Giáo trình Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

Nội dung text: Giáo trình Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

1. ThS. PHẠM THANH LIÊM ThS. TRẦN ĐẮC ĐỊNH GIÁO TRÌNH PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SINH HỌC CÁ TỦ SÁCH ĐẠI HỌC CẦN THƠ 2004 Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học cá
2. THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG CỦA GIÁO TRÌNH 1. THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ 1. Phạm Thanh Liêm Sinh năm: 1967 Bộ môn: Sinh học và Bệnh học Thủy sản Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ Email: ptliem@ctu.edu.vn 2. Trần Đắc Định Sinh năm: 1965 Bộ môn: Quản lý và Kinh tế nghề Cá Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ Email: tddinh@ctu.edu.vn 2. PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG Giáo trình có thể dùng tham khảo cho những ngành nào: Nuôi trồng thủy sản, Bệnh học Thủy sản, Quản lý nghề cá, Nông học Có thể dùng cho các trường nào: Đại học, Cao đẳng Các từ khoá: phương pháp nghiên cứu, phuơng pháp thu mẫu, cố định mẫu, hình thái cá, sinh học dinh dưỡng, sinh học sinh sản, mô học, tuổi và tăng trưởng, sinh học quần thể, đánh giá trữ lượng cá Yêu cầu kiến thức trước khi học môn này: Sinh học đại cương Đã xuất bản chưa, nếu có thì nhà xuất bản nào : Chưa xuất bản Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 2
3. MỤC LỤC THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ 2 1. THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ 2 2. PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG 2 MỤC LỤC 3 CHƯƠNG MỞ ĐẦU 6 I. GIỚI THIỆU CHUNG 6 1. Khái quát 6 2. Lịch sử phát triển của nghiên cứu cá 6 3. Tầm quan trọng của phương pháp nghiên cứu và mục tiêu của giáo trình 6 II. NỘI DUNG CỦA GIÁO TRÌNH 7 CHƯƠNG I: PHƯƠNG PHÁP THU VÀ XỬ LÝ MẪU 8 I.1. GIỚI THIỆU 8 I.2. PHƯƠNG PHÁP THU MẪU VÀ BẢO QUẢN MẪU 8 I.2.1. Nguyên tắc trong thu mẫu 8 I.2.1.1. Định danh chính xác mẫu thu 8 I.2.1.2. Chọn địa điểm thu mẫu 9 I.2.1.3. Chuẩn bị biểu mẫu 9 I.2.2. Thu mẫu phân tích ở phòng thí nghiệm 9 I.2.3. Kỹ thuật bảo quản mẫu 10 I.2.4. Kỹ thuật cố định mẫu cho các nghiên cứu mô học 12 I.2. CÂU HỎI ÔN TẬP 13 I.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO 13 CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI CÁ 14 II.1. NGUYÊN LÝ TRONG ĐO MẪU CÁ 14 II.2. ĐO CHIỀU DÀI VÀ KHỐI LƯỢNG CÁ 14 II.3. CÁC CHỈ TIÊU HÌNH THÁI 15 II.4. CÁC CHỈ TIÊU SỐ LƯỢNG 18 II.5. CÁC CHỈ SỐ SINH TRẮC 19 II.6. TƯƠNG QUAN CHIỀU DÀI KHỐI LƯỢNG VÀ HỆ SỐ ĐIỀU KIỆN 20 II.6.1. Tương quan chiều dài và khối lượng 20 II.6.2. Hệ số điều kiện 21 II.7. CÂU HỎI ÔN TẬP 21 II.8. TÀI LIỆU THAM KHẢO 22 CHƯƠNG III: KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU MÔ HỌC 23 III.2.1. Cố định mẫu (Fixation) 23 III.2.1.1. Các loại hóa chất cố định mẫu 24 III.2.1.2.Chọn dung dịch cố định 25 III.2.1.3. Phương pháp cố định: 25 III.2.1.4. Rửa mô sau khi cố định 26 III.2.2. Cắt tỉa và định hướng cho mẫu mô đã được cố định (Trimming and Orientation) 26 III.2.3. Loại nước, làm trong mẫu, ngấm paraffin (Dehydration, Clearing, Infiltration) 26 III.2.4. Đúc khối (Embedding) 28 III.2.5. Phương pháp cắt mẫu (Sectioning) 29 III.2.5.1. Cắt lạnh (frozen sectioning) 29 III.2.5.2. Cắt mô đúc trong khối paraffin 29 Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 3
4. III.2.5.3. Cách chuẩn bị các dung dịch để dán mẫu như sau: 30 III.2.6. Nhuộm màu (Staining) 30 III.3. CÂU HỎI ÔN TẬP 32 III.4. TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 CHƯƠNG IV: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DINH DƯỠNG CÁ 34 IV.1. THỨC ĂN TỰ NHIÊN CỦA CÁ 34 IV.1.1. Sinh vật phù du (plankton) 34 IV.1.2. Sinh vật tự bơi (Nekton) 34 IV.1.3. Sinh vật đáy (Benthos) 34 IV.1.4. Chất vẩn (Detritus) 34 IV.2. PHỔ DINH DƯỠNG 35 IV.3. CÁC CHỈ SỐ SINH TRẮC 36 IV.3.1. Tương quan chiều dài ruột 36 IV.3.2. Chỉ số no (index of fullness) của ống tiêu hóa và cường độ bắt mồi (feeding intensity) 37 IV.3.3. Phương pháp phân tích thức ăn trong ruột cá 37 IV.3.3.1. Phương pháp số lượng 38 IV.3.3.2.Phương pháp thể tích 39 IV.3.3.3. Phương pháp trọng lượng 39 IV.3.4. Sự phát triển các cơ quan tiêu hóa và mối liên hệ với tập tính dinh dưỡng 39 IV.3.5. Hệ số chọn lựa thức ăn 40 IV.3.5.1.Chỉ số ưu thế (index of preponderance): 40 IV.3.5.2.Chỉ số tương quan (index of Relative importance): 40 IV.3.6. Các chỉ tiêu đánh giá nhu cầu dinh dưỡng của cá 41 IV.4. CÂU HỎI ÔN TẬP 42 IV.5. TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 CHƯƠNG V:PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SINH HỌC SINH SẢN 44 V.1. XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH 44 V.2. CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA TUYẾN SINH DỤC 44 V.3. XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ THÀNH THỤC SINH DỤC THEO CHIỀU DÀI CƠ THỂ 47 V.4. HỆ SỐ THÀNH THỤC 48 V.5. NGHIÊN CỨU SỰ THÀNH THỤC DỰA TRÊN ĐƯỜNG KÍNH TRỨNG 48 V.6. SỨC SINH SẢN 49 V.6.1. Sức sinh sản tương đối (relative fecundity) 50 V.6.2. Sức sinh sản đặc biệt (specific fecundity) 50 V.7. MỐI LIÊN HỆ GIỮA SỨC SINH SẢN VÀ CÁC CHỈ TIÊU SINH HỌC KHÁC 51 V.8. CÂU HỎI ÔN TẬP 52 V.9. TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 CHƯƠNG VI: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TUỔI VÀ SINH TRƯỞNG 53 VI.1. NGHUYÊN LÝ XÁC ĐỊNH TUỔI 53 VI.2. XÁC ĐỊNH TUỔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG VẢY 53 VI.3. XÁC ĐỊNH TUỔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP DUNG ĐÁ TAI 54 VI.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TUỔI DỰA VÀO CÁC PHẦN XƯƠNG KHÁC 55 VI.5. PHƯƠNG PHÁP TẦN SUẤT CHIỀU DÀI 55 VI.6. THÀNH PHẦN TUỔI VÀ QUAN HỆ GIỮA TUỔI VÀ CHIỀU DÀI 56 VI.7. TĂNG TRƯỞNG TUYỆT ĐỐI VÀ TĂNG TRƯỞNG TƯƠNG ĐỐI 57 Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 4
5. VI.8. TÍNH NGƯỢC CHIỀU DÀI CÁ VÀ SỰ TĂNG TRƯỞNG 58 VI.9. PHƯƠNG TRÌNH ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG 58 VI.10. CÂU HỎI ÔN TẬP 59 VI.11. TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 CHƯƠNG VII: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SINH HỌC QUẦN THỂ 60 VII.3.1. Mục đích 61 VII.3.2. Các phương pháp đánh dấu 61 VII.3.2.1.Dùng hóa chất và thuốc nhuộm: 61 VII.3.2.2. Cắt một phần của cơ thể cá: 61 VII.3.2.3. Gắn trên cá một vật có ký hiệu riêng: 61 VII.4. SỰ BIẾN ĐỔI QUẦN THỂ VÀ CÁC MÔ HÌNH DỰ BÁO QUẦN THỂ 62 VII.5. SỰ KHAI THÁC BỀN VỮNG QUẦN THỂ 63 VII.6. CÂU HỎI ÔN TẬP 64 VII.7. TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 CHƯƠNG VIII: PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TRỮ LƯỢNG CÁ 65 VIII.1. MỤC TIÊU CỦA VIỆC ĐÁNH GIÁ TRỮ LƯỢNG 65 VIII.2. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU VÀ BẮT LẠI 65 VIII.2.1. Điều kiện áp dụng 65 VIII.2.2. Nguyên lý 65 VIII.3.1. Điều kiện áp dụng 65 VIII.3.2. Nguyên lý 65 VIII.4. PHƯƠNG PHÁP DÙNG SÓNG ÂM 66 VIII.4.1. Điều kiện áp dụng 66 VIII.4.2. Nguyên lý 66 VIII.5. PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN DIỆN TÍCH QUÉT CỦA LƯỚI KÉO 66 VIII.5.1. Điều kiện áp dụng 66 VIII.5.2. Nguyên lý 67 VIII.5.2.1.Xác định diện tích quét của lưới 67 VIII.5.2.2. Ước tính trữ lượng 67 VIII.6. PHƯƠNG PHÁP DỰA VÀO SỰ SUY GIẢM 68 VIII.6.1. Điều kiện áp dụng 68 VIII.6.2. Nguyên lý 68 VIII.7. PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT 68 VIII.7.1. Điều kiện áp dụng 68 VIII.7.2. Nguyên lý 69 VIII.8. CÂU HỎI ÔN TẬP 69 VIII.9. TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 5
6. CHƯƠNG MỞ ĐẦU I. GIỚI THIỆU CHUNG 1. Khái quát Nguồn lợi thủy sản (gọi ngắn gọn là cá theo nghĩa rộng) ngày càng được đánh giá là một nguồn tài nguyên quan trọng trong các loại hình thủy vực. Cá cung cấp nguồn chất đạm đáng kể cho cuộc sống con người ở rất nhiều quốc gia trên thế giới. Tuy nhiên, những năm gần đây nguồn lợi cá có xu hướng suy giảm do việc khai thác quá mức và việc thay đổi vùng sinh sống của chúng. Royce (1972) cho rằng chính sự suy giảm nguồn lợi cá đã là cơ hội cho ra đời một lĩnh vực khoa học tìm hiểu về vấn đề sinh học của chúng. Khoa học về nghiên cứu sinh học cá đã giúp rất nhiều trong việc xác định biến động quần thể, tương quan chiều dài và trọng lượng, hình thái phân loại, sinh sản, tuổi, sinh trưởng, dinh dưỡng và thức ăn, trở nên cực kỳ quan trọng không chỉ bổ sung các khiếm khuyết kiến thức hiện tại mà còn có thể sử dụng trong quản lý khai thác và nuôi các động vật thủy sản. Từ đó, phương pháp nghiên cứu sinh học cá ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong hầu hết các nghiên cứu về các đối tượng động vật thủy sản. 2. Lịch sử phát triển của nghiên cứu cá Lịch sử nghiên cứu cá chưa phát triển lâu, mặc dù nghề khai thác và nuôi cá được biết là phát triển trước đó rất nhiều. Có lẽ nghiên cứu sinh học cá chỉ bắt đầu sau thế kỷ 18 khởi đầu là các nghiên cứu về ngư loại học, mà lúc nầy cũng tập trung nhiều về hình thái và phân bố (Biswas, 1993). Người đầu tiên viết về các loài cá ở Ấn Độ là Block (Day, 1878), sau đó là hàng loạt các báo cáo viết về hình thái cá như Hamilton (1822), Cuvier và Valenciennes (1824-1849). Đến đầu thế kỷ 20 thì các nghiên cứu về ngư loại học phát triển nhanh về nhiều lĩnh vực như (i) hình thái và phân bố; (ii) phân loại; (iii) sinh lý và sinh hóa; (iv) sinh thái; (v) bệnh học; (vi) cấu trúc quần thể; (vii) di truyền; và (viii) bảo tồn, hàng loạt các nghiên cứu về sinh học cá đã được tiến hành như nghiên cứu về sinh học sinh sản của nhiều loài cá khác nhau như của Hickling (1930), Clark (1934), về tuổi và sinh trưởng của các loài các biển và cá nước ngọt như của Van Oosten (1929), Hickling (1933), Ford (1933), Pillay (1958), về đánh giá trữ lượng quần thể như Ricker (1954, 1975), Welcomme (1975, 1979), 3. Tầm quan trọng của phương pháp nghiên cứu và mục tiêu của giáo trình Trong nghiên cứu các vấn đề về thức ăn, sinh trưởng, sinh sản, biến động quần thể, của cá đều cần có một phương pháp phù hợp và chuẩn mực để có thể đưa ra các nhận định hay đánh giá chính xác và có thể so sánh kết quả giữa các nghiên cứu. Hiện nay có rất nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học cá được viết trong nhiều tài liệu khác nhau ở các cấp độ khác nhau. Nhiều nhà nghiên cứu làm việc ở các quốc gia phát triển (Tây Âu, Nhật Bản, Mỹ, ) luôn sử dụng các phương pháp mới, phức tạp và ứng dụng công nghệ thông tin hay thiết bị hiện đại, tất nhiên sẽ tiết kiệm thời gian, cho kết quả chính xác hơn, nhưng chi phí có thể cao hơn. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 6
7. Ở một số quốc gia, hay đối với một số đối tượng bắt đầu tiếp cận với phương pháp nghiên cứu cá (như sinh viên) thì rất cần các phương pháp đơn giản và dễ ứng dụng. Trên ý tưởng đó, giáo trình nầy được biên soạn trên cơ sở tổng hợp nhiều phương pháp đã ứng dụng trong nghiên cứu cá và trình bày có tính logic và dễ hiểu nhằm phục vụ cho sinh viên chuyên ngành thủy sản bậc đại học. Giáo trình nầy vì thể chỉ trình bày một số phương pháp quan trọng và phổ biến ở dạng cụ thể và ít trình bày các lý luận sâu cho từng phương pháp. Học qua giáo trình nầy sinh viên có thể ứng dụng ngay vào các nghiên cứu của mình để phục vụ cho các nghiên cứu làm luận văn hay chuyên đề tốt nghiệp và có thể ứng dụng cho các nghiên cứu đơn giản trong công tác. II. NỘI DUNG CỦA GIÁO TRÌNH Giáo trình được kết cấu thành 8 chương, với những kiến thức cơ bản nhất trong nghiên cứu sinh học bao gồm: - Chương 1: Phương pháp thu và xử lý mẫu - Chương 2: Phương pháp nghiên cứu hình thái cá - Chương 3: Phương pháp nghiên cứu mô học - Chương 4: Phương pháp nghiên cứu dinh dưỡng - Chương 5: Phương pháp nghiên cứu sinh học sinh sản - Chương 6: Phương pháp nghiên cứu tuổi và sinh trưởng - Chương 7: Phương pháp nghiên cứu sinh học quần thể - Chương 8: Phương pháp đánh giá trữ lượng cá Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 7
