Tài liệu Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Nội dung text: Tài liệu Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

1. KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)
2. KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) I. MỞ ĐẦU: Kỹ thuật PCR (viết tắt từ chữ Polymerase Chain Reaction), hay cịn gọi là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase hoặc phản ứng chuỗi tổng hợp ADN, do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Kỹ thuật PCR đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền phân tử, khuếch đại in vitro cĩ chọn lọc bằng tạo dịng in vitro mà khơng cần sự hiện diện của tế bào, khắc phục được nhược điểm thao tác phức tạp và cần thời gian dài của kỹ thuật tạo dịng in vivo. Nhờ phản ứng PCR, một đoạn ADN ở một vùng bất kỳ trong bộ gien được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn đĩ đã biết. II. NGUYÊN TẮC CƠ BẢN: Kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép ADN. ADN polymerase dùng các đoạn ADN mạch đơn làm khuơn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với sợi này. Các sợi ADN khuơn mạch đơn cĩ thể tạo ra theo cách đơn giản là đun nĩng dung dịch ADN mạch kép đến gần nhiệt độ sơi. ADN polymerase cũng địi hỏi phải cĩ một đoạn ngắn ADN mạch đơn (đoạn mồi) để khởi đầu quá trình tổng hợp. Do đĩ, để khởi đầu quá trình tổng hợp cần cung
3. cấp đoạn mồi oligonucleotid (cĩ độ dài từ 6 đến 30 nucleotid), đoạn này gắn bổ sung vào ADN khuơn tại điểm khởi đầu sao chép. Cả hai sợi ADN đều được dùng để làm khuơn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi oligonucleotid được cung cấp cho cả hai sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn để chặn hai đầu của đoạn ADN cần nhân lên, sao cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt đầu từ mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia (Hình 1c). Như vậy, sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi ADN mới được tổng hợp.
4. 5' 3' a) Vật liệu khởi đầu là phân tử ADN mạch kép 3' 5' Các đoạn mồi b) Các sợi tách nhau ra khi gia nhiệt o o 5' 3' 94 C, sau đĩ hạ xuống 30-65 C, trong 30 giây để các đoạn mồi gắn vào hai vị trí tương hợp trên ADN 3' 5' c) Taq polymerase tổng hợp các sợi 5' 3' ADN mới tương hợp với sợi khuơn, bắt đầu từ đoạn mồi kéo dài về phía đoạn mồi nằm bên sợi 3' 5' kia. d) Hỗn hợp phản ứng lại được gia nhiệt. Sợi ban đầu và sợi mới 3' 5' tổng hợp tách nhau ra. Trên hai sợi mới tổng hợp xuất hiện 2 điểm bám cho các đoạn mồi gắn 5' 3' vào. e) Taq polymerase tổng hợp các sợi ADN tương hợp mới, nhưng các chuỗi mới lần này chỉ tiến đến đúng vị trí đã được xác định bởi các cặp đoạn mồi đã lựa chọn. f) Quá trình được lặp lại, các đoạn mồi tiếp tục gắn vào các sợi mới 5' 3' tổng hợp. g) Taq polymerase tổng hợp các đoạn tương hợp sinh ra hai đoạn ADN mạch kép giống hệt đoạn 5' 3' cần tổng hợp. Quá trình cứ thế tiếp tục. 3'Các đoạn mong muốn 5' 5' 3' Hình 1. Sơ đồ nguyên lý phản ứng chuỗi 3' 5' và cứ thế tiếp tục trùng hợp PCR. (Để đơn giản hĩa sơ đồ, từ phần (d) khơng vẽ hai sợi ADN khuơn ban đầu)
5. Hỗn hợp phản ứng lại được đun nĩng lên để tách sợi ban đầu khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đĩ lại được dùng tiếp cho chu trình tiếp theo, bao gồm các bước gắn đoạn mồi, tổng hợp ADN và tách rời các đoạn. Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý thuyết ta sẽ cĩ 2n-2 bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi (Bảng1). Bảng 1. Hiệu quả nhân ADN của kỹ thuật PCR Số chu kỳ Số phân tử ADN Số chu kỳ Số phân tử ADN (n) mạch kép sinh ra (n) mạch kép sinh ra 1 0 17 32.768 2 0 18 65.536 3 2 19 131.072 4 4 20 262.144 5 8 21 524.288 6 16 22 1.048.567 7 32 23 2.097.152 8 64 24 4.194.304 9 128 25 8.388.608 10 256 26 16.777.216 11 512 27 33.544.432 12 1.024 28 67.108.864 13 2.048 29 134.217.728
