tử DNA được tiếp nhận. + Thứ hai, sự biến nạp được thực hiện bằng sốc điện, gọi là xung điện. Sốc điện dẫn đến sự không phân cực ngắn của màng tế bào trần, qua đó DNA được tiếp nhận. DNA đi vào nhân và kết hợp hoàn toàn ngẫu nhiên vào một vị trí bất kỳ vào DNA nhân của thực vật. Về nguyên tắc bất kỳ thực vật nào cũng có thể được biến nạp bằng các phương pháp trên. Tuy nhiên việc tái sinh cây hoàn chỉnh thường là khó khăn, vì vậy việc sử dụng biến nạp bằng tế bào trần bị hạn chế. 1.2. Hệ thống chọn lọc và chỉ thị Nói chung, ở tất cả các hệ thống biến nạp tỷ lệ cây tiếp nhận DNA bền vững là rất thấp. Vì vậy, người ta phải có phương pháp để phân biệt một số rất ít cây biến nạp từ một lượng lớn cây không biến nạp. Để xác định những cây được biến nạp người ta sử dụng hệ thống gen chọn lọc. Đặc biệt ưa thích là hệ thống chọn lọc trội, có nghĩa là chỉ những cây biến đổi gen có thể tái sinh và phát triển. Ngược lại, ở một hệ thống chỉ thị đơn giản như hệ thống chỉ thị GUS, thì cả những cây không biến nạp cũng tái sinh. Dĩ nhiên Công nghệ gen trong nông nghiệp 15
18. phương pháp này không hiệu quả, vì luôn luôn chỉ có một phần nhỏ tế bào thực vật được biến nạp. Một ưu điểm thứ hai quan trọng hơn là thao tác của hệ thống chọn lọc đơn giản để có thể phân tích nhanh một số lượng cây lớn. Trong nhiều trường hợp người ta sử dụng kháng sinh kanamycin cho chọn lọc trội. Tuy nhiên, ở nồng độ cao nó độc đối với phần lớn thực vật. Điển hình cho kháng sinh nhóm này là một aminoalcohol gắn với gốc đường chứa nhóm amine (Hình 1.12). Bên cạnh kanamycin thu được từ Streptomyces kanamyceticus còn có gentamycin (từ Micromonospora purpurea), neomycin (từ Streptomyces fradiae) và streptomycin (từ Streptomyces griseus) cũng thuộc nhóm này. Người ta sử dụng các gen kháng khác, ví dụ gen neomycin- phosphotransferase (nptII) mã hóa cho phosphotransferase, sản phẩm gen làm bất hoạt kháng sinh aminoglycosid (ví dụ: kanamycin) do gắn thêm nhóm phosphate (phosphoryl hóa). Gen mã hóa cho neomycin- phosphotransferase có nguồn gốc từ vi khuẩn và thường không có trong thực vật. Với những promoter và terminator tương ứng, gen này có thể được sử dụng trong thực vật. NH2 CH2 O OH HO HO O HO NH2 CH2O O O NH2 OH HO NH2 HO Hình 1.12. Công thức cấu tạo của kanamycin. Bên cạnh gen kháng kanamycin cũng có một loạt các hệ thống chọn lọc khác được sử dụng và giới thiệu ở bảng 1.3. Các gen kháng trội, ngoài Công nghệ gen trong nông nghiệp 16
19. neomycin phosphotransferase, còn có hygromycin B phospho-transferase và 3-enolpyruvyl shikimate 5-phosphatsynthetase (EPSP-synthetase). Ngoài các gen chọn lọc, còn các gen chỉ thị (reporter gene) cũng được sử dụng để chọn lọc thể biến nạp. Gen chỉ thị không chọn lọc trội, nhưng sản phẩm gen được chứng minh dễ dàng bằng phương pháp hóa sinh, hóa học mô, kính hiển vi hoặc quang kế. Ví dụ: người ta có thể chứng minh chức năng của promoter đặc hiệu mô cũng như sự biến nạp của những loại tế bào nhất định hoặc để kiểm tra một gen xác định có hoạt động hay không. Trong thực vật bậc cao được sử dụng nhiều nhất là -D-glucuronidase, luciferase và mới đây là green fluorescent protein (GFP). Việc xác nhận được thực hiện nhờ sự biến đổi của một chất đặc hiệu (glucuronid hoặc luciferin, hình 1.13) và sự phát hiện ra sản phẩm xúc tác hoặc quang tử trong trường hợp luciferse. Ngược lại ở GTP-protein có thể chứng minh được bằng kính hiển vi huỳnh quang của protein sau khi kích thích với ánh sáng có độ dài bước sóng phù hợp. Ở phương pháp này không cần một cơ chất đặc hiệu. Bảng 1.4. Hệ thống gen chọn lọc và chỉ thị cho thực vật. Chọn lọc Xác nhận Hoạt tính enzyme tính trội đơn giản 3-Enolpyruvylshikimate-5- Có Không phosphatsynthase Có Không Acetollactatsynthase Không Có Luciferase của vi khuẩn Có Không Bromxynilnitrilase Có Có Chloramphenicol-acetyltransferase Có Có Dihydro-folatreductase (Tetrahydrofolate- dehydrogenase) Có Có Gentamycin-acetyltransferase Không Có Green fluorescent protein Có Có Hygromycin-phosphotransferase Có Có Công nghệ gen trong nông nghiệp 17
20. Luciferase của côn trùng chiếu sáng Có Có Neomycin-phosphotransferase (Kanamycinkinase) Không Có Nopalinsynthase Không Có Octopinsynthase Có Có Phosphinothricin-acetyltransferase Không Có -D-glucuronidase Có Có Streptomycin-phosphotransferase Có Có Threonindehydratase a Ánh sáng (562 nm) Con đom đóm - Luciferase O + Luciferin Oxyluciferin + CO 2 2 ATP AMP + PP i b Cl COOH Br HO O O Chất màu Indigo OH N H HO -Glucuronidase COOH OH Cl Sự oxy hóa trong Cl O O Cl HO O OH Br không khí Br Br OH + N N N H HO H H Công nghệ gen trong nông nghiệp 18
21. Hình 1.13. Xác nhận sự biểu hiện gen chỉ thị. a: Xác nhận sự biểu hiện của luciferase, cơ chất là luciferin, phản ứng này phụ thuộc vào ATP. Ánh sáng tạo nên từ phản ứng được định lượng bằng máy. b: Xác nhận sự biểu hiện của -D-glucuronidase, cơ chất nhân tạo là 5-bromo-4-chlor-3-indoyl- -glucuronid (X-GlcA), chất này được thủy phân nhờ glucuronidase. Bằng sự oxy hóa xuất hiện một chất indigo màu xanh. Người ta có thể sử dụng các chất khác thay thế X-Glc, mà sản phẩm thuỷ phân là chất màu phát quang. 1.3. Tái sinh cây hoàn chỉnh So sánh với sinh vật đơn bào như vi khuẩn, nấm men hoặc tảo thì sự biến nạp vào thực vật bậc cao khó khăn hơn, vì không chỉ phải đưa DNA vào trong tế bào mà còn phải tái sinh cây hoàn chỉnh từ một tế bào hoặc mô phân lập. Điều này thực hiện được vì phần lớn tế bào thực vật có tính toàn năng và mỗi tế bào có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh (Hình 1.14). Khác với động vật, thực vật có thể tái sinh từ tế bào soma bình thường và từ đó thu được trực tiếp hạt biến đổi gen. Tuy nhiên, không phải tất cả các loại tế bào và mô đều phù hợp cho mục đích này. Vì vậy, ở thực vật phải thử nghiệm nhiều để tìm ra nguyên liệu sử dụng ban đầu phù hợp. Điều quan trọng là tìm ra môi trường phù hợp để kích thích tế bào phân chia. Bên cạnh những chất khoáng vô cơ, cần cả những chất hữu cơ khác nhau, đặc biệt đường là nguồn carbon và năng lượng, và các chất điều hoà sinh trưởng. Auxin và cytokinin có ý nghĩa lớn trong nuôi cấy mô và tế bào. Đôi khi amino acid hoặc nước dừa cũng được sử dụng. Cũng như ở trong cây tác dụng của phytohormone phức tạp và chức năng rất đặc hiệu. Tuy nhiên có thể nói rằng, lượng cytokinin cao kích thích sự tạo chồi, nồng độ auxin cao, phụ thuộc với hàm lượng cytokinin, kích thích tạo callus hoặc rễ. Callus là một khối tế bào không màu, có kích thước lớn, không phân hóa và chứa không bào. Khi bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy callus thì sự phát triển chồi và rễ được kích thích trở lại. Điều kiện chính xác cho sự tái sinh thành công phải được thử nghiệm cho từng loài cây. Ví dụ: để tạo callus và chồi từ mảnh lá thuốc lá thì cần bổ sung 0,2 mg/l -NAA và 1,0 mg/l BAP (Hình 1.14). Từ tế bào trần có thể tái sinh cây hoàn chỉnh, nếu thành công ở bước tạo thành tế bào và phân chia tế bào. Tuy nhiên, ở nhiều thực vật quá trình Công nghệ gen trong nông nghiệp 19
22. tái sinh này rất khó khăn. Dĩ nhiên, ở cây tái sinh có sự biến đổi lớn về kiểu hình và nguyên nhân là do sự bất thường ở phân bào nguyên nhiễm và đột biến, được gọi là biến dị soma. Như đã nêu không phải tất cả thực vật được tái sinh dễ dàng từ tế bào trần, tế bào hoặc mô. Những loài đại diện của họ cà, cây cải cay, cam, táo và cà rốt tái sinh dễ dàng. Ở những thực vật khác rất hiếm hoặc chỉ thành công với một số giống nhất định (như củ cải đường). Đặc biệt khó khăn là các cây ngũ cốc. Trong thực tế các thí nghiệm biến nạp, sự tái sinh và sự chọn lọc thường được tiến hành đồng thời. 1.4. Xác nhận sự thay đổi gen Thực tế là một cây sau khi biến nạp sinh trưởng trên môi trường chọn lọc thì chưa đủ cơ sở để nói là một biến nạp thành công, vì có thể là tính kháng xuất hiện tự nhiên do một đột biến trong vật chất di truyền của thực vật. Hơn nữa tỷ lệ biến nạp thấp, nằm trong độ lớn của đột biến tự nhiên với tần suất 10-6 đến 10-8. Vì vậy phải thực hiện các thí nghiệm bổ sung, như Southern blot hoặc PCR và các thí nghiệm khác để chứng minh sản phẩm của gen. Phát triển rễ Môi trường không chứa hormone Lá cây Phát triển chồi Môi trường đặc chứa cytokinin Lát cắt Callus ngang lá nhiều tế bào Mảnh lá Xử lý bằng Môi trường đặc pectinase chứa auxin Dòng nhiều tế bào Các tế bào Chuyển sang riêng rẽ dung dịch lỏng Tế bào Xử lý bằng phân chia cellulose lần thứ nhất Tái sinh thành tế bào Tế bào trần Công nghệ gen trong nông nghiệp 20
23. Hình 1.14. Sơ đồ biểu diễn tạo tế bào trần và tái sinh cây hoàn chỉnh. Những sinh vật biến đổi gen được chứng minh bằng việc phân tích thành phần các chất được thay đổi, đặc biệt là những đặc tính (ví dụ: kháng một tác nhân gây bệnh nào đó), những protein thay đổi, xuất hiện protein mới và bằng việc xác định DNA lạ được biến nạp. Để chứng minh DNA được biến nạp vào thực vật phương pháp Southern và PCR được sử dụng vì hai phương pháp này rất nhạy cảm. Ở quá trình tạo cây biến đổi gen, từng bước cần phải chứng minh, rằng tế bào và thực vật này được biến nạp. Phản ứng lai Southern blot được ưa thích, vì nó ít nhạy cảm với sự lẫn tạp của DNA khác và đồng thời người ta nhận được thông tin về số lượng copy, nghĩa là số lượng phân tử DNA ngoại lai đựợc gắn vào hệ gen. Để thực hiện phương pháp này chỉ cần vài g DNA (1 g = 1/1000 mg), mà người ta dễ dàng tách ra từ một lá cây duy nhất. Một ví dụ chứng minh cho DNA biến nạp đưa ra ở hình 1.15. 1 2 3 4 5 6 7 Hình 1.15. Phóng xạ tự ghi kết quả lai Southern. Sinh vật biến đổi gen được cắt bằng một enzyme giới hạn XhoI và các đọan DNA được tách ra bằng điện di. Sau đó thực hiện Southern blot và lai với mẫu dò là DNA đánh dấu phóng xạ. Các đường 1, 3 và 5: các nguyên liệu không biến nạp. Công nghệ gen trong nông nghiệp 21