8. CHƯƠNG I: PHƯƠNG PHÁP THU VÀ XỬ LÝ MẪU I.1. GIỚI THIỆU Có lẽ yêu cầu trọng nhất trong nghiên cứu về sinh học cá là phải thu được số mẫu lớn và có tính đại diện. Ngoài việc chọn lựa vị trí (địa điểm) thu mẫu phù hợp thì cần phải thu được số mẫu đủ lớn để kết quả phân tích phản ánh chính xác nội dung nghiên cứu mong muốn. Có nhiều cách để thu được mẫu và loại mẫu thu cũng phải tùy thuộc vào nội dung của nghiên cứu, ví dụ thu mẫu để xác định giống loài, thành phần loài hay là thu để đánh giá trữ lượng, Có những nội dung nghiên cứu đòi hỏi người thu mẫu phải có công cụ đánh bắt riêng, nhưng có nội dung có thể dựa vào thu mẫu từ ngư dân, trao đổi để ghi nhận thông tin từ ngư dân, thu từ chợ hay từ những người có liên quan khác ở địa bàn nghiên cứu. Tuy nhiên, trong thực tế thì việc thu thập các thông tin qua ngư dân không phải lúc nào cũng đầy đủ hoặc nhận được các trả lời chính xác hoàn toàn, bởi lẽ ngư dân không có ghi chép các thông tin, hoặc đôi lúc vì một lý do nào đó mà họ không thể nói thật hết những điều họ làm hay biết. Trong trường hợp nầy, người thu mẫu phải tạo ra một sự thân thiện nhất định và biết cách trao đổi để có thể khai thác được thông tin chính xác nhất về mẫu thu của mình. Bên cạnh đó, không phải lúc nào các mẫu thu đều có thể xử lý (phân tích) ngay tại chỗ mà phải mang về phòng thí nghiệm để phân tích. Vì thế, vấn đề xử lý mẫu thu cũng đòi hỏi phải được thực hiện nghiêm túc và khoa học để có thể có được kết quả phân tích chính xác. Phương pháp xử lý vào bảo quản mẫu vì thế tùy thuộc vào từng nội dung nghiên cứu. I.2. PHƯƠNG PHÁP THU MẪU VÀ BẢO QUẢN MẪU I.2.1. Nguyên tắc trong thu mẫu I.2.1.1. Định danh chính xác mẫu thu Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong nghiên cứu sinh học cá là phải xác định chính xác loài cá nghiên cứu. Nhưng đây không phải là công việc dễ dàng, nhất là khi mẫu thu là các loại cá trong giai đoạn con non. Thỉnh thoảng người nghiên cứu không phân biệt được 2 loài có quan hệ gần nhau và gọi chúng với cùng một tên loài. Tùy theo địa phương, mỗi loài cá có thể có những tên gọi khác nhau, cho nên việc sử dụng tên khoa học của loài là thuận tiện và chính xác nhất. Định danh loài thường được tiến hành bằng cách xác định một loạt các đặc điểm hình thái bao gồm: (i) mô tả hình thái của loài như hình dạng cơ thể, các loại vi, vị trí miệng, kiểu vẩy, (ii) Các chỉ tiêu số lượng (thí dụ công thức vi) như số lượng tia vi, vẩy, đốt sống. Số lượng gai và tia vi thường là một chỉ số không đổi giữa các cá thể trong cùng 1 loài, vì vậy công thức vi là một công cụ quan trọng để định danh loài. Ngoài công thức vi, số lượng vẩy, công thức răng hầu, số tia mang, số đốt sống cũng là các chỉ tiêu số lượng quan trọng để định danh loài. (iii) Các số đo hình thái như chiều dài đầu, cao thân, mối tương quan của các chỉ số này với chiều dài tổng cộng hay chiều dài chuẩn. Các số đo này thường được biểu hiện bằng tỉ lệ hay phần trăm. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 8
9. I.2.1.2. Chọn địa điểm thu mẫu Mẫu thu dùng cho nghiên cứu sinh học cá có thể thu ở chợ, cảng cá hay trực tiếp đánh bắt bằng các dụng cụ chuyên dùng (lưới kéo, lưới cào, chài, ). Tuy nhiên, vị trí thu mẫu là yếu tố quyết định đến kết quả của nghiên cứu. Thông thường, thu mẫu ở các cảng cá phù hợp hơn việc thu ở chợ, bởi lẽ đó là nơi mà mẫu thu thể hiện tính đại diện cho ngư trường mà họ khai thác như biển, sông, hồ chứa, . Bên cạnh đó, việc thu mẫu ở các cảng cá cũng sẽ rất quí cho việc tính toán sản lượng khai thác vì nó phản ánh chính xác nhất lượng cá khai thác theo ngư trường hay theo ngư cụ khai thác. Vị trí thu mẫu bằng cách đánh bắt trực tiếp có ý nghĩa rất quan trọng trong việc xác định vùng phân bố, tập tính di cư, bãi đẻ, tập tính sinh sản, Các yếu tố môi trường nơi thu mẫu đôi khi cũng cần phải được xác định như độ vẫn đục, độ mặn, pH, mật độ phiêu sinh vật để có kết luận chính xác hơn về tập tính dinh dưỡng, các thích nghi sinh lý, vòng đời của đối tượng nghiên cứu. I.2.1.3. Chuẩn bị biểu mẫu Khi thực hiện công tác thu mẫu thường phải chuẩn bị các biểu mẫu để có thể ghi chép một số thông tin về mẫu thu và cũng có thể xác định một số chỉ tiêu đo đạt nhanh. Thông thường, mẫu thu phải có ghi đầy đủ các thông tin như: 1. Nơi khai thác (tên sông, hồ, ngư trường, ) 2. Địa điểm thu mẫu 3. Loại tàu khai thác 4. Ngư cụ khai thác và kích thước mắc lưới 5. Độ sâu ngư trường khai thác 6. Diện tích khai thác (nếu được) 7. Loài khai thác, tỉ lệ thành phần loài, Nếu cần có thể ghi nhận nhanh kích cỡ về chiều dài và trọng lượng của cá tại nơi thu mẫu. Thông thường thì có thể phân nhóm theo kích cỡ cá để đo đạt, trong trường hợp cá có kích thước lớn hơn 30 cm chiều dài thì có thể đo độ chính xác là 1 cm, cá kích cỡ nhỏ hơn 30 cm thì độ chính xác là 0,5 cm và đối với cá nhỏ có thể đo ở độ chính xác 1 mm (Holden và Rait, 1974). I.2.2. Thu mẫu phân tích ở phòng thí nghiệm Thu mẫu cho các phân tích ở phòng thí nghiệm yêu cầu phải có tính đại diện cho quần thể. Mẫu thu cần phải được giữ càng tươi càng tốt. Tùy theo yêu cầu mà mẫu thu cũng có thể khác nhau, nếu như thu mẫu cho nghiên cứu mô học phải là mẫu sống thì thu mẫu phân tích tính ăn của cá phải thu vào buổi sáng (5:00-7:00 giờ) để không bị ảnh hưởng bởi chu kỳ ăn trong ngày (diurnal rhythm) và khả năng tiêu hóa thức ăn của cá. Theo Robotham (1977) đối với mẫu phân tích dinh dưỡng thì sau khi thu phải cho ngay vào dung dịch Chloral hydrate 10%, sau khi gây mê (narcotization) thì cố định trong formol trung tính 40% và sau đó pha loãng còn 5% để bảo quản lâu dài. Với cách nầy ông cho rằng sẽ giữa được tốt các thành phần trong dạ dày và ngăn cản sự biến mất một số thành phần. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 9
10. Hầu hết các nghiên cứu về sinh học cá được tiến hành trên một số ít mẫu thu được từ một quần thể có số lượng lớn. Khái niệm quần thể ở đây là tất cả các cá thể thuộc một loài và đang sống ở một khu vực địa lý nhất định, quần thể cũng có thể được xem như một nhóm các cá thể thuộc loài đang được nghiên cứu (Moller, 1979). Toàn bộ quần thể thì quá lớn cho nghiên cứu, hơn nữa cũng không thể tiến hành các phân tích trên tất cả các cá thể đánh bắt được. Vì vậy, việc chọn mẫu đại diện là cần thiết cho các nghiên cứu sinh học. Có nhiều cách để thu mẫu, tuy nhiên có thể chia ra thành 2 phương pháp chính là (i) thu mẫu ngẫu nhiên (random sampling) và (ii) thu mẫu có chọn lọc (non-random sampling). Tuy nhiên phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên được áp dụng nhiều nhất, trong phương pháp này tất cả các mẫu trong quần thể đều có khả năng được chọn lựa bằng nhau. Phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên lại được chia là 2 phương pháp là (i) thu mẫu hoàn toàn ngẫu nhiên (simple random) và (ii) thu mẫu ngẫu nhiên có giới hạn (restricted random). Trong phương pháp thu mẫu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi cá thể trong quần thể sẽ được gán cho một số (gọi là số ngẫu nhiên – random numbers) khi đó những cá thể nào được thu làm mẫu sẽ được xác định bằng các bảng số ngẫu nhiên (random table). Phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên có giới hạn lại có 2 cách thu mẫu: (i) thu mẫu phân tầng (stratified sampling) đối với quần thể không đồng nhất, khi đó quần thể sẽ được chia thành các phần đồng nhất và mẫu sẽ được thu độc lập từ các phần đồng nhất đó; và (ii) thu mẫu nhiều giai đoạn (multi-stage sampling), khi quần thể quá lớn (thậm chí số lượng rất lớn cho một mẫu đại diện) khi đó việc thu mẫu được chia thành 2 giai đoạn. Trước tiên quần thể muốn thu mẫu được chia thành các quần thể đại diện (sub-population) và mẫu sẽ được thu từ các quần thể đại diện (mẫu cấp 1). Bước tiếp theo, từ các mẫu thu của các quần thể đại diện, tiến hành thu các mẫu đại diện (mẫu cấp 2). Mẫu cấp 2 có thể được thu nhiều hơn 2 giai đoạn tùy thuộc vào nghiên cứu và kích cỡ của quần thể, do vậy phương pháp này được gọi là phương pháp thu mẫu nhiều giai đoạn. Vấn đề quan trọng nhất của việc thu mẫu là xác định số lượng mẫu thu. Có nhiều ý kiến cho rằng số lượng mẫu nên dao động từ 1-25% kích cỡ quần thể. Khi số lượng mẫu quá nhỏ có thể sẽ không đại diện được cho toàn bộ quần thể, trái lại số lượng mẫu quá lớn sẽ tốn rất nhiều thời gian để phân tích và làm gia tăng chi phí. Số lượng mẫu thu cũng phụ thuộc vào từng nghiên cứu, tuy nhiên số lượng từ 80-100 mẫu với các kích cỡ khác nhau cho mỗi tháng là thích hợp cho các nghiên cứu thông thường về sinh học cá. I.2.3. Kỹ thuật bảo quản mẫu Yêu cầu mẫu cho nghiên cứu sinh học phải còn tốt, những mẫu hư sẽ rất khó cho các phân tích vì thế mẫu cần được bảo quản càng nhanh càng tốt. Mẫu sau khi thu cần được rửa ngay bằng nước ngọt để mẫu được sạch đồng thời loại bỏ các vi sinh vật có thể bám theo mẫu, nhất là mẫu thu từ ngư dân. Mẫu sau khi rửa sạch thì cần đánh dấu và cân trọng lượng và chiều dài, và tất nhiên chi tiết của mẫu cần được ghi chép cẩn thận trong sổ. Đối với các mẫu cá có kích cỡ lớn rất cần thiết phải gắn các thẻ hay phiếu có ghi các chi tiết như nơi đánh bắt, chiều dài, trọng lượng và giới tính. Mẫu không ghi rõ sẽ khó sử dụng trong nghiên cứu. Mẫu thu có thể cố định ngay trong dung dịch formol. Mẫu dùng cho phân tích dạ dày cần phải được cố định ngay sau khi thu. Dung dịch cố định mẫu thường dùng là formol 10% (1 phần formol và 9 phần nước) cho những mẫu có kích thước lớn (lớn hơn 15 cm) và 5% cho các mẫu có kích thước nhỏ. Dung dịch được dùng cho cố định mẫu phải là dung dịch trung tính, thông thường borax sẽ được thêm vào trong formol (1:1000). Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 10
11. Phần bụng của mẫu cá có kích thước lớn nên được mổ và cắt sâu vào trong cơ hai bên thân cá để dung dịch cố định có thể thấm vào bên trong. Những cá nhỏ hơn 15 cm dài chỉ cần mổ phần dụng cá là đủ. Mẫu cá thường được cố định khoảng 7-10 ngày, sau đó rửa sạch và cố định lại trong dung dịch formol 10% hay cồn 70% (ethyl alcohol). Nếu như giữa mẫu trong dung dịch cồn thì trước tiên nên giữ trong cồn 50% từ 5-7 ngày trước khi chuyển sang cồn 70%. Trong trường hợp muốn giữa mẫu lâu, nếu dùng formol thì phải thay hàng tháng còn nếu giữa trong cồn (alcohol) thì thay mỗi 3 tháng. Tuy nhiên, tùy từng cơ quan của cá mà cách bảo quản mẫu có thể khác nhau để có thể giúp cho quá trình phân tích mẫu đạt kết quả tốt nhất. Vảy, đá tai, gai vi lưng hay gai vi ngực thường được sử dụng để xác định tuổi cá. Vảy cá thường được thu từ 5-10 vảy cho mỗi cá thể. Thông thường vảy tròn (cycloid scale) được lấy ở vùng giữa của vi lưng và đường bên, trong khi vảy lược (ctenoid scale) được thu ở vùng vi ngực. Trước khi thu vảy, mẫu cần phải được rửa sạch để loại bỏ các vảy dính trên thân cá (các vảy này có thể là của các mẫu cá khác dính vào), và chỉ thu các vảy còn đính chặt vào thân cá. Cũng có thể dễ dàng nhận biết các vảy tái sinh do sự sắp xếp không theo trật tự và thiếu các vòng đồng tâm gần, các vảy này không nên thu mẫu. Nên chọn thu đủ số lượng mẫu với các vảy đồng dạng. Khi lấy vảy cần cẩn thận tránh làm tổn hại phần rìa của vảy. Mẫu vảy của mỗi cá thể có thể được chứa riêng trong các túi (giấy hay nilon) có dán nhãn với đầy đủ các thông tin về mẫu. Mặt cắt thẳng đứng của đá tai cũng được sử dụng để xác định tuổi của cá. Đá tai thì nằm trong một khe của tai trong. Cách thu đá tai dễ dàng nhất là thu qua một đường mở nằm ngang trên đầu phía sau mắt, hoặc mở nắp hộp sọ. Một phương pháp khác để thu đá tai mà vẫn giữ nguyên hình dạng mẫu vật là lấy từ phần vòm miệng, tuy nhiên phương pháp này khó thực hiện hơn. Trước khi cắt mẫu, đá tai phải được đúc thành khối trong polyester hay nhựa thông. Có thể bảo quản đá tai bằng các phương pháp sau: - Giữ trong dung dịch glycerin và nước theo tỉ lệ 1:1. - Giữ đá tai trong creosol hay terpineol (Gibson và Ezzi, 1978). - Ngâm trong dung dịch 1% potassium hydroxide (KOH) để loại trừ hết các mô liên kết sau đó làm khô và giữ trọng lọ kín (Strum, 1978) Gai cứng của vi lưng (hoặc vi ngực) cũng được sử dụng để xác định tuổi cá. Gai vi được cố định trong dung dịch formal-calcium ít nhất 24 giờ. Cách chuẩn bị dung dịch này như sau: 40% formaldehyde 10 mL Calcium chloride khan 10 g Nước cất 80 mL Bột CaCO3 thêm vào quá mức bão hòa Sau khi cố định, mẫu được rửa sạch bằng nước cất và chuyển vào dung dịch khử canxi trong thời gian từ 6-12 giờ tùy thuộc vào chiều dài của gai vi. Dung dịch khử canxi được chuẩn bị bằng cách trộn lẫn 2 loại dung dịch A và B (Perry, 1967). Dung dịch A gồm 50 g sodium citrate và 250 mL nước cất, dung dịch B gồm 125 mL acid formir và 125 mL nước cất. Các phần khác của bộ xương như xương nắp mang, cột sống, xương gốc vi đuôi, có thể được thu bằng cách đun mẫu trong nước sôi khoảng 5 phút, khi đó các cơ bám vào Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 11