6. 14 4.096 30 268.435.456 15 8.192 31 536.870.912 16 19.384 32 1.073.741.824 III. CÁCH TIẾN HÀNH MỘT PHẢN ỨNG DÂY CHUYỀN TỔNG HỢP ADN: PCR là một kỹ thuật phịng thí nghiệm tương đối dễ làm, rất đa năng và phổ ứng dụng hết sức rộng rãi. Vật liệu gồm trước hết là ADN cĩ chứa đoạn cần nhân lên. Khơng cần thiết phải tách riêng đoạn cần nhân lên vì việc đĩ đã được các đoạn mồi dùng trong phản ứng xác định. Hàm lượng ADN cần cho phản ứng rất nhỏ. Trong các thí nghiệm bình thường ở phịng thí nghiệm chỉ cần một microgram ADN hệ gien (chromosome) là đủ. Trong nhiều trường hợp, phản ứng PCR cĩ thể nhân các đoạn ADN chỉ từ một phân tử riêng lẻ. Hai đoạn mồi để xác định điểm bắt đầu tổng hợp ADN, ADN polymerase, và hỗn hợp của tất cả bốn tiền chất deoxynucleotid (ở dạng dNTP) và dung dịch đệm cĩ ion Mg2+ cần được đưa vào ống nghiệm cĩ chứa ADN khuơn. Dung tích tổng số thường là 50 ml hoặc 20 ml. Hỗn hợp phản ứng được cho vào ống nhựa nhỏ chịu nhiệt, cĩ nắp đậy.  Bước 1: làm nĩng hỗn hợp phản ứng đến khoảng 94oC. Tại nhiệt độ này, các phân tử ADN mạch kép tách nhau ra hồn tồn, tạo nên các sợi đơn để dùng làm khuơn cho các đoạn mồi và ADN polymerase.  Bước 2: nhiệt độ được hạ xuống 30 – 65oC để các đoạn mồi (số lượng rất lớn) gắn với các trình tự bổ sung trên các phân tử ADN khuơn (do số lượng mồi
7. lớn nên liên kết giữa mồi và ADN khuơn xảy ra chủ yếu so với liên kết phục hồi giữa hai sợi đơn). Nhiệt độ gắn kết này gĩp phần quyết định tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Nhiệt độ và khoảng thời gian dùng ở đây thay đổi tùy thuộc vào chiều dài của đoạn ADN cần nhân lên (từ 30 – 70oC). Các điều kiện này sẽ tạo ra khuơn được mồi để cho ADN polymerase hoạt động.  Bước 3: nhiệt độ được nâng lên 72oC trong khoảng 5 phút để ADN được tổng hợp. Hỗn hợp ADN và mồi được ủ với enzyme Taq polymerase và bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate. Đoạn ADN nằm giữa hai mồi được tổng hợp. Vào cuối giai đoạn này, nhiệt độ một lần nữa được nâng lên 94oC, nhưng lần này chỉ trong vịng 30 giây để cho các mẩu ngắn của ADN mạch kép (cả sợi ban đầu và sợi mới được tổng hợp) tách nhau ra. Các sợi đơn này trở thành khuơn cho một chu kỳ tổng hợp ADN khác. Tĩm lại, một chu kỳ gồm: đun nĩng để tách các sợi ADN kép thành sợi đơn để làm khuơn, gắn kết các đoạn mồi vào sợi khuơn, và tổng hợp ADN bằng ADN polymerase, được lặp lại từ 30 đến 60 lần (Hình 1). IV. CÁC THÀNH PHẦN PHẢN ỨNG: Một phản ứng PCR cĩ thể gồm các thành phần hay các vật liệu ban đầu: mạch khuơn cho sự khuếch đại, các đoạn mồi oligonucleotide, dNTP, và ADN polymerase chịu nhiệt với dung dịch đệm phản ứng thích hợp và MgCl2. Nồng độ của mỗi thành phần này tùy yêu cầu. Trừ ADN khuơn và các đoạn mồi, các thành phần cho PCR đều cĩ sẵn từ các nhà cung cấp.
8. 1. Các polymerase chịu nhiệt: Enzyme ADN polymerase được sử dụng đầu tiên trong PCR là đoạn Klenow của ADN polymerase I. Đặc tính của đoạn này là xúc tác sự tổng hợp ADN theo chiều 5’- 3’ và cĩ hoạt tính exonuclease (thủy giải dần liên kết giữa các nucleotide từ đầu phân tử ADN) theo chiều 3’-5’. Tuy nhiên enzyme này khơng chịu được nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phải thêm enzyme mới vào phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân hủy, nhiệt độ lai thấp khiến sự khuếch đại khơng đặc hiệu vv ). Hiện nay thường dùng ADN polymerase là Taq polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ một lồi vi khuẩn suối nước nĩng, Thermus aquaticus. Enzyme này khơng bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Taq polymerase cĩ sẵn trên thị trường từ các cơng ty hàng đầu về cơng nghệ sinh học. Các polymerase chịu nhiệt khác cĩ trên thị trường bao gồm Vent polymerase được phân lập từ Thermococcus litoralis, nĩ sẽ cho nhiều bản sao chính xác từ mạch khuơn hơn là Taq polymerase. Ngồi ra cịn cĩ Tth polymerase được phân lập từ Thermus thermophilus. Các polymerase chịu nhiệt là thành phần đắt nhất của PCR và thường được sử dụng ở nồng độ là 1 đơn vị cho một phản ứng. Nồng độ này đủ để xúc tác cho sự khuếch đại khoảng 40 chu kỳ bằng máy PCR. Trước đây, việc lựa chọn polymerase chịu nhiệt cho một thử nghiệm thì khơng mấy khĩ khăn vì chỉ cĩ một loại ADN polymerase chịu nhiệt (Taq). Hiện nay cĩ nhiều loại polymerase cĩ nguồn gốc khác nhau, nhiều bản sao của các polymerase này được
9. biến đổi di truyền và chúng cĩ thể ưu việt hơn polymerase gốc trong phạm vi một vài ứng dụng (Bảng 2). Sự chọn lựa một polymerase chịu nhiệt cho một thử nghiệm PCR phụ thuộc vào yêu cầu của từng thử nghiệm.