24. Mẫu ở các giếng 2, 4, 6 và 7: thể hiện các sinh vật biến đổi gen, vì ở đây xuất hiện tín hiệu lai rõ rệt. Khi có nhiều mẫu khác nhau và có một lượng rất ít DNA, thậm chí DNA từ những thực phẩm được biến đổi gen như chip khoai tây được phân lập, thì khuếch đại PCR là phương pháp được lựa chọn. Phương pháp này đặc biệt phù hợp cho mục đích kiểm tra và xác định những thay đổi gen ở cây trồng và thực phẩm. Sự chứng minh DNA trong sản phẩm cây trồng thành công hay không, phụ thuộc vào phương pháp sử dụng. Ví dụ: có thể xác định DNA trong sản phẩm khoai tây đông lạnh, nhưng ở trong dầu đậu tương thì hầu như không có DNA. - 828 bp - 226 bp AmpR bar 35S bar cryIA M T ĐC SM Hình 1.16. Xác nhận thay đổi gen ở ngô biến đổi gen. Agarose gel với các đoạn DNA được phân tách sau khi thực hiện phản ứng PCR. Năm cặp primer được sử dụng (AmpR: gen kháng ampicillin, bar: kháng thuốc diệt cỏ, 35S bar: promoter và kháng thuốc diệt cỏ, cryIA: gen tạo độc tố ở Bt. ivrl: gen mã hóa invertase ở ngô). M: DNA từ ngô bình thường, T: DNA từ ngô biến đổi gen. Bên phải là marker chuẩn (SM) để xác định kích thước của các đoạn PCR. Công nghệ gen trong nông nghiệp 22
25. Một ví dụ về sử dụng PCR để xác định cây biến đổi gen trong minh họa ở hình 1.16. Từ thí nghiệm trên có thể rút ra những kết luận sau: + Đối chứng (không biến nạp gen) không có băng DNA. Có nghĩa là thí nghiệm được thực hiện chính xác. + Gen mã hóa cho invertase (ivr1) có trong tất cả các giống ngô tự nhiên vì thế có thể tìm thấy cả trong ngô không biến đổi gen (M) lẫn ngô biến đổi gen (T) nhờ cặp primer đặc hiệu của gen ivrl. Điều đó có nghĩa là DNA đã tồn tại ở cả hai loại ngô. + Với sự tham gia của 4 cặp primer (oligonucleotide) khác chúng đã khuếch đại những đoạn khác nhau của vector, một đoạn DNA được tạo ra chỉ ở ngô biến đổi gen (chỉ có T). Điều đó có nghĩa là cặp nucleotide đặc hiệu với DNA biến nạp và qua đó cho phép xác định chắc chắn giống ngô biến đổi gen. Nói chung, phản ứng lai DNA và khuếch đại PCR đòi hỏi phải có những thông tin nhất định về DNA được biến nạp, vì thế cần có những mẫu dò hoặc những nucleotide đặc hiệu. Một phương pháp khác là sự biểu hiện của gen chỉ thị, sản phẩm của nó dễ dàng được chứng minh. Tuy nhiên, phương pháp này thường được sử dụng cho mục đích nghiên cứu. Ở đây, người ta sử dụng vector biểu hiện - D-glucuronidase, hoạt động của nó được chứng minh dễ dàng bằng sự tạo nên một chất indigo màu xanh (Hình 1.13). Sự xác nhận di truyền của gen biến nạp ở các thế hệ sau được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, tuy nhiên vấn đề này cũng gặp nhiều khó khăn nhất là đối với các được chuyển gen có vòng đời dài (cây lâu năm). Mặc dù vậy yêu cầu này là cần thiết, vì ở thế hệ sau của cây biến nạp có thể xảy ra sự bất hoạt gen biến nạp. Cũng có các phương pháp chứng minh sự có mặt của protein đặc hiệu trong cây biến đổi gen. Đối với đậu tương biến đổi gen công ty Strategic Diagnostic Inc hợp tác với công ty Monsanto sản xuất ra bột hóa chất chuẩn GMO Soya Test KitTM; với kháng thể đặc hiệu, protein EPSP-synthetase được chứng minh là có mặt trong đậu tương biến đổi gen. 1.5. Biểu hiện của DNA ngoại lai Công nghệ gen trong nông nghiệp 23
26. Thực vật bậc cao có ba cơ quan (rễ, chồi và lá) và một số mô đặc hiệu như mô bảo vệ (ví dụ biểu bì), mô duy trì (ví dụ mô phân sinh) hoặc mô dày (collenchym). Ngoài ra còn có hơn một trăm loại tế bào khác nhau. Một gen lạ có thể biểu hiện trong tất cả tế bào (DNA lạ biến nạp vào nhiều vị trí khác nhau trong hệ gen) hoặc chỉ trong một số loại tế bào hoặc mô nhất định. Ở đây, người ta sử dụng những trình tự khởi động phiên mã được gọi là promoter. Mỗi một gen được một promoter điều khiển sự biểu hiện của gen. Trong khi một số promoter hoạt động trong phần lớn các tế bào, một số khác có tính chuyên hóa rất cao đối với những loại tế bào nhất định (Bảng 1.4). Trong tế bào có nhiều cơ quan như nhân, ty thể, lạp thể Nhờ những promoter thích hợp mà gen biến nạp biểu hiện ở vị trí chính xác như mong muốn. Ngoài ra, sự biểu hiện antisense cũng được đề cập, với phương pháp này sự biểu hiện của từng gen riêng lẽ có thể bị ức chế. Bảng 1.5. Một số promoter đặc hiệu cho mô và tế bào thực vật. Loại tế bào hoặc mô Promoter/tên gen Thực vật Phloem ở lá và rễ Asus1 Arabidopsis Hoa và đầu rễ CHS15 Đậu Mô phân sinh Cyc07 Arabidopsis Tế bào kèm của khí khổng Đoạn 0,3 kp của Khoai tây Phloem AGPase Lúa Hạt phấn Đoạn của RTBV Thuốc lá Giao tử đực PLAT4912 Lúa mỳ Tế bào tapetum Puroindolin-b Thuốc lá TA29 1.5.1. Biểu hiện gen ngoại lai ở nhiều vị trí Trong thực tế phần lớn promoter 35S từ virus khảm hoa súp-lơ (cauliflower mosaic virus, viết tắt CaMV 35S) được sử dụng cho sự biểu Công nghệ gen trong nông nghiệp 24
27. hiện của gen biến nạp trong tất cả các loại mô và tế bào. Promoter có nguồn gốc virus nên có hiệu quả phiên mã gen sau khởi động. Promoter CaMV 35S đặc biệt phù hợp cho sự biểu hiện của gen đánh dấu và gen chỉ thị hoặc tạo nên cây kháng thuốc diệt cỏ. Tuy nhiên, để nghiên cứu chức năng trao đổi chất của thực vật thì promoter này không phù hợp, vì sự thay đổi đường hướng trao đổi chất nhất định đòi hỏi sự biểu hiện gen ở tế bào hoặc mô đặc hiệu. 1.5.2. Biểu hiện gen ở tế bào hoặc mô đặc hiệu Trong thực vật nhiều quá trình trao đổi chất chỉ xảy ra ở một vị trí nhất định, nên việc vận chuyển các chất giữa cơ quan sử dụng và cơ quan sản xuất là cần thiết. Sản phẩm quang hợp được tạo ra phần lớn ở lá xanh (nguồn) và phải được vận chuyển qua phloem của bó mạch đến các cơ quan sử dụng như hoa và rễ (đích). Ví dụ này làm rõ sự cần thiết cho sự biểu hiện của gen biến nạp. Trong những năm qua, nhiều promoter được phát hiện để tăng cường sự biểu hiện của gen. Những gen biến nạp được biểu hiện đặc hiệu ở củ khoai tây, trong lá hoặc thậm chí trong những tế bào riêng lẽ như hạt phấn. Các promoter đặc hiệu được xác định qua thực nghiệm bằng cách phân lập các phân tử RNA chỉ tồn tại ở trong mô mong muốn. Tiếp theo là các gen và promoter được xác định. Tính đặc hiệu của một promoter được kiểm tra bằng các gen chỉ thị. Ở đây promoter được tạo dòng trước gen chỉ thị và được biến nạp vào thực vật, sau đó vị trí biểu hiện của gen đã được chứng minh, ví dụ hình 1.17. Chắc chắn trong những năm tới nhiều promoter đặc hiệu khác sẽ được xác định bằng những dự án xác định trình tự genome, như vậy trong thời gian không xa những promoter đặc hiệu sẽ được sử dụng cho tất cả các loại tế bào và loại mô. Công nghệ gen trong nông nghiệp 25
28. Hình 1.17. Xác định sự biểu hiện gen nhờ gen chỉ thị. Sự biểu hiện của - glucuronidase (vùng tối) dưới sự điểu khiển của một promoter tương ứng chỉ thể hiện ở vùng lá bị thương. 1.5.3. Biểu hiện antisense Năm 1988, lần đầu tiên người ta nhận thấy ở thực vật một sắc tố của hoa đã bị ức chế do sự biểu hiện của một RNA antisense. Phương pháp này có giá trị lớn không những đối với nghiên cứu cơ bản mà còn đối với ứng dụng. Antisense -Gen Phân giải nhờ RNase Gắn với antisense Antisense - RNA mRNA Phiên mã P hiên mã mRNA Protein Gắn với Ribosome Công nghệ gen trongRibosome nông nghiệ p Dịch mã 26 Protein
29. Hình 1.18. Ảnh hưởng của antisense-RNA. Ở giữa là phân tử DNA, làm khuôn mẫu để tổng hợp mRNA. Ở phần dưới là sự biểu hiện gen bình thường. mRNA gắn vào ribosome và sự dịch mã được thực hiện tạo nên một polypeptide. Phần trên của sơ đồ xảy ra ở thực vật biến đổi gen, một gen được biến nạp để tạo nên một antisense-RNA (màu xanh), nó có thể kết hợp với mRNA nội sinh, làm xuất hiện một phân tử RNA mạch kép. Phân tử này được phân giải nhờ một enzyme đặc biệt. P: promoter, T: terminator. Phương pháp antisense (Hình 1.18) dựa trên sự biểu hiện của phân tử RNA, bổ sung với sản phẩm phiên mã của một gen, làm cho mRNA bất hoạt và không thể dịch mã cho protein. Từ một RNA bổ sung chúng có thể tạo nên mạch kép. Mạch kép RNA được phân giải rất hiệu quả bằng một số enzyme xác định tương tự RNase H của retrovirus, qua đó sự phiên mã và tổng hợp protein bị đình trệ. Khi RNA tổng hợp tồn tại với một lượng lớn hơn sản phẩm phiên mã bình thường thì sự biểu hiện của gen này bị giảm rất mạnh hoặc đình chỉ hoàn toàn. Một ứng dụng nổi tiếng của phương pháp antisense là tạo ra cà chua FlavrSaver. Trong lĩnh vực sử dụng thực vật biến đổi gen làm thực phẩm thì phương pháp antisense có một ưu điểm lớn về sự an toàn, vì không có protein ngoại lai được tạo ra trong tế bào mà chỉ có một phân tử RNA nhỏ. Điều này hoàn toàn tin tưởng, vì con người hằng ngày tiếp nhận một lượng rất lớn RNA không có hại cùng với thực phẩm. 1.5.4. Sự bền vững của cây chuyển gen Để tạo nên những dòng thực vật biến đổi gen thì sự biểu hiện bền vững của gen biến nạp và sự truyền lại cho thế hệ sau có ý nghĩa lớn. Điều này nói lên rằng, độ bền vững của một gen biến nạp và sự biểu hiện của nó Công nghệ gen trong nông nghiệp 27
30. không phải luôn luôn chắc chắn mà nó có thể thay đổi, vì thực vật có cơ chế làm bất hoạt những DNA ngoại lai. Gần đây một số cơ chế bất hoạt gen biến nạp đã được xác định và sẽ được đề cập dưới đây vì nó ý nghĩa lớn đối với việc tạo ra thực vật biến nạp gen bền vững. 1.5.5. Sự bất hoạt do methyl hóa Thường sự bất hoạt gen biến nạp do sự methyl hóa xảy ra mạnh mẽ, gây ra do sự tồn tại nhiều bản sao của một gen hoặc allele. Đặc biệt sự tồn tại nhiều bản sao của một gen lạ gần nhau (sự sắp xếp nhiều phân tử vector kế tiếp nhau trong hệ gen của một cây biến nạp gen hoặc nhiều bản sao của gen biến nạp) tạo nên quá trình này. Người ta cho rằng sự bất hoạt của gen biến nạp lặp lại như là một cơ chế bảo vệ chống lại những nhân tố gen di động như transposone (gen nhảy). Transposone có số lượng bản sao lớn và có thể gây ra những đột biến trong hệ gen. Đặc biệt khi nghiên cứu di truyền phân tử ở nấm, phần lớn những transposone có trong nấm Ascobolus immersus ở dạng methyl hóa và do vậy mà bất hoạt. Những gen biến nạp lặp lại dạng chùm thường gặp khi biến nạp tế bào trần và biến nạp phi sinh học, ngược lại rất hiếm khi xảy ra ở biến nạp bằng Agrobacterium tumefaciens. Điều này tạo các cơ chế khác nhau của sự biến nạp DNA vào hệ gen thực vật. Sự methyl hóa DNA lặp lại xảy ra ở nguyên tử thứ 5 của vòng cytosine và thường ở trình tự base CG hoặc CNG, ở đây C và G là cytosine và guanine, N là ký hiệu cho một trong bốn base. Những trình tự được methyl hóa hoặc là không được phiên mã hoặc hiếm khi được phiên mã, do đó sự biểu hiện của gen bị giảm hoặc hoàn toàn bị ức chế. Nhiều bản sao của gen nằm thành chùm ở một vị trí được gọi là sự bất hoạt cis. Bên cạnh đó có sự bất hoạt trans, ở đây một phân tử DNA bất hoạt nằm xa một phân tử khác, ảnh hưởng âm tính đến sự biểu hiện gen. 1.5.6. Đồng ức chế Sự bất hoạt gen được biến nạp không phải luôn luôn là do sự methyl hóa DNA. Sự bất hoạt còn do sự đồng ức chế xảy ra sau khi phiên mã, ví dụ Công nghệ gen trong nông nghiệp 28