12. xương sẽ dễ dàng tách ra. Mẫu xương được làm khô ở nhiệt độ phòng trong thời gian khoảng 24 giờ. Sau đó giữ mẫu trong các túi có dán nhãn với các thông tin về mẫu cá. Cố định tuyến sinh dục đúng phương pháp là khâu rất quan trọng cho các nghiên cứu về sinh học sinh sản. Theo Gibson và Ezzi (1978) thì sau khi thu mẫu tinh sào cần phải đo chiều dài (tính bằng mm), cân trọng lượng và cho vào cố định trong cồn 70%. Buồng trứng sau khi thu cũng cần phải cân và đo sau đó xẻ dọc để cho dung dịch cố định thấm vào. Để cố định trứng thì Simpson (1951) đề nghị dùng dung dịch “Gilson’s fluid”. Dung dịch nầy không những có tác dụng cố định trứng mà còn giúp phá vỡ các mô liên kết trong buồng trứng và làm tách rời trứng. Để tách rời trứng khỏi các mô liên kết có thể cần giữ mẫu vài tuần trong dung dịch Gilson, lắc nhẹ lọ chứa trứng đến khi thấy hầu hết các trứng tách ra khỏi các mô của buồng trứng. Loại bỏ các mô của buồng trứng và nếu như trứng còn dính nhau thì tiếp tục giữ trong dung dịch cố định. Trứng đã tách rời phải được rửa sạch bằng cồn tuyệt đối và sau đó bảo quản trong cồn tuyệt đối cho các phân tích về sau (đo và đếm số trứng). Cách chuẩn bị dung dịch “Gilson’s fluid” như sau: 100 ml cồn 60% 15 ml a-xít nitric 80% 18 ml a-xít glacial acetic 20 g mercuric chloride 880 ml nước cất Ngoài ra, việc bảo quản trứng còn có thể thực hiện trong dung dịch formol-saline theo đề nghị của Hancock (1979). Dung dịch nầy có thể chuẩn bị bằng cách pha 100 ml formol 40% với 900 ml nước cất và bổ sung thêm 100 g muối (sodium chloride). Buồng trứng trước khi cố định phải sẽ dọc để dung dịch cố định thấm vào, và buồng trứng cần được xáo trộn (shaking) mỗi 2-3 tuần trong vòng 5-6 tháng để trứng tách rời ra khỏi các mô cơ liên kết. Dung dịch cố định cần được thay định kỳ đến khi mẫu trứng được đem ra phân tích. I.2.4. Kỹ thuật cố định mẫu cho các nghiên cứu mô học Đây là kỹ thuật rất cần thiết cho các nghiên cứu mô học trên các cơ quan khác nhau của cá. Ống tiêu hóa và tuyến sinh dục là 2 cơ quan được nghiên cứu phổ biến nhất vì sự khác biệt về tổ chức mô của 2 cơ quan này sẽ giúp người nghiên cứu hiểu biết hơn về sự phát triển, tập tính dinh dưỡng và giai đoạn thành thục sinh dục của từng loài cá. Kỹ thuật này cũng rất cần thiết cho các nghiên cứu về bệnh trên các loài thủy sản. Mẫu thu cho các nghiên cứu mô học phải là mẫu tươi được lấy từ cá mới được giết chết hay cá được gây mê. Tùy loại mô và kích thước mẫu mà có các loại dung dịch cố định và thời gian cố định mẫu khác nhau. Với các nghiên cứu về ống tiêu hóa, mẫu ống tiêu hóa của cá trưởng thành có thể được cố định bằng dung dịch Bouin trong thời gian 12 giờ sau đó chuyển sang bảo quản trong cồn 70%, với cá bột hay cá hương thì có thể cố định bằng dung dịch formol trung tính 10%. Đối với mẫu buồng trứng thì cố định bằng dung dịch Bouin ít nhất 24 giờ sau đó chuyển sang bảo quản trong cồn 70%. Mẫu cố định bằng dung dịch Bouin, khi bảo quản trong cồn 70% cần thay cồn nhiều lần cho đến khi màu vàng của dung dịch bảo quản được loại bỏ. Một loại dung dịch cố định cũng thường được sử dụng (nhất là trong các nghiên cứu mô học trên tôm) là dung dịch AFA Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 12
13. (alcohol–formalin–acid acetic), hàm lượng formalin và acid acetic có thể thay đổi tùy thuộc vào loại mẫu. - Dung dịch Bouin được chuẩn bị như sau: Dung dịch axit picric bão hòa 750 mL Formol 40% 250 mL Acid acetic 50 mL - Cách chuẩn bị dung dịch formol trung tính: Sodium phosphate (NaH2PO4.H2O) 4 g Sodium phosphate (Na2HPO4) 6,5 g Hòa tan trong 750 mL nước cất, thêm vào 100 mL formol (37- 40%); sau đó thêm nước vào cho đủ 1000 mL I.2. CÂU HỎI ÔN TẬP 1. Các nguyên tắc trong thu mẫu nghiên cứu sinh học. Nêu các bước chuẩn bị trước khi thu mẫu cho các nghiên cứu về sinh học cá. 2. Nêu những vấn đề cần chú ý khi thu mẫu phân tích trong phòng thí nghiệm để mẫu thu được có tính đại diện và phù hợp với nội dung nghiên cứu (chất lượng mẫu, cố định mẫu, số lượng mẫu, phương pháp thu mẫu). Phương pháp thu mẫu nào thường được sử dụng trong các nghiên cứu về sinh học cá. 3. Kỹ thuật bảo quản mẫu cho các nghiên cứu sinh học. Nêu các loại dung dịch cố định mẫu thường được sử dụng để cố định mẫu cá – tôm I.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Biswas, S.P., 1993. Manual of Methods in Fish Biology. South Asian Publishers, Pvt Ltd., New Delhi. 157 pages. 2. King, M., 1995. Fisheries Biology, Assessment and Management. Fishing News Books. 341 pages. 3. Lagler, K.F., 1978. Freshwater fishery biology. Second Edition, WM. C. Brown Company Publishers. Iowa, 421 p. 4. Nikolsky, G.V., 1963. Ecology of fishes. Academic press, London. 352 p. 5. Pravdin, I.F., 1963. Hướng dẫn nghiên cứu cá (chủ yếu cá nước ngọt). Nhà Xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội 1973. Tài liệu tiếng Việt do Phạm Thị Minh Giang dịch. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 13
14. CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI CÁ Nghiên cứu hình thái cá là một khía cạnh quan trọng trong nghiên cứu cá, nó cung cấp nguồn thông tin chủ yếu cho các nghiên cứu về phân loại và tiến hóa của cá. Mặc dù các kết quả nghiên cứu đạt được về di truyền, sinh lý, tập tính, và sinh thái cũng phục vụ cho mục đích này, hệ thống phân loại cá vẫn phụ thuộc rất nhiều vào hình thái học. Những đặc điểm của loài như hình dáng, kích cỡ, màu sắc, sự sắp xếp của vi, vảy và các chỉ tiêu hình thái khác là tiêu chuẩn trợ giúp cho việc nhận dạng, định danh và phân loại cá. Các phương pháp đo đếm các chỉ tiêu hình thái và sự tương quan của các chỉ tiêu sẽ được trình bày trong chương này. II.1. NGUYÊN LÝ TRONG ĐO MẪU CÁ Đo mẫu cá là một trong các phương pháp của nghiên cứu hình thái cá, tùy theo kích cỡ cá mà có các phương pháp đo thích hợp để có được các số liệu chính xác. Phương pháp căn bản dùng bàn đo (board) (Hình 2.1), bàn đo được thiết kế gồm bàn bằng gỗ hay kim loại, bên trên bàn có gắn cố định một thước và phần đầu của bàn đo có một tấm chắn để khi đo đầu cá đặt chạm vào tấm chắn nầy. Chiều dài của bàn đo tùy vào kích thước cá dự kiến sẽ đo. Thanh chắn Thước đo Hình 2.1: Dụng cụ dùng để đo cá (bàn đo cá) Đối với các mẫu có lớn (lớn hơn 50 cm) thì có thể dùng thước để đo, tuy nhiên đối với cá có kích thước nhỏ có thể dùng thước đo (caliper) hay thước có phân cỡ. Thông thường nên đo cá ngay tại nơi thu mẫu, lúc nầy cá còn tươi và ẩm, những mẫu cá bị khô có thể rất khó đo chính xác vì hình dáng của cá có thể bị biến dạng, nhất là không thể kéo thẳng để đo. Trong trường hợp đo mẫu cá sống có kích cỡ lớn thì rất cần thiết phải gây mê cá trong dung dịch Sandoz Ms 222 ở nồng độ thường dùng là 1/1.000, hoặc có thể dùng dung dịch 2 - phenoxy ethanol với hàm lượng từ 20 – 30 mL/100 L nước. II.2. ĐO CHIỀU DÀI VÀ KHỐI LƯỢNG CÁ Thuật ngữ chiều dài của cá thường để chỉ chiều dài tổng cộng (chiều dài toàn thân) của cá. Ngoài ra còn có các khái niệm khác như chiều dài chuẩn và chiều dài chạc. Chiều dài chuẩn thường được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng, tuy nhiên khi thu mẫu với số lượng lớn và cần phải đo nhanh cá ở hiện trường thì khó thực hiện chính xác. Chiều dài fork thường không thể dùng trong trường hợp các loài cá có vây đuôi không phân thùy Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 14
15. như cá rô đồng chẳng hạn. Chọn loại chiều dài nào để sử dụng tùy thuộc rất nhiều vào ý đồ của người nghiên cứu. Phương pháp đo thường dùng là để sát đầu cá vào tấm chắn (phía tay trái), sau đó vuốt cá thẳng ra về phía tay phải và xác định chiều dài của cá dựa vào thước đã gắn trên bàn đo. Phương pháp xác định khối lượng cá thường dùng là cân, có thể cân đĩa hay cân thăng bằng và tùy theo trọng lượng của cá mà dùng cân có mức cân tương thích. Cân thăng bằng thường ít được sử dụng do mất nhiều thời gian và độ chính xác cũng thấp. Cân điện hiện đang được áp dụng phổ biến và cho kết quả chính xác hơn. Xác định khối lượng cá cũng phải tùy vào tình trạng của cá (tươi hay đã qua cố định), trong trường hợp cá đã được cố định thì thường bị mất nước nên khối lượng thực của cá bị thay đổi và trong trường hợp nầy phải tìm hệ số qui đổi để có thể chuyển từ khối lượng cá đã cố định sang cá tươi. Ngoài ra, trong một số trường hợp khi cân khối lượng cá cũng phải xem xét tính đồng nhất của mẫu cá cân (mức độ ẩm chẳng hạn) để giảm sai số. Trong trường hợp không thể cân trực tiếp khối lượng cá thì có thể cân qua dụng cụ chứa cá, chẳng hạn dùng một dụng cụ chứa cá và cân khối lượng dụng cụ trước, sau đó cho cá vào cân lại. Trọng lượng cá chính là phần chênh lệch giữa khối lượng dụng cụ và cá so với khối lượng dụng cụ. II.3. CÁC CHỈ TIÊU HÌNH THÁI Các chỉ tiêu đo theo đề xuất của Lowe-McConnel (1971) và Grant & Spain (1977) trong nghiên cứu sinh học các gồm: 1. Chiều dài tổng cộng (total length): thể hiện giá trị lớn nhất của chiều dài cơ thể cá từ đầu đến cuối cơ thể. Nó là khoảng cách được xác định theo đường thẳng từ mút đầu (miệng cá) đến cuối của vi đuôi. Trong trường hợp cá có vi đuôi dạng phân thùy thì đo đến điểm mút cuối cùng của vi đuôi. 2. Chiều dài chạc (fork length): chiều dài chạc được tính từ mút đầu (miệng cá) đến giới hạn ngoài (điểm giữa) khía chữ V hoặc vị trí phân thùy của vi đuôi cá. 3. Chiều dài chuẩn (standard length): chiều dài chuẩn được đo từ mút đầu của cá (miệng) đến cuống vi đuôi (khớp vi đuôi và cơ thể cá). Vị trí này có thể nhận biết rõ khi bẻ đuôi cá sang 2 bên, một rãnh nhỏ sẽ được hình thành. 4. Chiều dài đầu (head length): chiều dài đầu được xác định từ mút đầu mõm (xương trước hàm) đến điểm cuối của xương nắp mang. 5. Chiều dài trước vi lưng (pre-dorsal fin): chiều dài nầy được tính từ mút đầu (miệng cá) đến gốc tia (gai) vi lưng đầu tiên. 6. Chiều dài phần trước mắt hay dài mõm (pre-orbital hoặc snout length): khoảng cách từ mút đầu cơ thể đến rìa trước ổ mắt 7. Chiều rộng giữa 2 mắt (inter-orbital width): được xác định từ mặt lưng của cơ thể, là khoảng cách từ rìa trên của ổ mắt trái đến rìa trên của ổ mắt phải. Khoảng cách này còn được gọi là khoảng cách nhỏ nhất giữa 2 mắt. 8. Chiều dài sau mắt (post-orbital length): Khoảng cách từ rìa sau ổ mắt đến điểm cuối của xương nắp mang. 9. Đường kính mắt: Khoảng cách từ mép trước đến mép sau của mắt theo trục chiều dài thân. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 15
16. 10. Chiều dài hàm trên (upper jaw length): khoảng cách giữa điểm mút xương trước hàm và điểm cuối của xương hàm trước. 11. Chiều dài hàm dưới (lower jaw length): khoảng cách giữa 2 điểm cuối (điểm giao nhau của hàm trên và hàm dưới) dọc theo mép của hàm dưới. 12. Chiều dài trước hậu môn (anal length): khoảng cách từ mút đầu cơ thể đến giới hạn trước của lỗ hậu môn. 13. Chu vi thân (girth length): vòng đo tại điểm rộng nhất của cơ thể (không tính vi). Chỉ số này thỉnh thoảng được dùng để xác định mức độ thành thục của cá (đặc biệt là cá cái). 14. Chiều cao thân (body depth): là khoảng cách giữa mặt lưng và mặt bụng tại điểm rộng nhất của cơ thể. 15. Chiều cao đầu (head depth): khoảng cách thẳng đứng tính từ điểm sau gáy (gốc sau của xương trên chẩm) đến mặt bụng của đầu. 16. Độ rộng miệng (gape width): còn được hiểu như chiều rộng miệng, là khoảng cách giữa 2 góc khi miệng cá đóng lại. 17. Chiều cao vi lưng (dorsal fin height): chiều dài của tia vi lưng lớn nhất hay của gai vi lưng. 18. Chiều dài gốc vi lưng (dorsal fin base): khoảng cách giữa giới hạn trước và sau của vi lưng dọc theo chiều dài của cơ thể. 19. Chiều dài vi ngực (pectoral fin length): chiều dài lớn nhất của tia vi ngực. 20. Chiều rộng gốc vi ngực (pectoral fin base): khoảng cách giữa điểm trên và dưới gốc vi ngực nơi các tia vi ngực đính vào. 21. Chiều dài vi hậu môn (anal fin length): chiều dài tia vi hậu môn dài nhất. 22. Chiều dài gốc vi hậu môn (anal fin base): khoảng cách từ điểm trước đến điểm sau gốc vi hậu môn. 23. Chiều dài vi bụng (ventral fin length): Chiều dài tia vi bụng dài nhất 24. Rộng gốc vi bụng (ventral fin base): khoảng cách giữa 2 giới hạn ngoài gốc vi bụng. 25. Chiều cao qua miệng (depth at mouth): khoảng cách giữa mặt lưng và mặt bụng của đầu, xác định tại đường kẻ thẳng đứng qua góc sau miệng. 26. Chiều cao qua mắt (depth at eye): khoảng cách giữa mặt lưng và mặt bụng của đầu, xác định tại đường kẻ thẳng đứng qua mắt. 27. Chiều cao thân qua vi lưng (depth at dorsal fin): chiều rộng cơ thể xác định bằng đường kẻ thẳng đứng qua giới hạn trước gốc vi lưng. 28. Chiều cao thân qua vi ngực (depth at pectoral fin): chiều rộng cơ thể qua gốc vi ngực. 29. Chiều cao thân qua hậu môn (depth at anus): chiều rộng cơ thể tại đường kẻ thẳng đứng qua hậu môn. 30. Chiều cao vi đuôi (caudal fin height): chiều rộng khi kéo căng các thùy của vi đuôi ra. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 16
17. 31. Chiều dài cuống đuôi (length of caudal peduncle): khoảng cách từ điểm cuối gốc vi hậu môn đến điểm giữa khớp vi đuôi. 32. Chiều cao nhỏ nhất cuống vi đuôi (least height of the caudal peduncle): cũng là thuật ngữ chỉ chiều cao nhỏ nhất của cơ thể. Là chiều cao nhỏ nhất của cuống vi đuôi trong khoảng giữa điểm cuối gốc vi hậu môn và điểm xuất phát của vi đuôi. Thực tế, nó là chiều rộng của cuống đuôi tại vị trí xương gốc vi đuôi. Hình 2.2: Một số chỉ tiêu hình thái của cá Hình 2.3: Các chỉ tiêu đo ở cá Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 17