10. Enzyme Nguồn gốc Nơi ở Mức ổn Hoạt Cation cần 3’ 5’ định ở động thiết Exonuclease 95oC tối ưu (t1/2) Tag Thermus Suối 40 phút 50-75 MgCl2 - aquaticus nước nĩng AmpliTaq Tag tái tổ hợp 40 phút 50-75 MgCl2 - AmpliTaq AmpliTag minus 80 phút 75-80 MgCl2 - Stoffel 289 N-terminal aa Tái tổ hợp Thermus Suối 20 phút 55-75 MnCl2 - thermophilus nước (RT), nĩng MgCl2 (PCR) Ultima Thermotoga Biển + maritima sâu giĩ nĩng Vent Thermococcus Biển >95% 80 MgSO4 + litoralis sâu giĩ hoạt động nĩng sau 1 h Vent Vent tái tổ hợp MgSO4 - (Exo-) Deep Vent Pyrococcus sp. Biển >95% 72-80 MgSO4 + Strain GB-D sâu giĩ hoạt động nĩng sau 1 h Pfu Pyrococcus Biển >95% 75 MgCl2 +
11. Bảng 2: Các loại ADN polymerase thơng thường 2. ADN khuơn mẫu: Phản ứng PCR cực nhạy, cĩ thể chỉ cần dùng một phân tử ADN làm khuơn cũng thu được sản phẩm. Tuy nhiên, mức độ nhạy cảm cao là nguyên nhân chính gây ra sự dương tính giả do các ADN ngoại nhiễm. Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên ADN thật tinh khiết nhưng nhiều kỹ thuật chẩn đốn bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với ADN thu nhận trực tiếp từ dịch chiết mẫu thử (vết máu, vật liệu lưu trữ, ADN cũ và ngay cả vi khuẩn đã tiệt trùng). Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp khác, các quá trình chuẩn bị mẫu phải được thực hiện để đảm bảo cho việc khuếch đại, vì các chất ức chế như heparin, EDTA, hay các acid cĩ thể hiện diện trong mẫu. Mạch ADN khuơn mẫu cũng cĩ thể ảnh hưởng đến phản ứng chuỗi. Nếu ADN này cĩ chứa nhiều GC thì sẽ khĩ khăn cho việc tách rời các chuỗi ADN ở nhiệt độ cao. Trong các trường hợp này, việc thêm formamide hay dimethyl sulfoxide (DMSO) vào hỗn hợp phản ứng cĩ thể giải quyết được vấn đề. Nồng độ của ADN khuơn mẫu trong PCR sẽ ảnh hưởng đến mức độ khuếch đại. Với việc sử dụng các polymerse cho hiệu quả cao, lượng ADN mẫu sử dụng cũng cĩ khuynh hướng giảm (1 microgram cịn 100 nanogram). Mặc dù, các khuơn mẫu đơn được khuếch đại nhưng khơng phải mọi thí nghiệm đều đạt được sự nhạy cảm này. Do đĩ, nên thiết lập PCR với lượng ADN khuơn mẫu thích hợp. Lượng khuơn mẫu ADN dư thừa cĩ thể ảnh hưởng xấu đến quá trình khuếch đại. Nếu lượng ADN khuơn mẫu quá cao thì sẽ cĩ khuynh hướng tạo ra lượng lớn các sản phẩm được kéo dài từ đoạn
12. mồi. Sự giới hạn đoạn mồi, sự cĩ mặt của các chất ức chế và quá trình ủ lặp lại khơng thích hợp cũng cĩ thể làm giảm sự khuếch đại. ADN khuơn cĩ thể là bộ gien tách ra từ tế bào, ADN từ các ngân hàng genome hoặc cADN (chỉ cần nồng độ dưới ng), các ADN bất kỳ, ARN tổng số hoặc ARNm. 3. Các đoạn mồi: Các đoạn mồi là thành phần quyết định sự khuếch đại đặc trưng và cĩ hiệu quả cao của PCR. Việc chọn đoạn mồi phải tuân thủ một số nguyên tắc: Trình tự của mồi được chọn sao cho khơng thể cĩ sự bắt cặp bổ sung giữa các mồi tạo cấu trúc bậc hai hay dimer giữa các nucleotide ngay trong một mồi của các đoạn mồi làm cho phản ứng giảm hiệu quả và ngăn cản sự tạo thành đoạn mong muốn. Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, khơng trùng với các trình tự lặp lại trên gien. Kích thước một đoạn mồi tối ưu từ 18-25 nucleotide. Đoạn mồi với kích thước này đảm bảo cho việc gắn chuyên biệt ở nhiệt độ tối ưu và giá thành cho một đoạn mồi được giảm thiểu. Khoảng cách giữa hai mồi khơng dài quá 3 kb. Phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb. Tỷ lệ GC ở các mồi thường chiếm khoảng 40-75%. Trong thành phần các đoạn mồi tránh cĩ quá nhiều cặp GC hay là một loạt các nucleotid G và C. Vì liên kết G:C mạnh hơn liên kết A:T (G nối với C bằng 3 liên kết hydro cịn A với C chỉ cĩ 2). Do vậy, việc bẻ gãy liên kết giữa G:C cần nhiều năng lượng hơn liên kết A:T. Người ta
13. tính nhiệt độ tối ưu sẽ hữu ích cho việc ủ các đoạn mồi trong PCR. Nhiệt độ này gọi là o Tm –5 C là nhiệt độ “chảy” của đoạn mồi trừ đi 5. Kết quả này cĩ từ phép tính đơn giản : o o Tm = 2 C x(A+T) + 4 C x(G+C) o Nhiệt độ ủ = Tm –5 C Các đoạn mồi được tổng hợp hĩa học trên một chất tải rắn trong máy tổng hợp oligonucleotide. Các máy này được tự động hố cao, dễ dàng tổng hợp ra các đoạn mồi. Cĩ nhiều qui tắc để thiết kế đoạn mồi và đã cĩ một số phần mềm cho sự chọn lựa một cặp đoạn mồi tối ưu cho sự khuếch đại của một ADN khuơn mẫu cĩ trình tự đã biết. Nồng độ mồi khoảng 0,1 mM đến 1 mM. Nồng độ thường được xác định dựa vào giá trị OD (optical density) đo ở 260 nm. 4. Nồng độ Magnesium chloride: Nồng độ MgCl2 ảnh hưởng đến sự thành cơng của phản ứng, nếu khơng cĩ mặt ++ Mg thì sự khuếch đại sẽ khơng xảy ra. MgCl2 cần cho hoạt động của ADN polymerase khi ủ ADN với các đoạn mồi và nĩ cĩ một mối tương quan với nucleotid triphosphat. Nồng độ MgCl2 tối ưu cho PCR phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thực nghiệm. Cĩ thể dùng phương pháp định phân bằng cách thiết lập một phản ứng với các nồng độ MgCl2 khác nhau từ 1 mM đến 5 mM và xác định nồng độ MgCl2 tối ưu cho mẫu mong muốn.