31. quá trình sắp xếp lại sau phiên mã. Biểu hiện của sự đồng ức chế là sự giảm lượng RNA của gen phiên mã từ 20-50 lần. Nhiều thí nghiệm đã chỉ ra, ở đây không phải là do hoạt động phiên mã bị giảm xuống mà là sự tăng cường phân giải RNA. Giải thích điều này người ta cho rằng do một RNA-polymerase phụ thuộc RNA sao chép ít RNA, số lượng này nằm trên một giá trị giới hạn. Các bản sao RNA này sau đó kết hợp với sản phẩm phiên mã như RNA antisense, tạo nên một RNA mạch kép, bị phân giải nhanh bởi enzyme tương ứng. Cơ chế đồng ức chế đã cản trở việc tạo nên cây biến đổi gen, nhưng nó cũng có ý nghĩa trong việc tạo nên những cây biến đổi gen kháng virus. Tóm lại. Để biến nạp gen vào thực vật bậc cao có ba phương pháp được sử dụng là biến nạp bằng Agrobacterium, bắn gen và tế bào trần. Chọn lọc và tái sinh là những yếu tố quyết định để thu được những cây biến nạp hoàn chỉnh. Xác nhận sự biến đổi gen của thế hệ tái sinh từ vật liệu biến đổi gen được thực hiện bằng kỹ thuật Southern, PCR hoặc sử dụng các gen chỉ thị. Do sự cấu tạo phức tạp của tế bào và mô thực vật nên phải có những trình tự promoter để tăng cường sự biểu hiện của một gen lạ ở đúng vị trí mong muốn. Với cơ chế RNA antisense sự biểu hiện của gen có thể bị giảm hoặc hoặc bị ức chế hoàn toàn. Trong thực vật biến đổi gen, DNA lạ không phải luôn luôn biểu hiện vì chúng bị bất hoạt do sự methyl hóa và cơ chế đồng ức chế. Câu hỏi 1. Các phương pháp chuyển gen được dùng phổ biến hiện nay? Ưu và nhược điểm của các phương pháp đó? 2. Hệ thống gen chọn lọc và chỉ thị được sử dụng để chuyển gen vào thực vật? 3. Các phương pháp xác nhận sự có mặt của sản phẩm gen? 4. Promoter là gì? Chức năng của promoter trong sự biểu hiện của gen ngoại lai, cho ví dụ? 5. Những cơ chế làm bất hoạt các gen ngoại lai trong thực vật chuyển gen? Công nghệ gen trong nông nghiệp 29
32. Chương 2 Những đặc tính mới của cây chuyển gen Trong hơn thập kỷ qua, nhờ thành tựu to lớn của công nghệ gen, người ta đã chuyển thành công những gen phân lập từ sinh vật này vào những sinh vật khác để tạo ra cơ thể biến đổi gen mang các đặc tính mong muốn. Sản phẩm biến đổi gen đang đem lại những lợi nhuận kinh tế khổng lồ cho nhiều quốc gia. Ở Mỹ, hiện nay có tới 1.300 công ty Công nghệ sinh học với doanh thu hàng năm đạt khoảng 12,7 tỷ đô la. Trong số các sản phẩm tạo ra (có liên quan đến biến đổi gen), sản phẩm y dược chiếm tới 75%, trong khi sản phẩm nông nghiệp chỉ chiếm 3%. Tuy nhiên, sự đầu tư mở rộng quy mô nghiên cứu và khai thác sản phẩm nông nghiệp biến đổi gen ngày càng tăng. Năm 1996, toàn thế giới chỉ có 1,7 triệu ha trồng cây biến đổi gen, nhưng đến năm 2004 diện tích cây trồng biến đổi gen toàn cầu tăng lên gần 48 lần, đạt tới 81 triệu ha, trong đó hơn 1/3 diện tích này là ở các nước đang phát triển. Hiện nay, có khoảng 20 quốc gia sản xuất cây trồng biến đổi gen với diện tích từ 50.000 ha trở lên. Mỹ là quốc gia hàng đầu trồng cây biến đổi gen với diện tích trong năm 2004 là 47,6 triệu ha (chiếm 59%). Tiếp đến là Argentina: 16,2 triệu ha (20%), Canada: 5,4 triệu ha (6,7), Brazil: 5 triệu ha (6%), Trung Quốc: 3,7 triệu ha (4,6%). Ở châu Á, cây trồng biến đổi gen chủ yếu là bông, được trồng nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, Philippines và Indonesia. Có 4 loại cây trồng biến đổi gen được thương mại hóa mạnh nhất. Đó là: đậu tương kháng thuốc diệt cỏ đạt đến diện tích 48,4 triệu ha (chiếm 60% tổng diện tích cây trồng biến đổi gen năm 2004), ngô kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu đạt diện tích 19,3 triệu ha (chiếm 24%), bông kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu đạt diện tích 9 triệu ha (chiếm 11%) và cải dầu kháng thuốc diệt cỏ đạt diện tích 4,3 triệu ha (chiếm 5%). Nếu so sánh diện tích trồng cây biến đổi gen với tổng diện tích cây trồng cùng loại ở quy mô toàn cầu thì đậu tương biến đổi gen chiếm 56%, bông biến đổi gen chiếm 28%, cải dầu biến đổi gen chiếm 19% và ngô biến đổi gen chiếm 14%. Ngoài 4 loại cây trồng biến đổi gen chính đã được thương mại hóa rộng rãi nói trên, còn Công nghệ gen trong nông nghiệp 30
33. có hàng loạt các cây trồng biến đổi gen khác như kháng nấm, kháng virus, chín chậm cũng đã và đang được phổ biến. Kháng nấm 4% Đặc tính nông học 4% Kháng thuốc diệt cỏ 28,9% Kháng virus 10,1% Kháng côn trùng 24,3% Khác 7,2% Chất lượng sản phẩm 21,4% Hình 2.1. Tỷ lệ (%) của các loại cây biến đổi gen được đưa vào sản xuất. Thực vật biến đổi gen đã mang lại những đặc tính tốt cho cây trồng. Chương này đề cập đến những biến đổi gen ở thực vật. Cho đến nay gen được chuyển vào thực vật nhiều nhất là gen kháng thuốc diệt cỏ và kháng côn trùng. Vì vậy, đã làm giảm một lượng đáng kể thuốc diệt cỏ và trừ sâu được sử dụng trong nông nghiệp. Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng đã tạo ra những cây biến đổi gen kháng vi khuẩn, virus và nấm. Khả năng chống chịu những điều kiện ngoại cảnh bất lợi như khô hạn, nóng hoặc kim loại nặng của cây trồng cũng được cải thiện. Ngoài ra, nhờ kỹ thuật gen đã tạo ra những thực vật có giá trị dinh dưỡng hơn, hàm lượng vitamin và khoáng cao hơn. Mùi vị và khả năng lưu giữ của quả cũng được nâng lên. Thực vật biến đổi gen cũng sẽ cung cấp nguyên liệu như carbohydrate, chất béo và chất dẻo phân giải sinh học. Công nghệ gen trong nông nghiệp 31
34. Trong lĩnh vực y học, thực vật chuyển gen cung cấp các alkaloid và những chất miễn dịch có ý nghĩa. Sự nhiễm bẩn của vaccine với virus gây bệnh ở người về cơ bản được loại trừ. Những hiểu biết về sự xuất hiện dạng và màu hoa cũng cho phép tạo nên những loài hoa mới. Những cây bất dục đực nhân tạo được tạo ra cho mục đích sản xuất giống. Sau đây sẽ đề cập cụ thể hơn về các kết quả này. 2.1. Tăng tính kháng và thích nghi với môi trường Sự mất mùa lớn hàng năm luôn xảy ra do côn trùng, bệnh và cỏ dại cũng như do ảnh hưởng bất lợi của điều kiện ngoại cảnh và những yếu tố phi sinh học khác. Theo một kết quả nghiên cứu, mất mùa do bệnh gây ra từ năm 1988 đến 1990 là 12,4% ở lúa mỳ, 15% ở lúa và 16,3% ở khoai tây, đã ảnh hưởng lớn đối với sản xuất nông nghiệp. Chế độ canh tác độc canh cần một lượng lớn thuốc bảo vệ thực vật, đã làm ảnh hưởng đến môi trường sống. Gần đây, cây trồng chuyển gen có khả năng kháng thuốc diệt cỏ và kháng côn trùng được sử dụng, có ý nghĩa lớn trong việc bảo vệ môi trường. 2.1.1. Kháng thuốc diệt cỏ Trong sản xuất nông nghiệp có tính chuyên môn hóa cao thì việc sử dụng các loại thuốc diệt cỏ dại là điều rất cần thiết nhằm đảm bảo năng suất cây trồng. Tuy nhiên, việc lạm dụng một số thuốc diệt cỏ có độc tính cao đã và đang gây ra các hậu quả nghiêm trọng đối với môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người. Gần đây, người ta đã tổng hợp được một số hợp chất chỉ tồn tại trong tự nhiên một thời gian ngắn, nhưng lại tiêu diệt toàn bộ cây cối. Các hợp chất này được gọi là thuốc diệt cỏ không chọn lọc. Bằng phương pháp sử dụng đột biến, người ta đã phân lập được một số gen tạo cho cây trồng có khả năng kháng các loại thuốc diệt cỏ nói trên. Việc chuyển các gen này vào cây đã nâng cao tính chọn lọc và hiệu quả kinh tế của thuốc diệt cỏ cũng như làm giảm ảnh hưởng của thuốc đối với quần thể sinh vật trong đất. Thật vậy, khi chưa có loại cây trồng biến đổi Công nghệ gen trong nông nghiệp 32
35. gen kháng thuốc không chọn lọc, người ta phải phun nhiều lần trước khi gieo hạt nhằm loại bỏ hoàn toàn mầm mống cỏ dại. Nhưng khi người nông dân gieo trồng loại cây biến đổi gen thì họ đợi cho cây trồng và cỏ dại cùng phát triển đến một mức độ nhất định, sẽ tiến hành phun thuốc một lần là có thể đảm bảo loại bỏ sự xâm lấn của cỏ dại. Đồng thời việc phun thuốc khi mà cây trồng đã phát triển sẽ làm giảm thuốc diệt cỏ thấm vào đất, làm giảm nguy cơ gây hại đối với môi trường. Kháng thuốc diệt cỏ nhân tạo là đặc điểm thường được sử dụng nhiều nhất cho đến nay ở thực vật biến đổi gen. Điều này có nhiều nguyên nhân: - Thứ nhất là tạo ra thực vật biến đổi gen loại này tương đối đơn giản. - Thứ hai, cỏ dại là một vấn đề lớn nhất trong nông nghiệp, làm giảm năng suất từ 10-15%. Về cơ bản phân biệt loại thuốc diệt cỏ chọn lọc với loại không chọn lọc. Ở liều lượng nhất định loại kháng chọn lọc có tác dụng đối với thực vật có đặc điểm sinh lý và hình thái nhất định. Ví dụ: thuộc nhóm này gồm có: atrazin, bromoxynil, 2,4-D. Tác dụng của thuốc diệt cỏ chọn lọc: Atrazin: Làm ngừng sự vận chuyển điện tử trong hệ thống quang hóa II ở lục lạp (cần thiết đối với quang hợp của thực vật). Ngô không mẫn cảm với atrazin. Bromoxynil: Đình chỉ sự vận chuyển điện tử trong hệ thống quang hóa II của lạp thể, làm chết cây hai lá mầm. Glyphosate (Round upR): Làm ngừng hoạt động enzyme EPSP- synthase và qua đó kìm hãm sự tổng hợp các amino acid thơm. Phosphinothricin (PPT) còn gọi là Basta: PPT là đồng phân dạng L của sản phẩm tổng hợp glufosinate. PPT có cấu trúc tương tự glutamic acid, gắn không thuận nghịch với enzyme glutamatsynthase, gây độc do tích lũy NH3. 2,4-D: Auxin tổng hợp này gây hại cho sự phát triển của cây hai lá mầm, phần lớn cây một lá mầm không mẫn cảm. Một số loại thuốc diệt cỏ chọn lọc tồn tại lâu trong đất, vì vậy nó làm nhiễm nguồn nước. Ngược lại, thuốc diệt cỏ không chọn lọc như glyphosate hoặc phosphinothricin (PPT) độc đối với tất cả cây trồng. Công nghệ gen trong nông nghiệp 33