18. Trong đó: TL: chiều dài tổng cộng; FL: chiều dài fork; SL: chiều dài chuẩn; BD: chiều cao thân; HL: chiều dài đầu; PD: chiều dài trước vi lưng; PO: dài mõm; PtO: dài đầu sau mắt; ED: đường kính mắt; AL: chiều dài trước hậu môn; IW: chiều rộng giữa 2 mắt; HPC: chiều cao nhỏ nhất cuống vi đuôi; HD: chiều cao vi lưng; BDF: chiều dài gốc vi lưng; PFL: chiều dài vi ngực; PFB: chiều rộng gốc vi ngực; VFL: chiều dài vi bụng; BV: chiều dài gốc vi bụng; AFL: chiều dài vi hậu môn; AFB: chiều dài gốc vi hậu môn. II.4. CÁC CHỈ TIÊU SỐ LƯỢNG Các chỉ tiêu số lượng là các chỉ tiêu sinh học có thể đếm được như số đốt sống, tia vi, vảy, sức sinh sản (Holden và Raitt, 1974). Để thuận tiện cho việc minh họa, chúng ta hãy xét trường hợp đơn giản là đếm số lượng tia vi (công thức vi) và vảy. Có 2 dạng tia vi – tia vi đơn hay gai vi và tia vi kép (phân nhánh) hay tia vi mềm. Với các mẫu cá lớn, có thể dễ dàng phân biệt các gai và tia vi, tuy nhiên với các mẫu cá nhỏ việc quan sát bằng kính hiển vi là cấn thiết để phân biệt tia vi mềm và gai cứng. Các ký tự như D, P, V, A, C, Ll, L.tr. được sử dụng để biểu thị cho vi lưng, vi ngực, vi bụng, vi hậu môn, vi đuôi, vảy đường bên, và vảy ngang đường bên. Dấu gạch chéo (/) được dùng để tách biệt giữa gai vi cứng và tia vi mềm. Thỉnh thoảng những gai cứng được biểu thị bằng chữ số La mã và tia vi mềm được biểu thị bằng chữ số A rập. Thông thường phần phân nhánh của tia vi cuối cùng của vi lưng và vi hậu môn kéo dài đến tận gốc vi, như vậy cả 2 nhánh này phải được tính như 1 tia vi. Hãy xem một số thí dụ minh họa về công thức vi được trình bày dưới đây: i) D. 2/9 – 11: nghĩa là vi lưng có 2 gai cứng và có từ 9-11 tia vi mềm ii) D1. 1/4, D2 5: nghĩa là vi lưng thứ I có 1 gai cứng và 4 tia vi, vi lưng thứ II có 5 tia vi và không có gai cứng iii) D. 2/15/0: Nghĩa là vi lưng thứ nhất có 2 gai cứng và 15 tia vi trong khi vi lưng thứ II thì không có gai và tia vi. iv) P. 12 – 14: nghĩa là vi ngực có từ 12 đến 14 tia vi nhưng không có gai cứng. Vảy đường bên (Ll) là các vảy có lỗ (hoặc răng cưa) nằm dọc theo đường bên (từ góc trên nắp mang đến gốc vi đuôi). Thông thường vảy đường bên không liên tục, trong trường hợp này L.r. sẽ được dùng biểu thị công thức vảy thay thế cho Ll. Vảy ngang đường bên (L.tr.) được đếm như sau: các vảy bên trên đường bên được đếm từ trên xuống và về phía sau bắt đầu từ khởi điểm gốc vi lưng cho đến vảy đường bên; các vảy dưới đường bên được đếm từ dưới lên trên và về phía trước bắt đầu từ khởi điểm gốc vi hậu môn (Hình 2.2). Thí dụ L.tr. 14 có thể được viết thành 8/1/5 hoặc 8½ /5½ . Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 18
19. II.5. CÁC CHỈ SỐ SINH TRẮC Theo Tobor (1974) mỗi chỉ tiêu cơ thể (dài đầu, đường kính mắt, cao thân, ) trong một mối tương quan với chiều dài cơ thể được xem như một chỉ số sinh trắc (biometric index). Trong mỗi chỉ số liên hệ giữa chỉ tiêu cơ thể với chiều dài (chiều dài đầu/đường kính mắt; chiều dài tổng cộng/chiều dài đầu ), giá trị trung bình của chỉ số sinh trắc sẽ được xác định. Theo Bayagbona (1963), nếu trong tất cả các nhóm kích cỡ cá nghiên cứu, chỉ số sinh trắc của mỗi đặc điểm riêng (chỉ tiêu) biểu hiện một tỉ lệ giảm liên tục, lúc đó đặc điểm khảo sát thể hiện một mối tương quan thuận (+), trái lại thì đặc điểm khảo sát thể hiện mối tương quan nghịch (-). Nếu chỉ số sinh trắc không biến đổi nghĩa là sự phát triển của chỉ tiêu khảo sát trong mối liên hệ với chiều dài là một tương quan đồng đẳng (Hình 2.4). Trong đó: A: Tương quan thuận (+) B: Tương quan nghịch (-) C: Tương quan đồng đẳng HL/ED 8 B TL/HL TL/BD x 7 C 6 5 biometric inde biometric 4 5 152535455565 length (cm) Hình 2.4: Chỉ số sinh trắc của cá Labeo pangusia Khi nghiên cứu về trắc lượng hình thái và các chỉ tiêu số lượng, phương pháp hồi qui sẽ được sử dụng với phương trình hồi qui dạng: y = a + b x Trong đó: y: là sự biến động của chỉ tiêu khảo sát như chiều dài thân, dài đầu, a: là hằng số A b: là hệ số tương quan x: là chiều dài tổng cộng Giá trị a và b được xác định bằng công thức sau: Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 19
20. a = y - b x Σ xy - n xy b = Σ x2 - n (x) 2 Trong đó: n: tổng số nhóm chiều dài khảo sát x : giá trị trung bình của x y: giá trị trung bình của y II.6. TƯƠNG QUAN CHIỀU DÀI KHỐI LƯỢNG VÀ HỆ SỐ ĐIỀU KIỆN II.6.1. Tương quan chiều dài và khối lượng Có một nguyên lý chung đó là sự tăng trưởng của cá và các sinh vật khác có ảnh hưởng đến chiều dài của chúng. Vì thế, có thể nói rằng chiều dài và tăng trưởng của của loài có mối tương quan với nhau. Huxley (1924) đã đề xuất công thức sinh truởng của cá qua mối quan hệ giữa chiều dài và khối lượng theo công thức: W = aLb Trong đó: W: là khối lượng L: chiều dài a: là hằng số tăng trưởng ban đầu b: hệ số tăng trưởng Le Cren (1951) đã chuyển đổi phương trình trên thành dạng log như sau: log W = log a + b. log L Giá trị a và b được xác định bằng công thức sau: a = y - b x Σ xy - n xy b = Σ x2 - n (x) 2 Trong đó: n: tổng số nhóm chiều dài khảo sát x: giá trị chiều dài trung bình y: giá trị trọng lượng trung bình Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 20
21. Vì thế khi biết được giá trị của a và b có thể tìm được khối lượng của cá và ngược lại. Đường hồi qui của log W theo log L phải được tính bằng phương pháp bình phương nhỏ nhất (least squares) bằng cách chia các số liệu khảo sát thành các nhóm nhỏ theo các nhóm kích cỡ. Số lượng nhóm phụ thuộc vào sự biến động về kích cỡ của mẫu thu được. Tuy nhiên số lượng nhóm không được dưới 10 nhóm. Số liệu phải được thu trọn năm và sự phân chia có thể theo nhóm chiều dài, nhóm giới tính và mùa vụ, để có thể thấy được sự thay đổi. Hệ số tương quan r được dùng để kiểm tra mức độ chặt chẽ của đường hồi qui và được tính bằng công thức sau: Σ x y - Σ x y r = √{(Σ x2 - n x 2) (Σ y2 - n y 2)} Nếu giá trị r lớn hơn 0,5 thì có sự tương quan giữa chiều dài - trọng lượng và ngược lại. II.6.2. Hệ số điều kiện Bên cạnh mối tương quan giữa chiều dài và trọng lượng, thì từng cá thể cũng có những biến động trong quá trình sinh trưởng. Sự biến động cá thể được phân tích thông qua một chỉ số gọi là hệ số điều kiện (condition factor hay K-factor) và có nhiều cách tính toán khác nhau. Tuy nhiên, Hile (1936) và Beckman (1948) đề nghị công thức dưới đây để tính hệ số điều kiện : K = (W x 105)/ L3 Trong đó: K: hệ số điều kiện W: khối lượng cá L: chiều dài của cá 105 là hệ số làm cho hệ số điều kiện K trở nên gần đồng nhất (Carlander, 1970). Hệ số điều kiện của cá bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi của tuyến sinh dục theo mùa và lượng thức ăn. Vì thế, khi tính toán hệ số điều kiện không nên dùng tổng khối lượng mà nên dùng khối lượng không nội tạng (nominal body weight), vì nó không bị ảnh hưởng bởi tuyến sinh dục và dạ dày (Papageorgiou, 1979). Khối lượng không nội tạng (Wn) được tính toán bằng cách lấy tổng khối lượng trừ đi khối lượng tuyến sinh dục (Wg) và dạ dày (Ws): Wn = W – (Wg + Ws) Hệ số điều kiện nên được tính toán theo mùa, theo giới tính và theo nhóm kích cỡ để xem có hay không sự biến động về giá trị của hệ số K. II.7. CÂU HỎI ÔN TẬP 1. Các phương pháp được sử dụng để định danh (phân loại) cá. Nêu các chỉ tiêu đo (hình thái) và đếm (số lượng) thường được sử dụng khi nghiên cứu hình thái cá. 2. Thế nào là chỉ số sinh trắc? Khi nào thì một chỉ số sinh trắc được cho là có mối tương quan thuận, nghịch hay đồng đẳng? Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 21
22. 3. Nêu phương trình biểu diễn sự tương quan chiều dài và khối lượng. Đại lượng nào dùng để đánh giá mức độ tương quan của phương trình trên. 4. Thế nào là hệ số điều kiện? Ý nghĩa của hệ số điều kiện II.8. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Biswas, S.P., 1993. Manual of Methods in Fish Biology. South Asian Publishers, Pvt Ltd., New Delhi. 157 pages. 2. Lagler, K.F., 1978. Freshwater fishery biology. Second Edition, WM. C. Brown Company Publishers. Iowa. 421 p. 3. Pravdin, I.F., 1963. Hướng dẫn nghiên cứu cá (chủ yếu cá nước ngọt). Nhà Xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội 1973. Tài liệu tiếng Việt do Phạm Thị Minh Giang dịch. 4. Rainboth, W.J. 1996. Fishes of the Cambodian Mekong. FAO identification sheets for fishery purposes. Food and Agriculture Organization, Rome. M-40, (ISBN 92-5- 103743-4). Pp. 265 5. Schreck, C.B., and Moyle, P.B., 1990. Methods for fish biology. American Fisheries Society, USA 6. Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993. Định loại cá nước ngọt vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Khoa Thủy Sản - Trường Đại học Cần Thơ 7. FishBase: Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 22
23. CHƯƠNG III: KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU MÔ HỌC III.1. GIỚI THIỆU Việc nghiên cứu tế bào và mô học bắt đầu từ thế kỷ XVII nhưng mãi đến gần cuối thế kỷ XIX, Tế bào học và Mô học mới thực sự được coi là ngành khoa học. Cuối thế kỷ XIX, sau khi học thuyết tế bào ra đời thì ngành Mô học mô tả bắt đầu phát triển mạnh. Những thành phần cấu tạo khác nhau của các cơ quan và các mô đã được nghiên cứu cẩn thận. Những thành công lớn lao trong kỹ thuật mô học nữa thế kỷ XIX như việc chế tạo ra máy cắt lát mỏng (microtone), cho phép người ta nghiên cứu tỉ mỉ cấu trúc vi thể của tế bào và mô. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu cấu tạo vi thể tế bào đã cho phép người ta tách việc nghiên cứu tế bào thành một phần riêng biệt trong Mô học gọi là Tế bào học. Học thuyết tế bào không chỉ là cơ sở của việc nghiên cứu cấu tạo mô bình thường mà còn là cơ sở của viêc nghiên cứu những thay đổi bệnh lý của mô, cơ quan và đồng thời nó cũng là cơ sở của việc nghiên cứu những hoạt động sinh lý. Mô học, một môn học của Sinh học và là khoa học nghiên cứu của sự phát triển, cấu tạo và hoạt động của các mô, các cơ quan, các bộ máy của cơ thể. Mô học có quan hệ qua lại với nhiều môn học khác trong ngành Sinh học như Hình thái học, Sinh lý học, Phôi học Trong chương này giới thiệu những kỹ thuật cần thiết để nghiên cứu mô, và mức độ nhỏ hơn là tế bào. III.2. PHƯƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU MÔ Tế bào và mô phải được quan sát bằng các loại kính hiển vi, do đó khi nghiên cứu mô và tế bào cần phải cắt mẫu với các độ dầy thích hợp đảm bảo cho ánh sáng xuyên qua trong quá trình quan sát dưới kính hiển vi. Qui trình xử lý mẫu và tạo tiêu bản bắt đầu từ cố định mẫu, cắt tỉa định hướng mẫu, khử nước, ngấm mẫu trong paraffin, đúc khối và cắt lát mỏng, dán lát cắt vào lam và nhuộm màu. Phủ lamelle lên tiêu bản, lúc này lát cắt có thể quan sát được dưới kính hiển vi. Tương tự, qui trình xử lý mẫu bằng kỹ thuật lạnh cũng có thể được áp dụng. Qui trình này tương đối đơn giản hơn, mẫu được đông lạnh nhanh, cắt, nhuộm, phủ lamelle lên tiêu bản. Phương pháp này được ứng dụng trong các nghiên cứu về các enzyme nội tiết vì các enzyme dễ bị mất đi trong phương pháp xử lý mẫu thông thường, nhưng kết quả xử lý mẫu thường không ổn định và khó nhận biết được các cấu trúc chi tiết, qui trình xử lý mẫu vì thế phụ thuộc vào từng trường hợp nghiên cứu cụ thể. III.2.1. Cố định mẫu (Fixation) Cố định mẫu là kỹ thuật làm chết tế bào nhưng vẫn giữ chúng trong tình trạng giống như khi chúng còn sống. Mẫu mô hay cơ quan của cá hoặc tôm sau khi tách ra khỏi cơ thể sẽ chết đi và trải qua quá trình hoại tử (tự phân hủy) và nhanh chóng tan rã (Trump và ctv, 1980) vì vậy cần phải ngăn chặn sự hoại tử và tan rã đó bằng việc cố định nhanh và ít gây ra sự thay đổi cấu trúc nhất. Ngoài tác dụng ngăn chặn quá trình hoại tử, việc sử dụng các loại hóa chất cố định còn giúp cho các tổ chức mô giữ vững cấu trúc trong suốt quá trình xử lý và nhuộm mẫu bằng nhiều loại hóa chất khác nhau. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 23
24. Một mẫu mô được cố định tốt khi những tế bào cấu tạo nên mô đó vẫn giữ nguyên hình dáng, không có sự thay đổi bào tương, không bị trương lên, không bị co lại, làm thể hiện được nhiều chi tiết và cấu trúc, đồng thời giữ được mối liên quan tương hỗ trong tế bào và trong mô giống như còn sống. QUI TRÌNH XỬ LÝ MẪU QUI TRÌNH XỬ LÝ MẪU THÔNG THƯỜNG LẠNH Cố định mẫu Đông lạnh Cắt tỉa và định hướng mẫu Đông khô mẫu Định hướng mẫu Khử nước Làm trong mẫu Đúc khối Cắt mẫu Dán tiêu bản Hydrate hóa Nhuộm Hoàn tất tiêu bản Hình 3.1: Sơ đồ các bước trong qui trình xử lý mẫu (Hinton, 1990) III.2.1.1. Các loại hóa chất cố định mẫu Có thể cố định tế bào và mô bằng nhiều cách như phương pháp vật lý (bằng nhiệt độ), phương pháp hóa học (bằng hóa chất). Cố định tế bào và mô bằng hóa chất là tốt hơn cả. Có nhiều loại dung dịch hóa chất dùng để cố định mẫu, trong đó một số dung dịch hóa chất thường sử dụng là: Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 24