14. 5. Nồng độ nucleotid triphosphat (dNTPs) Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20-200 mM/ mỗi loại nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. V. CHU KỲ NHIỆT PCR: Sự khuếch đại PCR đạt được bằng các chu kỳ được lặp đi lặp lại. Mỗi chu kỳ gồm sự biến tính bằng cách nâng nhiệt độ, ủ bằng cách hạ nhiệt độ và sự kéo dài. Một chu kỳ điển hình cho việc khuếch đại đoạn ADN gồm 500 cặp base sẽ là biến tính ở 95oC trong 60 giây, ủ ở 50oC trong 60 giây và 72oC trong 60 giây. Mỗi PCR được thiết kế và được tối ưu hĩa khác nhau và tùy thuộc một số các yếu tố : Kích thước của đoạn được khuếch đại. Các sản phẩm khuếch đại lớn hơn cĩ thể cần giai đoạn biến tính và kéo dài lâu hơn. Các đoạn ngắn hơn cần ít thời gian hơn ở giai đoạn kéo dài. Trình tự của các đoạn mồi và các điều kiện về ion sẽ quyết định nhiệt độ ủ tốt nhất cho một chu kỳ. Vì vậy, dựa vào các phản ứng đã được thực hiện, nhiệt độ ủ cĩ thể thay đổi từ 37oC đến 65oC. VI. ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR: Việc ứng dụng rộng rãi kỹ thuật PCR cĩ nhiều lý do: Rất nhanh chĩng. Chỉ tốn khoảng 3 giờ là cĩ thể khuếch đại một trình tự mong muốn đã biết so với các kỹ thuật cơng nghệ di truyền “cổ điển” phải mất một tuần hay hơn nữa.
15. Đơn giản: PCR cĩ thể được thực hiện trong một ống nhỏ với các thành phần tối thiểu và chỉ việc trộn chúng lại với nhau. Các phương pháp tạo dịng gien điển hình khác cần cĩ các vật liệu mắc tiền như các màng và các nucleotide triphosphate được đánh dấu phĩng xạ và các kỹ thuật đặc biệt. PCR cĩ thể được thực hiện trên các mẫu cĩ chứa ADN tương đối thơ, ví dụ vết máu chưa được xử lý cho việc phân tích pháp y. Điều này ngược với các phương pháp về thao tác gien là cần phải cĩ ADN cả khuơn mẫu lẫn vector tương đối tinh khiết. Các yếu tố trên cho thấy rằng PCR là một sự thay đổi đáng kể so với các phương pháp cổ điển cho việc khuếch đại các trình tự đặc biệt. Nhạy: Phản ứng PCR cực nhạy vì cĩ thể chỉ cần dùng một phân tử ADN làm khuơn cũng thu được sản phẩm. Tuy nhiên, cần phải nhấn mạnh rằng các ứng dụng rộng rãi của kỹ thuật PCR địi hỏi phải biết rõ trình tự ADN khuơn mẫu. Đây là một điểm giới hạn của kỹ thuật này, nghĩa là nĩ vẫn phải dựa vào nền tảng của các kỹ thuật cơng nghệ di truyền chứ khơng hẳn là thay thế các kỹ thuật này. Do vậy người ta khơng sử dụng kỹ thuật này trong các kỹ thuật tạo dịng gien thiết kế. Trong một vài trường hợp phương pháp PCR khơng áp dụng được với các đoạn ADN kích thước lớn hơn 3 kb (thường <1,5 kb là tốt nhất). Ngồi ra khả năng ngoại nhiễm đối với phương pháp này là rất lớn. VII. CÁC KỸ THUẬT PCR CẢI TIẾN: Phản ứng PCR được áp dụng rộng rãi và cĩ những biến đổi phù hợp với từng mục đích nghiên cứu riêng. Vì vậy chúng ta gặp nhiều phương pháp khác như PCR tổ (Nested-PCR), ADN nhánh (Branch-DNA), PCR đa thành phần (multiplex-PCR),
16. PCR ngược (Reverse-PCR), RAPD-PCR vv nhưng tất cả đều dựa trên nguyên tắc của phản ứng PCR. 1. PCR “tổ”: Để đạt được mức độ nhạy cảm cao trong PCR, người ta cĩ thể thực hiện 2 PCR liên tiếp. Trên một điện di đồ, các đoạn đạt được sau PCR thứ nhất, người ta quan sát được một vệt chính, nhưng cũng kèm theo các vệt nhỏ khác. Điều này là do các mồi cĩ thể bắt cặp với vùng khác của ADN đích bởi sự lai hĩa khơng đặc hiệu. PCR thứ 2 được thực hiện với các mồi giống nhau, khuếch đại các sản phẩm tạo thành của PCR thứ nhất. PCR “tổ” cĩ độ đặc hiệu cao: trong kỹ thuật này, sử dụng 2 cặp mồi khác nhau.  Cặp mồi ngoại: Cặp mồi này tạo ra các đoạn ADN được khuếch đại giống với PCR cổ điển. Chúng đặc hiệu cho 2 trình tự mút của ADN cần khuếch đại. Các đoạn ADN thu được (ví dụ đoạn thu được cĩ khoảng 258 cặp base) làm khuơn mẫu cho PCR thứ 2.  Cặp mồi nội: Cặp mồi này bổ sung với vùng nằm bên trong chuỗi nucleotide thu được với cặp mồi thứ nhất (theo ví dụ trên, sẽ cho các đoạn khoảng 211 cặp bases). Thuật ngữ “PCR tổ” là vì các đoạn mồi được tổ, đĩng hộp trong lần PCR đầu. Kỹ thuật này cĩ độ nhạy và độ chuyên biệt cao. Người ta dùng kỹ thuật này để phát hiện virus gây bệnh viêm gan C, một loại virus cĩ vật liệu di truyền là ARN. ARN virus khơng thể được phát hiện bằng sự lai hĩa trực tiếp, một sự khuếch đại phải được thực hiện. Cần phải chuyển tất cả ARN virus thành cADN, đây chính là bước sao