36. Ưu điểm của hai loại thuốc diệt cỏ này là phân giải rất nhanh trong đất thành những chất không hại. Thời gian bán hủy của Basta trong đất chỉ 10 ngày và Round up từ 3 đến 60 ngày. Thời gian bán hủy là khoảng thời gian mà 50% chất này bị biến đổi và phân giải. Để sản xuất cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, người ta cần những gen kháng mã hóa cho protein, những protein này hoặc làm bất hoạt thuốc diệt cỏ, hoặc thay đổi vị trí tác động của thuốc trong tế bào, làm thuốc không còn gây hại. Cơ chế kháng thuốc diệt cỏ không chọn lọc Basta và glyphosate được giải thích như sau: Basta là thuốc diệt cỏ không chọn lọc được sử dụng trong hơn 50 quốc gia, nhưng được sử dụng rất có giới hạn, vì nó gây độc ở cây trồng và cỏ dại như nhau. Gần đây, rất nhiều loại cây trồng biến đổi gen được tạo nên và đã được thử nghiệm trong hơn 100 thí nghiệm đồng ruộng, trong đó nhiều loại đã được đưa ra thị trường. Những gen kháng được phân lập từ vi sinh vật hoặc từ thực vật kháng trong tự nhiên. Từ cây linh lăng thảo (Medicago sativa) một gen không mẫn cảm với Basta được phân lập và từ vi khuẩn đất Streptomyces hygroscopius và S. viridochromogenes 2 gen bar và pat được phân lập, những gen này mã hóa cho enzyme phosphinothricin- acetyltransferase. Enzyme này làm mất độc tính của thuốc bằng acetyl hóa, gắn vào một gốc acetyl. Để sử dụng cho thực vật, những gen từ vi khuẩn được biến đổi và được điều khiển bởi promoter CaMV 35S nhằm đạt được sự biểu hiện gen thường xuyên trong tất cả các mô. Bằng cách này cây linh lăng thảo, cà chua, ngô, lúa, lúa mỳ và đậu tương kháng thuốc diệt cỏ được tạo nên. Thuốc diệt cỏ glyphosate đình chỉ đặc hiệu enzyme 5- enolpyruvylshikimate-3-phosphate-synthase (EPSP-synthase). Đây là enzyme cần thiết trong thực vật để tổng hợp amino acid thơm (phenylalanin, tryptophan và tyrosin), một số vitamin và các hợp chất có nguồn gốc thứ cấp. Enzyme này không có ở người và động vật, vì vậy glyphosate không độc đối với người. Glyphosate được phân giải trong đất nhờ vi sinh vật và không để lại sản phẩm độc hại nào. Kháng glyphosate có thể do những cơ chế khác nhau: - Thứ nhất trong cây có sự biểu hiện mạnh mẽ của enzyme của EPSP- synthase dưới sự điều khiển của promoter CaMV-35S và đồng thời tạo nên Công nghệ gen trong nông nghiệp 34
37. một enzyme oxidoreductase của vi khuẩn. Nhờ enzyme oxidoreductase mà thuốc bị bất hoạt và với một lượng lớn EPSP-synthase được tạo nên thì lượng thuốc còn lại không thể gây hại ở cây biến đổi gen (Hình 2.2). Ở đây 2 gen cần thiết, trong đó gen oxidoreductase là không có trong thực vật. Cây chuyển gen (gen bar) Cây không chuyển gen (đối chứng) Hình 2.2. Hiệu quả kháng thuốc diệt cỏ. Hình trên là cây chứa gen bar kháng basta. Hình dưới là cây đối chứng không chứa gen kháng này. Cả hai đều được phun basta. Ảnh chụp sau 15 ngày phun thuốc. Một khả năng thứ hai là sử dụng EPSP-synthase của vi khuẩn. Từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (loài CP4), EPSP-synthase vi khuẩn được phân lập và do sự thay đổi trình tự amino acid nên enzyme này không còn mẫn cảm với glyphosate và vì vậy được sử dụng trong nhiều cây trồng thương mại. Thứ ba là xuất hiện một dạng đột biến EPSP-synthase của cây trồng có khả năng kháng glyphosate (Hình 2.3). Tính kháng không chọn lọc được sử dụng đối với nhiều cây trồng biến đổi gen, như cây bông, khoai tây, ngô, đậu tương, thuốc lá và lúa mỳ. Bằng việc sử dụng cây trồng kháng thuốc diệt cỏ, lượng thuốc diệt cỏ được sử dụng giảm đi đáng kể, vì thuốc được dùng theo yêu cầu và trong phạm vi nhỏ hơn. Công nghệ gen trong nông nghiệp 35
38. EPSP SHKG Nhân synthase Glyphosate EPSP synthase ShkG* EPSP* synthase Glyphosate Gly → Ala Thay đổi cấu trúc enzyme EPSP EPSP EPSP* synthase synthase synthase Lục lạp Tế bào chất Phe, Trp, Tyr Phe, Trp, Tyr Hình 2.3. Đột biến xảy ra trong EPSP-synthase làm cho cây kháng thuốc diệt cỏ glyphosate. Sự kết hợp của glyphosate vào enzyme EPSP- synthase ở loại hình bình thường đã làm mất hoạt tính xúc tác và hạn chế sự di chuyển của enzyme này vào lục lạp. Dạng EPSP*-synthase (mã hóa bởi ShkG*-dạng đột biến) có hoạt tính thấp với glyphosate và vẫn thể hiện hoạt tính khi có mặt của thuốc diệt cỏ này. Năm 1996 và 1997 ở Mỹ, khi sử dụng cây kháng thuốc diệt cỏ đã làm giảm lượng thuốc dùng tương ứng là 26% và 22%. Rửa trôi đất giảm 90%, do đất không phải cày sâu, đồng thời năng suất tăng lên 5%. Một vấn đề khó khăn trong việc sử dụng cây biến đổi gen là sự lan truyền tính kháng qua hạt phấn đến những cây họ hàng. Để giải quyết vấn đề này việc tạo cây biến đổi gen là dựa vào sự thay đổi các gen trong lạp thể. Vì gen lạp thể ở phần lớn thực vật di truyền theo tế bào chất, vì vậy tính kháng thuốc diệt cỏ không thể lan truyền được qua hạt phấn. EPSP-synthase hoạt động ở trong lạp thể. Nhưng gen mã hóa cho enzyme này lại có mặt ở trong nhân. Protein được dịch mã ở ribosome trong Công nghệ gen trong nông nghiệp 36
39. tế bào chất và do có trình tự đích của lạp thể nên được vận chuyển vào cơ quan tử này. Cây thuốc lá kháng glyphosate đã được tạo nên bằng cách biến nạp gen mã hóa cho EPSP-synthase có nguồn gốc từ cây dã yên thảo. Gen này được chèn vào DNA của lạp thể. Lạp thể cũng có ribosome nên tổng hợp trực tiếp EPSP-synthese. Bằng cách này việc vận chuyển gen qua hạt phấn ở phần lớn cây trồng đã không xảy ra. 2.1.2. Kháng côn trùng gây hại Các tổn thất trước thu hoạch gây ra bởi các loại sâu phá hoại là một trong các nguyên nhân chủ yếu làm giảm năng suất cây trồng, đặc biệt là ở các nước nhiệt đới có nhiệt độ cao, ẩm độ lớn, thích hợp cho sự phát triển sâu bệnh như ở nước ta. Côn trùng gây hại cây trồng ở hai khía cạnh: - Thứ nhất là gián tiếp truyền các tác nhân gây bệnh khác như virus, vi khuẩn hoặc nấm. - Thứ hai là trực tiếp ăn hại các cơ quan của cây trồng. Biện pháp hữu hiệu được sử dụng rộng rãi hiện nay là phun thuốc trừ sâu hóa học. Việc sử dụng thuốc trừ sâu làm ảnh hưởng đến môi trường sinh thái, do dư lượng còn lại tích lũy trong chuỗi thức ăn và mặt khác thuốc trừ sâu gây độc không đặc hiệu đối với tất cả động vật. Vì vậy, sự phát triển những cây trồng chuyển gen kháng sâu có ý nghĩa lớn. Ở đây đề cập đến một loại toxin tự nhiên, được tạo ra trong vi khuẩn Bacillus thuringensis và chỉ gây hại ở một số loài côn trùng nhất định, không hại đối với các động vật khác và con người. Toxin này được gọi là Bt-toxin. B. thuringensis là một vi khuẩn đất tạo bào tử. Ở quá trình tạo bào tử xuất hiện những vỏ tinh thể chứa -endotoxin. Ở các loài B. thuringensis khác nhau người ta đã xác định được hơn 100 loại toxin khác nhau, là những protein với khối lượng phân tử khoảng 130 kDa. Trong ruột côn trùng - endotoxin được biến đổi thành dạng độc tố hoạt động và tích lũy trong tế bào thượng bì ruột. Việc tạo bào tử trong màng dẫn đến sự phân giải thẩm thấu những tế bào này và làm cho côn trùng chết. Trong nông nghiệp sinh thái vi khuẩn B. thuringensis được phun trực tiếp trên đồng ruộng. Tuy nhiên, đối với một số cây trồng, việc phun thuốc Công nghệ gen trong nông nghiệp 37
40. trừ sâu Bt đôi khi ít hiệu quả do đặc tính hình thái của cây trồng tại thời điểm cần phun thuốc. Ví dụ: đối với cây ngô loại côn trùng phá hoại chính là sâu đục thân Ostrinia nubilalis. Để phòng trừ loại sâu này, người ta phun thuốc vào thời điểm sâu bắt đầu nở. Nhưng do đặc tính khí hậu ở một số vùng, thời điểm sâu bắt đầu nở rơi đúng vào lúc cây đã phát triển. Điều này ngăn cản thuốc trừ sâu Bt đi tới các mô, các bộ phận mà sâu đục thân phá hoại. Mặt khác, thuốc trừ sâu Bt rất dễ phân hủy trong môi trường tự nhiên, đặc biệt dưới ánh sáng mặt trời chứa nhiều tia cực tím. Do vậy, ở những vùng thích hợp cho sự phát triển của sâu đục thân, khiến cho thời kỳ sinh sản của sâu kéo dài, người nông dân phải phun thuốc nhiều lần rất tốn kém. Bắt nguồn từ các hạn chế của việc phun thuốc trừ sâu Bt, các nhà khoa học đã chuyển gen Bt vào nhiều loại cây trồng. Lúc này, cây chuyển gen Bt có khả năng sinh tổng hợp trực tiếp loại thuốc trừ sâu sinh học. Điều này giúp cho việc phòng trừ trở nên hiệu quả hơn và giảm chi phí mua thuốc trừ sâu cho người nông dân. Hình 2.4. Cây ngô biến đổi gen, tạo ra Bt-endotoxin (phía trên) và cây ngô bình thường bị nhiễm sâu hại (phía dưới). Gen mã hóa cho Bt-toxin được biến đổi cho phù hợp với thực vật, được đưa vào các cây trồng khác nhau như bông, ngô, khoai tây và cà chua chuyển gen đang được sản xuất thương mại biểu hiện độc tố của Βt để tạo ra tính kháng đối với các côn trùng loại nhai-nghiền (chewing insects). Vi Công nghệ gen trong nông nghiệp 38
41. khuẩn B. thuringensis tổng hợp các protein -endotoxin tinh thể được mã hóa bởi các gen Cry. Người ta phân biệt 4 nhóm endotoxin (CryI đến CryIV), tùy thuộc nó độc với loài sâu nào, đối với Lepidoptere (bướm, CryI), Lepidoptere và Diptere (ruồi và muỗi, CryII), Coledoptere (côn trùng cánh cứng, Cry III) và Diptere (Cry IV). Sau nhiều thí nghiệm đồng ruộng các loại cây trồng chứa gen Bt đã có mặt trên thị trường với kết quả tốt. Ví dụ: với việc sử dụng ngô chứa gen Bt năm 1996 và 1997 đã làm giảm lượng thuốc trừ sâu cho cây ngô ở Mỹ 10%, năng suất tăng lên 9%, bông chứa gen Bt năng suất tăng 7%. 60% nông dân loại bỏ hoàn toàn thuốc trừ sâu. Một số ưu điểm của độc tố Bt như sau : - Tính đặc hiệu, mỗi protein Cry chỉ hoạt động chống lại một hoặc một vài loài côn trùng. - Sự đa dạng, nhiều protein Cry khác nhau đã được nhận biết. - Các ảnh hưởng không bất lợi hoặc bị giảm đã được xác nhận trên các côn trùng không phải đích hoặc các địch thủ tự nhiên của côn trùng. - Độc tính với động vật có vú là rất thấp. - Có thể thoái biến dễ dàng. Kết quả nghiên cứu cho thấy điểm mấu chốt là gen chịu trách nhiệm tổng hợp protein tinh thể trừ sâu của vi khuẩn B. thuringensis chủng kurstaki, chưa đặc biệt biểu hiện rõ ở cây trồng. Để nâng cao hiệu quả của độc tố, các nhà nghiên cứu đã cắt gọt bớt gen chỉ để tổng hợp phần protein có hoạt tính chứa độc tố mà không cần các phần gen phụ khác. Gen Cry được cắt bớt đã biểu hiện tổng hợp protein gấp 500 lần so với gen nguyên thủy. Hiện nay, hơn 40 gen khác nhau mang tính kháng côn trùng đã được hợp nhất trong cây trồng chuyển gen với một vài giống đã được thương mại hóa ở các nước như Mỹ, Úc Lợi ích của các độc tố Bt trong kiểm soát côn trùng đã buộc chúng ta phải có các phương thức quản lý khác nhau để làm chậm sự phát triển của tính kháng của côn trùng đối với Βt, bao gồm : - Bố trí các vùng bên cạnh trồng cây bông không chuyển gen Bt, làm nơi trú ẩn để giảm áp lực chọn lọc hướng tới việc kháng côn trùng. Công nghệ gen trong nông nghiệp 39