25. - Formalin trung tính 10% - Dung dịch cố định Bouin - Và hỗn hợp của cồn, acid acetic, và formalin với các tỉ lệ pha trộn khác nhau (Hopwood, 1977; Coolidge và Howard, 1979; Humason, 1979; Clark, 1981) III.2.1.2.Chọn dung dịch cố định Các dung dịch cố định có rất nhiều, mỗi loại dung dịch cố định thích hợp cho việc cố định loại mô và cơ quan khác nhau. Vì vậy việc chọn dung dịch cố định phụ thuộc mô cần cố định và vào mục đích nghiên cứu. Thí dụ như khi nghiên cứu sự phát triển của tuyến sinh dục của cá hoặc tôm hoặc cua dung dịch Bouin thường được sử dụng; khi nghiên cứu nhân tế bào người ta thường dùng dung dịch có chứa acid acetic, đối với tôm sử dụng dung dịch cố định Davidsion' AFA là tốt nhất Mặc khác cũng tùy thuộc vào loại thiết bị quan sát (kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử) mà dung dịch cố định mẫu cũng sẽ khác nhau. Với kính hiển vi điện tử dung dịch cố định thường được sử dụng là hỗn hợp của formalin và các aldehyde khác. Aldehyde có tác dụng liên kết protein, trong khi hỗn hợp cồn và acid acetic (được gọi là coagulant) là protein biến dạng hoặc kết tủa protein thành một dạng như bọt xốp hay dạng lưới để liên kết các thành phần khác của tế bào. III.2.1.3. Phương pháp cố định: Tùy theo từng loại mô mà có cách xử lý khác nhau. Kích thước của mẫu mô có ảnh hưởng đến kết quả cố định. Đối với loại dung dịch cố định có khả năng ngấm kém, chiều dầy mẫu mô không quá 1-2 mm. Nếu dung dịch có khả năng ngấm mạnh và sâu thì chiều dài của mô cũng không quá 5 mm. Theo Gabe (1976) chiều dầy của mẫu mô tốt nhất là nhỏ hơn 3 mm. Diện tích bề mặt mẫu mô không ảnh hưởng tới sự cố định. Khối lượng dung dịch cố định: thể tích dung dịch cố định cần lớn hơn nhiều lần so với thể tích mẫu mô (ít nhất 50 lần). Thời gian cố định: Thời gian cố định phụ thuộc vào từng loại dung dịch, thường dao động từ 4-24 giờ. Trên nguyên tắc kéo dài thời gian cố định tốt hơn rút ngắn. Đối với dung dịch làm giòn mô thì phải đúng thời gian cố định. Cố định quá dài làm thay đổi tính bắt màu của tế bào. Cố định lâu quá làm nhân kém bắt màu. Nhiệt độ cố định: Nhiệt độ cao làm tăng và lạnh làm chậm khả năng ngấm của dung dịch cố định. Đối với loại dung dịch cố định dễ bay hơi nên tiến hành ở nhiệt độ thấp Khi thực hiện các bước của qui trình mô học cần phải có sự cẩn thận để đảm bảo sự an toàn. Quá trình cố định, pha chế hóa chất và nhuộm mẫu tốt nhất thực hiện trong tủ hút. Cần mang găng tay, khẩu trang trong suốt quá trình làm việc trong phòng thí nghiệm. Acid piric, thành phần chủ yếu trong dung dịch cố định Bouin, là chất dễ nổ khi ở trạng thái khô vì vậy cần giữ trong điều kiện ẩm ướt, tốt nhất là là bảo quản trong nước cất (Brown 1969). Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 25
26. III.2.1.4. Rửa mô sau khi cố định Rửa mô sau khi cố định có tầm quan trọng lớn vì chất cố định có ảnh hưởng đến quá trình nhuộm màu và bảo tồn phiến đồ. Thời gian rửa bằng thời gian cố định nếu rửa bằng nước; hoặc rửa trong cồn 50%; sau đó chuyển sang cồn 7% để bảo quản trong thời gian dài. III.2.2. Cắt tỉa và định hướng cho mẫu mô đã được cố định (Trimming and Orientation) Mẫu mô đã cố định thường phải được cắt tỉa trước khi đúc khối, việc xác định chính xác mẫu (tổ chức mô) cần quan sát không những tiết kiệm được thời gian, chi phí, mà còn làm nổi bật lên cấu trúc của mẫu vật. Mẫu mô đã được cố định phải rắn chắc, từng cơ quan riêng biệt hoặc cả một mẫu cá nhỏ có thể được cắt tỉa bằng lưỡi dao cạo hoặc dao mổ để đạt được kích cỡ mong muốn và cắt bỏ những mô không có ý định nghiên cứu hoặc dành cho các nghiên cứu khác. Mẫu mô có thể được cắt đôi theo chiều nằm ngang, hoặc cắt thẳng đứng dọc ở giữa. III.2.3. Loại nước, làm trong mẫu, ngấm paraffin (Dehydration, Clearing, Infiltration) Paraffin wax, một loại sáp thường được sử dụng để đúc khối, thì không thể ngấm vào trong mô khi có sự hiện diện của nước. Vì vậy cần thiết phải loại nước, có sẵn trong mô và từ các dung dịch cố định, ra khỏi mẫu mô (Preece, 1972; Gabe 1976). Việc khử nước phải đảm bảo nguyên tắc là loại bỏ hết nước trong mô ra mà không làm tế bào bị biến dạng hoặc không làm vị trí của thành phần cấu tạo tế bào trong mô bị thay đổi. Quá trình loại nước được thực hiện bằng cách nhúng mẫu mô qua một loạt các dung dịch cồn (ethanol) với các nồng độ gia tăng (10% cho mỗi bước) từ cồn 50% đến cồn 80%, sau đó nhúng mẫu vài lần trong cồn 95% và cuối cùng là chuyển sang cồn 100%. Thời gian khử nước thay đổi tùy theo độ dầy mẫu mô. Sau khi hoàn thành quá trình khử nước, cồn cũng cần phải loại ra khỏi mẫu mô bởi vì cồn không thể hòa lẫn với paraffin (Drury và Wallington 1980, Gabe 1976). Nếu không loại bỏ hết cồn, phần mô đó sẽ bị co rút lại, khối mẫu đúc trong paraffin sẽ không đồng nhất, tạo nên những lỗ hỗng trên lát cắt. Do đó cần làm ngấm vào trong mẫu mô một loại dung môi trung gian có thể hòa tan được parffin và cồn. Quá trình này được gọi là quá trình làm trong (clearing) mẫu vì phần lớn các loại hóa chất sử dụng cho mục đích này thường có chỉ số khúc xạ cao và làm cho mẫu trở nên trong suốt. Mục đích chính của bước này là dùng dung môi hòa tan paraffin để đẩy cồn ngấm trong mô ra. Dung môi được sử dụng thường là các dung môi hữu cơ như, xylen, toluen, benzen Xylen là loại dung môi thường được sử dụng nhất do tính thấm nhanh. Thời gian làm ngấm dung môi hòa tan paraffin tùy thuộc vào kích thước mẫu mô, thông thường mẫu mô cần ngâm trong 3 lọ khoảng từ 30 phút đến 2 giờ. Sau khi làm trong, mẫu mô sẽ được chuyển sang bước ngấm paraffin (infiltration). Mẫu được ngâm trong các lọ paraffin nóng chảy (57 – 60o) với thời gian thay đổi từ 1 đến 3 giờ tùy theo kích thước mẫu mô. Đối với những mô ngấm chậm phải kéo dài thời gian ngâm trong paraffin có thể ngâm từ 6 đến 12 giờ. Sự ngấm paraffin sẽ không thành công nếu quá trình khử nước, khử cồn trong mô không tốt. Việc chuyển mẫu mô qua nhiều lọ paraffin là nhằm mục đích để cho dung môi của paraffin trong miếng mô được đẩy ra hết. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 26
27. Bảng 3.1: Qui trình xử lý mẫu Từ giai đoạn cố định mẫu đến giai đoạn ngấm paraffin, mẫu mô có thể được xử lý bằng một trong 2 qui trình: xử lý bằng tay hoặc xử lý tự động bằng máy. Trong các bước xử lý, mỗi bước lập lại có nghĩa là phải có sự thay đổi dung dịch xử lý. Nhiệt độ xử lý mẫu là nhiệt độ trong phòng, trừ các giai đoạn cần thiết xử lý ở nhiệt độ cao. 1. Qui trình xử lý bằng tay (Brown 1969) Bước xử lý Thời gian xử lý Xử lý nhanh Formaline 10% 24 giờ 30 phút ở 60oC Cồn 70% (ethanol) 6 giờ 30 phút ở 60oC Cồn 90% Qua đêm 30 phút ở 60oC Cồn 100% 2 giờ 30 phút ở 60oC Cồn 100% 1 giờ Cồn 100% 1 giờ Cồn 100% + acetone 15 phút ở 60oC Acetone 15 phút ở 60oC Xylen 1 giờ 15 phút Xylen 1 giờ 15 phút Paraffin 15 phút ở 60oC 15 phút ở 60oC Paraffin 15 phút ở 60oC 15 phút ở 60oC Paraffin 15 phút ở 60oC 15 phút ở 60oC Paraffin 15 phút ở 60oC 15 phút ở 60oC Paraffin 3 giờ ở 60oC 1 giờ ở 60oC 2. Qui trình xử lý mẫu bằng máy tự động (Coolidge và Howard, 1979) Bước xử lý Kích thước mẫu ≥ 5 mm < 5 mm < 3 mm < 1 mm Cồn 80% (ethanol) 30 phút 20 phút 10 phút 5 phút Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 27
28. Cồn 95% 60 20 10 5 Cồn 95% 30 30 10 5 Cồn 100% 60 40 20 5 Cồn 100% 180 40 20 5 Cồn 100% 180 40 20 5 Cồn 100% 180 60 30 5 Xylen 30 20 20 5 Xylen 30 30 20 5 Xylen + Paraffin (60oC) 60 60 20 5 Paraffin (60oC) 60 60 30 5 Paraffin (60oC) 60 60 30 5 Paraffin (60oC) 30 20 20 10 III.2.4. Đúc khối (Embedding) Trước khi cắt mẫu, mẫu mô phải được giữ chặt trong một khung cố định, thường thì đặt trong khung bằng paraffin. Mẫu mô đã được ngấm paraffin tốt sẽ được đặt trong khuôn bằng nhựa hay inox. Định hướng miếng mô cho đúng, cẩn thận đổ paraffin nóng chảy vào khuôn. Để đảm bảo mẫu được giữ đúng hướng (vi trí) việc làm lạnh khuôn có thể được thực hiện trong quá trình đúc khối. Khi miếng mô đã được vùi vững chắc vào paraffin, làm rắn paraffin lại bằng cách đặt khuôn vào trong tủ lạnh, sau đó tách khối paraffin ra khỏi khuôn. Ngoài paraffin, một vài chất khác cũng được dùng để đúc khối, thí dụ epoxy resin cũng dùng để đúc khối khi cần quan sát mẫu dưới kính hiển vi điện tử. Trở ngại chính trong quá trình đúc khối paraffin là làm miếng mô co lại, nguyên nhân là do nhiệt độ nóng chảy của paraffin (Bennett & ctv, 1976). Các nhà nghiên cứu đã so sánh mức độ ảnh hưởng của chất dùng để đúc khối đến sự thay đổi của mẫu mô, thí dụ trường hợp của gan cá hồi nếu được đúc khối theo kỹ thuật thường sử dụng là bằng paraffin thì mức độ co của mẫu mô so với ban đầu khoảng 25%, trái lại nếu đúc khối bằng glycol methacrylate thì mẫu mô chỉ co lại khoảng 1-2% (Hampton 1986). Khi cần phân tích các thể huyền phù trong tế bào bằng kính hiển vi quang học thì một số kỹ thuật trong qui trình xử lý mẫu sẽ được thay đổi. Thí dụ như khi nghiên cứu tế bào máu người ta sử dụng phương pháp xét nghiệm kính phết (mẫu của một chất được phết lên phiến kính để soi trên kính hiển vi) khi đó thì mẫu được cố định và nhuộm trực tiếp trên phiến kính (Humason 1979). Khi nghiên cứu dịch huyền phù của tế bào (thí dụ trong nuôi cấy mô), thì quá trình cố định được thực hiện bằng việc thêm một lượng chất cố định bằng thể tích của mẫu cần cố định. Sau mỗi bước của quá trình khử nước, dịch huyền phù được ly tâm nhẹ để cô đặc tế bào và nước được gạn chắt khỏi dịch huyền phù. Với qui trình này, dịch huyền phù trong tế bào được loại nước, làm trong, và được đúc Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 28
29. khối trong môi trường thích hợp. Tất cả các qui trình tiếp theo được thực hiện theo các bước của qui trình truyền thống. III.2.5. Phương pháp cắt mẫu (Sectioning) Mục đích của bước này là nhằm cắt mẫu mô thành những lát thật mỏng có khả năng cho ánh sáng xuyên qua để có thể quan sát bằng kính hiển vi. Có nhiều phương pháp và nhiều loại máy (microstome) để cắt mẫu. Máy cắt quay với lưỡi dao thép, hay lưỡi dao mỏng đặc biệt thường được sử dụng nhất. Có 2 phương pháp cắt mẫu thường được áp dụng III.2.5.1. Cắt lạnh (frozen sectioning) Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu mô nhanh nhất và hạn chế được các khiếm khuyết nhân tạo hình thành trên mẫu mô do ảnh hưởng của quá trình xử lý mẫu. Mẫu được cắt bằng máy cắt lạnh (freezing microtome), thường thì khí CO2 hóa lõng được dùng để làm lạnh mẫu và máy cắt. Tuy nhiên trong phương pháp cắt lạnh, các lát cắt không tạo thành một dãy băng như khi cắt mẫu đúc trong paraffin, mặt khác khó có thể cắt thành các lát cắt mỏng hơn 3 μm. Formal-saline là chất cố định tốt nhất cho mẫu cắt lạnh, khối mẫu có thể đặt trực tiếp vào máy cắt mà không cần đúc khối. Tuy nhiên, trong vài trường hợp, để tránh làm lát cắt vỡ vụn, mẫu mô có thể được đúc khối trong gelatine hay agar (Drury và Wallington, 1980). III.2.5.2. Cắt mô đúc trong khối paraffin Với máy cắt quay người ta có thể điều chỉnh độ dầy của lát cắt và điều chỉnh hướng của lưỡi dao. Lưỡi dao là phần quan trọng nhất trong việc cắt mẫu. Muốn có những lát cắt đẹp phải có lưỡi dao sắc, nên dùng lưỡi dao có sống dầy để tránh sự rung động khi cắt. Quá trình cắt gồm các giai đoạn đoạn: a. Chuẩn bị máy cắt Đặt dao vào máy cắt, vặn ốc thật chặc. Độ lệch của lưỡi dao với mặt cắt của khối mẫu tạo thành một góc khoảng 15-300. Khối mẫu sẽ được cắt thành các lát cắt khi tay quay của máy cắt xoay tròn, mỗi một vòng xoay thì một lát cắt được hình thành. b. Cắt mẫu Trước khi tiến hành cắt, phải điều chỉnh độ dầy của lát cắt. Có thể bắt đầu bằng những lát cắt 10-12 μm. Sau khi đã cắt bằng mặt khối nến và đạt đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dầy theo từng nghiên cứu cụ thể, thông thường là từ 4-6 μm. Độ dầy lát cắt của hệ thần kinh kể cả tủy sống là 10-20 μm, của thận là 1-2 μm. Nếu việc đúc khối với paraffin được thực hiện tốt, lưỡi dao sắc, nhiệt độ trong phòng thích hợp, các lát cắt sẽ nối tiếp sẽ dính vào nhau thành một dãy băng dài. Sự dính thành dãy băng thể hiện sự thành công của kỹ thuật cắt mẫu và là ưu điểm của phương pháp cắt mẫu đúc trong khối paraffin, đặc biệt là trong các trường hợp cần nghiên cứu những phiến đồ nối tiếp nhau theo thứ tự. c. Dán lát cắt vào phiến kính (slide) Khi dãy băng các lát cắt dài từ 10-15 cm, chúng sẽ được lấy ra khỏi lưỡi dao một cách nhẹ nhàng, cẩn thận bằng cách chèn kim giải phẩu vào giữa lát cắt và dao cắt. Đặt Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 29