17. mã ngược nhờ sự khuếch đại của cADN bằng kỹ thuật PCR “tổ”. Trong PCR thứ 2, một mồi được biotin hĩa, một mồi được gắn với iod 125. Các đoạn thu được sẽ được gắn trên một giá mang avidin (avidin là một chất cĩ ái lực mạnh đối với biotin), và cuối cùng người ta đo hoạt tính phĩng xạ để kết luận mẫu là dương tính hay âm tính (hình 2). PCR “tổ” cĩ độ nhạy cao hơn PCR tiêu chuẩn là do lặp lại sự khuếch đại sản phẩm từ một PCR thứ 1 với một PCR thứ 2. Tuy nhiên vấn đề ngoại nhiễm cũng là vấn đề hạn chế của nĩ. 2 ADN “nhánh”: Nguyên tắc: ADN đích được khuếch đại bằng PCR, sau đĩ cho lai với đoạn dị (là một phần đặc hiệu của ADN này), tín hiệu được lai hĩa đặc hiệu với đoạn dị theo cùng cách thức của ADN đích cĩ gắn (chất huỳnh quang, chất dạ quang hay chất màu), tín hiệu sẽ được tạo ra nhờ chất đánh dấu hiện diện sau cùng ở máy khuếch đại. Máy khuếch đại chính là một ADN tổng hợp cài lược. Sự tổng hợp của ADN cài lược được thực hiện bằng kỹ thuật với phosphoramide, sử dụng phosphoramide gắn cytosin đặc biệt gồm cĩ nhánh carbon gắn trên –NH2, tận cùng nhánh này cĩ chức rượu alcol bậc 1. PCR “nhánh” cĩ độ đặc hiệu cao. Kỹ thuật ADN “nhánh” được dùng để phát hiện ADN của virus gây bệnh viêm gan B. Trong kỹ thuật này sử dụng 5 đoạn dị. Một đoạn dị thành phần là một trình tự cho phép sự lai hĩa cùng một lúc trên 2 đoạn đích khác nhau (Hình 3).
18. d Khuếch đại C B A ADN đích a Hình 3 Kỹ thuật ADN “nhánh” sử dụng 5 đoạn dị 3. Kỹ thuật PCR đa thành phần: Trong kỹ thuật này, 2 hay nhiều ADN đích được khuếch đại đồng thời. PCR đa thành phần cĩ thể được sử dụng thường xuyên trong các xét nghiệm chẩn đốn, sử dụng 2 bộ mồi khác nhau: bộ thứ nhất để xác định sự đồng nhất của PCR và bộ thứ hai nhắm vào các trình tự ADN dư thừa. PCR đa thành phần cũng cĩ thể được sử dụng trong phịng thí nghiệm vi sinh lâm sàng với cùng đoạn dị cho một mẫu xét nghiệm cho vài sinh vật khác nhau trong một ống PCR. Khi tiến hành PCR đa thành phần cần phải xem xét một số yếu tố trong thiết kế đoạn mồi. Các mồi phải cĩ nhiệt độ lai tương tự nhau. Sự khác biệt 10oC trong nhiệt độ lai giữa các bộ mồi cĩ thể làm cho các sản phẩm khuếch đại rất khác nhau hay tạo sự khuếch đại khơng thể phát hiện được của sản phẩm này hay sản phẩm khác. Các đoạn mồi được sử dụng cũng được thiết kế sao cho các sản phẩm khác nhau đủ về kích thước để mỗi sản phẩm cĩ thể được xác định nhưng khơng quá khác nhau để cho sự khuếch đại của một ADN đích được ưu tiên hơn so với sự khuếch đại của ADN đích
19. khác. PCR đa thành phần cĩ các ADN đích khác nhau nhiều về kích thước thường ưu tiên khuếch đại các ADN đích ngắn trước các ADN đích dài, kết quả là cĩ sự khác nhau về số lượng các sản phẩm được khuếch đại. Tuy nhiên, sự thay đổi đáng kể về nhiệt độ lai hay chiều dài ADN đích là khơng thể tránh khỏi. Người ta cĩ thể điều chỉnh qui trình thực hiện để làm cân bằng phản ứng và đạt được số lượng sản phẩm tương đương nhau hoặc điều chỉnh nồng độ mồi cân bằng với một phản ứng đa thành phần. 4. PCR của ARN: Khi ARN của retrovirus được ly trích và được chuyển đổi thành cADN bởi enzyme sao mã ngược reverse transcriptase, người ta đã thành cơng trong việc tiến hành PCR để phát hiện ARN đích. cADN mới được dùng làm khuơn mẫu cho PCR. Tuy nhiên, các phản ứng nhờ men reverse transcriptase khĩ thực hiện và việc sử dụng các enzyme khơng chịu được nhiệt trên 42oC là một bất lợi vì xảy ra sự lai khơng nghiêm ngặt. Vì vậy, sự phiên mã ngược kém hiệu quả là một trở ngại làm cho sự phát hiện các ARN đích kém nhạy và kém đặc hiệu. Một loại reverse transcriptase chịu nhiệt sẽ làm giảm nhiều bất lợi đi khi tổng hợp cADN, làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng. Người ta đã tìm ra ADN polymerase chịu nhiệt cĩ hoạt tính reverse transcriptase đĩ là ADN polymerase tái tổ hợp được trích từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus thermophilus (Tth pol). ADN polymerase chịu nhiệt này hoạt động hữu hiệu khi cĩ sự hiện diện của ion Mn2+. Hỗn hợp phản ứng của PCR của ARN bao gồm : Tth pol, 2 loại mồi oligonucleotide (một được sử dụng cho sự tổng hợp cADN, và cả 2 được sử dụng cho PCR ), ion mangan ở dạng MnCl2, và tất cả các thành phần khác cần cho sự phiên mã ngược và PCR. Máy chu kỳ nhiệt được