42. - Triển khai các gen kháng côn trùng khác nhau (Ví dụ: protease inhibitors). - Dùng các loại độc tố Bt cho các receptor đích khác nhau. - Dùng các promoter khác nhau để điều chỉnh sự biểu hiện của các gen Bt. - Dùng các promoter đặc trưng mô (tissue-specific promoter), như thế côn trùng có thể ăn mà không tổn hại đến kinh tế trên các bộ phận ít quan trọng của thực vật. - Có các hướng khác để phát triển tính kháng côn trùng cho cây chuyển gen dựa trên cơ sở: protease inhibitors, -amylase, lectins, chitinases, cholesterol oxidase, các virus của côn trùng được tạo dòng, tryptophan decarboxylase, anti-chymotrypsin, bovine pancreatic trypsin inhibitor và nhân tố ức chế lá lách. Dĩ nhiên là Bt-toxin không độc cho tất cả mọi côn trùng và trong tự nhiên luôn có khả năng xuất hiện những loài sâu kháng. Vì vậy, phải có chiến lược tiếp tục tạo ra những loại cây trồng kháng. Đặc biệt hứa hẹn là chất ức chế serin-protease, kìm hãm các enzyme tiêu hóa quan trọng của côn trùng. Những cây trồng chứa một lượng lớn protein này có tác dụng bảo vệ trước sự phá hoại của sâu hại. Ngoài ra, nhiều phương pháp khác cũng được thử nghiệm. Về nguyên tắc các phương pháp này dựa trên việc sử dụng những protein có trong tự nhiên đặc hiệu chỉ gây hại cho côn trùng. Điều này đặc biệt có ý nghĩa ở trong cây lương thực và thực phẩm vì nó không chứa những chất độc gây hại cho người tiêu dùng. 2.1.3. Kháng virus gây bệnh Tương tự như vi khuẩn, động vật và người; ở thực vật cũng tồn tại một số lượng lớn virus. Ngoài ra, ở thực vật còn có thể được gọi là viroide. Virus chứa một vỏ protein và trong đó có cả màng lipid. Vật chất di truyền của virus là DNA hoặc RNA. Viroide không có vỏ protein và màng mà chỉ có phân tử RNA ở dạng vòng nhỏ. Sự tái sinh virus và viroide hoàn toàn phụ thuộc vào trao đổi chất của ký chủ. Theo quy ước quốc tế tên của virus được gọi theo tên thực vật đầu tiên mà loại virus đó được tìm ra, sau đó đến triệu chứng đầu tiên và thêm từ virus (ví dụ: thuốc lá-khảm-virus: Công nghệ gen trong nông nghiệp 40
43. tobacco-mosaic-virus). Virus thực vật cần sinh vật khác để truyền từ cây này sang cây khác. Ở đây phần lớn là nhờ côn trùng, và khi chúng mang virus được gọi là vector. Virus thường được coi là tác nhân gây bệnh nguy hiểm. Tuy nhiên, quan niệm này không hoàn toàn chính xác, vì khi phân tích từng phần hệ gen thực vật cho thấy, trong cây trồng và cây hoang dại tồn tại số lượng lớn các loại virus, trong chúng phần lớn là không gây hại. Ngoài ra, virus ở thực vật không phải là virus ở người và động vật. Chỉ có một số loài virus gây thiệt hại lớn cho mùa màng. Ví dụ loài virus tạo ra nhiều rễ nhỏ ở củ cải đường trong một số vùng lớn ở Đức đã gây thiệt hại đến 75%. Triệu chứng ở thực vật sau khi virus xâm nhiễm (thay đổi màu, dạng và chết) rất đa dạng và phụ thuộc vào các yếu tố môi trường. Ngược lại, virus thực vật có cấu tạo đơn giản, vì chúng gồm một vỏ protein đơn giản và bên trong vỏ này chứa nucleic acid mang những gen khác nhau. Phần lớn virus chứa những gen mã hóa cho vỏ protein, cho sao chép thông tin di truyền của nó (từ DNA hoặc RNA) và một gen cho sự di chuyển bên trong thực vật từ tế bào này đến tế bào khác. Thường tồn tại những chủng virus họ hàng với mức độ gây bệnh khác nhau. Có những chủng không gây triệu chứng, có độc tính thấp, trong khi đó có những chủng gây triệu chứng hại rất nặng, được gọi là virus có độc tính cao. Đã lâu người ta biết rằng, nếu tiêm chủng trước đó với loài virus độc tính yếu thì ở trong cây xuất hiện tính miễn dịch đối với loài virus họ hàng độc tính mạnh hơn. Sự tái sinh của virus bị ngừng hoặc là giảm rất mạnh, được gọi là bảo vệ chéo (cross protection) (Hình 2.5). Người ta lợi dụng hiệu quả trên để tạo cây biến đổi gen kháng virus. Đầu tiên những gen mã hóa cho protein vỏ của virus được đưa vào thực vật và biểu hiện dưới sự điều khiển của promoter CaMV 35S. Thực tế cho thấy những cây này sau khi nhiễm virus không xuất hiện triệu chứng. Theo cơ chế này những tính kháng cơ bản với nhiều loại virus khác nhau được tạo nên. Nhiều phương thức được sử dụng để kiểm soát sự xâm nhiễm virus bao gồm các xử lý hóa học để giết các vector virus, chuyển vào cây trồng các gen kháng tự nhiên từ các loài liên quan, sử dụng các phương pháp chẩn đoán hiện đại như PCR và đưa ra những chỉ dẫn thích hợp để đảm bảo nhân giống các vật liệu khởi đầu sạch virus (ví dụ: hạt, củ ). Công nghệ gen trong nông nghiệp 41
44. Nhiễm TMV Nước Nước độc tính yếu Cây đột biến gen Nhiễm TMV Nhiễm TMV Nhiễm TMV độc tính độc tính độc tính Sau khoảng 3 tuần Khỏe Bệnh Khỏe Hình 2.5. Thí nghiệm về bảo vệ chéo. Bên trái: Cây thuốc lá được xử lý với TMV yếu, sau đó được lây nhiễm với TMV độc tính và kết quả là cây không gây bệnh. Ở giữa: Cây thuốc lá không được xử lý với TMV yếu, xuất hiện triệu chứng bệnh sau khi xử lý với TMV độc tính. Bên phải: Cây biến đổi gen, chứa các gen mã hóa cho protein vỏ của TMV, kháng được sự lây nhiễm Tuy nhiên, phương pháp chủ yếu để khắc phục tình trạng trên là khai thác tính kháng xuất phát từ các tác nhân gây bệnh. Chẳng hạn, sử dụng các trình tự có nguồn gốc từ virus được biểu hiện trong các cây chuyển gen để tạo ra tính kháng đối với các virus thực vật. Hướng này dựa trên cơ sở các nghiên cứu về sự gây nhiễm (inoculation) hay xâm nhiễm (infection) ở thực vật, được khởi đầu với các chủng virus nhẹ tạo ra khả năng bảo vệ chống lại sự gây nhiễm tiếp theo với cùng chủng virus hoặc các virus có liên quan gần Công nghệ gen trong nông nghiệp 42
45. gũi. Tính kháng bắt nguồn từ tác nhân gây bệnh như vậy cần sự biến nạp thực vật với các trình tự có nguồn gốc từ virus. Tính kháng vật chủ xuất hiện từ hai cơ chế khác nhau: (1) Sự bảo vệ được dàn xếp thông qua biểu hiện của các protein virus tự nhiên hoặc đã được biến đổi (ví dụ: protein vỏ, replicase, và replicase khiếm khuyết). (2) Sự bảo vệ được dàn xếp ở mức độ phiên mã (RNA-mediated resistance), đòi hỏi sự phiên mã của RNA hoặc từ các trình tự hoàn chỉnh hoặc từng phần có nguồn gốc từ virus đích (bao gồm các gen cho protein vỏ, replicase, replicase khiếm khuyết, protease, protein vận động ). Một đường hướng khác tạo ra cây trồng kháng là dựa trên việc sử dụng những gen kháng (các gen R) tồn tại ở một số thực vật tự nhiên. Những gen kháng này đã xuất hiện trong quá trình tiến hóa của một số loài thực vật và mỗi một tính kháng chống lại một tác nhân đặc hiệu. Người ta chuyển một gen R vào một cây trồng khác thì cây này sẽ kháng được tác nhân đặc hiệu đó. Bằng cách này không những kháng virus có hiệu quả mà người ta còn biết các gen R kháng vi khuẩn, nấm và tuyến trùng. Trong tương lai có thể tạo nên các gen R có tính đặc hiệu xác định. Trong những năm 80, bệnh virus đốm vòng ở cây đu đủ đã xuất hiện ở vùng Hawai. Năm 1994, gần một nửa diện tích đu đủ của quốc gia này bị bệnh. Một giống kháng bệnh rất cần nhưng phương pháp lai tạo truyền thống đã không thành công. Các nhà nghiên cứu ở Đại học Cornell và Đại học Hawai quyết định tìm một dạng kháng bệnh này. Họ đã sử dụng công nghệ gen để chèn các gen mã hóa cho vỏ protein của virus đốm vòng đu đủ được phân lập từ virus này vào DNA của cây đu đủ. Sự có mặt của protein vỏ virus trong cây đã ngăn cản sự lây nhiễm virus vì các gen virus cần để gây nhiễm không có mặt. Như vậy, đã tạo ra một loại miễn dịch thực vật. Sau khi kiểm tra sự an toàn cần thiết người ta đã sử dụng loại cây đu đủ biến đổi gen để sản xuất. 2.1.4. Kháng vi khuẩn và nấm Vi khuẩn là những sinh vật tiền nhân. Cũng như virus, phần lớn vi khuẩn là tác nhân gây bệnh nguy hiểm, mặc dù thực tế cũng chỉ một số lượng nhỏ. Gần đây, được biết có 200 loài gây bệnh ở thực vật trong tổng số khoảng hơn một triệu loài. Công nghệ gen trong nông nghiệp 43
46. Đối với bệnh vi khuẩn, hướng nghiên cứu tạo giống mới bằng công nghệ gen chỉ mới bắt đầu. Về cơ bản có ba hướng: (1) Dùng gen mã hóa enzyme làm thoái hóa thành tế bào vi khuẩn, chẳng hạn gen sản xuất lysozyme từ các nguồn tế bào động vật hoặc từ bacteriophage T4 đưa vào cây thuốc lá và khoai tây. Các gen này biểu hiện hoạt tính lysozyme mạnh và các tế bào có khả năng phòng trừ vi khuẩn Erwina carotovora rất tốt. (2) Gen mã hóa -thionin-cystein được chuyển vào cây thuốc lá cũng phòng ngừa được vi khuẩn Pseudomonas syringae. (3) Chuyển nạp gen sản xuất protein làm giảm độc tố của vi khuẩn là hướng có nhiều hứa hẹn. Gen này chủ yếu sản xuất các loại enzyme phân hủy độc tố của vi khuẩn, do vậy đã ngăn cản tác hại của chúng. Nấm thuộc vào sinh vật nhân chuẩn (eukaryote), có khoảng 8.000 trong 100.000 loài nấm đã biết gây hại nặng ở thực vật. Một sự kiện nổi bật là sự phá hủy vụ khoai tây ở Ailen vào năm 1845 và những năm sau đó do nấm Phytophtora infestants. Sự kiện này đã dẫn đến nạn đói lớn nhất và sự di cư của hàng triệu người từ nước này đến Mỹ. Cho đến nay dân số nước này vẫn chưa đạt đến con số trước năm 1845. Mất mùa do vi khuẩn và nấm vẫn luôn là vấn đề lớn, vì vậy bắt buộc sử dụng thuốc trừ nấm trong nông nghiệp. Một vấn đề nữa là sự nhiễm thực phẩm do mycotoxin mà nấm thải ra, thường gặp khi thực phẩm thực vật không được xử lý bằng thuốc trừ nấm. Mycotoxin về cấu tạo hóa học rất đa dạng, có thể gây bệnh nặng ở người và động vật và có thể gây ung thư nếu sự tiếp nhận thực phẩm này trong thời gian dài. Khả năng gây hại chính xác của nó cho đến nay vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Vì phương thức tạo ra cây biến đổi gen kháng vi khuẩn và nấm có phần tương tự nhau, nên được đề cập chung ở đây. Việc sử dụng các gen kháng trong cây biến đổi gen đã được nêu rõ ở phần trên. Những gen kháng cụ thể có ý nghĩa và đã được thử nghiệm trong cây biến đổi gen. Gen kháng mã hóa cho các chất nhận, chúng kích thích nhiều phản ứng bằng chuỗi vận chuyển tín hiệu, ví dụ tạo nên kháng thể. Những gen này là sự quan tâm lớn của các nhà sản xuất. Công nghệ gen trong nông nghiệp 44