30. tạm cả phiến băng lên giấy vẽ đen và tách các lát cắt ra với độ dài thích hợp (phụ thuộc vào phiến kính hay vào mục đích của nghiên cứu). Sau đó đặt lát cắt nổi trong một chậu nước ấm (40 - 44oC) để giúp các lát cắt giãn thẳng ra trước khi dán vào phiến kính. Có nhiều cách để dán lát cắt vào phiến kính, cách thông dụng nhất là dán bằng dung dịch Mayer's albumen hoặc gelatin (Luna, 1968; Humason, 1979; Coolidge và Howard, 1979). Đối với dung dịch albumen, cho một giọt rất nhỏ dung dịch lên phiến kính, dùng tay xoa đều để tạo thành một màng mỏng albumen trên phiến kính. Sau khi làm giản thẳng lát cắt trong chậu nước ấm, nhúng phiến kính vào chậu nước ấm ngay bên dưới lát cắt. Cẩn thận đính một đầu của lát cắt vào phiến kính, điều chỉnh lát cắt đúng hướng, từ từ rút phiến kính khỏi nước, lát cắt sẽ được dán chặt vào phiến kính. Đối với dung dịch gelatin thì đơn giản hơn, cho dung dịch gelatin vào thẳng trong chậu nước ấm (40 - 45oC) lát cắt sẽ được thả nổi trong dung dịch này và cách dán lát cắt được thực hiện tương tự. III.2.5.3. Cách chuẩn bị các dung dịch để dán mẫu như sau: i) Dung dịch Mayer's albumen: lòng trắng trứng và glycerol với tỉ lệ 1:1 theo theo thể tích. Trộn đều sau đó lọc qua giấy lọc thô hay bông gòn, quá trình lọc có thể thực hiện nhanh bằng cách nâng nhiệt độ của hỗn hợp lên 55 – 60oC. Thêm vào một ít tinh thể thymol để ngăn vi sinh vật phát triển (Kiernan, 1990). ii) Dung dịch gelatin: Dung dịch 1% gelatin và 1% potassium dichromate được trộn đều với nhau theo tỉ lệ 1:1. Cho dung dịch này vào chậu nước ấm để tạo thành dung dịch 0,002% cho mỗi chất (Drury và Wallington, 1980). Phiến kính cần phải được làm sạch trước khi dán lát cắt vào. Sau khi dán lát cắt vào tiến hành làm khô phiến kính bằng cách sấy khô phiến kính 12 giờ (1 đêm) trong tủ sấy ở nhiệt độ 37oC, hoặc sấy khô bằng bàn sấy ở nhiệt độ 58 - 60oC để loại bỏ paraffin. III.2.6. Nhuộm màu (Staining) Nhuộm màu là một kỹ thuật quan trọng để nghiên cứu tế bào và mô bằng kính hiển vi. Ở tế bào sống, các thành phần cấu tạo tế bào và mô có chỉ số chiết quang gần giống nhau nên khó phân biệt dưới kính hiển vi quang học. Khi nhuộm màu, các thành phần này bắt màu khác nhau, tạo ra độ tương phản giữa các thành phần. Mặt khác, mỗi thành phần của tế bào và mô có ái lực đối với một loại thuốc nhuộm nên khi được nhuộm màu, mỗi thành phần có một màu đặc biệt, căn cứ vào đó người nghiên cứu sẽ phân biệt được chúng. Có nhiều phương pháp để nhuộm mẫu, tùy thuộc mục tiêu nghiên cứu và loại tổ chức (mô, tế bào) mà có thể áp dụng phương pháp thích hợp. Qui trình chung cho việc nhuộm mẫu gồm các bước sau: i) Loại bỏ paraffin: do paraffin rất khó thấm (hoặc không thấm được) các loại thuốc nhuộm, nên cần phải loại chúng ra khỏi mẫu. Xylen là loại hóa chất thường được sử dụng cho mục đích này, mẫu sẽ được nhúng qua các lọ xylen trong vài phút. ii) Loại bỏ xylen bằng cồn tuyệt đối: xylen không hòa tan được trong các dung dịch có nước do đó cần loại xylen ra khỏi mẫu. iii) Xử lý mẫu qua cồn với nồng độ giảm dần: nhằm làm giảm các dòng nước khuyếch tán, tránh sự co giản đột ngột có thể làm cho mẫu bị vỡ vụn và tách rời Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 30
31. khỏi phiến kính, mẫu sẽ được nhúng qua một loạt dung dịch cồn với nồng độ giảm dần từ 95, 70, 50% (có thể đến 30%). iv) Làm cho mẫu ngậm nước: là bước trung gian để chuyển mẫu về cùng điều kiện với dung môi hòa tan loại thuốc nhuộm được sử dụng đầu tiên. Thông thường nước cất được sử dụng cho mục đích này. Trong trường hợp dung môi hòa tan thuốc nhuộm là cồn, chuyển mẫu trực tiếp từ bước (iii) sang dung dịch thuốc nhuộm tại điểm có nồng độ cồn tương đương. v) Nhuộm màu: mẫu được nhuộm bằng 1 dung dịch (đơn chất hay hỗn hợp) hoặc bằng nhiều loại thuốc nhuộm khác nhau. Thời gian nhuộm mẫu có thể từ vài phút đến vài giờ tùy vào loại thuốc nhuộm. vi) Khử nước: Hầu hết các trường hợp, lát mẫu cắt trong paraffin phải được cố định và bảo quản trong một môi trường có thể hòa tan với xylen. Vì vậy, cần thiết phải loại nước ra khỏi mẫu bằng cồn trước khi chuyển mẫu sang xylen. Hơn nữa lát cắt cũng sẽ không trong suốt nếu việc khử nước không tốt, các vết mờ đục và các giọt nước nhỏ xung quanh lát cắt là biểu hiện của việc khử nước không hoàn chỉnh. vii) Làm trong mẫu: Mẫu được làm trong và cồn được loại hoàn toàn ra khỏi lát cắt khi nhúng mẫu vào trong xylen. Nếu lát cắt vẫn còn vết mờ đục hay việc khử nước chưa tốt, cần thiết phải chuyển mẫu trở lại cồn tuyệt đối. Một vài loại thuốc nhuộm như eosin thì có thể hòa tan một ít trong xylen mặc dù không thể quan sát rõ ràng cả sau khi ngâm mẫu vài giờ trong xylen. viii) Đóng khung: Sau khi nhuộm, phủ một phiến kính mỏng lên trên lát cắt để bảo quản và duy trì mẫu lâu dài. Dung môi dùng để đóng khung thường là loại chất lõng sánh đặc, dễ đông cứng lại và phải thỏa mãn các điều kiện (i) giữ mẫu sạch và trong suốt, (ii) không làm đổi màu sắc hay phản ứng với phẩm nhuộm và (iii) giữ cố định phiến kính phủ trên mẫu. Độ chiết quang của dung môi thì tương đương với độ chiết quang của thủy tinh. Keo Canada là loại dung môi thường được sử dụng nhất. Bảng 3.2: Kỹ thuật nhuộm mẫu bằng Mayer's Hematoxylin và Eosin (Hinton, 1990) 1. Mayer's H&E là phương pháp nhuộm thường được áp dụng cho hầu hết các loại tổ chức mô. 2. Áp dụng cho mẫu mô được cố định bằng các loại dung dịch cố định thông thường. 3. Qui trình nhuộm được tiến hành với mẫu cắt trong paraffin, lát cắt được loại paraffin bằng cách sấy qua đêm ở nhiệt độ 56 – 60oC. 4. Phiến mẫu sau khi loại paraffin sẽ được làm ngậm nước theo các bước sau a. Nhúng phiến mẫu vào xylen 2 – 3 phút b. Chuyển sang xylen sạch 1 – 2 phút c. Nhúng trong cồn tuyệt đối 1 – 2 phút d. Chuyển lần lượt sang các dung dịch cồn 95%, 70%, và 50%, 1 phút cho mỗi dung dịch. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 31
32. e. Rửa mẫu trong nước cất 5. Chuẩn bị phẩm nhuộm (cần thiết chuẩn bị trước) và nhuộm mẫu a. Mayer's Hematoxylin: Hòa tan 1 g tinh thể hematoxylin trong 750 mL nước cất. Thêm vào 0,2 g sodium iodate (NaIO3); 1 g acid citric và 50 g chloral hydrate. Thêm nước vào cho đủ 1 lít. b. Dung dịch chuẩn 1% eosin: 1 g eosin Y, 20 mL nước cất và 80 mL cồn (ethanol) 95%. Dung dịch nhuộm eosin được chuẩn bị như sau: 1 thể tích dung dịch chuẩn 1% eosin + 3 thể tích cồn 80%. Trước khi sử dụng thêm vào 0,5 mL acid acetic cho mỗi 100 mL dung dịch nhuộm eosin. c. Nhúng phiến mẫu trong Mayer' s hematoxylin 15 phút d. Rửa phiến mẫu dưới vòi nước 20 phút e. Nhúng phiến mẫu vào dung dịch nhuộm eosin từ 15 giây đến 2 phút tùy vào mức độ bắt màu của mẫu. 6. Chuyển phiến mẫu sang 2 lần cồn 95% (chuyển sang dung dịch mới cho mỗi lần lập lại), mỗi lần 2 phút để rửa hết eosin thừa. Quan sát phiến mẫu bằng kính hiển vi, mẫu đạt yêu cầu khi nền mẫu trong và tế bào chất bắt màu từ hồng nhạt đến cam. 7. Rửa phiến mẫu lại trong cồn 95%, sau đó chuyển phiến mẫu sang 2 lần cồn tuyệt đối, mỗi lần 2 phút. Làm trong mẫu bằng xylen 2 lần mỗi lần 2 phút. Sau khi nhuộm, dán phiến kính mỏng lên trên 8. Với phương pháp nhuộm này, nhân tế bào sẽ có màu xanh dương (blue). Vùng tế bào chất với lưới nội chất (tế bào gan, tuyến tụy ngoại tiết) có màu xanh nhạt hay tím. Phần tế bào chất còn lại sẽ dao động quanh màu hồng sậm III.3. CÂU HỎI ÔN TẬP 1. Nêu sự khác biệt của 2 qui trình xử lý mẫu thông thường (mẫu đúc vùi trong paraffin) và qui trình xử lý mẫu lạnh 2. Mục đích của việc cố định mẫu, các loại dung dịch cố định mẫu và cách chọn dung dịch cố định mẫu thích hợp. 3. Khi cố định mẫu cho nghiên cứu mô học cần phải chú ý đến các yếu tố nào? 4. Qui trình xủ lý mẫu bằng máy xử lý mẫu tự động bao gồm các công đoạn nào. Tại sao phải thực hiện bước làm trong mẫu bằng xylen? 5. Nêu sự khác biệt khi cắt mẫu đúc vùi trong paraffin và cắt mẫu lạnh. 6. Qui trình nhuộm mẫu đúc vùi trong paraffin phải trãi qua các công đoạn nào. Sau khi nhuộm màu, cần thực hiện các bước gì để có được một tiêu bản mô học hoàn chỉnh. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 32
33. III.4. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chinabut, S., Limsuwan, C., and Kitsawat, P., 1991. Histology of the walking catfish Clarias batrachus. AAHRI, Bangkok, Thailand. 96 p 2. Drury, R.A.B., and E.A., Wallington, 1980. Carleton's histological techniques, 5th edition. Oxford University Press, London 3. Kiernan, J.A., 1990. Histological and histochemical methods: Theory and practice. 2nd edition. Pergamon Press. 4. Schreck, C.B., and Moyle, P.B., 1990. Methods for fish biology. American Fisheries Society, USA. 5. Trịnh Bình, Phạm Phan Địch, và Đỗ Kính, 2004. Mô học. Trường Đại học Y Hà Nội. Xuất bản lần thứ 3. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 739 trang. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 33
34. CHƯƠNG IV: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DINH DƯỠNG CÁ IV.1. THỨC ĂN TỰ NHIÊN CỦA CÁ Biswas (1993), chia thức ăn tự nhiên của cá ra thành 4 nhóm chính: sinh vật phù du (plankton), sinh vật tự bơi (nekton), sinh vật đáy (benthos) và chất vẩn (detritus) IV.1.1. Sinh vật phù du (plankton) Là các loài vi sinh vật (tảo hay động vật có kích thước rất nhỏ) sống trôi nổi trong nước. Tùy vào sự hiện diện hay vắng mặt của diệp lục tố (chlorophyll) mà có thể chia thành 2 nhóm chính: thực vật phù du (phytoplankton) và động vật phù du (zooplankton). Tùy thuộc vào kích thước, sinh vật phù du lại được chia thành các nhóm (i) sinh vật nổi cực nhỏ (nannoplankton) kích thước nhỏ hơn 0,03 mm; (ii) sinh vật nổi nhỏ (microplankton) có kích thước từ 0,03-3 mm; và sinh vật nổi lớn (macroplankton) với kích thước lớn hơn 3 mm (Biswas, 1993). Plankton thì khác biệt với nhóm neuston (sinh vật màng nước), nhóm các loài động vật sống quanh màng nước chúng có thể sống ở bên trên (epineuston) hay bên dưới (hyponeuston) màng nước. Nhóm sinh vật này một số sống thường xuyên ở màng nước, một số chỉ sống một thời gian (ấu trùng của nhiều loài động vật). IV.1.2. Sinh vật tự bơi (Nekton) Đây là nhóm động vật có kích thước lớn, sống và bơi lội tự do trong các tầng nước của thủy vực. Nhóm này bao gồm giáp xác, thân mềm, cá, rắn, cá sấu IV.1.3. Sinh vật đáy (Benthos) Là nhóm sinh vật sống ở nền đáy của các thủy vực, sinh vật đáy có thể là thực vật đáy (phytobenthos) hay động vật đáy (zoobenthos) IV.1.4. Chất vẩn (Detritus) Thành phần chính của chất vẩn là một giá thể là một mảnh vật chất hữu cơ đang phân hủy, ngoài ra còn có vi khuẩn, tảo, nguyên sinh động vật và cả các loài luân trùng ăn vi khuẩn sống trên giá thể. Có 2 loại chất vẩn là chất vẩn lơ lững và chất vẩn lắng đọng dưới nền đáy (Qasim, 1972). Có nhiều ý kiến khác nhau về giá trị dinh dưỡng của chất vẩn. Nhiều tác giả cho rằng chất vẩn là loại thức ăn quan trọng vì nó là thức ăn trực tiếp của nhiều loài cá, đặc biệt là nhiều loài cá ăn đáy (David và ctv, 1969; Karamchandani và Mishra, 1978). Giá trị dinh dưỡng của chất vẩn chủ yếu là từ tập hợp nhiều loại vi khuẩn sống trên giá thể và các sản phẩm của chúng (Thanh, 1974). Tuy nhiên một số khác thì lại cho rằng giá trị dinh dưỡng của chất vẩn thì không rõ ràng (Prinslow và ctv, 1974; Verigina, 1977). Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 34
35. IV.2. PHỔ DINH DƯỠNG Theo Schaperclaus (1933), thức ăn của cá được chia thành 3 loại: (i) thức ăn chính (main food) hay thức ăn tự nhiên (natural food) là loại thức ăn chính yếu mà cá ưa thích nhất với loại thức ăn này cá sẽ phát triển tốt nhất; (ii) thức ăn phụ (occasional food) là loại thức ăn có giá trị dinh dưỡng tương đối cao, thức ăn này cũng được cá sử dụng một khi chúng xuất hiện; (iii) thức ăn bắt buộc (emergency food) là loại thức ăn mà cá bắt buộc sử dụng khi không có các loại thức ăn khác. Nikolsky (1963), phân chia thức ăn của cá ra thành 4 loại căn cứ trên tầm quan trọng của loại thức ăn đó trong khẩu phần ăn của cá. (i) Thức ăn cơ bản (basic food): là loại thức ăn được cá thường xuyên sử dụng và chiếm tỉ trọng lớn nhất trong khối lượng thức ăn mà cá ăn vào. (ii) Thức ăn thứ cấp (secondary food) là loại thức ăn thường phát hiện trong ống tiêu hoá của cá, nhưng với số lượng ít. (iii) Thức ăn ngẫu nhiên (incidental food) chiếm số lượng rất ít trong ống tiêu hóa; (iv) và thức ăn cưỡng bức (obligatory food) là loại thức ăn được cá sử dụng khi thiếu thức ăn cơ bản. Tùy vào khối lượng của các loại thức ăn được cá sử dụng Nikolsky (1963) chia tập tính dinh dưỡng của cá ra thành các nhóm như (i) cá ăn đơn (monophagic) chúng chỉ ăn 1 loại thức ăn duy nhất; cá có phổ dinh dưỡng hẹp (stenophagic) chúng ăn dược một số loại thức ăn khác nhau; và cá có phổ dinh dưỡng rộng (curyphagic) chúng ăn được nhiều loại thức ăn khác nhau. Tập tính dinh dưỡng của cá cũng có thể được phân chia theo vị trí của chuỗi thức ăn (hay loại thức ăn) sẵn có hay nơi mà loại thức ăn ưa thích của cá xuất hiện nhiều nhất. Theo đó cá được chia thành (i) cá ăn tầng mặt (surface feeder); cá ăn tầng giữa (mid feeder); cá ăn đáy (bottom feeder) hoặc cá ăn ven bờ (marginal feeder). Das và Moitra (1963) đã phân chia các loài cá ở Ấn Độ ra thành 3 nhóm chính: - Cá ăn thực vật (herbivorous) với thành phần thức ăn chiếm hơn 75% là các loại thực vật. - Cá ăn tạp (omnivorous) là nhóm cá ăn được cả thức ăn thực vật và động vật - Cá ăn thịt (carnivorous) với thành phần thực ăn động vật chiếm hơn 80% Bên cạnh 3 nhóm chính, cá cũng còn được chia thành các nhóm phụ dựa vào loại thức ăn tự nhiên mà cá ưa thích như cá ăn sinh vật nổi (planktophagus) hay cá ăn chất vẩn (detritophagus). Nhóm cá ăn tạp cũng có thể chia thành 2 nhóm phụ là (i) cá ăn tạp thiên về thực vật (herbi-omnivorous) và (ii) cá ăn tạp thiên về động vật (carni- omnivorous). Nhóm cá ăn thịt thì được chia ra nhiều nhóm phụ như: - Cá ăn côn trùng (insectivorous) - Cá ăn giáp xác (carciniphagus) - Cá ăn thân mềm (malacophagus) - Cá ăn các loài cá nhỏ khác (piscivorous) - Cá ăn ấu trùng của các loại côn trùng và cá (larvivorous) - Cá ăn thịt lẫn nhau (cannibilistic) chúng ăn ngay cả các ấu thể của chúng. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 35