20. đun nĩng trước đến 70oC, và những thành phần phiên mã ngược được ủ trong 15 phút. Sau phản ứng nhờ reverse transcriptase, hỗn hợp phản ứng được nâng nhiệt độ lên 95oC để làm biến tính phức hợp ARN-ADN. PCR sau đĩ được bắt đầu với 2 chu kỳ ở 95oC trong 15 phút và 60oC trong 20 giây, tiếp theo là 38 chu kỳ ở 90oC trong 15 giây và 60oC khoảng 20 giây. Khả năng thực hiện phiên mã ngược là ở 70oC do vậy độ đặc hiệu và độ nhạy của việc phát hiện ARN đích cao. VIII. CÁC LĨNH VỰC ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT PCR: Trong nghiên cứu khoa học, kỹ thuật PCR giúp ích hữu hiệu cho việc xác định trình tự nucleotid của các đoạn ADN được nhân; cĩ thể sử dụng PCR để tách dịng những đoạn ADN đặc hiệu, mặc dù trong nhiều trường hợp tách dịng khơng cần đến PCR; nĩ giúp phát hiện đột biến, nghiên cứu ARNm hoặc tạo các đột biến gien, cho phép phân tích liên kết gien từ những tế bào riêng lẻ; giúp nghiên cứu quá trình tiến hĩa ở mức phân tử. Thậm chí giúp phục hồi những gien đã tồn tại cách đây hàng chục triệu năm. Trong chọn giống vật nuơi và cây trồng, đặc biệt đối với động vật và thực vật bậc cao, vốn trước đây việc lựa chọn cặp cha mẹ làm giống là rất khĩ khăn, cần nhiều năm, thì nay kỹ thuật PCR cho phép thực hiện chỉ trong vài ngày, thậm chí vài giờ với hiệu quả rất cao. Trong y học, PCR cĩ thể chẩn đốn chính xác các bệnh nhiễm trùng từ virut đến vi khuẩn và các bệnh do nấm, kể cả HIV-AIDS, chẩn đốn sớm và theo dõi điều trị ung thư
21. Trong tham vấn di truyền y học, PCR cho phép chẩn đốn nhanh, chính xác các bệnh di truyền kể cả chẩn đốn trước sinh giới tính và các dị tật bẩm sinh cĩ thể cĩ từ khi thai mới được 8 tuần tuổi và điều quan trọng là khơng cần chọc ối, chỉ cần lấy một giọt máu ngoại vi của mẹ để làm mẫu thí nghiệm. Trong khoa học hình sư, kỹ thuật PCR là khơng thể thiếu, nĩ giúp chẩn đốn nhanh, chính xác thủ phạm chỉ từ một vết máu khơ, một sợi tĩc hoặc một sinh phẩm nào đĩ mà thủ phạm để lại trên hiện trường. Ngồi ra kỹ thuật này cịn cho phép xác định chính xác quan hệ huyết thống cha-con, ơng-cháu v.v cũng chỉ trong vài giờ. Trong bảo vệ mơi trường, việc xác định mức độ ơ nhiễm sinh học cĩ thể thực hiện rất hiệu quả và nhanh chĩng bằng kỹ thuật PCR. Những ứng dụng thực tiễn đa dạng của phản ứng chuỗi tổng hợp ADN thật vơ cùng tận. Nếu như năm 1985 mới cĩ 3 cơng trình được cơng bố về PCR thì 5 năm sau kỹ thuật này được sử dụng trong hàng nghìn phịng thí nghiệm trên khắp thế giới. Ngay ở nước ta, kỹ thuật PCR cũng đã và đang được dùng trong nhiều trường đại học, viện nghiên cứu và ngày càng trở nên phổ biến. Phản ứng chuỗi tổng hợp ADN thật sự đã đưa lại một cuộc cách mạng trong lĩnh vực ứng dụng thực tế của sinh học phân tử. Ngày nay cĩ thể nĩi mọi lĩnh vực nghiên cứu sinh học đều sử dụng kỹ thuật PCR. 1. Chẩn đốn phát hiện các tác nhân ngoại lai: Trong việc phát hiện những tác nhân gây bệnh, sử dụng các phương pháp sinh học phân tử cĩ nhiều thuận lợi hơn so với các phương pháp cổ điển, đĩ là: Tiết kiệm được thời gian vì khơng cần nuơi cấy các tác nhân gây bệnh, điều này đặc biệt đúng khi sử dụng phương pháp PCR. Ví dụ phát hiện virut HIV-1 gây suy
22. giảm miễn dịch ở người (Human Immunodeficiency Virus - HIV) bằng phương pháp PCR chỉ cần một ngày thay vì phải 3-4 tuần nuơi cấy. Các phương pháp sinh học phân tử là biện pháp duy nhất khi tác nhân gây bệnh khơng thể hay khĩ nuơi cấy: trực khuẩn Koch, Brucella, Chlamydia, virut viêm gan siêu vi B HBV (Hepatitis B Virus). Việc tạo dịng gien dùng làm mẫu dị đơn giản hơn việc sản xuất kháng thể chuyên biệt và cĩ thể dùng để phát hiện tất cả các kiểu huyết thanh (serotype) của tác nhân gây bệnh. Độ nhạy rất cao (với kỹ thuật PCR, chỉ cần cĩ 1 vi sinh vật để ly trích được ADN). Khơng địi hỏi nhiều kỹ thuật. Nếu trước kia để phát hiện tác nhân ngoại nhiễm, cần phải quan sát dưới kính hiển vi, nuơi cấy trên một loạt mơi trường, miễn dịch học, vv thì hướng chẩn đốn bằng sinh học phân tử chỉ cần một kỹ thuật, PCR hoặc lai phân tử (DNA probe). Phổ áp dụng rất rộng: cĩ thể phát hiện được vi khuẩn , virus, nấm . (Bảng 3) Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae M. aviumintracellulare Aeromonas hydrophila M. leprae Bacillary angiomatosis agient M. tuberculosis Bacillus anthracis Mycobacterium sp. Bacterial menigitis pathogiens Mycoplasma fermantans