47. Sản xuất những chất chống lại vi sinh vật trong cây biến đổi gen đã được thử nghiệm từ nhiều năm nay, nhưng kết quả thu được chưa thống nhất. Ví dụ: người ta đã thử nghiệm chitinase trong cây biến đổi gen, vì thành tế bào của nhiều loài nấm chứa chitin. Thực tế đã cho kết quả tốt ở một số thực vật do nấm gây bệnh. Cải tạo các giống cây trồng kháng nấm hại dựa trên nguyên lý đưa gen mã hóa một loại enzyme nào đó có tác dụng ức chế trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự phát triển của nấm hại. Các enzyme làm thoái hóa các thành phần chính của vỏ tế bào nấm chitin và β-1,3 glucan là loại đang được chú ý. Khi có gen chitinase chuyển vào, cây thuốc lá chuyển gen đã tăng hoạt tính kháng nấm gây hại. Sự biểu hiện đồng thời của cả hai gen chitinase và glucanase trong thuốc lá làm cho cây có tính kháng nấm gây hại cao hơn cây có một gen độc lập. Cũng tương tự, cà chua có tính kháng nấm Fusarium cao hơn hẳn, sau khi được chuyển cả hai gen nói trên. Protein ức chế ribosome (ribosomal inhibition protein-RIP) cũng biểu hiện tính kháng nấm khả quan. Cây thuốc lá cho tính kháng nấm rất tốt, khi cây được chuyển đồng thời gen RIP và chitinase. Nhiều thực vật biến đổi gen khác nhau tạo ra protein kháng vi sinh vật khác nhau. Ở đây người ta thu được những kết quả trái ngược nhau, ví dụ - thionin có nguồn gốc từ yến mạch được biến nạp vào cây thuốc lá kháng vi khuẩn Pseudomonas syringae và một thionin nhân tạo nội sinh biểu hiện mạnh kháng Fusarium oxyporum. Nhiều tác nhân gây bệnh tạo ra trong cây các chất độc. Ngược lại cây trồng cũng tạo ra chất độc để tự bảo vệ chúng. 2.1.5. Kháng các điều kiện ngoại cảnh bất lợi Thực vật gắn liền với vị trí của nó và vì vậy chúng đã phát triển cơ chế nhằm để chống lại những điều kiện bất lợi của môi trường. Ở đây phải kể đến nóng, lạnh, khô hạn, thiếu khoáng, nồng độ muối và kim loại cao, ô nhiễm môi trường và tia cực tím. Dĩ nhiên là không gặp tất cả những yếu tố này ở một vị trí và chúng có những ảnh hưởng khác nhau đến thực vật. Thực vật có khả năng chống chịu cao với những yếu tố bất lợi này có ý nghĩa đặc biệt cho những vùng khó khăn về nông nghiệp. Điều này rất quan trọng, vì diện tích gieo trồng cho đến nay chưa đáp ứng đủ nhu cầu cho dân số thế giới ngày càng tăng. Vì vậy, bắt buộc phải Công nghệ gen trong nông nghiệp 45
48. trồng cây trên những vùng rất khô hạn, nóng và lạnh, đặc biệt ở các nước đang phát triển với sự tăng dân số rất nhanh và nhiều vùng khó khăn về thời tiết. Người ta cho rằng, phần lớn những yếu tố bất lợi gây hại trực tiếp hoặc gián tiếp làm xuất hiện những hợp chất oxy độc, hoạt động, được gọi ngắn gọn là ROS (reactive oxygen species). ROS xuất hiện do sự vận chuyển điện tử từ chuỗi vận chuyển điện tử gắn liền với màng trong ty thể và lạp thể đến phân tử oxy. ROS hoạt động hóa học mạnh, gây hại cấu trúc tế bào và nucleic acid. Tất cả tế bào sống hiếu khí (cần oxygen) có khả năng phân giải nhanh những ROS. Ở người ROS gắn liền với quá trình lão hóa. Người ta cho rằng, ROS được tạo nên đã hoạt hóa các gen, mã hóa cho các enzyme, xúc tác cho tổng hợp các chất chống oxy hóa (ví dụ, vitamin D hoặc E). Mặc dù các marker phân tử kháng khô hạn đã được sử dụng trong lai tạo truyền thống, nhưng những nghiên cứu về khả năng kháng điều kiện bất lợi ở thực vật biến đổi gen vẫn còn trong giai đoạn nghiên cứu. Ngoài ra, còn có lý do khác là mỗi một quá trình trong tế bào gắn chặt chẽ với nhau, chẳng hạn quá trình hô hấp gắn liền với quá trình quang hợp. Tuy nhiên, đã có một số triển vọng nhờ dựa trên sự biểu hiện của enzyme tổng hợp chất chống oxy hóa như các ví dụ sau: - Người ta đã thành công trong việc tạo ra cây Arabidopsis biến đổi gen có mang enzyme cholinoxygenase từ vi khuẩn Arthrobacter globiformi. Thực vật này tích lũy glycinbetaine và thể hiện tính chịu mặn cao. Ở những thí nghiệm khác glycinbetaine được phun lên cây ngô và cây kê (Sorghum bicolor) đã đạt được khả năng chống hạn tốt hơn và năng suất cao hơn. Ở nhiều cây trồng khác có sự tích lũy mannitol để chống lại khô hạn và nồng độ muối cao. Gen mã hóa cho mannitol-dehydrogenase có nguồn gốc từ E. coli được biến nạp vào thuốc lá và enzyme biểu hiện ở lạp thể nhờ một trình tự đích tương ứng. Một sự tích lũy mannitol làm tăng khả năng chống lại các chất oxy hóa. - Người ta đã sử dụng gen mã hóa cho DNA helicase, loại enzyme có tác dụng tách DNA (giãn xoắn) trong suốt quá trình sao chép gen. Một helicase tìm thấy trong cây đậu Hà Lan cụ thể là chất PDH45 đã tăng khả năng chống chịu với nồng độ muối cao, sự khử nước và nhiệt độ thấp. Kết quả đã cho thấy sau khi chuyển gen PDH45 vào cây thuốc lá, thì cây này Công nghệ gen trong nông nghiệp 46
49. không chỉ tiếp tục tăng trưởng trong điều kiện độ mặn cao, mà còn cho phép việc các thế hệ tiếp theo của cây này giữ được gen và tiếp tục chịu được độ mặn cao. Các nhà nghiên cứu phát hiện thấy việc biểu hiện gen này trong cây thuốc lá tương tự như khả năng chịu mặn. Mặc dù cây thuốc lá chuyển gen được thử nghiệm trong điều kiện sinh trưởng khó khăn, nhưng chúng vẫn tiếp tục lớn lên, ra hoa và tạo quả với số lượng hạt kích thước hạt, khối lượng hạt và kích thước quả tương đương với những loại cây trồng hoang dại không phải chịu mặn. Đất bị nhiễm kim loại cũng là một khó khăn trong nông nghiệp. Có những chiến lược khác nhau được phát triển để tạo ra cây kháng hoặc ít nhất là không mẫn cảm. Việc biểu hiện gen Hg-reductase, kháng thủy ngân có nguồn gốc từ vi khuẩn ở cây có họ hàng với mộc lan (Liriodendron tulipifera) đã chịu được nồng độ Hg cao so với cây bình thường. Việc sử dụng các gen metallothionin cũng đã thành công ở cây thuốc lá biến đổi gen kháng cadium. Khi nghiên cứu cây Crasterostigma plantagineum có khả năng chịu hạn, người ta đã phát hiện được một số gen chỉ biểu hiện ở các mô chịu hạn. Phát hiện này mở ra những triển vọng trong tạo dòng, phân tích và chuyển gen vào thực vật tạo ra các cây có tính chịu hạn cao. Đây là những ví dụ cho phép hy vọng rằng trong tương lai có khả năng tạo ra những cây biến đổi gen với khả năng chống hạn, muối và kim loại cao hơn. 2.2. Nâng cao chất lượng sản phẩm Phần này thảo luận về vấn đề sản xuất lương thực với cây biến đổi gen. Ở đây phân biệt vấn đề trong các nước đang phát triển và các nước công nghiệp: Sự suy dinh dưỡng và thiếu lương thực vẫn tồn tại trong nhiều nước đang phát triển. Tuy nhiên, ở các nước công nghiệp do dị ứng hoặc không tiêu hóa đối với các thành phần trong thức ăn, đã làm ảnh hưởng phần nào đến chất lượng cuộc sống. Cuối cùng thì không nên xem nhẹ vấn đề vận chuyển thực phẩm từ nơi xa chuyển đến. Ví dụ: trái cây thường thu hoạch xanh, trong quá trình vận chuyển được gây chín nhân tạo. Từ những mối lo ngai này đã dẫn đến khả năng thay đổi thực vật theo hướng thay đổi các chất bên trong. Công nghệ gen trong nông nghiệp 47
50. 2.2.1. Carbohydrate và acid béo Carbohydrate đóng vai trò quan trọng và có nhiều chức năng đối với thực vật và con người. Tất cả sự sống trên trái đất suy cho cùng đều dựa vào cây xanh, từ H2O, CO2 và năng lượng ánh sáng để tạo nên glucose và O2. Quá trình này xảy ra trong lục lạp và được gọi là quang hợp. Quá trình tạo carbohydrate trong thực vật rất phức tạp, do vị trí tạo đường (phần lớn là ở lá cây) và vị trí tích lũy hoặc sử dụng đường (ví dụ: hoa, củ ) tách rời nhau và vì vậy phần lớn đường tạo ra ở dạng saccharose, được vận chuyển trong thực vật. Sự tích lũy carbohydrate chủ yếu ở dạng tinh bột, xảy ra ở trong vô sắc lạp (amyloplaste). Tinh bột là chuỗi các phân tử glucose, gồm mạch thẳng (amylose) và mạch phân nhánh (amylopectin). Tinh bột có vai trò lớn đối với sản xuất thực phẩm và là nguyên liệu cho công nghiệp. Khi sử dụng tinh bột cho các mục đích khác nhau, sự phân nhánh của amylopectin, độ lớn và cấu trúc của các hạt tinh bột có vai trò quan trọng. Nguyên lý của sinh tổng hợp đã rõ ràng và phần lớn những gen tham gia đã được tạo dòng. Có thể thay đổi thành phần carbohydrate của thực vật bằng việc biểu hiện những gen mới hoặc bất hoạt những gen hiện có. Ví dụ: người ta đã thành công trong việc chuyển enzyme AGPase (ADP-glucose- phosphorylase) từ vi khuẩn đường ruột E. coli đã được biến đổi đã làm tăng khả năng tích lũy tinh bột trong khoai tây. Ngược lại bằng cơ chế antisense, enzyme tổng hợp tinh bột synthetase ở trong hạt tinh bột bị ức chế. Khoai tây được tạo ra bằng cách này chỉ chứa amylopectin mà không có amylose. Không phải thị trường luôn luôn thú vị với cây biến đổi gen, vì những thay đổi về độ lớn củ hoặc làm giảm năng suất. Trong tương lai cần thiết phải tiếp tục phân tích các chức năng trao đổi chất liên quan phức tạp trong thực vật để tránh những hiệu quả phụ. Cấu tạo hóa học tương tự với tinh bột là cellulose, một polysaccharide, chủ yếu tạo nên thành tế bào thực vật. Chuỗi cellulose không phân nhánh (Hình 2.6) và không có vai trò trong thức ăn của người, vì chúng không được tiêu hóa. Chất béo là hợp chất ester của glycerine và các acid béo. Acid béo gồm một chuỗi carbon dài với đầu cuối là nhóm carboxyl. Các acid béo khác nhau về độ dài của chuỗi carbon và độ bão hòa, nghĩa là số lượng liên Công nghệ gen trong nông nghiệp 48
51. kết đôi trong phân tử. Những đặc điểm này ảnh hưởng đến đặc tính hóa học của acid béo. Có thể thay đổi chất béo theo hai hướng sau: - Thứ nhất là thay đổi tỷ lệ acid béo bão hòa và chưa bão hòa, thứ hai là tạo ra những acid béo có mạch carbon dài, chưa bão hòa, vì chúng được coi là thực phẩm có giá trị. Ví dụ: một gen từ Umbellularia californica mã hóa cho enzyme thioesterase được đưa vào cây cải dầu, đã tăng hàm lượng - lauric acid (CH3(CH2)10COO ), thuận lợi cho việc sản xuất bơ. H H H O H O H O H H H O H H CH CH2 H - O H 2 H O H O O O H O H H O H O HO O O O O H O H CH2 H CH2 H H H O H H H O H O O H H H O O HO O O HO HO OH O O HO HO OH O O HO OH O CH2OH O O HO CH2OH OH O O CH2OH HO O O OH HO CH2OH O OH O O HO OH O O HO OH O Công nghệ gen trong nông nghiệp 49