36. IV.3. CÁC CHỈ SỐ SINH TRẮC IV.3.1. Tương quan chiều dài ruột Một chỉ số thường được sử dụng để xác định tính ăn của cá là chỉ số tương quan giữa chiều dài ruột và chiều dài thân RLG (relative length of the gut). Alikunhi và Rao (1951) cho rằng chiều dài ruột của các loài động vật thì phụ thuộc vào loại thức ăn tự nhiên mà chúng tiêu thụ, chiều dài ruột tăng theo sự gia tăng tỉ lệ các loại thức ăn thực vật trong khẩu phần ăn của cá. Tuy nhiên, giá trị RLG không những thay đổi giữa các loài khác nhau mà còn thay đổi trong từng cá thể theo từng giai đoạn phát triển. Theo Sinha va Moitra (1976), khi cá tăng trưởng thì tập tính dinh dưỡng của cá cũng sẽ thay đổi từ tập tính ăn thịt sang ăn tạp và ăn thực vật. Cá giống của các loài thường có tập tính ăn tạp. Girgis (1952) cũng cho rằng giá trị RLG thì thấp ở giai đoạn cá hương và cao ở giai đoạn trưởng thành. Trong quá trình tăng trưởng, ống tiêu hóa của cá sẽ gia tăng về chiều dài và gia tăng các nếp gấp để giúp cá tiêu hóa và hấp thu các vật chất có nguồn gốc thực vật, điều này dẫn đến sự gia tăng giá trị RLG. Giá trị RLG được tính bằng tỉ lệ giữa chiều dài ruột và chiều dài thân (Al-Hussainy, 1949) Chiều dài ruột RLG = Chiều dài tổng cộng Khi chỉ số RLG nhỏ hơn 1, cá thuộc nhóm ăn động vật, chỉ số này lớn hơn 1 cá thiên về nhóm ăn thực vật. Giá trị RLG dao động quanh giá trị trung bình cá thuộc nhóm ăn tạp. Chú ý khi sử dụng chỉ số RLG, cần phải tính toán trên nhiều nhóm cá có kích thước khác nhau để tìm ra mối liên hệ giữa tập tính dinh dưỡng với chiều dài của các nhóm cá có kích thước khác nhau. Thí dụ minh hoạ cho tương quan chiều dài ruột thể hiện trong Bảng 5.1. Bảng 4.1: Chiều dài cơ thể, chiều dài ruột, giá trị RLG, hình dạng ruột và loại thức ăn chủ yếu ở một số loài cá Loại thức ăn chủ yếu Loài cá Giai đoạn RLG Hình dạng ruột trong ruột Labeo Cá hương 1,926 Ruột gấp khúc Zooplankton pangusia Tiền trưởng thành 5,865 Số nếp gấp tăng lên Tảo khuê và luân trùng Thành thục 10,258 Ruột cuộn Chất vẩn và tảo khuê Đã thành thục 10,957 Ruột cuộn rất nhiều Chất vẩn lần Labeo Cá hương 1,960 Ống, gấp khúc Zooplankton dero Tiền trưởng thành 5,879 Số nếp gấp tăng lên Tảo khuê, tảo và giáp xác Thành thục 12,681 Ruột cuộn rất nhiều Chất vẩn và tảo khuê lần Đã thành thục 12,115 Ruột cuộn rất nhiều Chất vẩn và tảo khuê lần Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 36
37. Tor tor Cá hương 0,827 Ống thẳng Côn trùng nhỏ, ốc và zooplankton Tiền trưởng thành 1,161 Ít nếp gấp Côn trùng, thân mềm và thực vật lớn Tảo sợi, thân mềm có Thành thục 2,074 Gấp khúc và thành vỏ và côn trùng ruột dầy Như trên Đã thành thục 2,749 Gấp khúc và thành ruột dầy IV.3.2. Chỉ số no (index of fullness) của ống tiêu hóa và cường độ bắt mồi (feeding intensity) Chỉ số về cường độ bắt mồi được xác định dựa trên mức độ no của ống tiêu hóa, mỗi ống tiêu hóa có thể được chia thành 10 phần tương đối bằng nhau. Giá trị của chỉ số no thức ăn được tính điểm theo thang bậc 10. Thí dụ 0,5/10 thì dành cho trường hợp ống tiêu hóa chỉ hiện diện dấu vết của thức ăn, 10/10 là điểm cho ống tiêu hóa căng phồng thức ăn. Giá trị trung bình của chỉ số no trong 1 tháng thu mẫu sẽ cho biết được chỉ số về cường độ bắt mồi (Robotham, 1977) Một phương pháp khác để ước lượng mức độ thỏa mãn (degree of satiation) về thức ăn của cá (chỉ số no) bằng cách áp dụng công thức của Shorygin (1952) 4 wi . 10 Chỉ số no = BW Trong đó: wi: là trọng lượng thức ăn trong ruột cá BW: là trọng lượng của cá Một chỉ số khác cũng thường được sử dụng để ước lượng cường độ bắt mồi của cá đó là chỉ số sinh trắc dạ dày (gastro-somatic index) GI. Chỉ số này được Desai (1970) tính theo công thức: Trọng lượng ruột GI = Tổng trọng lượng cá IV.3.3. Phương pháp phân tích thức ăn trong ruột cá Các nghiên cứu về thức ăn và tập tính dinh dưỡng của cá thì rất phức tạp và đòi hỏi nhiều công đoạn phân tích trong phòng thí nghiệm. Do không thể quan sát trực tiếp tập tính bắt mồi của cá trong tự nhiên nên cách tốt nhất để xác định tập tính dinh dưỡng của cá là phân tích thành phần thức ăn có trong ruột (dạ dày) của cá. Tuy nhiên các phương pháp phân tích ruột cá cũng có một số giới hạn. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 37
38. Khi đánh bắt cá hay khi cố định cá trong formalin, do bị sốc đột ngột cá thường nôn mửa phần thức ăn mới được ăn vào. Không phải bất cứ loại vật chất nào có trong ruột cá cũng được qui cho là thức ăn của cá. Thí dụ ở loài cá ăn đáy Labeo dero một số lượng lớn cát được tìm thấy trong ruột cá (Biswas, 1985) nhưng không thể xem là thức ăn cho cá được vì chúng không thể tiêu hóa được. Có nhiều phương pháp để phân tích thức ăn trong ruột cá và có thể nhóm lại thành 3 phương pháp chính (Biswas, 1993) đó là phương pháp số lượng (numerical), thể tích (volumetric) và trọng lượng (gravimetric) IV.3.3.1. Phương pháp số lượng Phương pháp này được thực hiện bằng cách đếm các loại thức ăn hiện diện trong ruột cá và được tính toán theo 4 cách khác nhau: i) Phương pháp tần số xuất hiện (occurrence method): trong phương pháp này số lượng dạ dày (ruột) cá hiện diện từng loại thức ăn riêng biệt được qui đổi ra phần trăm (%) trên tổng số dạ dày (ruột) cá được quan sát (Hynes, 1950). Phương pháp này được tiến hành theo 2 bước: - Bước 1: tất cả các loại thức ăn hiện diện trong các mẫu quan sát sẽ được liệt kê ra thành một danh sách, sau đó sự hiện diện hay không có mặt của mỗi loại thức ăn trong từng dạ dày sẽ được ghi nhận lại - Bước 2: số lượng dạ dày (ruột) trong đó có sự hiện diện của mỗi loại thức ăn sẽ được cộng lại và cách tính tương tự cho tất cả các loại thức ăn khác còn lại, sau đó sẽ được tính ra phần trăm trên tổng số mẫu quan sát. Phương pháp này cho phép định tính thành phần thức ăn và tần số xuất hiện của mỗi loại thức ăn trong số mẫu quan sát từ kết quả đó cho phép suy đoán được tính chọn lựa thức ăn của cá. ii) Phương pháp số lượng (number method): Trong phương pháp này số lượng của mỗi loại thức ăn sẽ được ghi nhận và được tính thành phần trăm trên tổng số các loại thức ăn hiện diện trong dạ dày (ruột). Phương pháp này sẽ rất có hiệu quả khi nghiên cứu trên nhóm cá ăn sinh vật nổi (planktophagus), tuy nhiên khi nghiên cứu trên nhóm cá ăn tạp thì phương pháp này sẽ bộc lộ nhược điểm do không chú ý đến kích cỡ khác nhau của các loại thức ăn. iii) Phương pháp tính nhóm thức ăn ưu thế (dominance method): Phương pháp này giống như phương pháp tính tần số xuất hiện. Sự khác biệt ở đây là thay vì ghi nhận tất cả các loại thức ăn hiện diện trong dạ dày (ruột) thì chỉ có loại thức ăn hay nhóm thức ăn chiếm ưu thế trong dạ dày (ruột) được ghi nhận, sau đó số lượng dạ dày có sự hiện diện của loại thức ăn hay nhóm thức ăn ưu thế sẽ được tính thành phần trăm trên tổng số mẫu cá quan sát. Yếu điểm chính của phương pháp này là nhóm thức ăn mà cá ưa thích nhất có thể bắt gặp với số lượng nhỏ do các tác động của môi trường. Khi đó một nhóm thức ăn khác sẽ vượt trội hơn và trở thành nhóm thức ăn ưu thế, gây nên sự khó khăn trong việc đánh giá chính xác tập tính dinh dưỡng của loài. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 38
39. iv) Phương pháp đếm điểm (Points method): Đây là phương pháp cải tiến nhất của các phương pháp số lượng. Điểm số của mỗi loại thức ăn phụ thuộc vào: - Tần số xuất hiện: thức ăn thường xuất hiện sẽ có điểm số cao nhất trong khi thức ăn ít xuất hiện sẽ có điểm số thấp nhất. - kích cỡ thức ăn: thức ăn kích thước lớn sẽ có điểm số cao hơn thức ăn có kích thước nhỏ Điểm số cho tất cả các loại thức ăn sẽ được kết hợp lại và được tính ra phần trăm trên tổng điểm số các loại thức ăn có trong khẩu phần ăn của cá. IV.3.3.2.Phương pháp thể tích Phương pháp này thường được xem là thỏa mãn và chính xác hơn trong việc phân tích dạ dày (ruột). Trong thực tế có 3 cách phân tích i) Phương pháp ước lượng bằng mắt (Eye estimation): Đây có lẽ là phương pháp đơn giản nhất trong các phương pháp phân tích thức ăn trong dạ dày (ruột) cá. Trong phương pháp này, thức ăn trong mỗi mẫu ruột cá được đưa về cùng một đơn vị thể tích và mỗi loại thức ăn được tính ra phần trăm (%) theo thể tích (Pearse, 1915; Pillay, 1952). Thức ăn trong mỗi ruột cá trước tiên được cho vào một thể tích nước nhất định, lắc thật mạnh để thức ăn được phân tán đều trong nước. Sau đó lấy một giọt mẫu và quan sát dưới kính hiển vi. Diện tích bị chiếm bởi mỗi loại thức ăn được xác định theo đơn vị mà người quan sát tự qui ước trước. Mỗi mẫu ruột cá quan sát ít nhất 10 giọt, sau đó lấy giá trị trung bình cho mỗi loại thức ăn. ii) Phương pháp tính điểm: phương pháp này cơ bản giống với phương pháp ước lượng bằng mắt, tuy nhiên thay cho việc ước lượng diện tích mỗi loại thức ăn được ước định bằng điểm số căn cứ trên thể tích của chúng. iii) Phương pháp thay thế: phương pháp này được xem là chính xác nhất trong các phương pháp thể tích sử dụng trong phân tích da dày (ruột) cá. Trong phương pháp này thể tích của mỗi loại thức ăn được đo bằng thể tích nước bị thay thế bởi thể tích thức ăn trong một xi lanh (ống đong). Phương pháp này thích hợp trong việc phân tích dạ dày của các loài cá ăn thịt. Thể tích của mỗi loại thức ăn cũng được tính thành phần trăm trên tổng thể tích dạ dày. IV.3.3.3. Phương pháp trọng lượng Phương pháp này cũng tương tự phương pháp thể tích, tuy nhiên thay cho việc xác định thể tích thức ăn, trọng lượng khô của mẫu và của mỗi loại thức ăn sẽ được xác định, sau đó tính ra tỉ lệ phần trăm trên tổng trọng lượng mẫu quan sát. IV.3.4. Sự phát triển các cơ quan tiêu hóa và mối liên hệ với tập tính dinh dưỡng Nghiên cứu cấu trúc của cơ thể cá như vị trí miệng, răng, kích cỡ miệng sẽ giúp chúng ta hiểu rõ hơn về loại thức ăn tự nhiên và tập tính bắt mồi của cá (Pillay, 1952). Cá có miệng dưới hay miệng nằm ở mặt bụng khẳng định đó chính là loài cá ăn đáy. Sự xuất hiện của các răng nhọn ở hàm chứng tỏ chúng có khả năng bắt và xé mồi như vậy đây là Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 39
40. loài cá ăn thịt (carnivore). Sự hình thành và phát triển của mắt cũng là một yếu tố rất quan trọng trong việc chọn lựa thức ăn của cá trong tự nhiên (Alikunhi, 1952). IV.3.5. Hệ số chọn lựa thức ăn Kết quả phân tích dạ dày (ruột) cá thường phải được so sánh với thành phần thức ăn tự nhiên có sẵn trong môi trường nước nơi cá sinh sống. Nếu một loại thức ăn tự nhiên có thành phần rất phong phú trong môi trường nước nhưng cá lại không sử dụng loại thức này mà trái lại chúng ăn một hay nhiều loại thức ăn khác để phát triển và tăng trưởng, điều này có thể kết luận rằng ở cá có sự chọn lựa thức ăn. Điều cần thiết là phải xác định mối liên hệ giữa số lượng từng loại thức ăn mà cá ăn vào với thành phần tương ứng sẵn có của các loại thức ăn đó trong môi trường. Mối liên hệ này được Ivlev (1961) thể hiện bằng chỉ số lựa chọn thức ăn E (electivity index) và được tính bằng công thức: (ri - pi) E = (ri + pi) Trong đó: ri: phần trăm của loại thức ăn (i) trên tổng số các loại thức ăn có trong ruột cá pi: phần trăm của loại thức ăn (i) tương ứng trên tổng số các loại thức ăn trong môi trường nước. Giá trị E dao động từ (-1) đến (+1). Chỉ số E dương tính biểu thị sự chọn lựa, và chỉ số âm biểu thị sự loại trừ hay lẩn tránh loại thức ăn đó. Giá trị 0 chứng tỏ loại thức ăn được cá ăn vào một cách ngẫu nhiên. Sự ưa thích đối với 1 loại thức ăn riêng biệt được phát hiện trong ống tiêu hóa của cá có thể được xác định bằng các chỉ số IV.3.5.1.Chỉ số ưu thế (index of preponderance): Là chỉ số kết hợp giữa tần số xuất hiện và thể tích của các loại thức ăn trong ống tiêu hóa (Natarajan và Jhingran, 1961) và được tính bằng công thức: ViOi Ii = x 100 Σ ViOi Trong đó Vi và Oi là phần trăm theo thể tích và tần số xuất hiện của loại thức ăn (i) có trong ống tiêu hóa. IV.3.5.2.Chỉ số tương quan (index of Relative importance): Kurian (1977) đưa ra công thức một công thức khác để tính mức độ lựa chọn thức ăn. Trong công thức này thể tích và tần số xuất hiện được kết hợp lại và tính ra phần trăm (Vi + Fi)/Ni Ii = x 100 Σ (Vi + Fi)/Ni Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 40