23. Bordetella pertussis Mycoplasma gienitalium Campylobacter sp. Mycoplasma pneumoniae Clamydia pneumoniae Mycoplasma sp. Clamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Clostridium difficile Neisseria meningitidis Coliform bacteria Rickettsia sp. Comamonas sp. S.aureus toxins Corynebacterium diphteriae Salmonella typhimurium Ehrlichia sp. Shigella sp. Enterohemorrhagic E. coli Staphylococcus aureus, Enterotoxigienic Escherichia coli Treponema pallidum Haemophilus influenzae Ureaplasma urealyticum Helicobacter pylori Vibrio cholerae Legionella pneumophila Whipple's disease-associated Leptospira sp. bacterium Listeria monocytogiens Yersinia pestis, Y.enterocolitica Virus Cytomegalovirus Human papillomavirus Enterovirus Human parvovirus B19 Epstein-Barr virus Influenza virus Herpes simplex virus types I và II Rhinovirus HIV-I và II Rubella virus
24. HTLV-I và II, HBLV Varicella-zoster virus, Human adenovirus Viêm gan A (HAV) Human herpes virus 6 và 7 Viêm gan B virus (HBV) Human JC virus Viêm gan C virus (HCV)
25. Nấm gây bệnh Blastomyces dermatitidis Histoplasma capsulatum Candida albicans Pneumocystis carnii Coccidioides immitis Trichosporon beigelii Cryptococcus neoformans Nguyên sinh động vật Babesia bigemina, B.bovis, B.microti Plasmodium falciparum Entamoeba histolytica Toxoplasma gondii Giardia lamblia Trichomonas vaginalis Leishmania sp. Trypanosoma sp. Naegleria fowleri Bảng 3. Vi sinh vật gây bệnh cĩ thể định danh bởi PCR 2. Phát hiện sự đề kháng kháng sinh: Phát hiện sự đề kháng kháng sinh ở vi sinh vật nhằm đánh giá, kiểm sốt tình hình đề kháng đối với các kháng sinh sau thời gian sử dụng, đồng thời gĩp phần trong việc sử dụng kháng sinh an tồn, hiệu quả. Để thực hiện điều này phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau, hiện nay các phương pháp thơng thường gồm cĩ các bước sau: (1) Phân lập tác nhân gây bệnh, (2) Thử nghiệm tính nhạy cảm của tác nhân với các kháng sinh khác nhau. Trong bước này lại cĩ thể sử dụng: (i) Dùng đĩa kháng sinh,
26. (ii) Pha lỗng trên mơi trường lỏng hay rắn, (iii) Thử nghiệm phát hiện các enzym bất hoạt kháng sinh. Tuy nhiên, đây chỉ là phát hiện về kiểu hình của sự đề kháng (phenotypic drug resistance). Các kỹ thuật về sinh học phân tử cho phép khảo sát kiểu gien của sự đề kháng kháng sinh. Các kháng sinh và các gien chịu trách nhiệm về sự đề kháng kháng sinh cĩ thể phát hiện bởi kỹ thuật Sinh học Phân tử được trình bày trong bảng 4. Ví dụ: để phát hiện các S.aureus kháng methicillin (MRSA), nguyên nhân là các chủng này đã sản sinh các penicillin-binding protein mới được gọi là PBP 2' hay PBP 2a cĩ ái lực thấp đối với các -Lactams. Để phát hiện gien mecA (gien liên quan), dùng các mồi RSM-2647 và RSM-2648, sản phẩm PCR phát hiện cĩ kích thước 533 bp. Ngồi ra việc phát hiện gien đề kháng trên các vi khuẩn mọc chậm đặc biệt giúp ích cho việc chọn kháng sinh nhạy cảm để trị liệu ngay từ đầu. Ví dụ để phát hiện M.tuberculosis hay M.leprae kháng rifampicin, giúp bác sĩ điều trị cĩ thể sử dụng phác đồ điều trị đúng cho bệnh nhân, theo phương pháp cổ điển phải mất 4-6 tuần, trong khi phương pháp PCR chỉ mất một ngày. Sản phẩm PCR cĩ kích thước khoảng 411 bp với đoạn mồi TBrpo 1 và TBrpo 2 trên M.tuberculosis hoặc 710 bp với đoạn mồi MLrpo22 và MLrpo23 trên M.leprae. Một ví dụ khác trên virus HIV, sau thời gian trị liệu từ 3-12 tháng với AZT người ta đã thấy cĩ sự đề kháng. Hiện nay đã tìm ra 4 đột biến Asp-67 Asn; Lys-70 Arg; Thr-215 Phe/Tyr và Lys-219 Gln cĩ liên quan. Nếu cả 4 đột biến hiện diện ở chủng virus thì khả năng phát hiện đột biến tăng hơn 100 lần.