52. Hình 2.6. Cấu trúc của (a) cellulose, (b) amylose (không phân nhánh) và (c) amylopectin (phân nhánh). - Tuy nhiên, thay đổi acid béo trong thực phẩm cũng có khó khăn vì có những trường hợp cho thấy, một số acid béo mới xuất hiện có ảnh hưởng xấu đến ngành chăn nuôi. Vì vậy, để có sự phát triển thích hợp phải thực hiện các nghiên cứu về độ an toàn. Điểm chính trong thay đổi acid béo là hướng về các mục đích công nghiệp, ví dụ các chất thay thế cho dầu tự nhiên. 2.2.2. Hàm lượng protein và amino acid không thay thế Hàm lượng protein và thành phần amino acid thay đổi rất nhiều trong thực phẩm thực vật. Ngoài protein thì các amino acid không thay thế, phải được tiếp nhận cùng thức ăn vì con người và động vật không tự tổng hợp được. Đặc biệt trong thức ăn gia súc chủ yếu là đậu tương và ngô, phải bổ sung các amino acid được sản xuất bằng phương pháp lên men như lysine, methionine, threonine và tryptophan. Trong tương lai không cần thiết phải bổ sung các amino acid này theo cách như vậy mà tạo dòng các gen ở cây đậu tương hoặc ngô mã hóa cho protein giàu những amino acid này. Một trong những thành công đầu tiên là tạo dòng ngô đột biến có cân bằng amino acid tốt hơn (hàm lượng protein cao hơn) có tên là Opaquez, có hàm lượng lysine cao hơn (tăng 32% so với đối chứng). Năm 1960, các nhà khoa học đã chứng minh được ưu thế dinh dưỡng của loại ngô này, nhưng người nông dân đã không chấp nhận vì năng suất giảm 15%. Thực tế này đã dẫn tới sự cố gắng trong lai tạo giống trong 30 năm để tạo ra được dòng ngô chứa protein chất lượng cao. Hàm lượng lysine của loại này không cao như Opaque2 (20% so với 32%), nhưng có những đặc điểm nông học tốt. Nông dân ở châu Phi và Nam Mỹ, nơi mà ngô là lương thực chính cho con người đã chấp nhận rộng rãi giống ngô này . Trong hạt đậu tương hàm lượng protein cao nhưng nghèo methionine. Những cố gắng để tạo ra cây họ đậu giàu methionine bằng công nghệ gen đã xác định được một protein trong hạt hướng dương chứa các amino acid có lưu huỳnh cao bất thường. Một đặc tính khác của protein này là bền trước sự phân giải vi khuẩn trong dạ cỏ. Một nhà nghiên cứu người Úc đưa gen mã hóa cho protein vào cây đậu lupin với mục đích biểu hiện ở hạt. Kết quả là Công nghệ gen trong nông nghiệp 50
53. tăng 100% hàm lượng protein trong hạt. Khi dùng hạt này để nuôi cừu, trọng lượng cừu tăng 7% và sản lượng lông tăng 8% so với cừu nuôi bằng loại hạt bình thường. Thành công này thúc đẩy các nhà nghiên cứu đưa gen này vào lá cây cỏ, nhằm cải tiến cân bằng amino acid không thay thế ở dạ cỏ. Thaumatin là những protein được chiết xuất từ thịt quả của cây Thaumatococus danielle, có độ ngọt gấp 1.000 lần đường saccharose. Người ta đã thành công trong việc chuyển một gen mã hóa cho thaumatin (thaumatin II) vào cây khoai tây, tạo một cây khoai tây có lá, thân rễ, củ đều ngọt. Kết quả này mở ra một triển vọng rất lớn đối với cây ăn quả ngọt. Cây trồng chuyển gen có khả năng sản xuất những loại protein mới. Việc sản xuất protein trong thực vật dễ dàng, nhưng tinh sạch những protein này từ mô thực vật là khó khăn và trước hết là giá thành cao. Vì vậy, người ta hy vọng vào một phương pháp mới, được giới thiệu bởi Raskin và cộng sự (1999). Những gen mã hóa cho protein được gắn với một promoter và đảm bảo cho protein chỉ được tổng hợp ở rễ. Tiếp theo, protein tạo thành có một hệ thống tín hiệu, đảm bảo cho nó được vận chuyển vào một vị trí xác định trong tế bào. Trong trường hợp đặc biệt protein được vận chuyển vào mạng lưới nội chất (endoplasmatic reticulum: ER). Protein đi vào ER có thể được tiết ra bên ngoài và chỉ ở vùng rễ, vì promoter chỉ đặc hiệu cho vùng này. Người ta có thể dùng một số dung dịch muối để tách protein một cách dễ dàng và với giá thành hợp lý. Một ví dụ khác cho hướng ứng dụng này là đã tạo ra được hai loại thuốc lá chuyển gen, mỗi loại có khả năng sản xuất một trong hai mạch immunoglobin nhẹ và nặng. Thế hệ con sinh ra nhờ lai hai loại cây trên biểu hiện được một kháng thể hoạt động gồm hai loại mạch với hàm lượng cao (chiếm 1,3% protein hòa tan tổng số của lá) và có tất cả các đặc tính của một kháng thể đơn dòng sản sinh từ hybridoma. 2.2.3. Vitamin, chất khoáng và các nguyên tố vi lượng Vitamin, chất khoáng và các nguyên tố vi lượng rất cần cho sức khỏe con người và phải được đưa vào cùng với thức ăn. Vấn đề này ở các nước công nghiệp thực hiện rất dễ dàng, trong khi ở các nước đang phát triển lại là sự thiếu hụt rất lớn. Hằng năm có khoảng 250 triệu trẻ em thiếu vitamin Công nghệ gen trong nông nghiệp 51
54. A, 250.000-500.000 trẻ em bị mù. Hai tỷ người, một phần ba dân số thế giới thường xuyên thiếu Fe, con số này còn tăng lên khi lương thực chính là gạo. Thực vật là nguồn cung cấp vitamin, chất khoáng và các nguyên tố vi lượng, trừ vitamin B12 và D. Các thực vật khác nhau có lượng vitamin và chất khoáng khác nhau. Gạo là lương thực chính cho con người hầu như không chứa viatmin A. Thực vật được sử dụng ăn sống có ý nghĩa đối với việc cung cấp vitamin, vì phần lớn vitamin không chịu nhiệt. Ở đây nêu hai ví dụ về Fe và vitamin A cũng như -carotene. Gần đây đã thành công ở cây lúa biến đổi gen, có đủ hàm lượng -carotene (trong cơ thể người nó được biến đổi dễ dàng thành vitamin A) và hàm lượng Fe hấp thu được cũng cao hơn. Nếu giống lúa này được sử dụng, tình trạng dinh dưỡng của hàng tỷ người được nâng lên rõ rệt. Giới báo chí gọi giống lúa này với cái tên “lúa vàng”. -Caroten biosynthesis Phytoene synthase Phytoene desaturase Hình 2.7. Lúa vàng “gold rice”. Giống lúa mới này được sản xuất bằng công nghệ gen. Hạt có màu vàng vì provitamin A được tạo ra trong toàn hạt (thay vì nằm ở vỏ ngoài của lúa không biến đổi gen). Để đạt được chất lượng trên, 7 gen khác nhau được biến nạp vào cây lúa. Số lượng này tương đối lớn và được thực hiện trong hai bước. Ở hạt gạo Công nghệ gen trong nông nghiệp 52
55. không chứa -carotene, nhưng người ta thấy có hợp chất geranyl- geranylpyrophosphate, chất này được biến đổi thành -carotene trong một trình tự gồm 4 phản ứng enzyme. Bốn gen cần thiết ở đây được phân lập từ vi khuẩn, thực vật và được biến nạp vào cây lúa thông qua A. tumefaciens. Chúng được nối thêm trình tự điều khiển để đảm bảo cho gen được biểu hiện trong nội nhũ. Vì vậy tiền vitamin A không bị mất đi khi xay xát. Nội nhũ bây giờ có màu vàng là do -carotene. Ba trăm gam gạo này chứa đủ lượng -carotene, đáp ứng nhu cầu hàng ngày của con người. Bốn enzyme cần thiết là: phytoen-synthase, phytoen-desaturase, - carotin-desaturase và lycopen- -cyclase. Ở nước ta, Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu long đã tiến hành nghiên cứu tạo được nhiều dòng lúa giàu -carotene, vitamin E và - oryzanol bằng phương pháp chuyển nạp gen qua trung gian A. tumefaciens và chọn lọc bằng mannose thay thế cho hệ thống chọn lọc bằng chất kháng sinh hoặc chất diệt cỏ. Kết quả nghiên cứu này còn có ý nghĩa trong việc tạo ra các dòng lúa biến đổi gen sạch, khắc phục các mối lo ngại về tính an toàn của cây biến đổi gen hiện nay. Song song một giống lúa thứ hai được tạo ra, chứa ba gen làm tăng sự cung cấp Fe. Phytate (myo-inositol-hexaphosphate) là một dạng phosphore dự trữ trong hạt ngũ cốc và hạt cây họ đậu. Khi hạt nảy mầm xuất hiện enzyme phytase giải phóng phosphate từ inositol. Tuy nhiên, những hạt không nảy mầm hoặc động vật trong hệ thống tiêu hóa không có phytase hoạt động ở mức độ đáng kể thì động vật phải sử dụng phosphate rất nghèo trong hạt. Phytate là yếu tố dinh dưỡng đối kháng vì nó kết hợp với Zn, Fe và các nguyên tố khoáng khác. Phytate kết hợp với Fe làm cho 95% Fe có trong thực phẩm không sử dụng được. Đối với nhóm người sử dụng chủ yếu là gạo, đặc biệt thiếu Fe do phytate. Để vượt qua vấn đề này người sản xuất thường xuyên cho thêm phytase của nấm để chuẩn bị thức ăn vì phytase này bền với nhiệt, phân giải phytate trong gạo. Gần đây, các nhà nghiên cứu tạo ra giống lợn biến đổi gen, có thể tiết ra phytase vào nước bọt để tiêu hóa phytate trong thức ăn của chúng. Công nghệ gen trong nông nghiệp 53
56. Những nghiên cứu tiếp theo là tìm kiếm những hạt đột biến dự trữ phosphate vô cơ hơn là phytate. Các nhà nghiên cứu đã xác định được dòng ngô có phytate thấp. Người và động vật ăn ngô này tăng được khả năng hấp thụ Fe. Người ta cũng tìm thấy hai gen từ thực vật, một gen làm tăng sự tích lũy Fe trong gạo (ferritin) và gen khác tăng sự hấp thu Fe (protein giàu cystein, tương tự metallothionine) trong cơ thể người. Bằng sự lai tạo giữa hai giống lúa này đã xuất hiện một giống có hàm lượng -carotene cao cũng như chứa nhiều Fe và độ hấp thu Fe cũng tăng lên. Hầu hết dầu của hạt chứa -tocopherol, một tiền chất không hoạt động của -tocopherol. Biến đổi dạng là gắn thêm một nhóm -CH3 (methyl). Gần đây, các nhà khoa học đã phân lập được gen mã hóa cho enzyme xúc tác phản ứng methyl hóa này ở trong mô thực vật, sau đó đã gắn gen với promoter đặc hiệu ở hạt và đưa vào cây thử nghiệm (test-plant). Kết quả là 95% tocopherol ở dạng hoạt động (methyl hóa), tăng 80 lần hàm lượng vitamin E. Ứng dụng kết quả này cho cây có dầu hứa hẹn sự cải thiện tốt vitamin E cung cấp cho người và động vật. 2.2.4. Tăng khả năng bảo quản và hương vị Ở các nước công nghiệp yêu cầu về lượng quả, rau và salat rất lớn cho từng mùa trong năm. Sự cung cấp vitamin cho con người trong mùa đông cũng được đảm bảo. Đáp ứng được nhu cầu này là do một phần thực phẩm tươi được vận chuyển đến từ những nơi rất xa. Thời gian vận chuyển dài nên khó khăn trong việc bảo quản nông sản tươi, vì quả chín mềm rất nhanh và không còn giá trị, đặc biệt đối với chuối và cà chua. Vì vậy, quả phải được thu hoạch xanh và quá trình chín xảy ra trong khi vận chuyển và bảo quản. Sự chín được thực hiện nhanh trước khi đưa ra thị trường bằng xử lý ethylene. Trường hợp này làm ảnh hưởng đến mùi vị của quả. Cà chua sẽ ngon hơn nếu thu hoạch khi quả chín, như vậy có thời gian lưu giữ ngắn. Với phương pháp biến đổi gen có thể kéo dài thời gian cất giữ quả. Đặc điểm tự nhiên của cà chua là chín rữa để giải phóng hạt. Trong quá trình này cây sản sinh ra enzyme phân giải thành tế bào làm cho quả chín. Trong các enzyme có polygalacturonase. Bằng phương pháp tạo dòng gen (antisense-polygalacturonase) enzyme này không được tổng hợp và nhờ Công nghệ gen trong nông nghiệp 54