41. Trong đó: Ii: chỉ số tương quan Vi: thể tích của thức ăn (i) Fi: tần số xuất hiện của thức ăn (i) Ni: số lượng thức ăn Tuy nhiên, Srivastava (1985) thì tính chỉ số tương quan (IRI) theo công thức sau: IRI = (n + v)f Trong đó: n và v là phần trăm theo số lượng và thể tích của thức ăn trong ống tiêu hóa, f là tần số xuất hiện của thức ăn. Enric Cortes (1996) đã cải tiến các phương pháp phân tích trên và đưa ra chỉ số IRI% (tỉ lệ phần trăm chỉ số tương quan của một nhóm thức ăn trên tổng các chỉ số tương quan và được tính bằng công thức sau: IRIi IRIi% = x 100 n Σ IRIi i = 1 Trong đó: IRI: là chỉ số tương quan của từng nhóm thức ăn đối với cá thể nghiên cứu và được tính bằng công thức: IRI = (N% + W%)O% N%: phần trăm từng nhóm thức ăn trong ống tiêu hóa tính theo số lượng W%: phần trăm từng nhóm thức ăn trong ống tiêu hóa tính theo trọng lượng O%: tần số xuất hiện IV.3.6. Các chỉ tiêu đánh giá nhu cầu dinh dưỡng của cá Theo Tacon (1990), tốc độ tăng trưởng là một yếu tố quan trọng để đánh giá nhu cầu dinh dưỡng của các động vật thủy sinh. Cá sẽ tăng trưởng tốt nếu chúng ăn được loại thức ăn thích hợp, đủ lượng và chất. Ngược lại nếu không có thức ăn thích hợp, cá sẽ không phát triển, chậm lớn, thậm chí sẽ chết. Các chỉ số thường được sử dụng để đánh giá nhu cầu dinh dưỡng của cá là: (i) Tốc độ tăng trưởng đặc biệt (Specific growth rate – SGR) (loge trọng lượng cuối – loge trọng lượng ban đầu) SGR = x 100 Thời gian nuôi Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 41
42. (ii) Hệ số chuyển hóa thức ăn (Food conversion ratio – FCR) Trọng lượng thức ăn (trọng lượng khô) FCR = Tăng trọng của cá (trọng lượng tươi) (iii) Hiệu quả sử dụng thức ăn (Food efficiency - FE) Tăng trọng của cá FE = Trọng lượng thức ăn IV.4. CÂU HỎI ÔN TẬP 1. Nêu các nhóm thức ăn tự nhiên của cá. Phân loại các nhóm thức ăn của cá dựa vào tầm quan trọng trong khẩu phần ăn. 2. Dựa vào cơ sở nào để phân chia phổ dinh dưỡng của cá? Phân chia các nhóm cá dựa theo phổ dinh dưỡng của chúng. 3. Phân chia tập tính dinh dưỡng của cá theo tương quan chiều dài ruột và thân. 4. Các chỉ tiêu nào thường được sử dụng để xác định mức độ thỏa mãn và cường độ bắt mồi của cá? 5. Nêu các phương pháp phân tích thức ăn trong ruột cá. 6. Thế nào là tần số xuất hiện của một loại thức ăn? Nêu các bước thực hiện để xác định tập tính dinh dưỡng theo phương pháp đếm điểm. 7. Các chỉ số nào thường được sử dụng để xác định tính lựa chọn thức ăn của cá. IV.5. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Al-Hussainy, A.H., 1949. On the functional morphology of the alimentary tract of some fishes in relation to differences in their feeding habits. Quart. J. Micr. Sci. 9(2): 190-240 2. Biswas, S.P., 1993. Manual of Methods in Fish Biology. South Asian Publishers, Pvt Ltd., New Delhi. 157 pages. 3. Das, S.M. and S.K. Moitra., 1963. Studies on the food and feedinh habits of some freshwater fishes of India. Part IV. A review on the food and feeding habits with general conclusions. Ichthyologica 2(1-2): 107-115. 4. Enric Cortes, 1996. A critical review of methods of studying fish feeding based on analysis of stomach contents: application to elasmobranch fishes. Can. J. Fish. Aqua. Sci, 54: 726-738. 5. Ivley, V.S., 1961. Experimental ecology of the feeding of fishes. Translated from Russian by D. Scott. Yale University Press, Connecticut. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 42
43. 6. Lagler, K.F., 1978. Freshwater fishery biology. Second Edition, WM. C. Brown Company Publishers. Iowa. 421 p. 7. Schreck, C.B., and Moyle, P.B., 1990. Methods for fish biology. American Fisheries Society, USA. 8. Tacon, Alber G.J., 1990. Standard methods for the nutrition and feeding of farmed fish and shrimp. Argent Laboratory. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 43
44. CHƯƠNG V:PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SINH HỌC SINH SẢN V.1. XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH Chỉ một số ít loài cá có sự khác nhau về hình dạng bên ngoài giữa con đực và con cái (như cá nhám, cá đuối), một số loài có sự khác nhau trong thời gian đẻ trứng (cá hồi đực có mõm dài hơn cá cái trong thời gian đẻ trứng). Nhiều loài cá có những đặc điểm khác biệt về giới tính và có thể nhận biết được thông qua các đặc điểm hình thái bên ngoài (như mức độ trơn láng của vi ngực ở nhóm cá chép Trung Quốc, chép Ấn Độ; mức độ phình to của bụng, mức độ nhô ra của lỗ sinh dục ở cá cái). Tuy nhiên, đa số các loài cá nhất là các loài cá hoang dã sống ngoài tự nhiên, xác định giới tính bằng cách quan sát các đặc điểm hình thái bên ngoài thì rất khó khăn và nhất là đối với cá chưa thành thục sinh dục. Trong trường hợp không xác định được giới tính bằng các đặc điểm hình thái bên ngoài, cá phải được giải phẩu để quan sát tuyến sinh dục. Khi cần xác định giới tính cho một số lượng lớn mẫu, phương pháp thường được áp dụng là quan sát bằng mắt nếu cần thiết thì có thể sử dụng kính lúp. Thông thường, tinh sào có dạng dẹp và quăn dợn sóng trong khi noãn sào có dạng ống, màu hồng nhạt và có hạt. Màu sắc của tuyến sinh dục cũng là một đặc điểm quan trọng để xác định giới tính đối với cá chưa thành thục sinh dục, tinh sào thường có màu trắng hay xám, trong khi đó noãn sào thường có màu hồng nhạt hay hơi đỏ. Tuy nhiên, quan sát tuyến sinh dục bằng kính hiển vi là cách xác định giới tính chính xác nhất, kể cả khi khảo sát các cá thể chưa thành thục. V.2. CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA TUYẾN SINH DỤC Sự sinh sản ở cá thường mang tính chu kỳ, các thông tin về chu kỳ thành thục và thoái hóa của tuyến sinh dục sẽ giúp chúng ta hiểu biết nhiều hơn và có thể dự đoán trước được những thay đổi và phát triển của một quần thể cá trong tự nhiên. Chu kỳ sinh sản của cá thường được xác định bằng việc khảo sát về hình thái và tổ chức mô của tuyến sinh dục. Sự thay đổi về hình thái và có tính chu kỳ của tuyến sinh dục (như hình dạng và cấu trúc) thường được sử dụng để đánh giá giai đoạn thành thục của cá. Thuật ngữ giai đoạn thành thục (maturity stages) được sử dụng để chỉ mức độ chín của tuyến sinh dục. Việc khảo sát tổ chức mô của tinh sào hay noãn sào phải được tiến hành ít nhất 1 năm để xác định chu kỳ phát triển và phóng thích những sản phẩm sinh dục của cá, chu kỳ này được gọi là chu kỳ thành thục (maturation cycle) Phương pháp thông thường để đánh giá giai đoạn thành thục của cá là xác định giai đoạn thành thục của từng cá thể theo bậc thang thành thục trong đó các đặc điểm khác biệt có thể nhận biết được bằng mắt thường. Bậc thang thành thục (hay bậc thang chín muồi sinh dục) cho phép đánh giá nhanh mức độ thành thục và khả năng sinh sản của một số lượng lớn cá thể. Tuy nhiên rất khó phân loại chính xác tất cả các cá thể vào trong các bậc thang thành thục. Hơn nữa, sự phát triển của tinh sào và noãn sào thường không đồng kiểu, các tế bào của tinh sào thường phát triển không đồng nhất và khó phân biệt sự phát triển của tinh sào ra thành 7-8 giai đoạn, trong khi đối với noãn sào thì dễ dàng phân biệt hơn vì các tế bào trứng phát triển khá đồng đều. Tuy vậy, các bậc thang thành thục vẫn là một công cụ khá thuận tiện trong việc xác định tiến trình phát triển của tuyến sinh dục. Tuy nhiên, để xác định chính xác giai đoạn thành thục của tinh sào hay noãn sào thì các kết quả khảo sát về hình thái phải được kết hợp với các kết quả khảo sát về tổ chức mô trong từng thời điểm. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 44
45. Rất nhiều tác giả đã đưa ra các bậc thang thành thục sinh dục của cá (Qasim, 1957; Kesteven, 1960; Nikolsky, 1963; Laevastu, 1965; Crossland, 1977; Beumer, 1979). Các tác giả này đã chia bậc thang thành thục sinh dục ra thành nhiều giai đoạn (4-5 giai đoạn hoặc thậm chí nhiều hơn: 7-8 giai đoạn). Sự phân chia bậc thang thành thục ra nhiều giai đoạn cho phép phân chia khá chính xác mức độ thành thục của các cá thể trong cùng một loài hay giữa các loài cá khác nhau. Tuy nhiên, đánh giá nhanh bằng mắt chỉ có thể phân chia một cách tương đối số lượng trung bình của mẫu vật quan sát, cho nên không thể sử dụng bậc thang thành thục có quá nhiều giai đoạn. Bậc thang thành thục có ít hơn 8 giai đoạn được xem là thích hợp cho việc đánh giá hầu hết các loài cá (Holden và Raitt, 1974). Khi khảo sát sự phát triển của tuyến sinh dục, có thể chọn bất cứ bậc thang thành thục nào theo chủ ý của người quan sát, tuy nhiên mục tiêu chính là nhằm định kỳ khảo sát một số lượng lớn mẫu trong những khoảng thời gian nhất định để có được một hình ảnh rõ ràng về giai đoạn thành thục và những thay đổi của quần thể cá tại thời điểm khảo sát. Hơn nữa, các bậc thang thành thục còn được sử dụng để đánh giá nhanh tình trạng thành thục của tuyến sinh dục trong điều kiện ít trang thiết bị khảo sát và cho phép khảo sát một số lượng lớn mẫu ngoài hiện trường. Nhìn chung, có 2 bậc thang thành thục sinh dục thường được sử dụng: i) Bậc thang thành thục 7 giai đoạn (Bảng 6.1) dành cho các loài cá đẻ trứng một lượt (isochronal spawner). Các loài cá đẻ trứng một lượt có buồng trứng phát triển đồng nhất và tất cả các trứng đều rụng cùng một thời điểm. Xác định giai đoạn thành thục với các loài cá này thường không khó, vì hầu hết các tế bào trứng đều phát triển với cùng một giai đoạn trong cùng một thời điểm. ii) Bậc thang thành thục 5 giai đoạn (Bảng 6.2) dành cho các loài cá đẻ trứng nhiều đợt (heterochronal spawner). Việc xác định giai đoạn thành thục ở các loài này là vấn đề khá khó khăn vì thời gian sinh sản của cá kéo dài và cá đẻ thành nhiều đợt. Buồng trứng của các loài này có nhiều lứa trứng với các giai đoạn thành thục khác nhau. Bảng 5.1: Bậc thang thành thục sinh dục cho cá đẻ trứng một lượt (isochronal spawner) theo Kesteven (1960). Giai Mức độ Mô tả đoạn thành thục Tuyến sinh dục chưa phát triển, còn rất nhỏ nằm sát vào cột Chưa thành thục sống. Tinh sào và noãn sào là 2 sợi dây dài, hẹp không màu I (virgin) hoặc màu xám. Tế bào trứng không quan sát được bằng mắt thường. Tuyến sinh dục bắt đầu phát triển và dài thêm. Tinh sào và noãn sào có màu hơi đục, màu hơi xám đến hồng. Chiều dài Trưởng thành tuyến sinh dục chiếm khoảng ½ hay hơn ½ chiều dài II (maturing virgin) khoang bụng. Hạt trứng nhỏ và có thể quan sát được bằng kính lúp. Các cá thể sau khi đẻ trứng cũng được xếp vào giai đoạn này. III Sinh trưởng Tuyến sinh dục mờ đục, màu hơi đỏ với nhiều mạch máu, chiếm khoảng ½ thể tích xoang bụng. Buồng trứng chứa Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 45
46. (Developing) đầy những hạt trứng nhỏ, màu trắng đục và có thể nhìn rõ bằng mắt thường. Tinh sào có màu đỏ nhạt đến trắng, không có sẹ lõng chãy Sinh trưởng và ra khi ấn nhẹ vào. Buồng trứng có màu vàng (cam) hơi đỏ. IV dinh dưỡng Các hạt trứng có màu đục và có thể phân biệt rõ từng hạt (Developing) trứng. Tuyến sinh dục chiếm khoảng 2/3 thể tích xoang bụng. Thành thục Tuyến sinh dục chiếm gần hết thể tích xoang bụng. Tinh V sào có màu trắng, có sẹ trắng chảy ra khi ấn vào. Hạt trứng (gravid) lớn, tròn, một số trứng bắt đầu trong mờ và chín. Trứng và sẹ chín muồi, khi ấn nhẹ vào bụng cá trứng và sẹ chảy ra thành từng tia. Nếu nhấc ngược cá lên và lắc nhẹ, Rụng và đẻ trứng VI trứng và sẹ sẽ chảy ra tự do. Tất cả trứng trở nên trong suốt (spawning) chỉ còn một vài trứng màu trắng mờ đục sót lại trong buồng trứng. Tuyến sinh dục trở nên mềm nhũn, co lại và có màu đỏ sẫm. Xoang bụng hầu như trống rỗng. Thường trong buồng VII Thoái hóa (spent) trứng còn sót lại một ít trứng nhỏ, các trứng này sẽ chuyển biến và thoái hóa. Sau đó buồng trứng trở về giai đoạn II. Bảng 5.2: Bậc thang thành thục sinh dục cho cá đẻ trứng nhiều đợt (heterochronal spawner) (Qasim, 1957; Crossland, 1977) Giai Mức độ Mô tả đoạn thành thục Chưa thành thục Tuyến sinh dục dài khoảng 1/3 chiều dài xoang bụng. Noãn I sào như một dãy băng mỏng, màu hồng nhạt, khó nhận thấy (immature) bằng mắt thường. Tinh sào là một sợi mảnh màu trắng. Tuyến sinh dục chiếm khoảng ½ thể tích xoang bụng. Noãn Trưởng thành sào có màu hồng nhạt, hơi đục, co thể nhìn thấy các hạt II (maturing virgin) trứng bằng kính lúp. Tinh sào có màu trắng như kem và dày lên. Tuyến sinh dục chiếm khoảng 2/3 xoang bụng. Trứng to và Đang chín dễ dàng nhìn thấy bằng mắt thường. Noãn sào có màu hồng III (Ripening) nhạt đến vàng. Tinh sào phát triển to ra, có màu trắng nhạt đến màu kem Chín muồi Tuyến sinh dục chiếm hầu hết thể tích xoang bụng. Noãn IV sào căng phồng với trứng to và trong mờ. Tinh sào to, mềm (Ripe) có màu trắng kem Phương pháp nghiên cứu sinh học cá 46