27. Kháng sinh Điểm tác động Vi trí của yếu Gien đích đã biết tố đề kháng Aminoglycosides Quá trình dịch mã P, C, Tn ant, aph, aac Glycopeptides Tổng hợp vách tế bào P vanA, vanB, vanC Chloramphenicol Dịch mã (50S ribosome) P, Tn erm, erc, mrs Tetracycline Dịch mã (ngăn aminoacyl- P, C, Tn tet tRNA kết với ribosome Macrolides Dịch mã (50S ribosome) P, C, Tn erm, erc, mrs Sulfonamides Tổng hợp axit folic P, C sul I, mil II Trimethoprim Tổng hợp axit folic P, C, Tn dlfr Quinolones Nhân đơi (ADN gyrase) C gyrA, gyrB Rifampicin Phiên mã (ARN C rpoB polymerase) -Lactams Tổng hợp vách tế bào và P, C, Tn mec, tem, các gien - phân chia Lactamase khác Ghi chú: viết tắt vị trí tác động C = chromosome, P = plasmid, Tn = Transposon Bảng 4. Đích dùng để phát hiện sự đề kháng kháng sinh 3. Pháp y và xác định quan hệ huyết thống: Đây là một lĩnh vực đặc biệt của y học, thường bao gồm việc nhận dạng cá thể, xác định mối quan hệ huyết thống, tìm chứng cứ đối với người bị nghi ngờ phạm tội. Trước đây, các chỉ tiêu sinh học dùng trong các thử nghiệm này là các dấu hiệu kiểu
28. hình như nhĩm máu, kiểu huyết thanh, các enzym của hồng cầu, hệ HLA (human leucocyte antigens – các kháng nguyên bạch cầu người), vv Các chỉ tiêu này cĩ độ tin cậy tương đối cao, nhất là hệ HLA, cĩ thể xác định quan hệ huyết thống hay loại trừ khả năng phạm tội của một cá thể. Tuy nhiên, chúng khơng thể dùng để làm chứng cứ buộc tội một người vì khơng đủ tính chuyên biệt cá thể, cĩ thể cĩ sự trùng lặp về các chỉ tiêu này giữa các cá thể. Nĩi chung, các dấu hiệu kiểu hình khơng cĩ tính chuyên biệt cá thể tuyệt đối, điều này chỉ được giải quyết với việc sử dụng một số trình tự trên ADN. Các kỹ thuật áp dụng: PCR, kỹ thuật phân tích sự đa hình về chiều dài của các mảnh ADN bị cắt đoạn (RFLP - Restriction Fragment Lengh Polymorphism). Tĩm tắt kỹ thuật RFLP là: ly trích bộ gien từ tế bào của các thể cần khảo sát (mơ, máu ), sau đĩ cắt đoạn bộ gien này bằng các enzym cắt giới hạn (restriction enzyme), điện di trên thạch, làm Southern blot, rồi dùng các đoạn dị đặt hiệu được đánh dấu để phát hiện. Kết quả là mỗi cá thể sẽ cĩ một hình ảnh đặc trưng bằng các vạch được đánh dấu bằng các đoạn dị khi lai ghép trên Southern blot (đối với ADN, cịn với RNA được gọi là Northern blot). Với PCR, ta cĩ thể dùng các đoạn mồi nằm trước và sau các tiểu vệ tinh (các vùng cĩ độ biến động cao trên bộ gien, được xem như “dấu vân tay di truyền”, đặc trưng cho từng cá thể) với trình tự (CA)n nằm rải rác khắp bộ gien cĩ tính đa hình rất cao. Các cá thể khác nhau cĩ sự khác nhau về số lượng các cấu trúc CA tạo thành các tiểu vệ tinh nên sau khi PCR và phân tích số lượng các vạch trên gel, sẽ thấy các các vạch khác nhau tùy theo từng cá thể phân tích (Kỹ thuật PCR-RFLP, Hình 4).
29. Các phương pháp sinh học phân tử giúp xác nhận quan hệ huyết thống hoặc phát hiện tội phạm chính xác từ những người nghi ngờ. Chỉ cần trên hiện trường cịn rất ít mẫu vật: một vài giọt máu khơ, vệt tinh dịch, vài sợi lơng hay mẫu tĩc, hay thậm chí mẫu tàn thuốc cĩ dính vài tế bào niêm mạc miệng. CÂU HỎI 1. Hãy giải thích cơ chế của phản ứng trong PCR? 2. Tại sao trong thành phần của đoạn mồi khơng được chứa quá nhiều cặp GC? 3. Nêu ứng dụng của phản ứng chuỗi PCR? 4. Tĩm tắt các kỹ thuật cải tiến của PCR? Tài liệu tham khảo 1. Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), Sinh học phân tử (Khái niệm – Phương pháp – Ứng dụng), Nxb. Giáo dục. 2. Nguyễn Thị Phương Lan (2001), Sinh học phân tử, Nxb. 3. Nguyễn Đức Lương (2001), Nguyên lý kỹ thuật di truyền, Nxb
30. Tế bào VK DNA đích 5' 3' 3' 5' Đoạn mồi Taq polymerase Máy luân nhiệt (Thermocycler) Điện di sản phẩm PCR Sản phẩm PCR Restriction enzyme DNA cắt giới hạn RFLP (Restriction fragment lengh polymorphism) trên gel PGS. TS. NguyễnHình Văn 4. Thanh Sơ đồ kỹ thuật PCR-RFLP