57. vậy mà cà chua giữ được lâu hơn. Tuy nhiên, sau đó cà chua sẽ chín do còn có những enzyme khác phân giải thành tế bào. Loại cà chua này trên thị trường được gọi với tên là Flavor Savor. Ưu điểm đối với người sản xuất là thu hoạch đơn giản và bảo quản được lâu hơn và đối với người tiêu dùng là chất lượng tốt hơn. Những thành phần khác, ví dụ như vitamin, theo phân tích cho đến nay là không thay đổi. Tuy nhiên, trong cà chua này có gen kháng kanamycin và giá cà chua này còn cao nên chưa phổ biến trên thị trường. 2.2.5. Giảm các chất gây dị ứng Dị ứng là một vấn đề lớn trong xã hội hiện đại, nguyên nhân gây ra cho đến nay khoa học vẫn còn tranh cãi. Thường thì dị ứng là do thức ăn hoặc các thành phần của nó. Đặc biệt là dị ứng đối với hạt dẻ, quả kiwi hoặc đậu tương. Gần đây dị ứng với hạt dẻ và đậu tương đang được quan tâm, vì nó có trong nhiều loại sản phẩm và gây ra dị ứng nguy hiểm cho con người. Người ta ước lượng có khoảng 20.000 sản phẩm trong thành phần có chứa đậu tương. Cho đến nay biện pháp duy nhất chống lại dị ứng và những chứng khó tiêu hóa khác là tránh tiếp nhận những thực phẩm gây dị ứng. Điều đó làm giảm chất lượng sống. Vì phần lớn chỉ một chất trong thực phẩm gây ra dị ứng nên biện pháp tốt hơn là loại bỏ chất này. Vấn đề cần thiết là xác định protein hoặc những hợp chất gây ra dị ứng và giải thích sự tổng hợp của chúng trong cây. Với kỹ thuật gen người ta có thể biến đổi hoặc làm ngừng tổng hợp enzyme, tạo ra cây biến đổi gen với khả năng dị ứng thấp hơn. Để đạt được mục đích này nhiều dự án đang được tiến hành. Ví dụ: gen mã hóa cho protein gạo gây dị ứng được phân lập. Đó là một protein tương tự với chất ức chế -amylase/trypsin của lúa mỳ và yến mạch. Bằng phương pháp antisense đã giảm được lượng protein gây dị ứng trong gạo. 2.2.6. Vaccine thực phẩm Gần đây, các nhà khoa học đã coi cây trồng như một nguồn cung cấp các loại vaccine phòng bệnh, bởi vì những loại vaccine thông thường đòi hỏi phải được bảo quản trong môi trường lạnh, điều vô cùng khó khăn ở những nơi xa xôi của các nước đang phát triển. Một nghiên cứu gần đây đã công bố Công nghệ gen trong nông nghiệp 55
58. một bước đột phá trong lĩnh vực sản xuất vaccine từ thực vật, đó là kết quả nghiên cứu của Thanavala và Arntzen (Mỹ) về khả năng gây miễn dịch trong cơ thể người bằng vaccine thực phẩm để điều trị bệnh viêm gan B. Loại cây trồng để chuyển gen kháng nguyên lấy từ virus viêm gan B là khoai tây. Nhờ đó loại khoai tây này có khả năng kháng virus viêm gan B bằng cách tạo ra kháng nguyên virus. Các nhà nghiên cứu hy vọng rằng khi ăn loại khoai tây này, chất kháng nguyên sẽ gây ra một phản ứng miễn dịch nhẹ trong cơ thể người. Từ đó, cơ thể người sẽ tạo ra chất miễn dịch cá thể đối với bệnh lây nhiễm viêm gan B. Loại khoai tây chuyển gen, chứa vaccine ngừa viêm gan B, đã thúc đẩy thành công khả năng miễn dịch trong các cuộc thử nghiệm lâm sàng đầu tiên. Theo đó, hơn 60% tình nguyện viên đã ăn khoai tây chuyển gen (tương đương ba liều vaccine) và kết quả là cơ thể họ tạo thêm một lượng lớn kháng thể chống lại virus. Tình nguyện viên ăn khoai tây bình thường không sinh thêm kháng thể. Tuy nhiên, do những người ăn sống khoai tây chuyển gen đã được tiêm vaccine viêm gan B thông thường nên vaccine khoai tây chỉ tăng cường khả năng miễn dịch của họ. Việc biến thực phẩm thành nguồn vaccine rẻ tiền rất hữu ích đối với các nước nghèo vì không phải chi phí cho bảo quản lạnh hoặc mua kim tiêm. Như vậy thì các nhà dược phẩm đang từ bỏ việc bào chế vaccine từ các loại thực phẩm cơ bản như chuối, cà chua và khoai tây. Nguyên nhân làm họ lo ngại là thực phẩm chứa vaccine có thể bị lẫn vào thực phẩm trong siêu thị hoặc cửa hàng. Thay vào đó, các nhà bào chế thuốc đang tập trung vào sản xuất vaccine trong lá cây ăn được, song thực vật đó không được bán làm thực phẩm. Nhóm nghiên cứu của Arntzen đang điều tra một số thực vật và hứa hẹn nhất là cây Nicotiana benthamina, họ hàng của cây thuốc lá. Lá được thu hoạch, rửa sạch, nghiền rồi ướp lạnh, sấy khô để bảo quản trước khi đóng vào các viên con nhộng. Ướp lạnh, sấy khô có nghĩa là vaccine tồn tại trong thời tiết nóng, không cần bảo quản lạnh giống như vaccine thông thường. Ngoài ra, đóng vaccine thành viên con nhộng đảm bảo liều lượng thống nhất. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cho biết rất quan tâm tới phương pháp bào chế vaccine dạng này. Tuy nhiên, vẫn chưa rõ liệu vaccine có an toàn và hiệu quả đối Công nghệ gen trong nông nghiệp 56
59. với người hay không. Số người không phản ứng với vaccine trong thực vật chuyển gen cao hơn nhiều so với vaccine thông thường. 2.3. Những ứng dụng mới của cây trồng-nguồn nguyên liệu và cải tạo đất Khoáng sản thu được trong công nghiệp ở dạng quặng, dầu, khí và thường sau đó được tinh chế và biến đổi hóa học. Nhiều khoáng sản trong tự nhiên có giới hạn và sẽ cạn dần trong tương lai. Một trong những suy nghĩ cách mạng nhất là sử dụng cây biến đổi gen để cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp: carbohydrate, chất béo và thậm chí là chất tổng hợp. Những cây này được trồng, thu hoạch và sử dụng làm nguyên liệu cho công nghiệp hóa học. Hiện nay, nhiều dự án theo hướng này đang được thực hiện. 2.3.1. Carbohydrate và acid béo là nguồn nguyên liệu Trong tương lai tinh bột biến đổi cho sản xuất chất dính và nguyên liệu cho các mục đích khác có ý nghĩa trong công nghiệp. Cellulose là nguyên liệu cần cho sản xuất giấy và pectin cần cho chất keo và chất làm kín. Thay đổi hướng trao đổi chất có thể tăng tỷ lệ một carbohydrate nào đó và cây biến đổi gen sẽ tạo ra một lượng lớn chất này. Đây cũng là một đóng góp quan trọng để bảo vệ môi trường. Chất béo và dầu là những nguyên liệu công nghiệp quan trọng. Cho đến nay chất béo và dầu thu được từ thực vật chưa đáp ứng nhu cầu. Ví dụ hằng năm khoảng 80% mỡ và dầu (khoảng 75 triệu tấn) dùng cho sản xuất thực phẩm, và chỉ có 15 triệu tấn sử dụng cho công nghiệp. Một nguyên nhân là do chất béo và dầu có giá cao gấp đôi so với dầu công nghiệp. Sự tổng hợp chất béo là một quá trình phức tạp, xảy ra ở trong nhiều vị trí khác nhau của tế bào. Thực tế cho thấy, tổng hợp một acid béo nào đó đạt cao hơn, khi chất này được vận chuyển và tích lũy vào vật chứa phù hợp (ví dụ: hạt). Về thay đổi thành phần chất béo đã có một loạt các dự án, ví dụ làm giảm độ no các acid béo của cây cải dầu bằng kỹ thuật antisense hoặc sử dụng các gen để tạo nên petroselic acid, cho mục đích sản xuất polymer. Sự kéo dài chuỗi carbon của acid béo để sản xuất dầu mỡ cho máy móc và chất làm mềm. Công nghệ gen trong nông nghiệp 57
60. 2.3.2. Chất tổng hợp Nhiều loài vi khuẩn tạo ra chất dự trữ là polyester, ví dụ polyhydroxy acid butyric [poly (3HB)]. Chất này không độc và có thể phân giải hoàn toàn bằng phương pháp sinh học. Chúng có đặc điểm tương tự polypropyle và vì vậy phù hợp cho sản xuất plastic. Ngoài việc sản xuất “bioplastic” trong vi khuẩn, gần đây người ta đã bắt đầu tạo cây chuyển gen để sản xuất hợp chất poly (3HB). Vấn đề này bước đầu đã không thành công, cây đã tạo ra được poly (3HB), tuy nhiên cây biểu hiện sự phát triển kém. Khi người ta chuyển 3 gen mã hóa cho poly (3HB) có nguồn gốc từ Ralstonia eutropha vào lạp thể của Arabidopsis thaliana thì thu được cây phát triển bình thường và sản sinh ra poly (3HB) và chất này đạt đến 14% khối lượng khô. Một sự cải tiến tiếp theo được thực hiện trong một nghiên cứu mới bằng việc sử dụng 4 gen. Ở Arabidopsis thaliana và cây cải dầu, chất trung gian để tổng hợp chất béo và amino acid được biến đổi để tổng hợp plastic có hiệu quả hơn. 2.3.3. Protein thực vật Việc sản xuất protein trong thực vật dễ dàng, nhưng làm sạch protein từ mô thực vật khá khó khăn và trước hết là giá thành cao. Vì vậy, người ta hy vọng vào một phương pháp mới, được giới thiệu bởi Raskin và cộng sự năm 1999. Những gen mã hóa cho protein được gắn với một promoter và đảm bảo cho protein chỉ được tổng hợp ở rễ. Tiếp theo protein tạo thành có một hệ thống tín hiệu, đảm bảo cho nó được vận chuyển vào một vị trí xác định trong tế bào. Trong trường hợp đặc biệt protein được vận chuyển vào mạng lưới nội sinh chất. Protein đi vào mạng lưới nội chất (ER) có thể được thải ra bên ngoài và chỉ ở vùng rễ, vì promoter chỉ đặc hiệu cho vùng này. Người ta dùng một số dung dịch muối để tách protein một cách dễ dàng và với giá thành hợp lý. 2.3.4. Cải tạo đất Nồng độ chất độc cao (kim loại nặng hoặc các chất thải) ở trong đất thường là hậu quả của quá trình sản xuất công nghiệp. Các chất này phải được đốt cháy hoặc phân giải nhờ vi khuẩn. Các quá trình này đắt tiền và nguy hiểm cho người lao động. Vì vậy, gần đây cây biến đổi gen đã được sử dụng để loại bỏ các chất độc. Năm 1999, lần đầu tiên đã thành công trong Công nghệ gen trong nông nghiệp 58
61. việc sử dụng cây chuyển gen để phân giải TNT (trinitrotoluene), trong đó người ta tạo dòng gen sản xuất enzyme vi khuẩn (pentathritol- tetranitratreductase) trong cây thuốc lá, enzyme này phân giải TNT và chất tương tự GTN (glyceryl trinitrate) thành những chất không độc. Tiếp theo, người ta đã chuyển một gen vi khuẩn mã hóa cho enzyme phân giải thủy ngân Hg-reductase vào cây họ hàng với mộc lan. Cây này hút ion Hg từ đất và biến đổi nó thành kim loại ít độc hơn. Việc loại các kim loại nặng như chì, uran và cadium với cây biến đổi gen đã được thực hiện. Với hệ thống rễ một số loại thực vật có thể hút các kim loại và tích lũy trong các phần trên mặt đất của nó, những phần này sau đó được loại trừ dễ dàng. Một phương thức để nâng cao các quá trình tự nhiên là tăng cường hô hấp của cây, vì kim loại nặng cùng với dòng nước đi lên các bộ phận trên mặt đất. 2.4. Cây dược liệu Thực vật chứa một lượng lớn các hợp chất có nguồn gốc thứ cấp, có cấu tạo hóa học không đồng nhất và tạo nên một sự đa dạng. Tác dụng chữa bệnh của một số thực vật đã được biết từ lâu, và thực tế tác dụng của chúng là nhờ vào các hợp chất thứ cấp tồn tại trong cây, ví dụ thuốc asparin được sản xuất từ acid salicylic có trong loại cỏ tự nhiên. Các công ty dược thực hiện sự tìm kiếm rộng rãi và tốn kém các hợp chất tự nhiên có dược tính. Những chất này được tìm ra, phân tích cấu tạo hóa học và được tổng hợp nhân tạo. Rừng nhiệt đới và san hồ ngầm ở biển là nguồn tiềm năng đối với các dược liệu vẫn còn chưa biết. 2.4.1. Alkaloid Khái niệm alkaloid bắt nguồn từ chữ Ả rập và biểu diễn các chất có trong thực vật chứa nitrogen, phần lớn là dị vòng và có tính kiềm. Năm 1806, alkaloid đầu tiên được phân lập là morphin từ cây nha phiến (Papaver sonniferum). Từ đó đến nay hơn 10.000 alkaloid khác nhau được tìm thấy và đã biết công thức cấu tạo. Một số được minh họa trong hình 2.8. Rất nhiều chất trong đó là chất độc, giảm đau hoặc chữa bệnh (ví dụ: atropin hoặc morphin) có ý nghĩa trong y học hoặc là chất kích thích (ví dụ: coffein hoặc nicotin). Có ý nghĩa trong chữa bệnh ung thư là các alkaloid như taxol, đã thu được từ Taxus brevifolia. Công nghệ gen trong nông nghiệp 59